Ecofisiologa del Cultivo in vitro

FOTOSNTESIS IN VITRO
Fotosntesis de plantas cultivadas in vitro
La fotosntesis neta de microplantas en condiciones ex vitro y analizada bajo condiciones
ambientales ptimas, comparada con la de plntulas obtenidas de semillas de esas mismas
especies es variable (Lee et al, 1985; Smith et al, 1986; Pospisilov et al, 1987; Kozai e
Iwanami, 1988; Pospisilov et al, 1988; Shimada et al, 1988; Yue et al, 1992). En
algunas especies, la tasa fotosinttica es especialmente baja, probablemente a causa del
marchitamiento que se produce al extraer las hojas del recipiente para proceder a su
medida (Grout y Aston, 1978; Donnelly y Vidaver, 1984; Donnelly et al, 1984; Grout y
Millam, 1985; Smith et al, 1986; Lees et al, 1991; Mohammed et al, 1992). Aunque
existe una gran variabilidad de respuestas en los valores de fotosntesis neta observados
respecto a la irradiancia o a la concentracin de COi, generalmente son similares a los que
presentan las plantas ex vitro (Pospisilov et al, 1987; Pospisilov et al, 1988; Slarov
et al, 1989; Kozai et al, 1990; Yue et al, 1992). Sin embargo, en algunas ocasiones,
como en Actinidia, Betula y Rubus la fotosntesis es inferior frente a distintas radiancias
(Donnelly y Vidaver, 1984; Smith et al, 1986; Infante et al, 1989). En otras especies, el
incremento de irradiancia aumenta la respuesta fotosinttica (Lee et al, 1985; Kozai et al,
1990). Curiosamente, la fotosntesis neta de Actinidia aumenta considerablemente al
aumentar la concentracin de C2nicamente hasta los 600 ppm (Infante et al, 1989).
El aparato fotosinttico y sus actividades enzimticas
El efecto de las condiciones ambientales de los cultivos sobre la fotosntesis de las plantas
in vitro ha sido revisado recientemente por Pospisilov et al, (1997). La actividad
Ribulosa-l,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) disminuye al aumentar la concentracin de
sacarosa en el medio de cultivo (por encima del 3%) (Hagimori et al, 1984; Watanabe et
al, 1990; Tanaka et al, 1991). Adems, las actividades Rubisco y Fosfoenolpiruvato
carboxilasa (PEPC), se ven claramente afectadas al aumentar la concentracin relativa de
oxgeno en el interior de la atmsfera de los recipientes de un 5% a un 21% (Tanaka et al,
1991; Hidder y Desjardins, 1994). Sin embargo en algunas ocasiones aunque se detectan
actividades apreciables de Rubisco en plantas micropropagadas en recipientes con baja
tasa de ventilacin, la asimilacin de COi, depende de la tasa de ventilacin, o lo que es lo
mismo de la disponibilidad de COi. El estudio de las enzimas Rubisco o PEPC puso de
manifiesto que las actividades varan durante las distintas fases de cultivo,
incrementndose en el inicio de los cultivos y disminuyendo al final (Kumar et al, 1988).
Adems parece que dichas actividades pueden estar condicionadas por los reguladores del
crecimiento empleados en cada fase de la micropropagacin.
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La Ecofisiologa Vegetal: Una Ciencia de Sntesis
Fotosntesis en el interior de los recipientes
De forma genrica podramos decir que en los recipientes de cultivo con baja tasa de
intercambio gaseoso, se pueden observar marcadas fluctuaciones diarias de la
concentracin de CCb en su interior. Adems, la liberacin de CCh durante la
respiracin que provoca un incremento de su concentracin al final del perodo oscuro,
puede depender de las especies, tamao de tallos o plantas, estado de desarrollo,
concentracin de azcares en el medio, volumen del recipiente, duracin del
fotoperodo, etc. (Pospisilov et al., 1997). A pesar de esta acumulacin, durante las
primeras horas (1 a 4 h) del fotoperodo, la concentracin de C2 disminuye hasta
niveles prximos al punto de compensacin, y por tanto la fotosntesis neta tambin
disminuye. En estas condiciones, los explantos precisan de una fuente de energa
exgena que se incorpora al medio de cultivo. Este hecho, unido a la baja
concentracin de C2 e intensidad de luz hace que se desarrolle en las plntulas una
nutricin hetertrofa, ya que no es sostenible la forma de nutricin autotrfica que
sera deseable para obtener un mejor rendimiento en la fase de aclimatacin de las
plntulas. Estudios recientes han demostrado que los explantos cloroflicos tienen, en
general, capacidad fotosinttica restringida principalmente por las bajas
concentraciones de C2 en el recipiente de cultivo durante el fotoperodo (Fujiwara et
al., 1987; Jeong et al, 1995) ms que por la baja capacidad fotosinttica de los
explantos (Pospisilov et al., 1997) (Fig. 4), debido a la baja tasa de intercambio
gaseoso, baja irradiancia y alto contenido en azcares del medio (Langford y
Wainwright, 1987; Kozai, 1991). Por tanto el nivel de heterotrofa, mixotrofa o
autotrofa depender, no slo de la capacidad fotosinttica de la especie en cultivo, sino
tambin de la composicin del medio, volumen y formas de los recipientes, y del
sistema de cierre de dichos recipientes. Adems, la fijacin de C2 se ve inhibida por la
presencia de azcares en el medio, aumentando significativamente en ausencia de
sacarosa (Solarova et al., 1989; Cournac et al., 1991), sobre todo si va acompaado de un
aumento en la concentracin de C2 atmosfrico (Kozai et al., 1991; Deng y Donelli,
1993). Otros autores han observado que concentraciones de azcar superiores a un 3%
disminuyen la fotosntesis neta (Langford y Wainwright 1987; Capellades et al, 1991;
Lees et al, 1991; Desjardins, 1995). En cualquier caso el estudio de la respuesta
fotosinttica frente a distintas concentraciones de C2 y de sacarosa, parece indicar que el
desarrollo del aparato fotosinttico depende principalmente de la concentracin de C2
existente en los recipientes de cultivo (Solarova et al, 1989; Posposilov et al, 1992).
Normalmente, los explantos cultivados en medios con sacarosa acumulan grandes
cantidades de almidn en los cloroplastos debido a la baja exportacin de azcares fuera
de la hoja (Capellades et al, 1991). Incluso la anatoma foliar cambia, encontrndose
diferencias notables en la acumulacin de almidn del estroma y en la anatoma de las
clulas del parnquima en empalizada (Dimassi-Theriou y Bosabalidis, 1997).
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Ecoflsiologa del Cultivo in vitro
Figura 4. Fotosntesis neta de plntulas de Cymbidium en el interior del recipiente de cultivo frente a la
concentracin de C2.
Utilizacin del potencial fotosinttico durante las fases de micropropagacin
De los distintos datos recogidos en varias revisiones (Kozai, 1992; Pospisilov et al.,
1997). Se pueden enunciar los siguientes principios respecto a la fotosntesis de tejidos o
plantas durante las distintas fases de la micropropagacin (Tabla 5):
Tabla 5. Ventajas y limitaciones del potencial fotosinttico en la micropropagacin de plantas
1. Las hojas de explantos/tallos/plantas in vitro tienen capacidad fotosinttica
2. La capacidad fotosinttica est restringida por una baja concentracin de C2 durante el fotoperodo
3. Existe un crecimiento obligadamente hetertrofo o mixtrofo
4. La actividad Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) y la fotosntesis neta disminuyen al aumentar la
concentracin de sacarosa por encima del 2%
5. Una elevada irradiancia no aumenta la tasasfotosinttica si la concentracin de C2 es limitante
6. Las plantas crecen ms rpidamente bajo condiciones de autotrofa, con elevada irradiancia y C2, que en
condiciones de hetera- o mixotrofa
7. El crecimiento inicial bajo condiciones auttrofas es mayor para explantos con hojas de mayor rea y
elevada capacidad fotosinttica
8. La composicin del medio de cultivo definida para la micropropagagin hetera- o mixtrofa no es
adecuada para la micropropagacin auttrofa
9. La falta de renovacin del aire en el interior de los recipientes (adems de la baja concentracin de C2
tambin limita la fotosntesis)
10. La renovacin del aire sea por difusin o ventilacin forzada promueve la fotosntesis y el crecimiento
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Sistemas de medida de fotosntesis in vitro
La posibilidad de enriquecer con C2 los recipientes de cultivo ha conducido al desarrollo
de sistemas de medida de la tasa de fotosntesis en condiciones in vitro. Inicialmente la
fotosntesis de las plantas producidas in vitro, fue analizada utilizando una pequea cmara
de asimilacin con una sistema de aire forzado bajo condiciones ambientales controladas.
En estos sistemas la concentracin de C2 del aire que se mueve desde dentro hacia afuera
de la cmara se mide con un analizador de infrarrojos (Grout y Aston, 1978; Donnelly y
Vidaver, 1984; De et al, 1993). Sin embargo las condiciones fsicas y fisiolgicas en la
cmara de medida, pueden ser diferentes de las encontradas habitualmente en los
recipientes de cultivo. Por ello la medida de la fotosntesis neta in situ puede diferir de la
obtenida en una cmara de asimilacin con idntica concentracin de COi, irradiancia, y
temperatura a las del interior del recipiente.
Figura 5. Diagrama que muestra la configuracin de un sistema de cultivo fotoautotrfico con control de la
concentracin de C2 en lnea mediante analizadores de infrarrojos. El flujo de gas y medio de cultivo se
representan por lneas slidas y las seales elctricas por trazos.
Sistemas alternativos para medir fotosntesis in situ han sido desarrollados por Falqu
et al (1991) y Fujiwara et al (1992). Utilizando analizadores de infrarrojos (Fig. 5) para
medir el C2, con la limitacin de que la tasa de flujo mnima para el anlisis en este tipo
de equipos es de 0,3 L min"
1
, lo que puede producir alteraciones del ambiente de los
recipientes, ya que los valores de la tasa de intercambio de C2 no son suficientes para
determinar algunos parmetros de la fotosntesis. Por tanto en muchas ocasiones la tasa
fotosinttica no refleja los valores reales que se obtendran con una ventilacin natural por
difusin. Un aspecto importante que debe ser considerado en este tipo de estudios es que la
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fotosntesis neta de explantos y plntulas en cultivo de tejidos, en situaciones de
ventilacin forzada, es superior a la que se obtiene con ventilacin por difusin
(Nakayama et al, 1991; Kubota y Kozai, 1992). Recientemente, Niu et al (1998) han
diseado un sistema que integra las aplicaciones y posibilidades de control descritos hasta
la fecha, y que puede analizar la concentracin de C2 mediante un cromatgrafo de gases
(Fig. 6).
A. Analizador de C2
B. Bomba
C. Controlador de CO
2
CO
2
. Cilindro de CO
2
D. Deshumidificador
Fr. Regulador de flujo
Fg. Filtro membrana atmsfera
Fp. Prefiltro
Fs. Filtro membrana sustrato
Ps. Bomba peristltica
R. Botella de nutrientes
Tg. Reloj de control de
vlvulas solenoides
Ts. Reloj de control de la
bomba peristltica
V. Vlvula de dos o tres vas
Figura 6. Diagrama de un sistema para estimar la transpiracin y fotosntesis neta de plntulas in vitro a
diferentes valores de humedad relativa.
ACLIMATACIN Y CRONOLOGA DE LA ACLIMATACIN
Las caractersticas fisiolgicas y anatmicas de las plantas obtenidas en recipientes con
baja tasa de intercambio gaseoso hacen imprescindible realizar una aclimatacin
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