Tesis 198

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIN Y SEROTIPIFICACIN DE ENTEROBACTERIAS
DEL GNERO Salmonella EN UNA POBLACIN DE Crocodylus intermedius Y

TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIN DE BIOLOGIA
TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO META

DIANA ALEXANDRA PACHN CUBILLOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGA AGRCOLA Y VETERINARIA
BOGOT
2009
2

DEL GNERO Salmonella EN UNA POBLACIN DE Crocodylus intermedius Y


TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para Optar el Ttulo de

Microbilogo Agrcola y Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBOLOGIA AGRCOLA Y VETERINARIA
BOGOT D.C.
2009

3

NOTA DE ADVERTENCIA

La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma y a la
moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia

Artculo 23 de la Resolucin N 13 de Julio de 1946

4

DEL GNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIN DE Crocodylus intermedius Y

DIANA ALEXANDRA PACHON CUBILLOS

APROBADO

______________________________ ______________________________
Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarn MV. Carlos Alfonso Moreno Torres
Director. Revisor Consultor
Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia

______________________________ ______________________________
MV. MS.c. Rubiela Castaeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos
Jurado Jurado
Pontificia Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.
5

DEL GNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIN DE Crocodylus intermedius Y


APROBADO

______________________________ _____________________________
INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P.
Decana Acadmica Directora
Facultad de Ciencias Carreras de Microbiologa

6

A Dios por llenarme de bendiciones cada da y llevarme de su mano por el camino que
me permitir alcanzar todos mis objetivos.

A mi madre por ser el mayor ejemplo de fortaleza, constancia, dedicacin y superacin;
por todo su esfuerzo para que juntas alcanzramos esta meta, por su confianza y
dedicacin y por haberme hecho el ser humano que soy ahora.

A mi padre por que desde el cielo me ha acompaado durante todos estos aos, por su
ejemplo de entereza, sabidura y fortaleza.

A mi hermano por su apoyo, confianza y compaa durante todos los aos de mi vida, a
mi abuelita por estar siempre a mi lado haciendo de mi un ser humano fuerte y
perseverante, a mi sobrinito por ser la luz de mi vida.

A Javier por acompaarme durante todo este proceso, brindndome apoyo en los
momentos difciles y por infundirme paciencia cuando cre que esto no sera posible.

7

AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Adriana Pulido Villamarn, por haberme dado la confianza para la realizacin de
este proyecto, por su dedicacin, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos
sus conocimientos para la realizacin de este trabajo.

Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para
concluir con xito este trabajo.

Al laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
Universidad Nacional de Colombia, a su directora Dra. Judith Figueroa Ramrez y Dra.
Derly Fierro Toscano por haberme dado la oportunidad de trabajar en sus instalaciones,
ya que sin su colaboracin esto no hubiera sido posible.

Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotacin de medios de cultivo,
kit de identificacin y sensidiscos.

A todo el personal de la Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco por toda su
colaboracin y especialmente a su directora profesora Mara Cristina Ardila por sus
aportes al trabajo.

ENERO DE 2009

8

TABLA DE CONTENIDOS

Pgina

1. INTRODUCCIN 17
2. MARCO TERICO 19
2.1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE 19
2.2. GNERO Salmonella 20
2.2.1. Caracterizacin morfolgica y bioqumica 21
2.2.2. Clasificacin taxonmica 22
2.2.3. Estructura Antignica 22
2.2.4. Factores de virulencia 24
2.2.5. Patognesis y patogenicidad 24
2.2.6. Salmonelosis 27
2.2.7. Diagnstico 27
2.2.7.1. Mtodos de aislamiento de Salmonella sp. 28
2.2.7.2. Identificacin bioqumica 34
2.2.7.2.1. Diagnstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. 35
2.2.7.3. Serotipificacin 37
2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann - White 38
2.2.8. Sensibilidad Frente a agentes antimicrobianos 39
2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos 40
2.2.8.2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 41
2.2.8.2.1. Principios del mtodo de difusin en agar (Kirby-Bauer) 41
2.2.8.2.2. Interpretacin de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por
el mtodo de difusin en agar. 42
2.2.8.2.3. Seleccin de los agentes antimicrobianos 42
2.3. EL GNERO Salmonella sp. ASOCIADO A LOS REPTILES 43
2.4. ESPECIES EN ESTUDIO 47
2.4.1. Caimn del Orinoco (Crocodylus intermedius) 47
2.4.2. Testudinos 48
2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles 49
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN 51
3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA 51
3.2 JUSTIFICACIN 52
4. OBJETIVOS 53
4.1 OBJETIVO GENERAL 53
viii
9

Pgina

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS 53
5. MTODOLOGA 54
5.1. REA DE ESTUDIO 54
5.2. POBLACIN MUESTRAL 54
5.3. TOMA DE MUESTRAS 54
5.3.1. Obtencin de muestras por hisopado cloacal 56
5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques 57
5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques 58
5.4. FASE ANALTICA 59
5.4.1. Aislamiento e identificacin de Salmonella sp. 59
5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo 59
5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo 59
5.4.1.3. Aislamiento primario en medio selectivo y diferencial 59
5.4.1.4. Identificacin bioqumica 63
5.4.1.5. Serotipificacin 63
5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibiticos 64
6. RESULTADOS Y DISCUSION 66
6.1. ANLISIS DE DATOS 66
6.2. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS DEL GNERO Salmonella sp.
POR TCNICA BBL CRYSTAL

66
6.3. POSITIVIDAD A Salmonella sp. EN ESTANQUES DE CROCODYLIA Y
TESTUDINEA 67
6.4. PRESENCIA DE Salmonella sp. SEGN LA ESPECIE 69
6.5. AISLAMIENTOS DE Salmonella sp. SEGN EL TIPO DE MUESTRA
PARA EJEMPLARES DE CROCODYLIA Y TESTUDINOS 71
6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia segn
grupos etreos 74
6.6. SEROTIPIFICACIN 75
6.7. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS 77
6.8. MICROORGANISMOS DIFERENTES A Salmonella sp. AISLADOS EN
LOS ESTANQUES DE LA ESTACIN 80
7. CONCLUSIONES 85
8. RECOMENDACIONES 86
9. REFERENCIAS 87
10. ANEXOS 106
ix
10

NDICE DE TABLAS

Pgina

Tabla N 1. Propiedades bioqumicas diferenciales de las subespecies de
Salmonella sp. 34

Tabla N 2. Resultados de las pruebas bioqumicas clave para la identificacin de
microorganismos pertenecientes al gnero Salmonella sp. 37

Tabla N 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y nmero de cepas
de Salmonella sp. aisladas para cada especie segn estanques muestreados 55

Tabla N 4: Comportamiento de los microorganismos del gnero Salmonella sp.
aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los
antibiticos utilizados mediante el mtodo de Kirby Bauer 77

aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los
antibiticos utilizados mediante el mtodo de Kirby Bauer. 78

x
11

INDICE DE FIGURAS
Pgina

Figura N 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46

Figura N 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46

Figura N 3. Caimn del Orinoco o Caimn Llanero (C. intermedius) 48

Figura N 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la
E.B.T.R.F 49

Figura N 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56

Figura N 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius
mediante hisopado cloacal. 57

Figura N 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58

Figura N 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos
y Testudinos 58

Figura N 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58

Figura N 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros
de los animales en estudio. 59

Figura N 9. Identificacin de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios
de cultivo selectivos. 60

Figura N 9 A. CRHOMagar Orientacin 60

Figura N 9 B. Agar MacConkey 60

Figura N 10. Caractersticas morfolgicas de las enterobacterias del gnero
Salmonella sp. aisladas en los medios de cultivo diferenciales. 61

Figura N 10 A. CHROMagar Salmonella. 61

Figura N 10 B. Agar Hektoen Entrico. 61

Figura N 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en
las muestras. 62

Figura N 11 A. Staphylococcus saprophyticus. 62
Figura N 11 B. Escherichia coli. 62
Figura N 11 C. Enterococcus sp. 62
Figura N 11 D. Klebsiella sp. 62
Figura N 11 E. Citrobacter sp. 62

xi
12

Pgina
Figura N 12. Lectura de pruebas de identificacin Crystal

para
microorganismos entricos/no fermentadores. 63

Figura N 12 A. Identificacin a partir de agua y sedimento del estanque
de Testudinos nmero 21. 63

Figura N 12 B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimn
neonato en el estanque nmero 47 63

Figura N 13. Esquema de una lmina hemoclasificadora utilizada para
la serotipificacin de las cepas de Salmonella sp. y modo en que se emple. 64

Figura N 14. Antibiograma 65

Figura N 15. Porcentaje de presentacin de Salmonella sp. en los
estanques de la E.B.T.R.F. 67

Figura N 16. Estanques de Tortugas positivos y negativos
a Salmonella sp. 69

Figura N 17. Estanques de C. intermedius positivos y negativos a
Salmonella sp. en la E.B.T.R.F. 70

Figura N 18. Aislamiento de Salmonella sp. segn el origen
de la muestra en Testudinea 72

Figura N 19. Aislamiento de Salmonella sp. segn el origen de la muestra
en estanques de C. intermedius 72

Figura N 20. Porcentaje de aislamientos positivos a Salmonella sp.
en los estanques de Crocodylia segn los grupos etreos. 74

Figura N 21. Serotipificacin de Salmonella sp. aislada en la E.B.T.R.F 76

Figura N 22. Pruebas de Sensibilidad a antimicrobianos 78

Figura N 23. Microorganismos diferentes a Salmonella sp
aislados en los estanques de C. intermedius y Testudinos de la E.B.T.R.F 80

Figura N 24. Microorganismos aislados las muestras de agua y sedimento
en los estanques de Testudinea muestreados 81

Figura N 25. Microorganismos aislados en las muestras
de arena y materia fecal en los estanques de Testudinea muestreados 81

Figura N 26: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados
cloacales de ejemplares de Testudinata muestreados 82

Figura N 27: Microorganismos aislados en las muestars de agua y
sedimento de los estanques de C. intermedius muestreados 82

Figura N 28: Microorganismos aislados en las muestras de arena y
materia fecal halladas en los estanques de C. intermedius muestreados 83

xii
13

Figura N 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados
cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 83

xiii
14

NDICE DE ANEXOS
Pgina

ANEXO N 1. Plano de la E.B.T.R.F 106

ANEXO N 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar
Orientacin 107

ANEXO N 3. Sistema de Identificacin BBL Crystal para Entericos/No
Fermentadores. 108

Anexo 3.1. Procedimiento para la identificacin de los microorganismos por
sistema BBL Crystal. 108

Anexo 3.2. Ficha tcnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109

Anexo 3.3. Calculo del nmero de perfil 109

ANEXO N 4. Esquema de Kauffmann White 110

ANEXO N 5. Interpretacin de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 112

ANEXO N 6. Resultados obtenidos por estanque en cada muestreo. 114

xiv
15

RESUMEN

Durante mucho tiempo las enterobacterias pertenecientes al gnero Salmonella han sido
reportadas como patgenos para humanos y animales tanto domsticos como silvestres;
aunque tambin hacen parte de la flora normal intestinal de reptiles, especialmente de
tortugas.
La Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco de la Universidad Nacional de
Colombia, ubicada en la ciudad de Villavicencio, lidera el programa de recuperacin del
Caimn Llanero (Crocodylus intermedius) que se encuentra en inminente peligro de
extincin y adems cuenta con una coleccin viva de Testudinos de diferentes gneros.
Con el fin de evidenciar la presencia del enteropatgeno en la Estacin, se procedi a
aislar microorganismos del gnero Salmonella a partir de muestras de origen ambiental y
cloacal de las especies all encontradas, utilizando la metodologa microbiolgica
estndar; posteriormente se procedi a serotipificar los aislamientos por el mtodo
convencional de Kauffmann-White especialmente a nivel de antgeno somtico y
finalmente se realiz la prueba de sensibilidad a antimicrobianos para cada cepa
encontrada en la Estacin.
Los resultados reportan una prevalencia del 52% de Salmonella sp. en el total de la
poblacin muestreada, con una mayor positividad a partir de muestras de
agua/sedimento y las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos determinaron que el
100% de los aislamientos fueron sensibles a la norfloxacina. Teniendo en cuenta que
microorganismos del serogrupo C2 fueron los ms prevalentes (41,4%) y conscientes del
riesgo zoontico se dio inicio a la implementacin de un manual de bioseguridad para la
estacin y as prevenir todo riesgo para la poblacin animal y humana.
Los resultados obtenidos fortalecern programas de sanidad animal que pretenden
garantizar la salud de los ejemplares y realizar nuevas investigaciones de patogenia,
nutricin, etologa y gentica.

16

ABSTRACT

Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild;
in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles.
The Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is
part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the
Caiman Llanero (Crocodylus intermedius), which is in imminent extinction danger and
also bill with an alive collection of Testudinos of different families.

With the purpose of evidencing the presence of the enteropathogen, we proceeded to
isolate microorganisms of the gender Salmonella sp. starting from samples of
environmental and cloacae origin using the standard methodology; we proceeded to
serotyping the isolations for the conventional method of Kaufmann-White and finally we
did an antimicrobial susceptibility test for each strain found in the Estacin.

Results reports a prevalence of 52% of Salmonella sp in the population sampled with a
bigger detection starting from samples of water/silt. Antimicrobial susceptibility test could
determine than 100% of the isolates were sensible to norfloxacine. Knowing that
microorganism of serogroup C2 were the most prevalent (41,4%) and aware of the
zoonotic risk we begin to the implementation of a biosecurity manual for the Estacion and
this way to prevent all risk for the animal and human population.

Results going to strength programs of animal sanity that seek to guarantee the health of
the animals and to carry out new in investigation in pathology, nutrition, etiology and
genetics.

17

1. INTRODUCCIN

Los miembros del gnero Salmonella estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, se
encuentran como comensales y patgenos en el tracto gastrointestinal de mamferos
domsticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de
enfermedades en sus hospederos, considerndose como la principal enterobacteria de
importancia en salud pblica
(Selbitz et al.,1995. Turnbull, 1979)
.
Para el caso de Latinoamrica y especialmente para Colombia la investigacin acerca de
microorganismos pertenecientes al gnero Salmonella se ha centrado en relacin con las
enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha
investigado con respecto a la transmisin por reptiles donde esta enterobacteria hace
parte de la flora intestinal normal; a pesar que las autoridades reguladoras del medio
ambiente reconocen el problema zoontico que representan las especies silvestres
frente a la poblacin humana, las investigaciones en el rea biolgica y veterinaria son
insuficientes
(Hernndez, 2004)

Los reptiles frecuentemente son portadores asintomticos de Salmonella sp. y por
consiguiente, los casos clnicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia
(Ramsay, et al, 2002)
. Sin embargo, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos
niveles de mortalidad en serpientes y tortugas, y a su vez, un gran porcentaje de
investigaciones han implicado la herpetofauna en la transmisin de Salmonella sp. hacia
los humanos, lo cual permite establecer la capacidad de generar procesos de infecciones
zoonticas y la importancia de la bacteria a nivel de salud pblica
(Saelinger y Lewbart, 2006)
.

De manera natural los reptiles son susceptibles a enfermedades que contribuyen a la
disminucin de las poblaciones; aunque en la mayora de los casos se desconoce la
accin patgena de los microorganismos sobre estas especies silvestres, ignorndose el
impacto que tienen las enfermedades bacterianas sobre las mismas, as como el
tratamiento ideal para combatir los signos producidos
(Mader, 1996)
. Sin embargo, es de vital
importancia tener en cuenta que la presencia de ste tipo de endopatgenos no se
asocia necesariamente con estados de enfermedad
(Lax, et al., 1995)
. Desde el punto de vista
profilctico, la susceptibilidad a patologas causadas por enterobacterias en reptiles se
relaciona con estados de depresin en el animal, que pueden producirce a causa del
estrs por el cautiverio, alteracin en temperaturas medioambientales, el nmero de
microorganismos presentes, edad, estado nutricional del animal, entre otras
(Mader, 1996)
.
Los resultados asociados a este tipo de condiciones son la afeccin de tejidos y fluidos
por generar un bloqueo de los vasos sanguneos, edema, ulceraciones, necrosis,
18

disminucin de actividad, prdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitacin,
diarrea, constipacin y letargia.
(Jertborn et al 1990)
.
Estudios sobre Salmonella sp. en especies silvestres demuestran que su presencia es
constante, pero se deben conocer las serovariedades implicadas y la sensibilidad que
tienen tanto animales cautivos como salvajes para ser afectados por el microorganismo
con el fin de minimizar los posibles inconvenientes que se pueden presentar en los
programas de recuperacin debido a enfermedades asociadas al enteropatgeno;
adems, parece ser que en los centros donde los reptiles estn en condiciones de
cautividad, hay ms posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre
(Ramsay
et al., 2002).
La Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco, es el centro de recuperacin
de especies silvestres en va de extincin ms importante en el pas, ha demostrado una
excelente gestin en el manejo de estas poblaciones logrando as minimizar los riegos
de extincin de las especies; es una entidad encaminada al cuidado y recuperacin de
ejemplares de Crocodylus intermedius (Caimn Llanero) y Testudines llevando a cabo
investigaciones en el mbito de salud, nutricin y reproduccin que permiten la
repoblacin de estos ejemplares; sin embargo, las condiciones ex situ de los animales
producen estados de inmunosupresin donde microorganismos patgenos como
Salmonella sp. pueden llegar a colonizar generando cuadros de enfermedad en los
individuos; con base en ello, es necesario tener en cuenta que el conocimiento de la
microbiologa entrica de estas especies es fundamental para diagnosticar desrdenes en
la flora digestiva as como para prevenir infecciones secundarias, todo ello dirigido a
optimizar los respectivos programas de conservacin de estas especies silvestres
(Saelinger y
Lewbart, 2006)

Mediante la realizacin de este estudio se pretende llevar a cabo un anlisis sobre la
condicin de los animales de Orden Crocodylia y Orden Testudinea cautivos en la Estacin
de Biologa Tropical Roberto Franco dependencia de la Facultad de Ciencias de la
Universidad Nacional de Colombia, en la ciudad de Villavicencio, debido a que de acuerdo
con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unin Internacional para
la Conservacin de la Naturaleza (UICN), son las especies de vertebrados ms
amenazados en Colombia
(Min. Medio Ambiente, 2002)
. Para tal fin, se llevar a cabo el aislamiento e
identificacin de enterobacterias del gnero Salmonella, estableciendo los serogrupos que
predominan en dichas especies, identificados mediante pruebas serolgicas, para
posteriormente reconocer su valor zoontico y finalmente lograr con la investigacin hacer
un aporte sustancial en cuanto a los riesgos biolgicos y epidemiolgicos de importancia en
salud pblica dentro de la Estacin y asimismo, promover la preservacin de la fauna nativa
que se encuentra en peligro de extincin.
19

2. MARCO TERICO

2.1. Familia Enterobacteriaceae
La familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), pertenece al orden XIII
Enterobacteriales. Segn la segunda edicin 2001 del Manual Bergey de Bacteriologa
Sistemtica, est conformada por 41 gneros y ms de 100 especies

(Quinn et al., 2002)
,
aunque menos de la mitad tienen inters desde el punto de vista veterinario
(Stanchi, 2007)
.
Su hbitat natural es el intestino y muchos de estos microorganismos provocan
enfermedades tanto en los animales productores de alimentos (diarrea de los recin
nacidos y salmonelosis), como en los animales de compaa (infecciones y abscesos del
tracto urinario) y en el hombre
(Biberstein, y Chung Zee, 1990)
. Esta familia incluye gneros de gran
importancia a nivel epidemiolgico como son Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella
sp, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Edwarsiella
sp., Yesinia sp., Morganella sp., y Arizona sp. entre otras
(Jawetz, et al, 2005)
.

Los microorganismos de esta familia son parecidos en cuanto a su morfologa y
caracteres tintoriales por ser bacilos pleomrficos Gram negativos y asporgenos de un
tamao de 2 3 m por 0,4 0,6 m, catalasa positivos y oxidasa negativo, por carecer
de citocromo c, lo cual es una propiedad bioqumica til en el aspecto diagnstico de la
familia
(Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990)
. Los representantes de este grupo de
microorganismos son anaerobios facultativos; en condiciones anaerobias, su crecimiento
depende de que en el medio existan carbohidratos como fuente de carbono; en
aerobiosis, la gama de sustratos apropiados para su crecimiento incluye cidos
orgnicos, aminocidos y carbohidratos
(Biberstein y Chung Zee, 1990)
. Mediante observacin
microscpica resulta difcil diferenciar los representantes de un determinado gnero de
los pertenecientes a los dems gneros. Son clave para el diagnstico los productos
resultantes de la fermentacin de azcares; casi todos los microorganismos de este
grupo fermentan la glucosa a cido pirvico por la va de Embden Meyerhoff (glicolisis);
fermentan la D-glucosa a menudo con produccin de gas, reducen los nitratos a nitritos y
poseen un contenido de DNA del 39 al 59% de guanina mas citosina (G+C), algunos
poseen cpsula
(Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990)
.
Las propiedades que definen a la familia deben ponerse en evidencia para afirmar que la
cepa es una enterobacteria. A partir de ah se realiza la identificacin, fundamentalmente
por las caractersticas bioqumicas para estudiar el metabolismo proteico (presencia de
ureasa, produccin de indol, degradacin del triptfano), el metabolismo glucosdico
(fermentacin de azcares: glucosa, lactosa, sacarosa, etc.), la capacidad de utilizar el
citrato como nica fuente de carbono, la presencia de enzimas descarboxilasa y
20

desaminasas y la produccin de hidrgeno sulfurado, entre las caractersticas ms
importantes
.
Las Enterobacterias pueden comportarse como apatgenas, patgenas oportunistas y
patgenas importantes. Las primeras, pueden encontrarse como contaminantes de
muestras clnicas, siendo aisladas del ambiente y/o materia fecal, como es el caso de
Hafnia; las enterobacterias patgenas oportunistas ocasionalmente producen
enfermedad a nivel del tracto digestivo, mientras que las patgenas importantes pueden
causar daos entricos y sistmicos, por poseer una estructura antignica compleja y
producir varias toxinas y otros factores de virulencia
(Bamler et al. 1998, Muoz et al, 2002, Biberstein y
Chung Zee, 1990)
.

2.2. El Gnero Salmonella
El gnero Salmonella recibe su nombre en honor al microbilogo americano Daniel
Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en
medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a
Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes
descubrieron los grmenes designados como salmonelas, en 1885, aislndolos de
cerdos con clera
(Stanchi, 2007)

Salmonella sp. es la enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pblica por
producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino
en todas las especies animales
(Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979, Lujan y Blas, 2007)

Los microorganismos del gnero Salmonella estn extensamente diseminados en la
naturaleza como comensales y como patgenos del aparato digestivo de los mamferos
domsticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir
una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonelas son potencialmente
patgenas
(Stanchi 2007; Smith et al. 1952; Mahajan et al. 2003)
al ser parsitos intracelulares y por
medio de los macrfagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo
afectado aprovechando la va linftica y sangunea
(Smith et al. 1952; Suter, 1956; Stanchi, 2007)
. En
medicina humana estn descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre
entrica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria
se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda,
subaguda y crnica, y abortos en diferentes especies animales
(Stanchi, 2007)
. Las diversas
especies de salmonelas se transmiten por contacto tanto con enfermos como con
portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida por este agente
microbiano tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados
21

con el patgeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminacin ambiental es
invariablemente la materia fecal
(Stanchi 2007 ; Smith et al. 1952; CDC. 2007)
.

2.2.1 Caracterizacin morfolgica y bioqumica
Los miembros del gnero Salmonella son bacilos Gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5m,
no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados
(Terragno et al, 2003)
;
generalmente mviles por flagelos pertricos con la excepcin de Salmonella gallinarum y
Salmonella pullorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente
(Stanchi
2007, Terragno et al, 2003)
.

Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo; fermentan glucosa con produccin de
cido y gas (excepto S. typhi), tambin fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, D-
manosa, L-ramnosa, Dsorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcitol
.

Son
oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges- Proskauer (VP) negativo, rojo de
metilo y citrato de Simmons positivo, producen H
2
S, son urea negativo, lisina ornitina y
descarboxilasa positivo
. Entre otras caractersticas bioqumicas se
encuentran la reduccin de nitratos a nitritos, no desaminan la fenilalanina y son
tetrationato reductasa
(Jawetz, et al, 2005)
.

Las salmonelas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubacin
por 18 a 24 horas a 32
o
C son de 2 a 3 mm de dimetro salvo algunos serotipos que
producen colonias pequeas; con algunas excepciones no presentan cpsula
(Smith et al.
1952; Suter 1956)
. Los miembros del gnero Salmonella crecen en un amplio rango de
temperaturas (7 - 28
o
C), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son
incapaces de tolerar altas concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada
durante periodos prolongados
(Jawetz et al. 2005)
.

Los criterios para la identificacin bioqumica de Salmonella sp. son relativamente
estndar, sin embargo puede haber variaciones en los medios de cultivo y algunas
pruebas bioqumicas, por lo cual como alternativa se estn introduciendo cada vez ms
los mtodos moleculares que permiten un diagnstico ms rpido y pueden ser ms
simples de realizar, pero tienen como desventaja que son de costo elevado
(Terragno et al,
2003)
.

22

2.2.2. Clasificacin taxonmica
La ms reciente clasificacin del gnero Salmonella est basada en estudios realizados
sobre la base de tcnicas de hibridacin del DNA de la bacteria y se ha concluido que
ste est conformado por dos especies:
1) Salmonella enterica, dividida en seis subespecies aisladas de:

a. Subepecie I. S. enterica subsp. enterica: Humanos y Animales de sangre caliente
b. Subespecie II. S. enterica subsp. salamae: Animales de sangre fra y del ambiente.
c. Subsespecie III a. S. enterica subsp. arizonae: Animales de sangre fra y del
ambiente.
d. Subespecie III b: S. enterica subsp. diarizonae. Animales de sangre fra y del
ambiente.
e. Subespecie IV. S. enterica subsp. houtenae. Animales de sangre fra y del
ambiente.
f. Subespecie VI. S. enterica subsp. indica. Animales de sangre fra y del ambiente.

2) Salmonella bongori. Subespecie V: No constituye un patgeno para los humanos,
pero si ha sido implicada en ciertas patologas en animales
(Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y
Weill; 2007; Stanchi 2007; Farmer 2003 y Terragno et al 2003)

Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonelas
segn su hibridacin de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se
encuentran constituidas por ms de 2400 variedades serolgicas, determinadas segn
las distintas asociaciones de los antgenos somticos O y flagelares H
(Stanchi, 2007)
.

Tambin puede hacerse una clasificacin de las salmonelas desde el punto de vista
epidemiolgico en tres grupos:

1) Sin ninguna afinidad por hospedador
2) Afectan nicamente al ser humano
3) Adaptadas a un hospedador animal nicamente
(Stanchi 2007; Terragno et al 2003)
.

2.2.3. Estructura antignica
La estructura antignica de Salmonella sp. es similar a la de otras enterobacterias,
contando con la presencia de dos clases de antgenos principales: Antgenos O
(somticos) y Antgenos H (flagelares). En algunas cepas se encuentra un tercer tipo de
Antgeno de superficie, anlogo funcionalmente a los Antgenos K (capsulares) de otros
23

gneros. Al estar este antgeno relacionado con la virulencia de las cepas se le
denomina Antgeno Vi
(Koneman y Allen. 1999)
, que puede interferir con la aglutinacin por
antisueros O y que se relacionan con invasividad
(Jawetz et al, 2005)
.

a. Ag Somtico (O de pared celular): Es un polisacrido, termostable, tipo-
especifico, que se halla en todas las especies
(Stanchi 2007)
. Se distinguen dos clases:
mayores (determinantes del serogrupo) y menores (se hallan en algunas
Salmonelas y serogrupos de stas), son compartidos por diferentes serovares y no
determinan los serogrupos
(Stanchi 2007)
, aunque existen numerosos antgenos O, son
los factores O principales los que sirven para caracterizar los diferentes tipos
antignicos. (Por ejemplo O4: se refiere al grupo B, O9: Grupo D, entre otros)
(Muoz et
al. 2002)
. El complejo de antgenos O determina el subgrupo somtico al que
pertenecen los gneros de Salmonella, sp., Arizona sp., Citrobacter sp., Escherichia
sp., Providencia spp. Serratia sp. entre otros
(Bayley y Schott, 1982)
.

b. Ag Flagelar (H): Es proteico y termolbil, constituido por flagelina, cuya
composicin en aminocidos es constante para un tipo antignico determinado
(Bayley
y Schott, 1982)
. Por lo general, los microorganismos que tienen este antgeno, poseen
dos fases diferenciables por medio de aglutinacin en tubo de ensayo
(Stanchi 2007; y
Terragno et al, 2003)
; esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase
1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria.
En el primer caso (H1), lo ms relevante es que se trata de un Ag especfico de
especie (segn Kauffmann y White) y su sntesis reside en el gen hag1, que slo se
expresa durante las primeras 24 h del crecimiento, en lo que se refiere al H2, es
compartido por varias especies de Salmonella y el gen que codifica para su
produccin es el Hag2, el cmismo que se manifiesta a partir de las 24 h posteriores
al inicio del desarrollo. La mayora de las cepas del gnero Salmonella pueden
expresar las dos especificidades de su antgeno H (difsicos), sin embargo existen
algunas que logran expresar solamente uno (monofsicos)
(Parra et al. 2002)
. Cada
Salmonella sp. expresa alternativamente estos dos tipos de antgenos mediante un
mecanismo denominado cambio de fase
(Quinn et al., 2002, Smith et al., 1952)
.

c. Ag capsular (K): Es un antgeno termolbil aunque existen pocas excepciones
(Bayley y Schott, 1982)
; es llamado en Salmonella el Ag (Vi), que protege a la bacteria
dndole resistencia antifagoctica. La presencia de este antgeno hace imposible la
aglutinacin de sueros anti O, debido a que recubre toda la bacteria; en este caso,
la cepa en estudio debe ser sometida a un calentamiento a 100
o
C durante 30
24

minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de
aglutinacin con el Ag somtico correspondiente
(Stanchi 2007; Terragno et al, 2003)
. De all
que la expresin de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo
necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresin tenga lugar
(Parra et
al. 2002)
.

2.2.4. Factores de virulencia
Para Salmonella sp. se conocen varios factores de virulencia, uno de ellos es la
produccin de al menos tres toxinas: las enterotoxinas que son sustancias liberadas al
intestino y que ocasionan sntomas gastrointestinales como clico y diarrea, las
endotoxinas que hacen parte de la membrana externa de la bacteria y cuya actividad
biolgica est asociada con los lipopolisacridos (LPS) y por ltimo, las citotoxinas que
estn asociadas con la superficie celular, las cuales inhiben la sntesis proteica en la
clula hospedadora y pueden estar implicadas en la adherencia a las clulas epiteliales,
constituyendo esta ltima un segundo factor de virulencia de Salmonella sp.
(Madigan et al 1997;
Salyers y Whitt 2002)
. Tambin se ha descrito en algunas subespecies de Salmonella (S.
typhimurium) la formacin de pseudpodos en la clula hospedera, lo que trae como
resultado la internalizacin de la bacteria en vesculas endocticas; adicionalmente, la
produccin de adhesinas que incluyen fimbrias codificadas por el plsmido de virulencia
pSLT, permiten la unin de la bacteria a las microvellosidades de los enterocitos,
fimbrias polares largas que se encargan de la unin de la bacteria a las placas de Peyer,
y las fimbrias agregativas delgadas llamadas curli que tambin pueden estar implicadas
en la unin a las vellosidades de los enterocitos
(Madigan et al 1997, Salyers y Whitt 2002)
.

Otros factores relacionados con la adherencia son los polisacridos de superficie celular
(O) y el antgeno Vi, un polisacrido capsular compuesto de cido N-acetilglucosamin-
urnico el cual ayuda a prevenir la fagocitosis y puede proteger la bacteria de las formas
reactivas de oxgeno al interior de los fagocitos, las cepas negativas para el antgeno Vi
son menos infecciosas y virulentas que las positivas para este antgeno
(Parry et al. 2002)
.
La respuesta de tolerancia al cido, es otro aspecto importante de la virulencia de
Salmonella sp. lo que le permite a la bacteria atravesar el ambiente cido del estmago,
requisito necesario para la infeccin
(Salyers y Whitt 2002)
.

2.2.5. Patognesis y patogenicidad
Todos los serotipos de Salmonella sp. conocidos son patognicos para el hombre y los
animales
(Parker y Collier, 1990)
. La virulencia de la bacteria se relaciona con su capacidad de
invadir las clulas hospedadoras, replicarse en su interior y resistir tanto la digestin por
25

los fagocitos como la destruccin por la accin del complemento, lo cual facilita la
difusin de las salmonelas en el organismo del hospedador
(Henrici 1999, Quinn et al. 2002; Smith et al.,
1952)
.
El complejo proceso de invasin es mediado por los productos de la expresin de varios
genes cromosmicos, mientras que la capacidad de crecer en el interior de las clulas
hospedadoras depende de la presencia de plsmidos de virulencia
(Vadillo et al 2002, Smith et al
1952. y Quinn et al, 2002)
. Algunos factores que determinan el carcter patgeno de ciertas
especies del gnero Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en
las que se denominan genricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes
relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patgenos pero que
estn ausentes o solo presentes de forma espordica en las especies saprfitas
(Vadillo et al
2002; Terragno et al 2003)
.

La Salmonella sp. cuenta con 5 islas de patogenicicidad, tres de ellas conteniendo genes
de virulencia
(Salyers y Whitt, 2002)
:

Isla SPI1: Contiene genes inv responsables de la internalizacin de las clulas,
estos genes as como otros de la misma isla de patogenicidad (spa, prg y org)
codifican para un sistema de secrecin tipo III; tambin contienen genes que
codifican protenas que son inyectadas en la clula eucaritica por este tipo de
sistema de secrecin, como por ejemplo el gen sptP que codifica para una
tirosina fosfatasa que altera las seales de transduccin en clulas de la
mucosa, produciendo diarrea. De igual forma posee genes involucrados en la
regulacin de genes de virulencia (hila, invF, sira y phoPQ), algunos de los
cuales controlan la expresin de genes localizados en otras partes del
cromosoma de la bacteria. Los genes contenidos en esta isla parecen ser
importantes en las etapas iniciales de la infeccin en la cual las bacterias
invaden las clulas de la mucosa.
Isla SPI2: Codifica un sistema de secrecin tipo III, diferente al codificado por la
isla SPI1, usado por la bacteria al interior del fagosoma para evitar la fusin
fagosoma-lisosoma; tambin codifica las protenas que inyecta a la clula
eucaritica. Esta isla de patogenicidad parece tener mayor importancia en la
fase sistmica de la infeccin.
Isla SPI3: Codifica un trasportador de Mg
2+
de alta afinidad, el cual puede ser de
importancia en la supervivencia de la clula al interior de fagosomas. No codifica
sistema de secrecin.
Islas SPI4 y SPI5: No se conoce su funcin, no codifican sistemas de secrecin.
26

Las clulas blanco revisten el ltimo tramo del intestino delgado y el primer tramo del
intestino grueso; si la clula blanco est libre con respecto al nmero de salmonelas, es
posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del gnero Salmonella
segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan que
la enfermedad generada sea diarreica o septicmica. Las cepas que producen diarrea se
multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolbil) que altera la
sntesis de los nucletidos cclicos, haciendo que el microorganismo invada la clula, ya
en el interior, las Salmonelas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su
desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y lquido
hacia la luz intestinal, lo que a su vez ocasiona diarrea.
(Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990)
La
gravedad de la enfermedad depende del nmero de clulas blanco afectadas
(Blaser y
Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990)
. Aproximadamente 10
7
organismos viables son
requeridos normalmente para el inicio de una gastroenteritis en humanos; en animales,
se desconoce la dosis infectiva pero depende de la especie
(Blaser y Newman 1982)
; en
animales, los sntomas de la enfermedad son dolor abdominal y diarrea acompaada de
seales de muerte celular (sangre, restos de clulas y clulas inflamatorias)
(Biberstein y Chung
Zee 1990)
.

Adicionalmente, es posible que las cepas que producen septicemia provoquen o no
diarrea, destruccin de las clulas blanco, o ambas cosas. La accin de la enterotoxina
se basa en la interrupcin de la sntesis de protenas provocando la muerte celular
(Biberstein y Chung Zee 1990)
. Los sntomas que se presentan, aunque no siempre, suelen ser
septicemia y shock; las cepas que producen esta forma clnica de enfermedad eluden la
destruccin por parte del hospedador y se multiplican en el interior de los macrfagos del
hgado, bazo y tambin en el interior de los vasos sanguneos
(Hinton, 1971)
. Su destruccin
en la corriente sangunea se encuentra obstaculizada en parte por las unidades
repetitivas del antgeno O del LPS, posiblemente porque se impide la unin entre el
complejo de ataque a la membrana del sistema del complemento y la membrana externa
de la bacteria
(Barrow y Lovely 1991)
.

Las cepas de Salmonella sp. son relativamente hidrfilas, debido en parte a la fraccin
de carbohidratos del LPS que provoca su repulsin de la membrana de las clulas
fagocitarias, la cual es relativamente hidrfoba; las salmonelas que son fagocitadas no
son destruidas fcilmente porque en el animal el contenido de los lisosomas del
macrfago no atacar con facilidad a las salmonelas que se encuentran en el interior del
fagosoma, debido a que las bacterias sintetizan enzimas que tienen la capacidad de
27

neutralizar las que son producidas por el fagosoma
(Blaser y Newman 1982, Biberstein y Chung Zee 1990 y
Quinn et al 2002)
. La multiplicacin del microorganismo origina una endotoxemia, la cual
explica la mayora de los sntomas y el curso de la enfermedad
(Stanchi, 2007)
.

2.2.6. Salmonelosis
Constituye un grupo de infecciones producidas por microorganismos del gnero
Salmonella sp. adquiridas por la ingestin de alimentos o bebidas contaminadas y
caracterizadas por presentar sndromes febriles asociados a manifestaciones
gastrointestinales sistmicas, con frecuencia severas
(Saravia 2008)
. Las manifestaciones
clnicas de las salmonelosis en humanos y animales se presentan bsicamente bajo tres
modalidades las denominadas fiebres entricas, entre las cuales la ms comn es la
fiebre tifoidea producida por la S. typhi, las gastroenteritis producidas por varias
subespecies y la forma septicmica, caracterizada por la bacteremia asociada a lesiones
focales
(Saravia 2008)
. Dentro de las manifestaciones clnicas comunes est la fiebre
acompaada de dolor abdominal, evacuaciones intestinales lquidas frecuentes, de
aspecto verdoso, ftidas, mucoides y en ocasiones con estras de sangre
(Saravia 2008, Report,
1989,1993)
.

2.2.7. Diagnstico
Existe un gran nmero de mtodos diagnsticos diferentes que pueden realizarse para la
determinacin de Salmonella sp., sin embargo, segn la mayor parte de estudios
realizados, el cultivo microbiolgico es la prueba ms comnmente empleada para el
aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El mtodo ideal debe tener
una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rpido y econmico.
Ningn mtodo cumple con todos los criterios y ninguno es ptimo para todas las
condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y
algunas pruebas bioqumicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse tambin en los
nuevos mtodos de diagnstico que estn innovando para el aislamiento de Salmonella
sp. mediante el uso de pruebas serolgicas y moleculares como ELISA y PCR
respectivamente; esta ltima tiene la capacidad de detectar un pequeo nmero de
organismos del gnero Salmonella (10
2
a 10
4
). Estos mtodos arrojan resultados
favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos
(Ward
et al 2005 y Terragno et al 2003)
.
Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio es
variado: se enviar en caso de infeccin intestinal, muestra de heces; en enfermedad
sistmica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estndar
(Biberstein y
Chung Zee, 1990 y Stanchi 2007)
. Adems, es posible determinar la contaminacin de alimentos y
28

agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisin de una muestra al
laboratorio para ser analizada convenientemente
(Stanchi 2007)
; el diagnstico incluye
aislamiento, identificacin bioqumica y serotipificacin de las cepas aisladas
(Stanchi 2007,
Luna 1991)
.

2.2.7.1. Mtodos para el aislamiento de Salmonella sp.
Los mtodos para el aislamiento de la bacteria estn divididos en tres etapas sucesivas
las cuales son: (1) Enriquecimiento No Selectivo, (2) Enriquecimiento Selectivo, (3)
Siembra en Placa con medios slidos selectivos y diferenciales. Posteriormente se lleva
a cabo el estudio de las caractersticas Bioqumicas de las colonias sospechosas en los
medios adecuados para su identificacin, y finalmente el Anlisis Antignico
(Luna, 1991)
.

1) Preenriquecimiento en medio no selectivo: Se utiliza cuando la muestra en
estudio ha sufrido un proceso de desecacin o irradiacin, cuando ha estado
congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento
puede determinar que las bacterias presentes en la muestra se encuentren en un
estado semilatente y tiene como finalidad la revitalizacin de los microorganismos
afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de
almacenamiento, permitiendo que las clulas bacterianas comiencen el proceso de
multiplicacin normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que
puedan llegar a ser txicas para estas bacterias debilitadas, sustancias que si
estn presentes en los medios selectivos de enriquecimiento. Se realiza en caldo
peptonado bufferado o lactosado al 0,2%, para incrementar la recuperacin de
especies de salmonelas deterioradas por tcnicas de elaboracin, preservacin,
preservantes, presin osmtica alta, cambios bruscos de pH, etc.
(Luna 1991; Hurtado 2001)
.

2) Medios de enriquecimiento selectivo: Se realiza en caldos de enriquecimiento,
los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella sp, e
inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre los caldos
mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp. se
encuentran:
x Caldo selenito: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios
para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y el
mecanismo de accin del selenito, es inhibir el crecimiento de bacterias intestinales,
coliformes y Enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de
incubacin. Salmonella sp., Proteus sp., y Pseudomona sp., no son inhibidos
(Merck,
1994).

29

x Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de
salmonelas con excepcin de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros
materiales. Mediante la utilizacin de este caldo, es posible obtener algunas
ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obtenindose un
rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43
o
C y
previo enriquecimiento
(Van Schothorst et al, 2004)
. El medio cuenta con una baja
concentracin de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para
as obtener un mayor porcentaje de recuperacin de Salmonella sp. Adems la
reduccin del pH a 5,2 mejora la selectividad
(Trichopoulos 1972; Iveson 1964)
.
x Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma
coliformes y otras bacterias acompaantes, sin alterar las bacterias reductoras de
tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares
que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia
obligatoria en el intestino
(Palumbo y Alford, 1970)

x Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) segn Hajna: Favorece la
recuperacin de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y
Salmonella sp., pues en su composicin tiene triptona que acta como nutriente en
el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con accin bactericida para organismos
Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos
esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer,
evitando la acidificacin precoz del medio de cultivo a cargo de productos
metablicos cidos. Adicionalmente, la elevada concentracin de manitol sobre la
dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y
Salmonella sp.
(Hurtado, 2001)

Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectar
la recuperacin de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos
serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inculo es pequeo (S.
paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S.
treforest, entre otras)
(Van Schothorst, et al, 1977)
.

3) Medios de cultivo selectivos y diferenciales

Medios de cultivo selectivos: Son aquellos que permiten seleccionar ciertos
microorganismos deteniendo el desarrollo de otros; esto se logra con el agregado
de sustancias inhibidoras como antibiticos, ciertos colorantes, sales biliares, etc.
Los medios EMB (a), MacConkey (b), desoxicolato (c) o CHROMagar Orientacin
(d), permiten detectar con rapidez los microorganismos No fermentadores de
30

lactosa como Salmonella sp. y Shigella sp. El agente inhibidor en estos medios son
sales biliares
(Stanchi, 2007).

a. Agar eosina azul de metileno (EMB), permite demostrar la presencia de
enterobacterias patgenas y propiciar su aislamiento, sin embargo, no es
confirmativo, solo permite una orientacin al diagnstico. El modo de accin del
medio se basa en que sus componentes lactosa y sacarosa permiten diferenciar las
enterobacterias de acuerdo con su capacidad de fermentarlos y por el aspecto y el
color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben notablemente el desarrollo
de grmenes Gram Positivos. Las colonias de Salmonella sp. se observan en el
medio incoloras o con tonalidad ambar
(Bonnie, 2001)
.
b. Agar MacConkey (McK), las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibicin
significativa sobre las bacterias Gram Positivas. La lactosa y el indicador rojo neutro
permiten comprobar la degradacin de ese disacrido; las colonias lactosa positivas
(Escherichia coli) aparecen rojas con halo turbio; las lactosa negativas (Salmonella
spp.) son incoloras
(Stanchi, 2007)
.
c. Agar desoxicolato, es un medio altamente selectivo por ser el desoxicolato sdico
supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivos. Las colonias tpicas de la
Salmonella sp. son pequeas, incoloras, elevadas y opacas; algunas cepas
producen precipitado negro en el centro
(Stanchi, 2007)
.
d. BD BBL
TM
CHROMagar
TM
Orientacion
: Medio de cultivo para el aislamiento e

identificacin de patgenos del tracto urinario. Pemite la identificacin de
Escherichia coli, Enterococcus, grupos KES (Klebsiella - Enterobacter . Serratia) y
PMP (Proteus Morganella - Providencia), Staphylococcus saprophyticus y
Streptococcus agalactiae aunque requiere de pruebas confirmatorias. Algunos de
estos microorganismos producen enzimas para el metabolismo de lactosa,
glucsidos o ambos. Otros organismos no producen ningn tipo de enzima, por
ejemplo E. coli contiene enzimas para el metabolismo de lactosa pero es
glucosidasa negativo; algunos miembros de la familia Enterobacteriacea, como
Salmonella sp. y algunos cocos Gram positivos son glucosidasa positivo pero no
poseen las enzimas para la fermentacin de la lactosa. Adicionalmente, la enzima
triptfano deaminasa es tpicamente encontrada en el grupo PMP.
El medio contiene sustratos cromgenos que pemiten la diferenciacin de los
microorganismos mediante la degradacin de enzimas especificas de cada uno
(Bonnie, 2001; ISO, 2002)
(Anexo N 2).

31

Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioqumicamente las
bacterias por su actividad metablica. Poseen un sustrato, sobre el cual acta o no
la bacteria, y esa actividad se revela por variacin del pH del medio o por alguna
actividad enzimtica que modifica su aspecto. En el proceso de recuperacin de
Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa
en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la
observacin de colonias caractersticas y propias de la bacteria
(Stanchi, 2007)
. Los
medios ms reconocidos para el aislamiento de Salmonella sp. son:

a. Agar Hektoen entrico: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para la
demostracin y aislamiento de bacterias intestinales patgenas, a partir de los ms
diversos materiales tales como heces y alimentos entre otros
(Merck, 1994)
. Las colonias
del gnero Salmonella se desarrollan con produccin de cido sulfhdrico (H
2
S) y un
halo trasparente alrededor dando caractersticas de un ojo de pescado
(Merck,1994 ,
Murray y Shea 2004).
Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para
enterobacterias Hektoen an cuando posee suficiente efecto supresor de la flora
acompaante, ejerce escasa inhibicin de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo
tanto, permite la obtencin de altos rendimientos en estos grmenes
(King y Meztger 1968,
Taylor y Schelhart 1971).
Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina cida, las colonias
lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromtica frente a las colonias
lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan
lentamente la lactosa y ms fcilmente la sacarosa y la salicina, sustancias
reaccionantes fcilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patgenos
falsamente positivos. La combinacin de tiosulfato, como sustancia reaccionante y
una sal de hierro como indicador, da una coloracin negra a las colonias H
2
S
positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompaante
(Merck,1994, Murray y
Shea 2004)
.

b. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): Medio para el aislamiento y

diferenciacin de
enterobactericeas patgenas, especialmente especies de Shigella sp. y
Salmonella sp. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es dbil; el desoxicolato
genera la inhibicin de bacterias coliformes y permite la dispersin de cepas de
Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonella;
adicionalmente, la diferenciacin entre Salmonella sp. y Shigella sp. se da porque la
primera produce fermentacin de Xilosa, descarboxilacin de Lisina y genera cido
sulfhdrico
(Hurtado, 2001)
. La forma de accin del medio se basa en que la degradacin
a cido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje del medio a amarillo, por
32

el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formacin de
cido sulfhdrico por la precipitacin de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las
bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo
purpreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias
(Merck,1994, Murray y Shea
2004)
.

Varias de estas reacciones pueden presentarse simultneamente o
suscesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de
pH, a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubacin ms
prolongada. Las colonias de Salmonella sp. se observan con pigmentacin rosa o
roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras
(Murray y Shea 2004)
. Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes y del
mismo color que el medio de cultivo. Este gnero bacteriano al no fermentar la
xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol; como
tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo prpura alrededor de las
colonias, al no haberse producido cadaverina
.

c. Agar Salmonella Shigella (SS): Es un medio selectivo y diferencial. La

selectividad est dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de coliformes y el desarrollo
invasor del Proteus sp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa y la
formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella sp,
desarrolla colonias traslcidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a
causa de la produccin de cido sulfhdrico
(Meljem, 1995, Murray y Shea 2004)
.
)
. Las colonias
sospechosas de Shigella son transparentes, translcidas u opacas y suelen ser lisas
.

d. Agar verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo y diferencial para
el aislamiento de enterobacterias patgenas como Salmonella sp. a excepcin de
S. enterica serovar typhi y paratyphi A. En el medio la pluripeptona y el extracto de
levadura, constituyen la fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la
sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el indicador
de pH, que vira a amarillo cuando hay produccin de acido a partir de la
fermentacin de azcares; el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el
verde brillante acta como agente selectivo. Las colonias de Salmonella sp. se
observan con coloracin rosa, blanca o transparente sobre un fondo rojo
(Murray y Shea,
2004)

e. Agar bismuto sulfito: Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e
identificacin de Salmonella enterica serovar typhi y otras bacterias entricas. El
medio contiene peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato
frrico y sulfito bismuto que acta como inhibidor de la mayora de organismos
33

comensales. Las colonias tpicas de Salmonella sp. pueden ser caf, gris o negras
con o sin brillo metlico, generalmente el medio circundante (halo) es caf que
posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la
formacin del halo oscuro
.
f. AGAR XLT4
(DIFCO
tm
)
:

Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para el
aislamiento e identificacin de microorganismos del gnero Salmonella excepto S.
enterica serovar typhi
(Dush y Altwegg, 1955)
. El medio contiene peptona como fuente de
nitrgeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la
diferenciacin de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la
fermentacin de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilacin de la lisina y la
produccin de sulfuro de hidrgeno, la cual es detectada por la adicin de iones
frricos. Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente de
sulfuro inorgnico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico del medio y el
rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las
reacciones de fermentacin y decarboxilacin. Al medio base, es adicionado
suplemento de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos
diferentes a la Salmonella sp. Las colonias tpicas de la bacteria (H
2
S positivas),
aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro despus de 18 24
horas de incubacin. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de
pigmento negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, con
centro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H
2
S negativas, aparecen
de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayora de las colonias de Citrobacter
sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento. El
crecimiento de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus, Pseudomona,
Providencia, Alteromonas putrefaciens, Yersinia enterocolitica y Acinetobacter
calcoaceticus est completamente inhibido, mientras que las especies de Shigella
son parcialmente inhibidas; las colonias que aparecen son de tonalidad roja
(Becton
Dickinson).

g. BD BBL
TM
CHROMagar
TM
Salmonella
: Es un medio selectivo y diferencial para el

aislamiento e identificacin presuntiva de especies de Salmonella sp, permitiendo la
diferenciacin de la enterobacteria de la flora acompaante dada la presencia de
sustratos cromgenos en el medio. Los organismos Gram positivos son inhibidos
como resultado de un medio base selectivo; adicionalmente cuenta con un agente
antifngico que previene el crecimiento de especies de Candida; otros agentes
antimicrobianos presentes en el medio de cultivo inhiben el crecimiento de Gram
negativos, microorganismos no fermentadores de lactosa y especies de Proteus.
Debido a diferencias metablicas en la presencia de cromgenos seleccionados, las
34

colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa prpura, mientras que los
microorganismos pertenecientes a otros gneros se observan con pigmento verde
azulado, son completamente inhibidos
(Gaillot, et al; 1999)

2.2.7.2. Identificacin bioqumica
Los microorganismos para crecer requieren de polimerizacin de protenas, cidos
nuclicos, polisacridos y lpidos; estos elementos deben encontrarse preformados en el
medio donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la propia
clula. Para realizar el metabolismo se requiere adems la maquinaria biosinttica para
transformar los substratos en materiales bsicos o compuestos utilizables para la clula,
y la energa para realizar las reacciones qumicas
(Escobar, 2004)
.
En la identificacin final de Salmonella sp. las colonias sospechosas observadas en el
medio de cultivo diferencial se someten a pruebas de reaccin bioqumica con el fin
confirmar la presencia de la bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un
conjunto de pruebas que incluyen produccin de indol, rojo de metilo, Voges- Proskauer,
Citrato, TSI, hidrlisis de la urea, deaminacin de la fenilalanina, decarboxilacin de
lisina, arginina y ornitina, motilidad, hidrlisis de gelatina, utilizacin de malonato,
fermentacin de glucosa con produccin de acido y gas, fermentacin de lactosa,
sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa,
maltosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, eritritol, hidrolisis de esculina, fermentacin de
melibiosa, de arabitol, de glicerol, utilizacin de acetato, lipasa, ADNasa, transformacin
nitrato-nitrito, oxidasa y fermentacin de manosa
(Farmer, 2003, Forbes et al, 1998)
. (Tabla 1).

Tabla N 1. Propiedades Bioqumicas Diferenciales de las Subespecies de Salmonella sp.
Fuente: Instituto Nacional de Salud. 2003.

d
d

d
35

2.2.7.2.1. Diagnstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp.

A. Pruebas bioqumicas: En la tabla N 2 es posible observar las reacciones
producidas en la batera de bioqumicas utilizada normalmente para la identificacin de
enterobacterias pertenecientes al gnero Salmonella
(Koneman y Allen, 1999)
, la cual consta de
las pruebas descritas a continuacin:

TSI (triple azcar hierro): es un agar diferencial basado en la fermentacin de azcares y
la produccin de H
2
S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y lactosa; estas ltimas en una
concentracin 10 veces mayor a la glucosa. El indicador de pH es el rojo de fenol, el cual
vira a amarillo por formacin de cido a partir del carbohidrato, el sulfato ferroso es un
detector de la produccin de cido sulfhdrico. Por lo general Salmonella sp. da como
resultado de esta prueba una reaccin alcalina/acido con produccin de H
2
S que se
evidencia por el fondo negro del tubo (K/A H
2
S
++
); en ocasiones, como resultado de la
fermentacin de glucosa tambin hay produccin de gas
(Instituto Nacional de Salud, 2003, MacFaddin,
2000)
.

LIA (agar lisina hierro): El fundamento de esta prueba es que los procesos de
decarboxilacin y deaminacin en el medio de cultivo tienen lugar con la previa
fermentacin del carbohidrato que contiene el medio (glucosa) y la acidez producida por
esta reaccin, si el microorganismo posee las descarboxilasas necesarias, se produce la
decarboxilacin liberndose como producto final las aminas que alcalinizan el medio de
cultivo, por otro lado si el microorganismo posee las deaminasas se efecta la
deaminacin y el producto final son cidos orgnicos que acidifican el medio de cultivo.
Salmonella sp. por lo general da como resultado tendido prpura y fondo prpura, (K/K),
con produccin de H
2
S y gas, es decir, posee la enzima lisina-decarboxilasa
(Instituto Nacional
de Salud, 2003)
.

Utilizacin del citrato: El principio de esta prueba es determinar la capacidad de los
organismos para usar el citrato de sodio como fuente de carbono para el metabolismo y
el crecimiento. El medio contiene fosfato sdico de amonio, fosfato de monopotasio,
sulfato de magnesio, citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. Si el
carbono del citrato de sodio es utilizado, el nitrgeno tambin es extrado del fosfato de
amonio contenido en el medio, liberando amonio, lo cual alcaliniza el medio que vira de
verde a azul. Salmonella sp. por lo general utiliza el citrato como fuente de carbono, por
lo cual se produce una variacin en el color del medio
(Koneman et al, 1997; Farmer, 2003)
.

36

Produccin de indol: Esta prueba se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio
est en capacidad de desdoblar el indol de la molcula de triptfano; el indol es uno de
los componentes de la degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias
que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con
produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. La prueba se basa en la formacin de un
complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-
dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y
Ehrlich, utilizados para la identificacin de produccin de indol por parte de los
microorganismos. Salmonella sp. no tiene la capacidad de generar el indol por lo cual no
se presenta ninguna reaccin en el medio
(MacFaddin 2000)
.

Prueba de motilidad: Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. La
movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos que se
encuentran principalmente entre los bacilos, aunque algunas formas de cocos son
mviles. Esta prueba es llevada a cabo en un medio de cultivo semislido (SIM), donde
a su vez es evaluada la produccin de indol y de cido sulfhdrico por los
microorganismos. Las bacterias mviles producirn un enturbiamiento homogneo del
medio debido a la distribucin aleatoria de los microorganismos. Por el contrario las
bacterias inmviles permanecern en la misma picadura donde se sembraron
(MacFaddin,
2000)
. La mayora de las salmonelas son motiles a excepcin de S. pullorum y S.
gallinarum, huspedes especficas de aves, responsables adems de las enfermedades
pulorosis y tifoidea aviar respectivamente
(Infante et al, 1991)
.

Hidrlisis de urea: La urea es un compuesto orgnico nitrogenado que es transformado
por algunos microorganismos, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de
esta actividad microbiana, el nitrgeno es liberado en forma inorgnica como molculas
de amoniaco. Cuando esta reaccin ocurre, el medio de cultivo se alcaliniza y el
indicador de pH permite percibir visualmente el cambio de coloracin en el medio debido
a la acidificacin producida en el mismo. Salmonella sp.no tiene la capacidad de
hidrolizar la urea, por lo tanto la prueba es negativa. Esta prueba se considera vital en la
diferenciacin bioqumica entre Salmonella sp. y Proteus sp.
(MacFaddin, 2000)
.

37

Tabla N 2. Resultados de las pruebas bioqumicas clave para la identificacin de
microorganismos pertenecientes al gnero Salmonella sp. Fuente: Manual de pruebas
bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica (MacFaddin 2000)
PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO PARA Salmonella sp.
TSI K/A H
2
S
++
LIA K/K H
2
S
++

UREA -
MOTILIDAD +
INDOL -
CITRATO +

B. Sistemas BBL Crystal de identificacin (Patgenos entricos/No fermentantes)
:

El sistema de identificacin BBL Crystal de bacterias entricas/no fermentadoras (E/NF)

sirve para lel reconocimiento de bacterias gram negativas que pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae as como tambin de los bacilos Gram negativos fermentadores y
no fermentadores de glucosa aislados con ms frecuencia
(Muytjens et al, 1984)
.
Los anlisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF
estn basados en la utilizacin y

degradacin de sustratos especficos por parte de los microorganismos detectados por
distintos sistemas indicadores. Las reacciones de fermentacin detectan la capacidad de
un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxgeno atmosfrico, y las
reacciones de oxidacin estn basadas en la capacidad de un organismo para
metabolizar el sustrato siendo el oxgeno el aceptor final de electrones, ambas
reacciones se detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el
sustrato del anlisis
(Murray et al, 1999)
. Los sustratos cromgenos al sufrir hidrlisis producen
cambios de color que pueden ser detectados visualmente. Adems, existen otros anlisis
que detectan la capacidad de un organismo para hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de
otro modo un sustrato en el sistema BBL Crystal

(Manafi et al, 1991).
(Anexo N 3)

2.2.7.3. Serotipificacin
La serotipificacin constituye un importante complemento de la identificacin bioqumica
y desde el punto de vista epidemiolgico permite determinar la prevalencia de una
serovariedad en distintas zonas geogrficas, tambin es de utilidad para el estudio de
brotes y para conocer la fuente de infeccin y las vas de transmisin
.
Desde el punto de vista gentico, el gnero Salmonella sp. constituye una sola especie
siendo el grupo ms complejo de la familia Enterobacteriaceae
(Biberstein y Chung Zee, 1990;
Crawford et al, 1971)
dado que los representantes del gnero Salmonella sp. han sido objeto de
38

sucesivas modificaciones, a travs de los aos, en lo que respecta a su nomenclatura y
taxonoma. Sin embargo, todava siguen vigentes las ideas desarrolladas por Edwards y
Ewing, en la dcada del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del
gnero Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae
(Stanchi, 2007)
.

Las tcnicas serolgicas son comnmente empleadas para identificar cultivos
desconocidos con sueros conocidos
(Smith et al.1952)
; Salmonella sp. est serotipificada de
acuerdo a sus antgenos somticos de superficie (LPS, antgenos O), antgenos
flagelares (protenas, antgenos H) y antgeno capsular (Vi)
. Los antgenos
se identifican con anticuerpos monovalentes y polivalentes disponibles comercialmente,
mediante pruebas de aglutinacin en lmina. Para identificar los antgenos O, se hace
una prueba con antisueros contra los grupos del O1 (A) al O67, luego se prueba el
antisuero Vi para antgeno capsular, y por ltimo se incluyen los antisueros contra los
antgenos flagelares H
(Farmer 2003, Brooks et al., 2000, Forbes et al., 1998, Jawetz et al .2005, Smith et al.1952)
.

En el gnero Salmonella existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la
mayora de las salmonelas no producen cpsula
(Hirsh 2006)
. La constitucin antignica de
la fraccin polisacardica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie;
asmismo, la clase y el nmero de azcares junto con los enlaces existentes entre los
mismos, definen los determinantes antignicos que contienen los antgenos O de un
determinado aislamiento; dichos antgenos O, junto con los determinantes antignicos
existentes en la superficie de los flagelos (antgenos H), que poseen la mayora de las
salmonelas, contribuyen, desde el punto de vista serolgico, a definir como especie un
determinado aislamiento. Este esquema de clasificacin se le denomina de Kauffmann-
White

2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann White
La identificacin de los serotipos sobre la combinacin antignica est dada en el
Esquema de Kauffmann-White, publicado por el Centro Colaborador de la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS) de Referencia e Investigacin de Salmonella
del Instituto Pasteur en Paris el cual agrupa todas las serovariedades de Salmonella sp.
conocidas
(Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; 2007)
(Anexo N 4). Ambos investigadores disearon
su clasificacin considerando ciertas determinantes antignicas presentes en el AgO,
que determinan la existencia de grupos o serogrupos -de la A a la I- y a los antgenos
flagelares en fase 1, que hoy en da establecen el serotipo
(Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill;
2007)
.
39

Este esquema plantea las diferencias mediante la identificacin de los antgenos de
superficie que se producen en la bacteria. La especificidad del factor O (somtico) de
Salmonella sp. se determina por la composicin y la estructura de la cadena polisacrida
O del lipopolisacrido. Al antgeno O, se lo designa con nmeros; Salmonella sp. se
clasifica en serogrupos que surgen del antgeno somtico O; a estos grupos se los
designa con letras maysculas, por ejemplo, A, B, C
1
, C
2
, D
1
, D
2
, E
1
, E
2
, etc.
(Basualdo et
al.,1996)
. El antgeno flagelar representado por letras minsculas y nmeros, caracteriza a
los serotipos dentro de cada grupo, rara vez se hace referencia al antgeno Vi que es
asociado a la cpsula bacteriana.

2.2.8. Sensibilidad frente a agentes antimicrobianos
Los agentes antimicrobianos evalan las diferencias de estructura o de funcin
bioqumica existentes entre el hospedador y el parsito
.
Durante los ltimos 25 aos, la investigacin quimioteraputica se ha centrado
fundamentalmente alrededor de las sustancias antibacteriales de origen microbiano
llamadas antibiticos
(Jawetz et al., 2005)
; los cuales son compuestos qumicos producidos por
microorganismos, que inhiben o matan otros microorganismos
(Escobar, 2004)
. Sin embargo,
es de tener presente que ningn agente qumico antimicrobiano tiene la capacidad para
actuar eficazmente sobre todo tipo de microorganismos, debido a la diferente actividad
del qumico y las variadas caractersticas de sensibilidad y resistencia que presenta cada
bacteria, ante la sustancia
(Escobar, 2004)
. La selectividad se explica por las diferencias
estructurales y bioqumicas entre las clulas eucariotas y procariotas
(Gentilini 2007)
; lo cual
ofrece mayor oportunidad para que, en comparacin con los agentes antifngicos, los
agentes antibacterianos manifiesten su toxicidad selectiva ya que las clulas fngicas, al
igual que en mamferos, son eucariotas
(Prescott 1988)
.

Los mecanismos de accin de los agentes antimicrobianos se encuadran en cuatro tipos;
(1) Inhibicin de la Sntesis de Pared, (2) Alteracin de la funcin de la Membrana
celular, (3) Inhibicin de la Sntesis o de la Funcin del cido Nuclico y (4), Inhibicin de
la Sntesis de Protenas
(Prescott, 1988)
. Sin embargo, el antibitico ideal empleado con fin
teraputicos, debe reunir una serie de condiciones.

a. Tener una toxicidad selectiva para el agente infeccioso, lo que implica escasa o
nula toxicidad para las clulas del husped y alta para el patgeno.
b. Penetrar en los tejidos y las clulas del organismo para ejercer su accin sobre
el agente infeccioso.
40

c. Alcanzar la concentracin adecuada para ejercer su efecto en el foco de la
infeccin y que se excrete lentamente.
d. Poseer una accin ms bactericida que bacteriosttica. Los agentes bactericidas
matan a los microorganismos, y los bacteriostticos inhiben el desarrollo,
interviniendo los mecanismos de defensa del husped en la erradicacin final de
la infeccin.
e. No alterar los mecanismos de defensa naturales del hospedador (fagocitosis,
produccin de anticuerpos, entre otros).
f. No generar aparicin rpida de resistencia.
g. Poseer un amplio espectro de accin sobre los microorganismos que con mayor
frecuencia se aslan.
h. Permanecer activo en presencia de plasma, lquidos corporales, exudados.
i. Poseer actividad antibacteriana in vitro.
j. Ser estable para garantizar un periodo razonable de almacenamiento.
k. Ser econmicamente accesibles.
l. No producir efectos colaterales indeseables en el husped
(Stanchi, 2007).

2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos.
El desarrollo de cepas resistentes hace necesaria la determinacin de la susceptibilidad
a los antimicrobianos de aislamientos provenientes de muestras biolgicas. Esta se lleva
a cabo mediante pruebas in vitro de susceptibilidad, que permiten seleccionar los
quimioteraputicos segn la sensibilidad demostrada por el microorganismo causal
(Gentinili et al, 2002)
.
Los mtodos empleados, son entre otros, la difusin con monodiscos de antibiticos,
mtodo estandarizado por Kirby-Bauer, en el cual se emplea el agar Mueller Hinton,
nico medio validado por el NCCLS (Comit Nacional para la Normatizacin de
Laboratorios Clnicos) para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, dado que existen
suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad
realizadas en este medio
(NCCLS, 1996)
. Otro mtodo realizado en laboratorio es la
determinacin de la concentracin mnima inhibitoria del antibitico (CMI), el cual se
realiza mediante la tcnica de dilucin en tubo, donde se preparan una serie de tubos
con medio de cultivo, cada uno a una concentracin diferente de antibiticos sembrados
con el microorganismo. Despus de la incubacin, se observa la mnima concentracin
de antibitico que inhibe el crecimiento del microorganismo
(Escobar 2004 y Stanchi 2007)
. Estas
pruebas estn cuidadosamente estandarizadas con el objeto de mejorar el valor
predictivo clnico de los resultados. Desde 1958, el Comit Nacional de Estandarizacin
de Laboratorios Clnicos (NCCLS) estableci un Subcomit de Pruebas de
41

Susceptibilidad Antimicrobiana Veterinaria (VAST). Gracias al desarrollo de NCCLS-
VAST, se estn generando los criterios interpretativos de los agentes antimicrobianos
veterinarios especficos con el empleo de aislamientos animales
(Stanchi 2007, Gentilini 2007).

2.2.8.2. Prueba de sensibilidad a los antimicrobianos
Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a
infecciones cuando su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificacin. La
determinacin de la sensibilidad est indicada en los casos en que el microorganismo
causal de la infeccin pertenezca a una especie capaz de exhibir resistencia a los
antibiticos de uso clnico. Los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos
incluyen: produccin de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de accin y
modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas
(Pasteran et al.,2003)
.
Para realizar pruebas de sensibilidad e identificacin se debe partir de un cultivo primario
en medio slido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de microorganismo
que pueda tener rol patgeno. No es aconsejable la realizacin de pruebas de
sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infeccin y la muestra contiene flora
normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados probablemente
tengan poca relacin con el proceso infeccioso, ya que en estos casos los resultados
obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento
.

2.2.8.2.1. Principios del mtodo de difusin en agar (Kirby Bauer)

El principio del mtodo involucra la aplicacin de una cantidad determinada de
antimicrobiano en un reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino,
etc.) en la superficie del agar sobre la cual se ha distribuido un inoculo del
microorganismo en cuestin; se formar as, por difusin, un gradiente de concentracin
de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad del microorganismo estar
indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento bacteriano. El dimetro
obtenido depender no slo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco,
sino tambin del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composicin, de la
capacidad de difusin de la droga en ese medio, de la temperatura y atmsfera de
incubacin, de la velocidad de duplicacin bacteriana, del tamao del inoculo y la fase de
crecimiento de la bacteria, etc, todas estas son las variables ms importantes que
afectan el resultado del antibiograma
(Pasteran, et al. 2003)
.
Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusin del antibitico que
contiene comienza instantneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de
concentraciones alrededor del reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a
las 6 hs. El tamao de la zona de inhibicin depender del equilibrio entre la difusin del
42

antibitico y la velocidad de crecimiento del microorganismo. Las recomendaciones del
NCCLS son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de inoculada la placa y proceder
a la incubacin de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la colocacin de los
discos. Cualquier variacin en estos tiempos ocasionar un desplazamiento del equilibrio
antes mencionado que se traduce en errores en el tamao de la zona de inhibicin.
Como la difusin del disco comienza instantneamente despus de apoyado sobre el
agar, estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque
seguramente ya no tendrn la carga de antibitico original
.

2.2.8.2.2. Interpretacin de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos por el mtodo de difusin en agar
Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones crticas" o "puntos de corte"
que permiten separar a los microorganismos en tres categoras, sensibles, resistentes o
de sensibilidad intermedia (Anexo N 5). Estas categoras se establecen para cada
bacteria frente a cada antibitico comparando la CMI en cada caso con los puntos de
corte establecidos
.
Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibitico cuando se
puede esperar que una infeccin causada por el mismo responda al tratamiento
con dicho frmaco a la dosis recomendada.
Resistente: este trmino indica que no es probable que la infeccin causada por
el microorganismo responda al antibitico en cuestin, cualesquiera que sean la
dosis y la localizacin de la infeccin.
Sensibilidad Intermedia: Esta categora se aplica a dos situaciones. Por un lado,
se incluyen en ella las cepas con sensibilidad disminuida a un antibitico que
puede utilizarse con xito, para el tratamiento en dosis ms altas, por ser poco
txico o porque se concentra en el foco de infeccin (por ejemplo, antibiticos -
lactmicos o quinolonas en la orina). En esta categora se incluyen asimismo las
cepas de "sensibilidad intermedia" a antibiticos que, por ser ms txicos, no
puede usarse en dosis ms altas. En este caso, la categora intermedia sirve
como una zona de transicin entre las cepas sensibles y las resistentes y
previene pequeos errores causados por factores tcnicos. Muchas veces un
resultado intermedio requiere la definicin de la sensibilidad mediante el uso de
un mtodo cuantitativo como la CMI
(Escobar, 2004)
.

2.2.8.2.3. Seleccin de los agentes antimicrobianos
Para la seleccin de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se
deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clnica, prevalencia de
43

resistencia, costo, indicaciones del FDA (Administracin de alimentos y Frmacos),
recomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativos
(Pasteran et
al.,2003)
. Entre los antibiticos con actividad frente a Salmonella sp. se encuentran:

Aminopenicilinas (Ampicilina).
Cloranfenicol (slo para aislamientos de infeccin sistmica).
Tetraciclinas (Tetraciclina)
Trimetoprim/sulfametoxazol
Fosfomicina
Nitrofuranos
Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)
Cefalosporinas de tercera generacin (cefotaxima/ceftriaxona solo para
aislamientos de infeccin sistmica)

2.3. El gnero Salmonella asociado a los reptiles
En general, la clase Reptilia, consta de ms de 6000 especies que incluyen serpientes,
lagartos, tortugas y cocodrilos, muchos estn clasificados por la UICN (Unin
Internacional para la Conservacin de la Naturaleza) dentro de las categoras de
amenaza, por enfrentar un alto riesgo de extincin, principalmente a causa de
actividades antrpicas, y hoy en da se estn viendo afectados por microorganismos
patgenos que los han llevado a un estado mximo de riesgo
(Chatfield, et al 2007)
.

La herpetofauna (particularmente reptiles), ha estado frecuentemente relacionada con
casos de enfermedades asociadas a salmonelosis, por lo cual se reconoce que estas
especies son una va directa de transmisin de Salmonella sp. a los seres humanos
(Center
for Disease Control and Prevention -CDC- 1999)
; esta bacteria se considera de carcter zoontico, por
generar cuadros patolgicos de gran importancia en salud pblica
(Selbitz et al, 1995; Turnbull
1979)
de esta manera, los reservorios animales tienen un importante papel en la
determinacin de los factores epidemiolgicos de la infeccin
(Turnbull 1979)
.

Numerosos investigadores han reportado el aislamiento de Salmonella sp. a partir de los
excrementos de reptiles tales como las tortugas y cocodrilos en varias partes del mundo

(Bovre y Sandbu, 1959, Cohen et al, 1980, Chiodini y Sundberg, 1981, Shane et al, 1990. Woodward et al, 1997. Passmans et al, 2000)
y se ha establecido que el hbitat natural de los miembros del gnero Salmonella es el
intestino de vertebrados de sangre caliente y sangre fra; siendo posteriormente
dispersados en el ambiente, donde a su vez pueden sobrevivir y multiplicarse
(Cohen, et al
1980)
. En los reptiles, Salmonella sp. es un microorganismo natural de la flora intestinal,
44

sin embargo, estos animales son catalogados como portadores asintomticos de la
bacteria
(Chiodini y Sulberg, 1981; Millan et al, 1997,; Mitchel y Shane, 2000; Abalem de S y Sorari, 2001; Geue y Lschner, 2002;
Corrente et al, 2004; Mermin et al, 2004)
, ya que segn estudios realizados, sta se ha encontrado en
90% o ms de la poblacin de reptiles evaluada
(Chiodini y Suldberg, 1981, Woodward et al, 1997)
, pero
son relativamente pocos los reportes de cuadros patolgicos en estas especies silvestres
(Boever y Williams, 1975; Isaza et al, 2000; Oros et al, 1996; Oros et al, 1997)
.

El primer reporte de aislamiento de Salmonella sp. en reptiles aparece en 1930 en
Indiana County, a partir del excremento de iguanas y desde este momento, se han
realizado numerosos estudios que determinan la presencia de la enterobacteria
Salmonella sp. en estas especies, adems del hallazgo de microorganismos como
Arizona sp. Citrobacter sp., y Edwarsiella sp. a partir de animales silvestres y en
cautiverio
(Jackson, et al, 1969; Jackson y Jackson, 1971., Kennedy, 1973., Mann y Bjotvedt, 1967, McNeil y Hinshaw, 1946,
Nasasai et al, 2005., Vadillo, et al, 2002)
, lo cual ha aumentado el inters de investigacin, por
representar grandes relaciones con la enfermedad diarreica aguda (EDA), puesto que
segn las estadsticas, para el ao 2000 (de acuerdo con un estudio realizado a partir de
muestras de aves y humanos) se present en el pas una tasa superior a los 1500 casos
de EDA por cada 100.000 habitantes, siendo aproximadamente el 50% de los casos,
relacionados con enterobacterias de los gneros Salmonella sp. y Shigella sp.
(Jimenez y
Mayorga, 2000)
.

Dado que la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de los animales, la ruta de
infeccin puede ser por contacto directo con las heces del animal o indirectamente con la
piel contaminada con el excremento
(Mahajan et al., 2003 y Minette 1984)
. En los reptiles, la
transmisin puede darse perinatalmente, por ingestin de presas contaminadas o por
contacto directo con la materia fecal de otros reptiles; las altas tasas de ejemplares
portadores de Salmonella sp. se relacionan con el comportamiento de coprofagia por
parte de las crias, lo que asegura la transmisin prematura de dichos microorganismos
(Mader 1996; Schrter et al. 2004)
.

El primer riesgo real de contraer la enfermedad es para nios menores de 5 aos y
personas inmunosuprimidas donde las septicemias por especies prevalentes de
Salmonella sp. se observan cada vez con mayor frecuencia. En segunda instancia, slo
de 3 a 5% de los casos de salmonelosis son a causa de los reptiles; sin embargo, el
95% de estos casos estn asociados con animales mantenidos en cautiverio como
mascotas, lo cual hace que desde 1975 se consideren los reptiles como importante va
45

de transmisin de Salmonella sp. dado el gran incremento de la adopcin de estos
animales como mascotas
(CDC, 1999: Schrter et al, 2004)
.

Los caimanes (Orden Crocodylia) y tortugas (Orden Testudinata) son reservorios de
enterobacterias como Salmonella sp. y son ampliamente reconocidos como fuentes de
transmisin del microorganismo hacia los humanos demostrando su papel zoontico
(Ebani
et al, 2005)

En todas sus fases de desarrollo, las tortugas, como consecuencia de su amplia
distribucin geogrfica, sus hbitos y caractersticas biolgicas, son altamente
vulnerables a la depredacin natural, captura comercial, saqueo de nidos, matanza de
hembras anidadoras, comercio ilcito de subproductos de tortugas y prdida del hbitat
entre otras, lo que ha disminuido la poblacin de manera crtica
(Bayley y Scott,1882; Boede y
Hernandez, 2004)
.

Adicionalmente, existen otros factores que afectan de manera negativa las especies
silvestres anteriormente mencionadas al estar implicados en la disminucin de la
poblacin a causa de alteraciones fsicas y/o patolgicas que se pueden presentar.
Centros de cra, proteccin y preservacin de la fauna silvestre (como la Estacin de
Biologa Tropical Roberto Franco) han dado a conocer las principales afecciones que
pueden presentarse en este tipo de animales siendo entre otras: dao renal por exceso
en la ingesta de protenas; fracturas de huesos mandibulares y maxilares por golpes en
peleas territoriales, mordeduras cuando toman el alimento y errores en la manipulacin
al ser capturados, alteraciones a nivel ocular, posiblemente por aguas contaminadas con
desinfectantes como hipoclorito, entre otras
(Rodrguez y Ramrez 2000)
.

Existen numerosos reportes de infecciones por Salmonella sp. en animales
poiquilotermos, y las condiciones para que se presente enfermedad en estas especies,
estn sujetas a la inmunosupresin debida al estrs por cautiverio, variacin en las
temperaturas medioambientales, nmero de microorganismos presentes, edad y estado
nutricional del animal
(Pasmans et al, 2002; Bumler et al, 1998; Blanc et al, 1960; Cambre et al.1980, Dimow, 1996.)

Generalmente se presentan cuadros en el tracto gastrointestinal, aunque las condiciones
asociadas a salmonelosis en los reptiles incluyen gastroenteritis, meningitis,
osteomielitis, peritonitis, pleuritis (Figura N1) y bacteremia (Figura N 2)
(Mahajan et al., 2003 y
Minette 1984)
; se ha reportado que en reptiles, la invasin de las clulas del epitelio intestinal
y subsecuente colonizacin de los rganos internos parece no ser necesaria para el
establecimiento de una infeccin por Salmonella sp.
(Pasmans et al, 2002)
. Aunque los reptiles
46

son portadores asintomticos y por consiguiente los casos clnicos de salmonelosis son
reportados con menor frecuencia, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos
niveles de mortalidad en serpientes y tortugas
(CDC 1999, Chatfield et al, 2007; Durango et al, 2004; Muoz et
al, 2000; Muoz et al, 2002, Ramsay et al, 2002)
.

Figura N 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia. Fuente: Shotts, (2001)

Figura N 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudines. Fuente: Shotts, (2001)

Las infecciones por Salmonella sp. son comunes tanto en animales homotrmicos como
en poiquilotermos entre los cuales existen diferencias significativas en el curso de la
infeccin. Mientras que en aves y mamferos las patologas son causadas por serotipos
de Salmonella entrica subespecie entrica, un gran nmero de serotipos de Salmonella
sp. han sido reportados asociados a los reptiles; entre ellos se incluye S. enterica
subsp. enterica, S. bongori, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S.
enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. Indica
(Pignato et
al, 1998)
; siendo todas las especies causantes de infecciones persistentes pero sin producir
signos de salmonelosis clnica en la mayora de los casos
(Zwart et al, 1970; Greenberd y Sechter, 1992)
.
Sin embargo, en Colombia no se han desarrollado investigaciones especficas de
aislamiento e identificacin de salmonelas en reptiles y tan solo se ha reportado su
47

importancia zoontica con respecto al mantenimiento como especies silvestres en
cautiverio en calidad de mascotas o por medio de su comercializacin
(Hernandez 2004)
.

2.4. ESPECIES EN ESTUDIO

2.4.1. Caimn del Orinoco
El caimn llanero, cocodrilo del Orinoco Crocodylus intermedius (Figura N 3), es
nativo de la regin Orinoqua Colombo-Venezolana, es uno de los cocodrilos de mayor
tamao de Amrica y actualmente se encuentra catalogado como una de las principales
especies de reptiles en peligro de extincin en el mundo, debido a que la
sobreexplotacin para el comercio de las pieles entre los aos 1930 a 1960, diezm las
poblaciones silvestres y su recuperacin no ha sido evidente desde ese tiempo
(Ross, 1998)
.
En Colombia, segn Medem (1981), el cocodrilo del Orinoco ocupaba un rea de
253.530 Km
2
, entre los ros Arauca al Oriente y Guayabero Guaviare al occidente, el
lmite occidental lo forma el rio Duda, tributario del Alto Guayabero. Censos realizados
por diferentes investigadores
(Ardila et al, 1998, Ardila et al, 1999, Barahona et al., 1996a, Barahona et al., 1996b)

reportan que existen menos de 100 individuos distribuidos de forma natural. Todas estas
investigaciones le permitieron al gobierno nacional declararla en peligro de extincin;
actualmente la especie se encuentra protegida por un marco normativo a nivel nacional e
internacional. Rodrguez y Ramrez (2002) en el Libro Rojo de Reptiles de Colombia,
catalogan la especie en categora global CR (peligro crtico), como una poblacin
pequea y en disminucin con menos de 250 individuos maduros, con una rpida
reduccin en su tamao poblacional en extensin de presencia o rea de ocupacin
(Bejarano, 2001; Ramrez y Burbano, 2002)
. Tras la veda de la caza comercial las principales amenazas
para C. intermedius las constituyen: la fragmentacin de las poblaciones, la prdida de
hbitat, la caza que para protegerse de los animales ejercen los lugareos y, finalmente,
el asalto de los nidos para consumo humano de los huevos o para el comercio ilegal de
las cras
(Ardila et al, 1999, Lugo, 1995)
. Adems, segn Boede y Sogbe (2000), la especie es
afectada por las siguientes enfermedades en individuos mantenidos en cautiverio en
zoocriaderos: anomalas congnitas e intoxicaciones en neonatos, avitaminosis por
deficiencias nutricionales, escoliosis, osteodistrofia, infecciones bacterianas, micticas,
virales, parasitismo, traumatismos y estados de shock en cras y juveniles, traumatismos
e hiperparasitoidismo nutricional secundario en adultos. En ocasiones se ha visto que
por ingesta de trozos de caucho y telas, se han producido muertes por ahogamiento.

48

Figura N 3. Caiman del Orinoco o Caiman Llanero (C. intermedius)

2.4.2. Testudinos
Colombia con sus 25 especies de tortugas continentales, dentro de las que se
encuentran las tortugas acuticas, semiacuticas y terrestres (Figura N 4), constituye
uno de los pases ms ricos en Testudinata de la Regin Neotropical, ya que posee casi
la mitad de las 53 especies de tortugas de la regin
(Ceballos, 2000)
. Sin embargo, la situacin
de estas tortugas es altamente preocupante dado que al menos 14 especies enfrentan
un alto riesgo de extincin y se encuentran incluidas dentro de las categoras de
amenaza de la Unin Internacional para la Conservacin de la Naturaleza (2000) debido
a la sobreexplotacin de manera intensiva, degradacin de hbitats a tal punto que
muchas de ellas han desaparecido en vastos sectores de distribucin natural o se hallan
confinadas en hbitats incapaces de sustentar poblaciones saludables
(Boyer y Boyer, 1996).
Durante muchos aos las especies de tortugas continentales han sufrido una fuerte
disminucin en sus poblaciones por varias causas, principalmente antrpicas: consumo
de huevos y carne, uso del caparazn para la fabricacin de artesanas, captura
accidental en redes de pesca y palangres, contaminacin y destruccin del hbitat de
alimentacin y de desove
(National Research Council, 1990)
. Poco se conoce sobre el impacto de
las enfermedades infecciosas bacterianas en las poblaciones de tortugas en estado
natural y sobre el papel que varios microorganismos puedan desarrollar como agentes
patgenos
(Glazebrook y Campbell 1990b)
.

49

Figura N 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F (Morroco
Amar Geochelone denticulata)

2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles
Muchas bacterias han sido identificadas como las causantes de enfermedades en
reptiles mantenidos en cautiverio
(Keymer 1978, Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook y Campbell 1990b,
Glazebrook et al. 1993)
. Sin embargo, se conoce que muchos microorganismos pueden ser
causa de elevada mortalidad en otras especies de animales acuticos de vida libre
(Medway
1980, Ghittino et al. 1984, Gulland 1999)
. Adems, muchas de estas bacterias son patgenas para los
humanos. Segn Santoro et al (2006); Aeromonas sp. es el microorganismo ms
frecuentemente aislado, seguido de Citrobacter freundi, Salmonella sp, Acinetobacter sp.
y Pseudomona aeruginosa .
Aeromonas sp., Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus sp.,
Acinetobacter sp., Citrobacter sp., son bacterias potencialmente patgenas, que pueden
portarse como oportunistas, ingresar en los tejidos daados por traumas o aprovechar
las condiciones de estrs causando enfermedades graves. Estas bacterias en reptiles en
cautividad, han sido asociadas a enfermedad cutnea septicmica ulcerativa, dermatitis
papilar, dermatitis focal erosiva, dermatitis ulcerosa traumtica, dermatitis necrosante,
estomatitis ulcerosa, rinitis obstructiva, queratoconjuntivitis, septicemia, bronconeumona
y osteomielitis
(Draper et al, 1981, Lauckner, 1985; Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook et al.1993, Dickinson et al, 2001).

Por su parte, existen ms de 2300 serotipos de Salmonella sp. , muchos de los cuales
fueron encontrados en reptiles silvestres y en cautiverio
(Mermin et al. 1997),
y algunos de estos
en quelonios marinos
(Keymer et al. 1968; Keymer 1978; Glazebrook y Campbell 1990a; Raidal et al. 1998; OGrady y
Krause 1999)
. Estos microorganismos son conocidos como oportunistas principalmente por
50

generar cuadros de enfermedad cuando los hospederos estn debilitados y
ocasionalmente son identificados como agentes causales de gastroenteritis en los seres
humanos por consumo de carne de los animales portadores o contacto directo con heces
de los mismos
(OGrady y Krause 1999)
. Se considera actualmente que los reptiles son fuente de
transmisin de Salmonella sp.
(Johnson-Delaney 1996)
. En reptiles terrestres, coliformes y
Enterobacter sp. son asociados a enfermedades locales y generales
(Hoff et al. 1984; Glazebrook y
Campbell 1990a)
. Proteus mirabilis y Bacillus sp. son considerados saprfitas y parte de la
flora normal que se encuentra sobre la piel de los reptiles
(Glazebrook y Campbell 1990a, Shotts, 2001).

Los estudios de la flora bacteriana en animales de vida libre son de fundamental
importancia pues permiten conocer el papel que tienen estos microorganismos en las
enfermedades infecciosas y como afectan la supervivencia de las poblaciones de
tortugas en condiciones naturales dentro del equilibrio biolgico de estos vertebrados.
Considerando que el nmero de los microorganismos resulta mayor en reptiles con
inestable estado de salud, este aspecto puede ser utilizado como un importante ndice
para identificar grupos de animales inmunosuprimidos o enfermos, evaluando la flora
bacteriana de una poblacin durante varios aos. En fin, el conocimiento de la flora
normal de animales silvestres es importante para entender los riesgos potenciales de la
zoonosis
(Santoro et al., 2006).

51

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

3.1 FORMULACIN DEL PROBLEMA

En los reptiles, Salmonella sp. hace parte de la flora intestinal normal, por lo cual estos
animales son catalogados como portadores asintomticos del microorganismo. Sin
embargo, la enterobacteria al tener un comportamiento de parsito intracelular, es
oportunista y puede llegar a causar afecciones en los ejemplares donde se presentan
altos niveles de inmunosupresin debido a las condiciones del cautiverio, situacin que
es aprovechada por el microorganismo para la colonizacin de rganos internos
causando serias patologas en los animales incluso bajo ciertas condiciones llegando a
producir la muerte de los mismos.
(Chiodini y Sulberg 1981; Millan et al. 1997; Mitchel y Shane 2000; Boever y
Williams 1975; Isaza et al. 2000; Oros et al. 1997)
.
Teniendo en cuenta lo anterior es indispensable conocer la implicacin que puede tener
esta bacteria en los cuadros patolgicos presentados por estos animales y adems
reconocer el potencial riesgo zoontico para las personas que trabajan en la E.B.T.R.F y
que estn en contacto directo con los ejemplares de C. intermedius y Testudinos que
son preservados all. Para tal fin, es necesario conocer la carga de Salmonella sp. que
se presente en la poblacin animal, para poder involucrarla directamente con procesos
de enfermedad en los individuos y en el personal. Esto es de vital importancia, dado que
en el pas no se ha realizado ninguna investigacin que abarque todos los objetivos
propuestos para este estudio, relacionando la presencia de Salmonella sp. en la
predisposicin de los animales a presentar patologas asociadas al microorganismo.
Teniendo en cuenta que todos los ejemplares muestreados se encuentran ex situ y el
objetivo de la Estacin es la reintroduccin de los mismos a su hbitat natural, el
proyecto sirve de gua hacia la preservacin y disminucin de los riesgos para las
poblaciones de stas especies silvestres encontradas in situ, garantizando que los
ejemplares que salen de la Estacin se encuentren completamente sanos, todo en
bsqueda de implementar estrategias que a su vez permitan conservar la integridad de
los ltimos ejemplares que habitan el planeta en condiciones in situ.

52

3.2. JUSTIFICACIN
El caimn llanero (Crocodylus intermedius) es una especie declarada en peligro de
extincin; a partir de la resolucin 0676 del 21 de julio de 1.997 emitida por el Ministerio
del Medio Ambiente, las acciones se han dirigido a la elaboracin de un programa
general de conservacin producto de la concertacin de todas las Instituciones pblicas
o mixtas con incidencia directa y/o indirecta tanto en los relictos poblacionales existentes
como en los territorios sealados como hbitats tradicionales de la especie. Por su parte,
las tortugas constituyen el segundo grupo de vertebrados tetrpodos ms amenazados
en Colombia, ya que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas
publicadas por la UICN, mas de la mitad de las especies registradas en nuestro pas (19
de 32 (taxones), poseen algn riesgo de desaparecer en un futuro cercano, si no se
adoptan medidas efectivas para su proteccin, manejo y conservacin. Es por ello que
esta investigacin pretende en primer lugar y con una visin conservacionista, establecer
cientficamente si la Salmonella sp. puede estar afectando a los ltimos ejemplares en
cautiverio que existen en Colombia y que son el soporte gentico con el que cuenta
nuestro pas para evitar su extincin; en segundo lugar y dada la implicacin que tiene
esta bacteria en la salud pblica, se busca establecer con precisin la presencia de este
enteropatgeno en tortugas que tambin se investigan en la Estacin Roberto Franco,
ejemplares donde la literatura reporta que esta bacteria puede hacer parte de la flora
normal, constituyndose en una fuente potencial de contagio para los caimanes y el
personal que labora en la Estacin. Una vez conocida la situacin real de la presencia
de este patgeno en los reptiles ser posible establecer medidas de control ms
pertinentes, enfocadas al establecimiento de la buena salud animal y humana.

La salmonelosis permanece como un importante problema de salud pblica alrededor del
mundo y pese a los grandes esfuerzos en investigacin, muchos detalles de su patognesis
son an desconocidos
(Lax, et al 1995)
y contina siendo la principal enfermedad gastrointestinal
en los seres humanos. En Colombia, las investigaciones acerca de la enterobacteria
Salmonella sp. se han centrado en la implicacin de la misma en las enfermedades
transmitidas por agua y alimentos (ETA) y son escasos los estudios llevados a cabo acerca
de los posibles contagios producidos por especies de reptiles, aunque se reconoce su gran
poder zoontico; no se ha tenido muy en cuenta el porcentaje de casos de la enfermedad
que pueden ser generados a partir del contacto con especies cautivas, aunque, segn
datos estadsticos, el aumento de la popularidad de esos animales como mascotas,
coincide con el nmero de casos de salmonelosis en humanos asociadas a reptiles, por lo
cual este problema ha sido en los ltimos aos de gran importancia a nivel de salud pblica.

53

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar e identificar mediante diversos anlisis microbiolgicos, la presencia de
enterobacterias del gnero Salmonella en ejemplares de caimn llanero (Crocodylus
intermedius) y tortugas de diferentes gneros (Orden Testudinata); animales mantenidos
en cautiverio en la Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco (EBTRF), determinando
las serovariedades de mayor prevalencia en estos animales.

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:
x Determinar mediante pruebas microbiolgicas, la presencia de enterobacterias del
gnero Salmonella aisladas a partir de muestras de hisopado cloacal, de diferentes
especies de tortugas de Orden Testudinata y Crocodylus intermedius neonatos.
x Establecer las especies del Orden Testudinata en las que hay mayor prevalencia de
la enterobacteria en estudio.
x Realizar un anlisis indirecto de los ejemplares pertenecientes a la especie
Crocodylus intermedius, estableciendo la presencia de la enterobacteria Salmonella
sp. en el agua y sedimento de los estanques donde permanecen los animales.
x Aislar enteropatgenos del gnero Salmonella en las muestras de materia fecal
encontrada en los encierros de los ejemplares de caimn llanero en estudio.
x Realizar un anlisis antignico de todas las cepas compatibles con Salmonella sp.
para determinar el/los grupos predominantes en las especies en estudio.
x Establecer mediante pruebas estadsticas descriptivas, el porcentaje de presentacin
de la bacteria tanto en Tortugas como en Crocodylia, para as mismo reportar el
grado de infestacin en la Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco.
x Realizar los primeros aportes en Colombia acerca de la descripcin de los serotipos
de Salmonella sp. encontrados en diferentes especies de tortugas y la presencia de
la bacteria en el caimn llanero (Crocodylus intermedius).

54

5. METODOLOGA

5.1 REA DE ESTUDIO
Esta investigacin se llev a cabo en La Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco
(E.B.T.R.F.) ubicada en la ciudad de Villavicencio - Meta, centro de investigacin de la
Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia.
Las condiciones climticas muestran un rgimen de lluvias unimodal con una
precipitacin media anual de 4085mm; temperatura promedio de 27
o
C y una humedad
relativa de 77,8%
(Rodrguez y Ramrez, 2000).
La E.B.T.R.F, cuenta actualmente con una coleccin viva que supera los 300 ejemplares
de tortugas terrestres nativas del pas, distribuidas en ms de 20 especies y,
adicionalmente un nmero mayor a 200 ejemplares de Crocodylus intermedius
distribuidos en diferentes grupos etreos entre los que se encuentra una gran cantidad
de neonatos y juveniles (80%), producto de investigaciones en el rea reproductiva.
El estudio de esta coleccin permite el desarrollo de un sinnmero de investigaciones y
proyectos que contribuyen a la conservacin de estos individuos y asimismo avanzar en
el conocimiento de estas especies que constituyen el grupo de vertebrados tetrpodos
ms amenazado de Colombia, de acuerdo con las listas oficiales de especies
amenazadas publicadas por la Unin Internacional para la Conservacin de la
Naturaleza (UICN)

5.2 POBLACIN MUESTRAL:
El muestreo fue realizado sobre la totalidad de los ejemplares encontrados en la
Estacin distribuidos en 52 estanques (Anexo N 1) as: 29 caimanes adultos (4 aos en
adelante) ubicados en 8 estanques, 118 animales juveniles (3 4 aos) encontrados en
8 estanques y 80 neonatos (1 2 aos) distribuidos en 9 estanques; los ejemplares del
Orden Testudines se encontraban distribuidos en 27 estanques en cada uno de los
cuales se encuentran animales de diferentes especies en peligro de extincin (Tabla N
3).

5.3 TOMA DE MUESTRAS
Se realizaron tres muestreos seriados con un intervalo de 15 das entre cada uno. Se
obtuvieron muestras de arena encontrada alrededor de los estanques donde estn
alojados los ejemplares en estudio procurando que en la muestra se incluyera materia
fecal; simultneamente se muestre el agua y sedimento de cada uno de estos
encierros. Adicionalmente, en cada uno de los estanques se obtuvo hisopado cloacal del
55

Tabla N 3: Especies de Testudines y Crocodylia muestreadas y nmero estanques y
ejemplares muestreados para cada caso
Especies
Nombre Cientifico Nombre comn
N
Estanques
Muestreados
N
Ejemplares
Muestreados

Caimanes

Crocodylus intermedius

Caiman del Orinoco /
Caiman Llanero

25

24

227

226

Caiman crocodilus

Babilla

1

2

Tortugas

Rhinoclemmys melanosterna

Palmera
27

2
342

72

Rhinoclemmys diademata

Inguensa

2

32

Rhinoclemmys nasuta

Sabaletera

1

2

Hbrido Rhinoclemmys

Hbrido

2

115

Geochelone denticulata

Morroco Amar

1

4

Geochelone carbonaria

Morroco Negro

1

15

Rhinoclemmys funerea

1

1

Phrynos gibbus

Hedionda

1

4

Kinosternon sp

Tapaculo

1

3

Phrynos geoffroanus

Bachala

1

1

Peltocephalus dumerilianus

Cabezon

1

1

Chekus fimbriatus

Mata Mata

1

2

Podochnemis unifilis

Terecay

1

20

Podochnemis expansa

Charapa

1

8

Podochnemis vogli

Sabanera

1

26

Podochnemis lewyana

Lewyana

1

2

Trachemys scripta ornata

Pecho carey

1

3

Trachemys scripta callirostris

Icotea

1

31

25% de los ejemplares de la coleccin de Crocodylia neonatos y Testudines de todas las
edades presentes en la E.B.T.R.F y las muestras se trabajaron como un grupo por cada
estanque.Teniendo en cuenta que la obtencin de muestras se realiz de forma
aleatoria, cabe aclarar que en cada muestreo las muestras remitidas eran diferentes a
las procesadas en el muestreo anterior.

56

5.3.1. Obtencin de muestras por hisopado cloacal

Testudines: Se muestre el 25% de la poblacin total encontrada en cada estanque,
para lo cual se introdujo a travs de la cloaca un hisopo estril, haciendo movimientos
de rotacin contra las paredes cloacales se garantiz la obtencin de suficiente muestra
(Figura N 5); inmediatamente el hisopo se deposit en una bolsa de cierre hermtico
que contena caldo lactosado esteril (2%), con el fin de evitar la deshidratacin y
contaminacin
(Saelinger y Lewbart 2006, Crawford et al,1971; Chambers y Hulse, 2006)
Las bolsas que
contenan las muestras se remitieron al laboratorio debidamente etiquetadas con el
nmero de estanque y tipo de muestra; fueron transportadas en refrigeracin por un
periodo menor de 6 horas
(Luna, 1991)
para inmediatamente ser procesadas en el
laboratorio de microbiologa veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y de
Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot.

Figura N 5. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Testudines.

Caimanes neonatos: Se muestre el 25% de la totalidad de los ejemplares neonatos
(menores de 1 ao) encontrados en cada estanque (Figura N 6). De igual forma que en
los individuos de tortugas, las muestras se transportaron en bolsas de cierre hermtico
que contenan caldo lactosado en un lapso menor de 6 horas
(Luna, 1991)
hasta su
procesamiento en el laboratorio de microbiologa veterinaria de la Universidad Nacional
de Colombia.
57

Figura N 6. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Crocodylus intermedius
neonatos.

5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques:

Tortugas y Caimanes Neonatos: Una vez se homogenizaba el agua contenida en los
estanques, se introdujo una jeringa de 20cc a la cual previamente se le haba colocado
una sonda estril de 50 cm de longitud y se realizaba aspirado del fondo del estanque
hasta obtener una muestra de 250 ml de agua y sedimento; sta se deposit en bolsas
de cierre hermtico (Figura N 7 A y B). Se emple una jeringa y una sonda por cada
estanque.

Caimanes adultos y juveniles:
La toma de muestras se realiz a partir de los canales de desage, se hizo apertura de
los sistemas de evacuacin y se tomaron aproximadamente 250 ml de agua junto con
sedimento directamente en la bolsa de cierre hermtico (Figura N 7 C).

Todas las muestras fueron transportadas en condiciones de refrigeracin, debidamente
identificadas
(Rodriguez, et al,1980)
para posteriormente ser procesadas

en el laboratorio de
microbiologa veterinaria en la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogot en un
periodo menor de 6 horas desde el momento de la toma.

58

A. B.

C.
FIGURA N 7. Muestreo de Agua y Sedimento de los Estanques. A y B. Muestreo en los
estanques de Tortugas y Crocodylia neonatos. C. Muestreo en estanques de Crocodylia
Adultos y Juveniles

5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques: Se abarc la
totalidad de la playa de cada estanque, llevando a cabo un muestreo significativo en 5
puntos del terreno conformando la letra Z
(Petersen y Calvin, 2006)
, se realiz una excavacin
hasta aproximadamente 10 cm de profundidad y a partir de este punto se obtuvo una
muestra de 250g de arena, se procur que el sitio de toma de la misma se encontrara
contaminado con restos de materia fecal; la muestras se depositaron en bolsas de cierre
hermtico y se transportaron a la ciudad de Bogot igualmente en un lapso menor a 6
horas (Figura N 8).
59

Figura N 8. Toma de muestra: Arena y materia fecal encontrada en los encierros de los
ejemplares en estudio.

5.4. FASE ANALTICA

5.4.1. Aislamiento e identificacin de Salmonella sp.
El cultivo de la bacteria fue realizado de acuerdo con la norma ISO 6579: 2002, con
adicin de algunos medios de cultivo que han demostrado buenos resultados en la
recuperacin del microorganismo
(Chambers, y Hulse, 2006; Gaillot et al, 1999

Bonnie, 2001)

5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo
Las muestras de hisopado cloacal fueron enriquecidas con 20 ml de caldo lactosado
estril, a las muestras de agua/sedimento y materia fecal/arena, se les adicionaron 250
ml de caldo lactosado esteril. Se llevaron a incubar a 37C, durante un periodo de 24
horas
(Mann y Bjotvedt, 1967; Luna, 1991; Corrente et al 2004)
.

5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo
Se recuperaron 10 ml del caldo de preenriquecimiento y se adicionaron a un tubo de
ensayo con 10 ml de caldo tetrationato
BD
, el cual se incub en bao serolgico a
430,5
o
C por 24 horas
(Luna, 1991)

5.4.1.3. Aislamiento primario en medios selectivos y diferenciales
Las muestras enriquecidas en caldo tetrationato, fueron inoculadas en medios de cultivo
selectivos como Agar MacConkey
BD
(Mck) y CHROMagar Orientacin
BD

respectivamente mediante tcnica de aislamiento o agotamiento con una incubacin a
37
0
C durante 24 - 48 horas.
(Gaillot et al;1999)
y a partir de los aislamientos realizados en los
60

medios de cultivo selectivos, se llev a cabo la identificacin de las colonias
sospechosas de Salmonella sp; el CHROMagar Orientacin
BD
permite la
identificacin de microorganismos mediante reacciones de sustratos cromgenos
artificiales y Salmonella sp. no tiene la capacidad de reaccionar con ningn sustrato
cromgeno del medio, por lo cual las colonias sospechosas se identifican por no producir
ningn tipo de coloracin; son de bordes definidos y tamao regular (2 - 5)
(Hengstler et al,
1997)
(Figura N 9 A); en agar MacConkey
BD
Salmonella sp. no tiene la capacidad de
degradar la lactosa presente en el medio, por lo cual las colonias se consideraban
sospechosas cuando no presentaban ninguna coloracin y se identificaban como
colonias Lactosa Negativas (Figura N 9 B)
(Aguilar y Escolstica, 2001)

A B
Figura N 9. Identificacin de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de
cultivo selectivos. A. CRHOMagar Orientacin, B. Agar MacConkey

Una vez detectadas las colonias sospechosas de Salmonella sp., fueron recuperadas y
aisladas en los medios de cultivo diferenciales CHROMagar Salmonella
BD
y Agar
Hektoen Entrico, trabajados en el estudio para confirmar la pureza del cultivo y
determinar si la morfologa y caracterstica de las colonias eran efectivamente
pertenecientes a Salmonella sp..
En Agar Hektoen Entrico la identificacin de microorganismos del gnero Salmonella
est determinada por el crecimiento de colonias con una coloracin negra en su parte
central debida a la produccin y precipitacin de cido sulfhdrico y presentan un halo
transparente alrededor que ha permitido en el dialecto comn definir que los
microorganismos del gnero Salmonella en agar Hektoen crecen con apariencia de ojo
de pescado (Figura N 10 A)
(Luna, 1991; Richards, et al, 2004; Gaillot et al, 1999; Dusch y Altwegg, 1993; 1995;
Monnery et al, 1994)
.

Adicionalmente, en CHROMagar Salmonella
BD
las colonias
pertenecientes a este gnero crecen con una coloracin rosa prpura (Figura N 10 B),
61

mientras que los microorganismos no deseados son inhibidos o aparecen como colonias
con pigmento verde azul
(Bonnie, 2001; ISO, 2002; Dusch y Altwegg, 1993; 1995; Monnery, et al , 1994; Poisson et al,
1993; Ruiz et al, 1996).

A B

Figura N 10. Caractersticas morfolgicas de las enterobacterias del gnero Salmonella
aisladas en los medios de cultivo diferenciales. A. Agar Hektoen.
B. CHROMagar Salmonella.

Los medios cromognicos permitieron el hallazgo de otros microorganismos aunque no
era un objetivo propuesto para el trabajo, lo cual es de gran importancia, dado que
permite conocer la microbiologa cloacal de las especies y de esta forma identificar si
existe alguna alteracin a nivel de la flora gastrointestinal normal. En CHROMagar
Orientacion
BD
se observaron colonias de coloracin prpura y opacas caractersticas de
Staphylococcus saprophyticus (Figura N 11 A), Escherichia coli se reconoce por crecer
con apariencia rosa transparente de tamao medio con o sin halos alrededor (Figura
N 11 B); Enterococcus sp. crece con pigmentacin verde azulada y colonias de tamao
pequeo (Figura N 11 C),. Simultneamente fue posible identificar enterobacterias del
gnero Klebsiella sp. por presentar un tamao medio y coloracin azul oscuro; (Figura N
11 D), Proteus present morfologa asimtrica en las colonias con una pigmentacin
crema rodeada de halos marrn. Finalmente, Citrobacter sp. produce colonias azul
violeta en el medio (Figura N 11 E).

62

Figura N 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. A:
Staphylococcus saprophyticus. B: Escherichia coli. C. Enterococcus sp. D. Klebsiella sp.
E. Citrobacter sp.

A B

C D
E
63

5.4.1.4. Identificacin Bioqumica
El reconocimiento de acuerdo con el metabolismo de los microorganismos
pertenecientes al gnero Salmonella sp. se llev a cabo mediante el sistema de
identificacin BBL cristal
BD

para bacterias entricas/no fermentadoras realizando el
montaje y lectura de las placas segn las indicaciones, recomendaciones e instrucciones
del productor (Figura N 12) (Anexo N 3).

A B
Figura N 12. Lectura de pruebas de identificacin Crystal

para microorganismos
entricos/no fermentadores. A. Identificacin a partir de agua y sedimento del estanque
de Testudines nmero 21. B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimn neonato
en el estanque nmero 47

Para la lectura del perfil del microorganismo por parte del Software fue necesario realizar
a las colonias sospechosas en los medios de cultivo diferenciales, un nuevo
aislamiento en agar tripticasa soya
BD
enriquecido con 5% de sangre ovina y luego de
una incubacin por 24 horas a 37C
(Murray, 1999)
se realiz prueba de indol en medio SIM y
simultneamente se llev a cabo prueba de oxidasa, Salmonella muestra un
comportamiento negativo para las dos pruebas.

5.4.1.5. Serotipificacin
Una vez los aislamientos fueron identificados como Salmonella sp. por el mtodo de
Crystal
BD
, las cepas fueron recuperadas nuevamente a partir de Agar TSA con Sangre.
Los aislamientos de Salmonella sp. fueron expuestos a antisueros mono y polivalentes
especficos como lo indica la metodologa de Kauffmann White
(Grimont y Weill, 2007)
. En una
lmina hemoclasificadora se rotul el primer cuadrante de forma vertical con el antisuero
a evaluar y cada recuadro horizontal con la identificacin de la cepa a serotipificar
(Figura N 13). En la primera seccin de la lmina (Grupo B/2 A+S) se depositaron 50l
64

de solucin salina 0,85% y se tom una asada de la colonia a evaluar a partir del TSA
con sangre, se homogeniz la solucin y posteriormente se adicion una gota de 50l
del antisuero correspondiente y se mezcl; se esper la formacin macroscpica de
agregados finos o grandes aglutinados que indicaba la positividad de la reaccin; en
caso de no haber evidencia de aglutinacin, se proceda a evaluar el antisuero siguiente
(Grupo D) y as sucesivamente hasta establecer el serogrupo del aislamiento (Anexo N
4). Para cada reaccin positiva se realizaba un control positivo y negativo con el fin de
garantizar la inexistencia de falsos positivos
(Bayley y Scott, 1982, Chatfield, et al., 2007. Luna, 1991, Winkle y
Rhode, 1961)

Cepa

Antisuero

2 A+S

7 A + S

14 HC

24 A+S

31 A+S

38 A+S

44 HC

49 A + S
Grupo B
+ +
Grupo D1
+
Grupo C1
+
Grupo C2
+ +
Poli B
+
Poli C
+
Figura N 13. Esquema de una lmina hemoclasificadora utilizada para la serotipificacin
de las cepas de Salmonella sp. (+: Reaccin positiva de aglutinacin).

Para la serotipificacin se emplearon los antisueros comerciales Polivalentes B DIFCO

(grupos C1,C2, F, G y H) y Polivalente C DIFCO

(Grupos I, J, K, M, N, O) y antisueros
monovalentes para Grupo B DIFCO

(Factor 1, 4, 5, 12), Grupo C1 DIFCO

(Factor 6,7),
Grupo C2 DIFCO

(Factor 6,8), y Grupo D1 DIFCO

(factor 1,9, 12).

5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibiticos
La prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realiz (mediante el mtodo de Kirby
Bauer o prueba de difusin por disco) a las cepas de Salmonella sp. identificadas por el
sistema de identificacin BBL Crystal
BD
.
A partir de los aislamientos en el medio de cultivo agar TSA + Sangre
BD
se tomaron
aproximadamente 2 o 3 colonias y se inocularon en un tubo con solucin salina esteril,
garantizando una total dilucin de las colonias hasta alcanzar una turbidez
correspondiente al patrn 0,5 de McFarland, con una concentracin aproximada de 1,5
x 10
8
UFC/ml.
(Chambers y Hulse, 2006 y Smith et al, 1952).

La suspensin anterior, se deposit sobre una caja de agar Mueller Hinton
BD
, medio de
cultivo validado por la NCCLS
(Chambers y Hulse, 2006)
; se garantiz que toda la suspensin
entr en contacto directo con el agar y pasado un lapso de 2 minutos aproximadamente,
65

el exceso de solucin se descart e inmediatamente se ubicaron los discos
comerciales
BD
impregnados con el agente antimicrobiano a enfrentar con la bacteria
haciendo una leve presin sobre el agar; las placas se llevaron a incubacin durante un
lapso de 16 18 horas a una temperatura de 37
o
C. Los antibiticos evaluados fueron
Sulfatrimetoprim (25g), Norfloxacina (10g), Ampicilina (10g), Cloranfenicol (20g),
Cefoxitin (20g), y Tetraciclina (30g)
BD

(Passmans, et al, 2005).

Posterior a la incubacin, los halos inhibitorios fueron medidos en milmetros (Figura N
14) y de esta forma se clasific el tipo de respuesta segn las tablas de interpretacin
provistas por la NCCLS. donde se evala la accin de antimicrobianos frente a
microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, estableciendo, la
sensibilidad total, sensibilidad moderada y/o resistencia a este tipo de agentes (Anexo N
5)

.
Figura N 14. Antibiograma

66

6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1. Anlisis de datos
Todos los datos obtenidos durante el proyecto fueron analizados mediante estadstica
descriptiva y se representaron con tablas, histogramas, grficos circulares, entre otros.

6.2. Identificacin de microorganismos del gnero Salmonella por
tcnica BBL Crystal

Mediante esta tcnica de identificacin fue posible confirmar los aislamientos que se
haban identificado como sospechosos de Salmonella en los medios de cultivo
diferenciales. Se obtuvieron en total 36 aislamientos sospechosos, de los cuales 31
fueron identificados por el software (Libro electrnico de cdigos BBL Crystal
) como
Salmonella sp. con un nivel de confianza promedio de 0.9908. De los 5 aislamientos
restantes, en tres se descart la presencia de Salmonella sp. puesto que en uno se
obtuvo Escherichia coli con un nivel de confianza de 0,9029; en otro se aisl
Flavimonas oryzihabitans antes clasificada como Pseudomonas oryzihabitans la cual
segn reportes bibliogrficos es frecuentemente recuperada de ambientes tales como
plantaciones de arroz, suelos y agua estancada; y no tiene ninguna significancia clnica
(Trevio, et al 2001);
finalmente, se aisl Providencia rustigianii, con un nivel de confianza de
0,7766. Dos de los aislamientos no pudieron ser identificados por el kit para la
evaluacin de microorganismos Entricos/No Fermentadores, por lo cual se reportaron
como negativos para Salmonella sp.
Adicionalmente, es necesario tener en cuenta que el sistema identific dos de los
aislamientos como Salmonella cholerae suis subsp. arizonae, serovariedad encontrada a
partir de una muestra de origen ambiental la cual no ha sido reportada en especies de
reptiles, hecho que permiti plantear una hiptesis sobre la posible contaminacin de la
arena en el encierro mediante fmites (botas, herramientas) que hubiesen sido utilizados
previamente en alguna granja donde se mantienen cerdos puesto que la serovariedad
aislada ha sido reconocida como agente causal de salmonelosis porcina
(Thomas, 1997; Mc
Caughey et al, 2005).
Sin embargo, mediante las indagaciones realizadas acerca del manejo en
la E.B.T.R.F. y las medidas de bioseguridad establecidas all, esta hiptesis fue
descartada.

67

6.3. Positividad a Salmonella sp. en estanques de Crocodylia y
Testudinea
Entre los ejemplares de Crocodylia se encuentran especies de Crocodylus intermedius
en su mayora, distribuidos en 24 estanques, en 15 de stos se encontr la bacteria; el
estanque restante es ocupado por ejemplares de Caiman crocodylus (Babillas) donde
igualmente se encontr el microorganismo, lo cual permite concluir que el 64% de los
estanques de caimn se encontraban positivos a la bacteria. Por otro lado, de los 27
estanques de tortugas evaluados, 12 (44,4%) son positivos para Salmonella sp;
encontrndose la presencia del microorganismo en 7 de las 18 especies que conforman
la coleccin viva de la E.B.T.R.F; estos resultados son de gran preocupacin puesto que
de acuerdo a los resultados obtenidos y haciendo un anlisis general que rene los
datos globales colectados en la Estacin, para las dos especies evaluadas, se pudo
establecer que en 27 de los estanques (52%) fue posible recuperar microorganismos del
gnero Salmonella; mientras que los 25 (48%) restantes se encuentran negativos para la
bacteria (Figura N 14). Segn el volumen de muestras remitidas al laboratorio, de un
total de 129 muestras, 30 fueron positivas para el microorganismo, lo cual equivale a un
24% . Es necesario aclarar que en el primer muestreo se remitieron al laboratorio 129
muestras, en el segundo muestreo 96 y en el tercero 73; debido a que si en alguno de
los estanques evaluados se reportaba el hallazgo de Salmonella en cualquiera de las
muestras procesadas, no era relevante muestrear nuevamente dicho estanque ya que el
proyecto estaba condicionado a la evaluacin de la presencia/ausencia de la bacteria.

Figura N 15.
Es de vital importancia tener en cuenta que es muy poco lo que se ha investigado a nivel
mundial y mucho menos Nacional, con respecto a la presencia de la enterobacteria en
este tipo de reptiles, ya que por muchos aos se han encaminado los estudios a las
N = 52
68

especies que son criadas como mascotas, tales como iguanas, lagartos, tortugas y
serpientes
(Hidalgo et al, 2008; Corrente, et al, 2004; Kourany y Telford, 1982; Ebani et al; 2005; Mitchell y Shane, 2001)
, pero
en animales que se encuentran en via de extincin y que son el objetivo principal de los
centros de conservacin y recuperacin de las especies mediante programas de
reproduccin, los ensayos acerca de la presencia de Salmonella sp. tanto en los
animales como en su hbitat natural son insuficientes. Adicionalmente, si bien es cierto
que el microorganismo hace parte de la flora comensal de los reptiles y que su
aislamiento en tortugas de diferentes familias ha sido reportado con mayor frecuencia
(Hidalgo, et al 2007,2008; Siebeling et al, 1975; Passmans et al, 2002; Saelinger y Lewbart 2006)
, no se puede ignorar el
hecho de que para todos los individuos evaluados, las condiciones de cautiverio donde
son mantenidos crean cuadros de inmunosupresin marcada donde la enterobacteria es
excretada de manera intermitente
(Chiodini y Sundberg, 1981; Bradley et al, 2001; Ebani et al 2005)
y puede
llegar a producir estados patolgicos caracterizados por letargia, anorexia, septicemia,
pneumonia, celomitis, abscesos, shock hipovolmico y, bajo circunstancias extremas, la
muerte del ejemplar
(Onderka and Finlayson, 1985; Frye, 1991)
.
Aunque todos los reptiles son considerados portadores naturales de Salmonella sp.,
lagartos, serpientes y tortugas en particular, son reservorios de dicha bacteria
(Bamler et al,
1998)
y no es claro cmo frecuentemente las especies de reptiles son colonizadas por
serovariedades de Salmonella; en algunos estudios realizados se ha evaluado la
capacidad de colonizacin de la bacteria en tero, contaminacin perinatal, por ingestin
de presas contaminadas y/o contacto con heces de otros reptiles
(Schter, et al , 2004)
. Segn
Kourany y Telford (1982), la predisposicin a condiciones de estrs y escases de
alimento hacen que la bacteria atraviese la barrera sangunea y linftica, llegando a
oviducto, causando la contaminacin de los huevos; aunque Mitchell y Shane (2000),
sugieren que la contaminacin de los huevos se da por abrasin del mismo cuando entra
en contacto con el suelo y cscaras remanentes, en su ensayo descartan la transmisin
vertical puesto que no lograron el aislamiento del microorganismo a partir de ovarios,
oviducto y saco embrionario. Sin embargo, la mayor parte de investigaciones en esta
rea concluyen que la ingestin de agua contaminada con heces es la principal va de
infeccin considerndose el medio acutico favorable para la transmisin
(Hidalgo, et al, 2007)
sin llegar a subestimar que el alimento y el contacto con otros reptiles tambin son una
importante va de contaminacin; adems las altas tasas de ejemplares portadores de
Salmonella se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las cras, lo
que a su vez asegura la transmisin prematura de dichos microorganismos
(Mader, 1996)
La
importancia de las infecciones por Salmonella sp. es su potencial zoontico y los
aislamientos de la bacteria a partir de reptiles se han considerado como patgenos para
humanos, ya que poseen factores de virulencia cruciales para el desarrollo de una
69

gastroenteritis
(Pasmans et al., 2005).
Estos factores demuestran la importancia en la obtencin
de los resultados ya que se ha informado a la Estacin de Biologa Tropical Roberto
Franco acerca de la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. tanto en los animales
como en su hbitat natural, con el fin de concientizar al personal que labora en sus
instalaciones y que se encuentra en un potencial riesgo de contraer salmonelosis
asociada a reptiles.

6.4. Presencia de Salmonella sp. segn la especie
En la Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco se encuentra una coleccin que
supera los 400 ejemplares de tortugas distribuidos en ms de 18 especies y ms de 200
ejemplares de Crocodylus intermedius. Es una poblacin que se encuentra en buenas
condiciones de salud, a pesar de haberse obtenido aislamientos de Salmonella sp. en
un 46% de los estanques de tortugas (Figura N 16) y 60% de C. intermedius (Figura N
17). Cabe resaltar que ninguno de los animales presentaba sintomatologa asociada con
Salmonelosis, lo cual puede ser compatible con varias investigaciones que se han
realizado en este tipo de ejemplares establecindose de esta forma que son portadores
aisntomticos de la enterobacteria
(Chambers y Hulse, 2006; Mitchell y Shane, 2000; Pasmans, et al 2005; Geue y
Lschner, 2002; Chiodini y Sundberg, 1981; Milln et al, 1997; Abadem de S y Solari; 2001)

Figura N 16.

N = 27
70

Figura N 17.

Saelinger y Lewbart (2006) plantearon dos hiptesis de acuerdo con los resultados que
obtuvieron en el aislamiento de Salmonella sp. en ejemplares de tortugas silvestres; ellos
postulan que no lograron recuperar ningna cepa, posiblemente porque las tortugas
excretan Salmonella sp. nicamente bajo condiciones de estrs como el cautiverio y/o
porque las tortugas silvestres no son portadores naturales de Salmonella sp. sino que la
adquieren cuando son incluidas en ambientes ex situ; de esta forma proponen que las
tortugas salvajes no pueden ser portadores de los organismos antes de la captura; sin
embargo tanto el anlisis experimental llevado a cabo en la Estacin Roberto Franco,
como el realizado por Chambers and Hulse (2006), contradice por completo el hallazgo
de dichos investigadores quienes a partir de ejemplares silvestres, reportaron que el 85%
de la muestras procesadas eran positivas para Salmonella sp. Nuestra investigacin en
la Estacin, soporta la primera hiptesis planteada por Saelinger y Lewbart (2006)
puesto que el porcentaje de recuperacin de Salmonella sp. en los Testudines cautivos
en la E.B.T.R.F (Figura N 16), fue de 46% y se plantea que los resultados inesperados
obtenidos por dichos autores posiblemente se dieron por una errada metodologa de
muestreo al haber empleado nicamente hisopado cloacal en la toma de las muestras
dado que la cantidad que se obtiene de esta manera es insuficiente y se conoce que la
concentracin de Salmonella sp. frente a la flora acompaante es muy baja, lo cual hace
que su recuperacin sea ms difcil posiblemente al igual que Richards et al (2004), no
obtuvieron resultados favorables seguramente por no realizar previo enriquecimiento de
la muestra.

Por otra parte, el porcentaje de aislamiento de Salmonella sp. en C. intermedius
observado en la Figura N 17 fue mayor que el obtenido para ejemplares de Orden
Testudinata, lo cual concuerda con lo reportado por Geue y Lschner (2002) quienes
N = 25
71

obtuvieron un porcentaje de recuperacin de la bacteria solo de 2,6% (una muestra) en -
Testudines, mientras que en lagartos obtuvieron un porcentaje de aislamiento de 47,4 %;
(36 muestras); de igual manera en un estudio realizado por Corrente et al (2004) se
obtuvo 50% de recuperacin en lagartos y 10,3% en tortugas. Los resultados obtenidos
en la estacin fueron mayores a lo esperado puesto que existen muchos ms reportes
de aislamientos a partir de muestras provenientes de tortugas que de caimanes
(Richards.
et. al 2004; Mitchell and Shane. 2001; Pasmans, et al 2005; Hidalgo, et al 2007, Lane, 1996).
Es importante destacar que estos resultados apoyarn bibliogrficamente a muchos
investigadores en esta rea pues no se conocen datos acerca del comportamiento de la
bacteria en ejemplares de Caimn y como se puede deducir, es de vital importancia
determinar la presencia de Salmonella en este tipo de animales puesto que la
prevalencia en los individuos ex situ es altsima y teniendo en cuenta que generalmente
se encuentran incluidos en programas de recuperacin y repoblacin de la especie es
necesaria la implementacin de medidas que eviten la predisposicin de los animales a
inmunosupresin extrema y adicionalmente mantener las medidas de bioseguridad
apropiadas que garanticen condiciones sanitarias ideales para los animales y el personal
que labora con los mismos.

Cabe resaltar que para animales mantenidos en cautiverio, es de vital importancia
conocer que Salmonella sp. es altamente resistente fuera de su hospedero y permanece
viable despus de 89 das en suelo y/o agua y 30 meses en Materia Fecal, lo que
permite asegurar que todo el ambiente del encierro puede ser fuente para aislamientos
positivos para Salmonella sp.
(Warwick, et al 2001)
. Adicionalmente, teniendo en cuenta que la
excrecin de la bacteria no es constante y que el muestreo por hisopado cloacal no es lo
suficientemente sensible, se opt por llevar a cabo un muestreo mucho ms amplio que
permitiera aumentar las probabilidades de recuperacin del microorganismo a partir de
muestras de origen ambiental puesto que segn reportes bibliogrficos, han generado
resultados satisfactorios en el aislamiento del microorganismo
(Hidalgo, et al 2007)
siempre y
cuando el muestreo sea continuo y repetitivo
(Woodward et al., 1997; Mermin et al., 2004).

6.5. Aislamientos de Salmonella sp. segn el tipo de muestra para
ejemplares de Crocodylia y Testudinos
Las muestras de tipo ambiental obtenidas para el aislamiento de Salmonella sp. en este
ensayo han permitido una buena recuperacin de la bacteria, consiguindose un mayor
ndice de recuperacin de la bacteria a partir de muestras de agua y sedimento de los
estanques donde se aisl el microorganismo en 7 (50%) de las 14 muestras positivas en
72

Testudines y 10 (71,4%) de 14 muestras igualmente positivas en Crocodylia; a diferencia
de los hisopados cloacales donde la recuperacin del microorganismo fue menor.

Las figuras N 18 y 19 muestran claramente los resultados obtenidos de acuerdo al tipo
de muestras procesadas para el aislamiento de Salmonella en los ejemplares evaluados
y analizando los datos es posible afirmar que cualquier metodologa que se emplee para
el aislamiento de la bacteria no es lo suficientemente sensible y especfica por si sola;
deben emplearse diferentes muestras para garantizar la recuperacin del
microorganismo; es as como es posible corroborar los resultados de ensayos previos
donde el aislamiento del enteropatgeno a partir de hisopado cloacal en muchos casos
no ha permitido la obtencin de la bacteria
(Geue y Lschner, 2002; Richards. et al .2004; Pasmans et al. 2002;
Saelinger y Lewbart, 2006)
y refutar aquellos donde se ha obtenido un altsimo porcentaje de
aislamiento tal como Schrter et al (2004) quienes mediante hisopado cloacal obtuvieron

Figura N 18.

Figura N 19.
73

81% de recuperacin de Salmonella sp. en serpientes y Pasmans et al (2005), con 25
aislamientos positivos para Salmonella sp. (75,8%) de 33 muestras obtenidas a partir de
hisopados cloacales en lagartos, aunque igual establecen que el muestreo nico por
hisopado cloacal no es altamente sensible. Segn los resultados obtenidos en este
trabajo, no es recomendable realizar hisopados cloacales en los animales porque el
estrs generado durante el procedimiento es muy alto y el porcentaje de recuperacin
de la bacteria muy bajo; adems, conociendo que la excrecin de la bacteria es
intermitente, el aislamiento del microorganismo mediante hisopado cloacal va a
depender no solo de llevar a cabo una buena metodologa diagnstica, sino del factor
azar que garantice que en el momento del muestreo la bacteria este siendo excretada
por el animal
(Hidalgo, et al 2007; Saelinger y Lewbart 2006; Pfleger,. et al, 2003; Warwick, et al 2001; Woodward et al, 1997;
Mermin et al. 2004).

Los datos sugieren que el agua, junto con el sedimento, es una fuente de transmisin
importante para los ejemplares que se encuentran alojados en cada estanque; a
diferencia de Mitchell y Shane (2000), quienes no obtuvieron resultados en las muestras
de agua procesadas, en su trabajo de investigacin, al igual que en este lograron aislar
el microorganismo en la arena de los estanques contaminada con heces de los animales,
la cual segn los resultados obtenidos, tambin puede ser tomada como una muestra
apropiada para el aislamiento de la bacteria aunque debe estar acompaada de otra
metodologa de aislamiento. En nuestra investigacin se realizaba una excavacin
aproximada de 15 cm de profundidad y a partir de all se obtena la muestra, logrndose
un porcentaje de recuperacin de 12,5% en Testudinea y 8% en Crocodylia aunque se
debe aclarar que el lugar de eleccin para la toma de la muestra era aquel contaminado
con excremento del animal en los estanques de Testudinea puesto que en ninguno de
los 3 muestreos realizados se encontr materia fecal sobre la arena de los encierros en
Crocodylia. Algunos reportes soportan la metodologa empleada en este estudio; han
establecido que a profundidades de 5 50 cm hay una mayor supervivencia de
Salmonella sp. en la arena en comparacin con la superficie
(Platz, 1980; Purvis, et al, 2002),
a
pesar de ser un ambiente ms inestable expuesto a temperaturas extremas
(Mitscherlich y
Marth. 1984; Bicudo y Goyal, 2003)
, desecacin (
Purvis, et al, 2002; Zibilske y Weaver, 1978)
y rayos Ultra Violeta
(Schlundt, 1984)
. Aunque se expone que la persistencia de Salmonella sp. en la profundidad
puede verse afectada por el grado de infiltracin de la columna de arena, lo cual a su
vez depende de las propiedades fsico qumicas del suelo tal como la textura, porcentaje
de arena, limo y arcilla que la compone, porcentaje de materia orgnica en la superficie,
pH, el movimiento y direccin del agua
(Winfield y Groisman, 2003)
.

74

Es claro que tanto para tortugas como para caimanes, la frecuencia de aislamiento de
Salmonella sp. en el ambiente de la Estacin (19,2% n =10 en tortugas y 24 % n = 12 en
caimanes) indica la habilidad del microorganismo para sobrevivir fuera del hospedero, lo
cual favorece la contaminacin de los otros animales que permanecen en contacto
constante con el estanque infectado
(Winfield y Groisman, 2003)
; sin embargo, las propiedades
fsico qumicas del ambiente externo influyen fuertemente en la supervivencia de
Salmonella sp. y por consiguiente en el riesgo de infeccin asociado para los otros
ejemplares. Segn Jensen et al (2006) es posible disminuir la carga bacteriana en el
suelo realizando tratamientos sobre la arena, como lo es el arado; sugirieron que el
hecho de recoger el excremento peridicamente podr reducir la concentracin del
microorganismo.

6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia
segn grupos etreos
En la figura N 20 se observa el porcentaje de aislamiento de Salmonella en cada uno de
los grupos, es notable que en caimanes adultos y juveniles el aislamiento de esta
bacteria en los estanques no vari de manera significativa puesto que se obtuvieron
porcentajes de 29% (n = 4) y 21% (n = 9) respectivamente. Estos resultados concuerdan
con los obtenidos por Gee y Lschner (2002), donde la prevalencia de Salmonella sp.
fue calculada como 63,3% (12 de 19 muestras) en lagartos juveniles y 63,6% (14 de 22
muestras) en lagartos adultos aunque los resultados que obtuvieron en lagartos
neonatos difieren los obtenidos en este estudio ya que en este grupo encontraron el
menor porcentaje de prevalencia de Salmonella sp. (17,4%) a diferencia del 50%de
presentacin de la bacteria en este experimento.

Figura N 20.
75

El hecho de que en caimanes neonatos se halla encontrado el mayor porcentaje de
aislamiento permite el planteamiento de varias hiptesis teniendo conocimiento de la
posible transmisin vertical del microorganismo que ha sido evaluada en varios estudios
reportados previamente. En esta instancia es posible citar a Kourany y Telford (1982),
quienes evaluaron la presencia de Salmonella sp. en oviducto y huevos a partir de
lagartos hembras, encontrando Salmonella rubislaw y S. sandiego en todas las muestras
a pesar de que los animales procedan de diferentes sitios; ellos plantearon que en
animales saludables la enterobacteria permanece en el tracto gastrointestinal pero bajo
condiciones adversas como estrs y/o escases de alimento atraviesa la barrera linfoide y
coloniza el contenido interno de los huevos y el oviducto. Por el hecho de haber aislado
los mismos serotipos en muestras de diferente orgen, sugirieron que la bacteria estaba
presente en oviducto y que los huevos son infectados en estados tempranos de
formacin en el mismo. Por otra parte, tambin existen reportes en que los caimanes
neonatos pueden adquirir Salmonella sp. cuando se encuentran en estado de huevo y
este se encuentra enterrado en arena o suelo hmedo contaminado con la bacteria o
tambin puede contaminarse con el microorganismo durante el pasaje a travs de la
cloaca. Se ha reportado que Salmonella sp. est en capacidad de contaminar el
contenido interno de los huevos dentro de una hora post exposicin
(Austin y Wilkins, 1998)
.
Como medida de prevencin, Mitchell and Shane (2001) plantean que el uso de
oxitetraciclina y cloranfenicol puede eliminar la Salmonella en huevos eclosionados antes
de 24 horas por metodologa de inmersin; en huevos con 48 horas despus de la
oviposicin ya no surge ningn efecto el empleo de los antibiticos
(Siebeling et al, 1975)
.
6.6. Serotipificacin
De los 31 aislamientos identificados mediante mtodo de Crystal
BD
como Salmonella sp.
29 se lograron clasificar con los antisueros comerciales DIFCO
empleados,
identificando 6 serogrupos prevalentes en la Estacin. En la figura N 21 se observa que
el 40% de las cepas de Salmonella sp. halladas en la Estacin pertenecen al serogrupo
C2; mientras que la prevalencia de bacterias clasificadas como pertenecientes al Grupo
B y Grupo C1 fue la misma, obteniendose un porcentaje de 20% para cada caso. En esta
instancia, se debe mencionar que hubo correlacin entre las cepas de Salmonella
cholerae suis identificadas por el sistema BBL crystal y la serotipificacin ya que las
cepas sospechosas son pertenecientes al serogrupo C1 donde se encuentra incluida S.
cholerae suis segn el esquema de Kauffmann White (Anexo N 4).
El 20% restante de las cepas pertenecen a serotipos incluidos en los Grupos que abarca
el antisuero polivalente B (14%), Grupo D1 y serogrupos pertenecientes al Polivalente C.
76

Figura N 21.
Los serogrupos de Salmonella sp. que se han identificado en la E.B.T.R.F. mediante
antgeno somtico han sido frecuentemente reportados en reptiles; teniendo en cuenta
que el grupo C2 fue el de mayor ocurrencia, segn

Grimont y Weill (2007) y Popoff y Le
Minor (1992); en este se encuentran incluidas serovariedades como S. newport y S.
muenchen; las cuales son agente causal de salmonelosis en humanos, reptiles y
caprinos entre otras especies
(Passman, et al 2002; Simmons, 2002).
Adicionalmente, los antisueros
polivalentes B y C, incluyen serovariedades de Salmonella sp. que han sido aisladas
constantemente a partir de muestras de reptiles; entre estas se encuentran S.
oranienburg, S. berta, S. panama, S. rubislaw entre otras, muchas de las cuales se han
reportado como agentes causales de patologas gastrointestinales en los reptiles y
algunas veces asociadas a salmonelosis en humanos producida por contacto directo con
el animal asintomtico
(Kourany y Telford, 1982; Ebani, et al 2005; Geue y Lschner, 2002; Saelinger, et al; 2006).
S. cholerae suis nunca ha sido reportada para reptiles, por lo cual es necesario realizar
una investigacin profunda en la E.B.T.R.F. que permita determinar la causa o el origen
del hallazgo de esta serovariedad especfica de porcinos, teniendo en cuenta que este
tipo de alimento no es suministrado a los animales y que las personas que manejan los
ejemplares aseguran no estar en contacto con porcinos, es probable que los individuos
introducidos recientemente a la Estacin, hayan traido consigo el microorganismo y que
ste se encuentre establecido en el hbitat.
El hecho de que en la Estacin se encontraran cepas de Salmonella sp. incluidas en los
Grupos B (20%) y Grupo D1 (3 %) permite inferir en la posibilidad de encontrar
serovariedades con alto potencial de transmisin a los humanos puesto que en estos
serogrupos se encuentran incluidas cepas como Salmonella typhimurium y S. enterididis,
dos de los serovares ms comunes en Estados Unidos, implicados en aproximadamente
77

el 50% de los casos de Salmonelosis en humanos
(Mermin et al, 2004)
, lo cual permite plantear
que el personal de la Estacin se encuentra en riesgo de contraer el microorganismo
debido a su comportamiento zoontico. Cabe resaltar que sin una serotipificacin
completa de todos los microorganismos recuperados en la Estacin Roberto Franco, no
es pertinente asegurar que el personal que labora all se encuentre en inminente riesgo
de contraer salmonelosis, antes se debe evaluar su estado inmunolgico pues, de la
misma manera que en reptiles, si los humanos se encuentran inmunosuprimidos podran
desarrollar un cuadro clnico severo.
Como mtodo de prevencin es necesario el seguimiento de las normas de
bioseguridad establecidas en la Estacin para el manejo de las poblaciones all
mantenidas.
6.7. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad a antibiticos a partir de los
aislamientos obtenidos en la E.B.T.R.F. se encuentran consignados en las tablas N 5 y
N 6 donde se puede analizar el comportamiento de las cepas frente a los diferentes
antibiticos a los cuales se enfrentaron los aislamientos recuperados tanto a partir de
tortugas como de Crocodylia. Existen diferencias notables para cada una de las especies
puesto que las cepas aisladas de muestras provenientes de caimn son mucho mas
sensibles a los antimicrobianos que las de tortugas, donde varios de los aislamientos
eran resistentes a los antibiticos utilizados; por ejemplo, para cloranfenicol todas las
cepas provenientes de caimn fueron sensibles mientras que en tortugas 6 generaron
resistencia al antibitico.
aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los
antibiticos utilizados mediante el mtodo de Kirby Bauer

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBITICOS EN TESTUDINES

Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n)
Ampicilina 8 - 5
Cefoxitin 7 1 5
Cloranfenicol 7 - 6
Norfloxacina 13 -
Sulfatrimetoprim 8 - 6
Tetraciclina 1 10 2

78

Simultneamente se puede asegurar que el antibitico de eleccin para emplear en la
estacin Roberto Franco es Norfloxacina debido a que todas las cepas de Salmonella
enfrentadas a este antimicrobiano tienen un alto grado de sensibilidad, de igual manera,
se establece que Tetraciclina tiene un comportamiento de sensibilidad intermedia para
todos los aislamientos. Cloranfenicol es un antimicrobiano que tendra alto rendimiento
contra los microorganismos del gnero Salmonella aislados a partir de ejemplares de
caimn; sin embargo, es un antibitico que tiene restricciones para ser suministrado por
generar alteraciones y degeneraciones a nivel de mdula sea
(Ebani. et al. 2005)

Figura N 22.

La resistencia a antimicrobianos en aislamientos de Salmonella sp. a partir de muestras
de origen animal es un problema emergente; estas cepas pueden ser una fuente de
plsmidos de resistencia para otras bacterias y producir alteraciones en el tratamiento
antimicrobiano clave para combatir enfermedades en medicina humana y veterinaria
(Ebani
et al 2001)
.
Tabla N 5: Comportamiento de los microorganismos del gnero Salmonella sp. aislados
a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibiticos
utilizados mediante el mtodo de Kirby Bauer.

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBITICOS EN CROCODYLIA

Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n)
Ampicilina 10 1 1
Cefoxitin 11 1 1
Cloranfenicol 13 - -
Norfloxacina 13 - -
Sulfatrimetoprim 11 2
Tetraciclina - 9 4

79

El porcentaje de sensibilidad, resistencia y sensibilidad moderada para todas las cepas
aisladas en las muestras de la E.B.T.R.F se observa en la figura N 22. Como ya se
habia mencionado, el 100% de las cepas fueron sensibles a la Norfloxacina; resultado
que se puede extrapolar para ser soportado por Mitchell et al (1999) quienes obtuvieron
100% (N = 20) de sensibilidad frente a cepas de Salmonella sp. aisladas a partir de
muestras de hisopados cloacales en tortugas a las cuales se les administr durante un
periodo de 14 das Enrofloxacina [10 mg/Kg] lapso en el cual se realiz un nuevo
aislamiento del microorganismo, obteniendo una totalidad de negativos a la bacteria.
Norfloxacina y Enrofloxacina son antibiticos pertenecientes a la familia de
Fluoroquinolonas que tienen actividad bactericida, propiedad que es indispensable en un
antibitico ideal
(Gentilini, 2007)

De igual forma, en la figura N 22 es posible observar que en general todos los
antibiticos empleados en los antibiogramas tienen un buen porcentaje de efectividad a
excepcin de tetraciclina, antibitico que para la mayora de aislamientos producen
grados de sensibilidad intermedia a diferencia de varios reportes donde las cepas
exhiben un alto porcentaje de resistencia a este antimicrobiano
(Corrente, et al, 2004; Mitchell y
Shane, 2001; CDC,1999);
adicionalmente se debe aclarar que la eleccin de los antibiticos a
utilizar en este ensayo se bas en los resultados obtenidos en antibiogramas realizados
a distintos ejemplares de reptiles con patologas asociadas a algunas bacterias
diferentes a Salmonella sp.; casos que eran remitidos al laboratorio de Microbiologa de
la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Nacional de Colombia,
los datos se colectaron mediante un estudio retrospectivo realizado a los archivos de
resultados obtenidos durante el ao 2003 a 2007.

Es necesario tener presente que cuando el tratamiento antibitico es incapaz de eliminar
las bacterias del intestino de los reptiles y en cambio promueve la persistencia de cepas
resistentes a antibiticos, el tratamiento de los portadores del Salmonella sp. debe
evitarse y se recomendaran las buenas prcticas de higiene a los propietarios del reptil
o al personal que labora en el centro de recuperacin para minimizar el riesgo de
infeccin
(Bradley et al 1998).
Adicionalmente no se puede olvidar que el uso de antibiticos de
amplio espectro como las quinolonas (Norfloxacina) que mostraron un 100% de
efectividad para combatir las cepas aisladas en la estacin (Figura 22), son ampliamente
utilizados en medicina herpetolgica y pueden ser causa de alteracin momentnea
grave de la flora tan rica de Gram Negativos y Gram Positivos que se encuentra en el
tracto gastrointestinal de estas especies. Existen datos bibliogrficos que demuestran
80

una cierta tendencia a la anorexia o a alteraciones digestivas en reptiles herbvoros tras
terapias prolongadas de antibiticos
(Jacobson, 1980;1999; Kaufman, 1998)

6.8. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en los
estanques de la Estacin
Aunque la identificacin de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. no era un
objetivo propuesto para el trabajo, el medio de cultivo utilizado CHROMagar
Orientacin
BD
, permiti la identificacin de los otros microorganismos presentes en cada
una de las muestras trabajadas de acuerdo a las reacciones de cada bacteria con los
sustratos cromgenos presentes en el medio (Anexo N 2).

Figura N 23.

De acuerdo con la Figura N 23, se puede establecer que en este estudio hay un
predominio de flora Gram negativa, lo que concuerda con lo reportado por Sunderland y
Veal (2001), sin embargo, Enterococcus sp. microorganismo Gram Positivo, fue el que
estuvo en un mayor porcentaje (33%) en todas las muestras trabajadas sin importar el
origen de las mismas.

Por su parte; en las figura N 24 y 25 es posible observar el porcentaje de presentacin
de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. en las muestras de agua y
sedimento y arena junto con materia fecal respectivamente en los estanques de
Testudines muestreados y se puede notar que en los dos tipos de muestra evaluados
hubo una mayor prevalencia de microorganismos del gnero Enterococcus sp;
Eschericha coli y Klebsiella sp. Sin embargo se observa que en las muestras de agua y
sedimento se recuperaron ms microorganismos que en las de arena y materia fecal
81

aunque los porcentajes de presentacin no variaron significativamente entre las
muestras.

Figura N 24.

Figura 25.

Adicionalmente, se tuvieron en cuenta los microorganismos encontrados a partir de
muestras de hisopados cloacales de animales de Orden Testudinata, datos que se
pueden observar en la figura N 26; donde a su vez puede establecerse que la
recuperacin de microorganismos fue menor para este tipo de muestra.

82

Figura 26.

Para los ejemplares de Crocodylus intermedius la prevalencia de los microorganismos
diferentes a Salmonella sp. fue muy similar a los aislamientos obtenidos en tortugas; sin
embargo, tal como se puede observar en la figura N 27 existe una marcada variacin en
los porcentajes de microorganismos aislados a partir de agua y sedimento con respecto
al comportamiento presentado en las muestras de tortugas evaluadas previamente y los
resultados obtenidos en arena y materia fecal (Figura N 28) e hisopado cloacal (Figura
N 29) en ejemplares de caimn. Es as como en las muestras de agua y sedimento
obtenidas a partir de estanques de caimn, hubo una mayor prevalencia de
microorganismos del gnero Klebsiella sp. (31%) y contrario a lo encontrado en el resto
de las muestras se obtuvo 23% de aislamientos de Enterococcus sp.

Figura N 27.
Proc. Alligator Production Conference, La composicin y diversidad de especies de
enterococos en las heces de animales silvestres parece depender sobre todo de la
83

alimentacin y condiciones del ambiente en el que se desarrolla el ciclo vital del
hospedador. As, los animales en cautiverio o de hbitats periurbanos o que tienen una
dieta oportunista son los que presentan una mayor diversidad de enterococcos, lo cual
explica los hallazgos del presente experimento. Por el contrario, cuando existe una
especializacin en un alimento y/o habitan en ambientes con menor influencia de la
actividad humana se encuentra una menor diversidad del microorganismo
(Ballesteros, 2003)
.

Figura N 28.

Figura 29.

De igual forma, en un estudio realizado por Mundt (1963), se obtuvo un 85,7% de
recuperacin de Enterococcus sp. a partir de muestras fecales de reptiles, el alto
porcentaje de recuperacin de estos microorganismos es interesante debido a la
marcada diferencia en temperatura corporal entre reptiles y mamferos, y en
consecuencia se puede decir que las bacterias aisladas a pesar de ser mesfilas;
84

pueden tener una adaptacin a la temperatura llegando a desarrollarse a temperaturas
inferiores de lo esperado
(Boyer, 1992)
Se han aislado tambin, Citrobacter, Klebsiella, y
Proteus, las cuales aunque son flora normal, bajo ciertas condiciones pueden llegar a
producir septicemias, enterocolitis y diarreas; Escherichia coli puede producir dolor
abdominal, diarrea, vmito y fiebre; Klebsiella produce enfermedades respiratorias y
Citrobacter alteraciones a nivel del colon
(Martnez, et al, 2003).

Es necesario conocer la particular poblacin saprofita en los reptiles debido a que
cualquier causa que altere este equilibrio puede desencadenar diarrea u otras patologas
digestivas
(Martnez, et al, 2003).
Adicionalmente, hasta el momento se han realizado anlisis
como este en otras especies de reptiles, como

serpientes y tortugas; sin embargo, la
informacin que se ofrece en este trabajo es la primera descripcin microbiolgica
realizada hasta la fecha en las especies de Crocodylus intermedius manejadas en
Colombia.

La poblacin bacteriana estudiada refleja, por tanto, la normalidad de la flora digestiva en
este grupo de reptiles y no pueden establecerse conclusiones evolutivas o adaptativas
sin la realizacin de estudios adicionales. Por lo tanto, el conocimiento de la
microbiologa cloacal de estas especies es fundamental para diagnosticar desordenes de
la flora digestiva as como prevenir procesos secundarios a estrs e inmunosupresin,
todo ello dirigido a optimizar programas de conservacin como los implementados a
diario en la Estacin de Biologa Tropical Roberto Franco.

85

7. CONCLUSIONES
Se logr aislar e identificar mediante anlisis microbiolgicos la presencia de
enterobacterias del gnero Salmonella en ejemplares de tortugas y Crocodylus
intermedius mantenidos en cautiverio en la Estacin de Biologa Tropical Roberto
en la Ciudad de Villavicencio; estableciendo su ocurrencia en el 52% de los
estanques
Se comprueba que ninguna metodologa para el aislamiento de Salmonella es
por s sola suficientemente efectiva para la recuperacin del microorganismo; se
debe emplear ms de un tipo de muestra para obtener mayor porcentaje de
resultados positivos.
Los ejemplares de la E.B.T.R.F son portadores asintomticos de Salmonella sp.
, sin embargo, se deben implementar medidas de prevencin que minimicen su
potencial como patgeno oportunista, desencadenando cuadros clnicos de
salmonelosis.
La Norfloxacina es el antibitico ideal para tratar los ejemplares de la Estacin
Roberto Franco que puedan presentar sintomatologa asociada a salmonelosis,
aunque su administracin debe ser cuidadosa con el fin de evitar alteraciones en
la flora digestiva natural de los reptiles.
Las muestras obtenidas a partir del hbitat (agua, lodos y sedimento)
proporcionan mayor sensibilidad en la bsqueda de Salmonella sp que el
hisopado cloacal.
La mayor presencia de Salmonella sp. se obtuvo a partir de la poblacin neonatal
de caimn, aspecto que puede deberse a una transmisin vertical.
Teniendo en cuenta la presencia de aislamientos de Salmonella sp.
pertenecientes a los serogrupos B, C1, C2, D1 y otros atpicos, se hace
necesario implementar medidas de bioseguridad que disminuyan su riesgo
zoontico.
Este documento es el primer reporte sobre microbiologa entrica en ejemplares
de Crocodylus intermedius en Colombia, siendo un aporte bsico para los
programas de conservacin, reproduccin y repoblamiento de la especie.

86

8. RECOMENDACIONES
Realizar muchas ms investigaciones acerca de la microbiologa cloacal de
animales de la Clase Reptilia puesto que muchos se encuentran en peligro de
extincin y estos microorganismos bajo ciertas condiciones pueden llegar a
causar serios cuadros patolgicos e incluso la muerte de los ejemplares
Se recomienda realizar los aislamientos de Salmonella en reptiles a partir de
muestras de origen ambiental puesto que se obtiene mayor porcentaje de
aislamientos en relacin a hisopado cloacal y no se genera estrs en los
animales
Se plantea el uso de quinolonas como terapia antimicrobiana al encontrarse
100% de senbilidad a norfloxacina
Los medios de cultivo CHROMagar Orientacin
BD
y CHROMagar
Salmonella
BD
son altamente selectivos y diferenciales para el aislamiento e
identificacin de los microorganismos.
Se recomienda la implementacin de medidas de bioseguridad en la estacin
que disminuyan los factores de riesgo zoontico; incluso recoger peridicamente
el excremento de los animales y realizar prcticas de arado en los encierros
puede reducir la concentracin del microorganismo.

87

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106

10. ANEXOS
ANEXO N 1: Plano de la E.B.T.R.F

107

ANEXO N 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientacin

MICROORGANISMO APARIENCIA DE LAS
COLONIAS
PRUEBAS
CONFIRMATORIAS
E. coli Colonias rosadas
transparentes de tamao medio
con o sin halos alrededor

Grupo KES Colonias de tamao medio y
pigmento azul oscuro
BBL Crystal E/NF ,
Indol

Grupo PMP Colonias Beige o crema
redondeadas por halos marrn
BBL Crystal E/NF ,
Indol

Enterococcus sp. Colonias verde azul de tamao
pequeo

S. agalactiae Colonias pequeas , con
pigmento vede azul claro,

S. saprophyticus Colonias pequeas color
purpura opacas con o sin halos
Disco de 5 g
novobiocina
Otros (Incluyendo
Salmonella sp.)
Colonias sin pigmento, color
crema
Identificacin
bioqumica y
serologca.
108

ANEXO N 3. Sistema de Identificacin BBL Crystal para Entericos/NoFermentadores.

Anexo 3.1. Procedimiento para la identificacin de los microorganismos por sistema BBL
Crystal.

A. Sacar las tapas de la bolsa
B. Tomar un tubo de inoculo y etiquetarlo con el nmero de muestra. Aspticamente
con un asa estril tomar una colonia grande bien aislada o 4 5 colonias
pequeas a partir de una placa de agar Tripticasa soya con 5% de sangre de
cordero. Suspender las colonias en un tubo de fluido de inoculo BBL Crystal,
taparlo y agitarlo en un vortex durante 10 15 segundos. Posteriormente, marcar
la base con el nmero de muestra y verter todo el contenido del tubo fluido en el
rea objetivo de la base
C. Sostener la base con las dos manos y mover el inoculo de un lado a otro a lo
largo de las pistas hasta que se hallan llenado todos los pocillos. Descartar el
sobrenadante.
D. Alinear la tapa de forma que el extremo marcado de la tapa est en la parte
superior del objetivo de la base.
E. Apretar hasta percibir una ligera resistencia. Colocar el pulgar en el borde de la
tapa hacia la parte media del panel y hacer presin simultneamente hasta que
la tapa encaje.
F. Colocar los paneles en las bandejas y llevar a incubacin por 18 20 horas.

109

Anexo 3.2. Ficha tcnica de reacciones de color para Lectura de Resultados.

Anexo 3.3. Calculo del Nmero de Perfil

110

ANEXO N 4. Esquema de Kauffmann - White
Simplificacin del Esquema de Kauffmann White para identificacin de antgenos
somticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp.
ORGANISMO GRUPO ANTGENO
SOMTICO
ANTIGENO FLAGELAR
FASE 1 FASE 2

S. enteritidis
bioser Paratyphi A
ser Paratyphi B
variante Odense
bioser Java
ser Stanley
ser Schwarzengrund
ser Saintpaul
ser Reading
ser Chester
ser Sandiego
*
ser Derby
ser California
ser Typhimurium
variante
Copenhagen
ser Bredaney
ser Heilderberg

S. choleraesuis
bioser Kunzendorf

S. enteritidis
ser Braenderup
ser Montevideo
ser Oranienburg
ser Thompson
ser Infantis
ser Othmarseenn
*
ser Tennessee
ser Muenchen
ser Manhattan
ser Newport
*
ser Blockley
ser Litchfield
ser Tallahassee
ser Kentucky
bioser Miami

S. typhi

A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B

C
1
C
1

C
1
C
1
C
1
C
1
C
1
C
1
C
1
C
2
C
2
C
2
C
2
C
2
C
2
C
3
D
1

D
1

1,2,12
1,3,5,12
1,4,12
1,4,5,12
4,5,12
1,4,12,27
1,4, [5],12
4,5,12
4,5,12
4,5,12
1,4,5,12
4,5,12
1,4,5,12
1,4,12
1,4,12,27
[1],4,[5],12

6,7
6,7

6,7
6,7
6,7
6,7 [14]
6,7 [14]
6,7 [14]
6,7
6,8
6,8
6,8
6,8
6,8
6,8
(8), 20
1,9,12

9,12, Vi

a
b
b
b
d
d
e, h
e, h
e, h
e, h
f, g
m, t
i
i
i,v
r

c
[c]

e, h
g, m, s
m, t
k
r
y
z
29
d
d
e, h
k
l, v
z
4,
z
32
i
a

d

-
1,2
1,2
[1,2]
1,2
1,7
1,2
1,5
e, n, x
e, n, z
[1,2]
-
1,2
1,2
1,7
1,2

1,5
1,5

e, n, z
15
-
-
1,5
1,5
1,5
-
1,2
1,5
1,2
1,5
1,2
-
Z
6
1,5

111

Cont. Simplificacin del Esquema de Kauffmann White para identificacin de antgenos
somticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp
ORGANISMO GRUPO ANTGENO
SOMTICO
ANTGENO FLAGELAR
FASE 1 FASE 2

S. enteritidis
ser Berta
ser Enteritidis
*
ser Dublin
ser Panama
ser Javiana
bioser Pullorum
ser Anatum
ser Meleagridis
ser Give
ser Newington
ser Illinois
ser Senftenberg
ser Simsbury
ser Rubislaw
ser Poona
ser Worthington
ser Cubana
ser Florida
ser Madelia
ser Nottingham
*
ser Cerro
ser Siegburg
ser Minnesota
ser Urbana

D
1
D
1
D
1
D
1
D
1
D
1
E
1
E
1
E
1
E
2
E
3
E
4
E
4
F
G
1

G
2
G
2
H
H
I
K
K
L
N

9,12
1,9,12
1,9,12
1,9,12
1,9,12
9,12
3,10
3,10
3,10
3,15
(3), (15), 34
1,3,19
1,3,19
11
[1], 13,22, [36]
1,13,23
1,13,23
1,6,14,25
1,6,14,25
16
18
6,14,18
21
30

f, g, t
g, m
g, p
l,v
l, z
28
-
e, h
e, h
l,v
e, h
z
10
g, s, t
z
27
[d], r
z
z
z
29
d
y
d
z
4,
z
23
z
4,
z
23
b
b

-
-
-
1,5
1,5
-
1,6
l, w
1,7
1,6
1,5
-
-
[d], e, n, x
1,6
l, w
-
1,7
1,7
e ,n, z
15

[z
45
]
[1,5]
e, n, x
e, n, x

Nota: La primera columna indica el nombre de la serovariedad, en la segunda columna indica el serogrupo del
Ag O, en la tercera, estn consignados los Ags somticos (O). Los nmeros indican el o los factores del Ag O y
se escriben separados por una coma. En las ltimas columnas, se observan los Ags flagelares (H),
estableciendo los factores pertenecientes a la fase 1 (motil) denominados con letras minsculas y en la fase 2
(no motil) se usan nmeros. El signo (-) indica que la fase est ausente. Los factores entre parntesis
aglutinan dbilmente. Los factores somticos determinados por conversin fgica estn subrayados y los que
estn entre corchetes pueden estar presentes o ausentes.
* Serovariedades encontradas en reptiles
Fuente: Laboratorios DIFCO

112

ANEXO N 5: Interpretacin de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
TABLA DE INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Metodo de Difusin en Agar (Normas CLSI NCCLS Ao 2005)
AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE
(mm)
INTERMEDIO
(mm)
SENSIBLE
(mm)
AMICACINA 30g 14 15 - 16 17
AMOXICILINA/CLAVULANICO
Estafilococos Haemofilus
Enterobacterias

20/10 g
20/10 g

19
13

-
14-17

20
18
AMPICILINA
Entericos Gram Negativos
Estafilococos
Enterococos
Haemofilus sp.

10 g
10 g
10 g
10 g

13
28
16
18

14 -16

19-21

17
29
17
22
AMPICILINA/SULBACTAM
Entericos Gram Negativos y
Estafilococos
Haemofilus sp.

10 g

10 g

11

19

12-14

15

20
CARBENICILINA
P. aeruginosa
Enterobacterias y Acinetobacter

100g
100g

13
19

14-16
20-22

17
23
CEFACLOR
Haemofilus

30g
14
16
15-17
17-19
18
20
CEFALOTINA 30g 14 15-17 18
CEFAMANDOLE 30g 14 15-17 18
CEFAZOLINA 30g 14 15-17 18
CEFEPIME
N. gonorrea
Grupo Viridans
30g
30g
30g
14

21
15-17

22-23
18
31
24
CEFETAMET
N. gonorrea
10g
10g

14

15-17
18
29
CEFIXIMA
N. gonorrea
5g
5g

15

16-18
19
31
CEFMETAZOLE
N. gonorrea
30g
30g
12
27
13-15
28-32
16
33
CEFONICID 30g 14 15-17 18
CEFOPERAZONA 75 g 15 16-20 21
CEFOTAXIMA
N. gonorrea
Estreptococos Beta Hemoliticos
Grupo Viridans

30g
30g
30g
30g
14

25
15-22

26-27
23
31
24
28

113

TABLA DE INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS
Metodo de Difusin en Agar (Normas CLSI NCCLS Ao 2005)
AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE
(mm)
INTERMEDIO
(mm)
SENSIBLE
(mm)
CEFOXITINA
N. gonorrea
E. aureus y lugdunensis
E. coagulasa negativo excepto
lugdunensis
30g
30g
30g
30g
14
23
19
24
15 17
24-27
18
28
20
25

CIPROFLOXACINA
N. gonorrea
Haemofilus
5g
5g
5 g

15
27

16-20
28-40
21
41
21
CLORAMFENICOL
E.pneumoniae
Haemofilus
30g
30g
30g
12
20
25
13-17

26-28
18
21
29
DOXICICLINA 30g 12 13-15 16
ENROFLOXACINA 5g 15 16-20 21
ERITROMICINA
E.pneumoniae
15g
15g
13
15
14-22
16-20
23
21
ESTREPTOMICINA
Enterococos (alta resistencia)
Otros microorganismos

300g
10g

6
11

7-9
12-14

10
15
FLORFENICOL 30g 16 17-20 21
GENTAMICINA
Enterococos (alta resistencia)
Otros microorganismos

120g
10g

6
12

7-9
13-14

10
15
KANAMICINA 30g 14 14-17 18
NALIDIXICO ACIDO 30g 13 14-18 19
NITROFURANTOINA 10g 14 15-16 17
NORFLOXACINA 10g 12 13-16 17
PENICILINA G
Estafilococos
Enterococos
Estreptococos (- E. pneumoniae)
N. gonorrea

10U
10U
10U

28
26
14

27-46

29
15
24
47
RIFAMPICINA
Estafilococos Enterococos y
Haemofilus
E . pneumoniae

5g
5g

16
16

17-19
17-18

20
19
TETRACICLINA
Estafilococos
Estreptococos

30g
30g

14
18

15-18
19-22

19
23
SULFATRIMETOPRIM

1,25/23,75
g
10 11-15 16
VANCOMICINA 30g 14 15-16 17
114

ANEXO N 6. Muestras positivas para Salmonella sp. en cada estanque segn cada
muestreo.

x Muestreo N 1 (N = 129)

MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE
TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 76 )

N ESTANQUE
ORIGEN DE LA MUESTRA
AGUA /
SEDIMENTO
MATERIA FECAL /
ARENA
HISOPADO
CLOACAL
2 X
5 X
6 X X
7 X
14 x
21 X
22 X
25 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 9 (12,3 %)

Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 53)

N ESTANQUE
AGUA /
SEDIMENTO
MATERIA FECAL /
ARENA
HISOPADO
CLOACAL
30 X
31 X
34 X
38 X
43 X
45 X
46 X
47 X
48 X
51 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 10 (18,8%)
Caiman Adulto: 2 / Caiman Neonato: 6 / Caiman Juvenil: 2


TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 60)

N ESTANQUE
AGUA /
SEDIMENTO
MATERIA FECAL /
ARENA
HISOPADO
CLOACAL
11 X X
12 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (5%)

115

Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 34)

N ESTANQUE
AGUA /
SEDIMENTO
MATERIA FECAL /
ARENA
HISOPADO
CLOACAL
42 X
44 X
49 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (8,8 %)
Caiman Juvenil: 1 Caiman Neonato: 2


TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N =48)

N ESTANQUE
AGUA /
SEDIMENTO
MATERIA FECAL/
ARENA
HISOPADO
CLOACAL
8 X
24 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (4,2%)

Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N= 28)

N ESTANQUE
AGUA /
SEDIMENTO
MATERIA FECAL /
ARENA
HISOPADO
CLOACAL
33 X
36 X
TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (7.14 %)
Caiman Adulto: 2

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