Micotoxinas: introdução aos conceitos e definições

Captulo 1.
Micotoxicologia

Sumrio

Neste captulo visa-se fazer uma introduo ao estado actual de conhecimento na rea da micotoxicologia, e
introduzir conceitos e definies que so usados no decorrer da dissertao.

1. O que so micotoxinas...................................................................................................................................... 12
2. Produo de micotoxinas e sua presena em alimentos.................................................................................... 30
3. Fungos produtores de micotoxinas.................................................................................................................... 38
4. Deteco, quantificao e identificao de fungos filamentosos em comodidades agrcolas e alimentos........ 55
5. Mtodos de determinao de micotoxinas........................................................................................................ 59

CAPTULO 1. MICOTOXICOLOGIA
1. O que so micotoxinas

Os fungos so capazes de produzir em condies naturais e laboratoriais, metabolitos
secundrios txicos. Os metabolitos secundrios so compostos biossintetizados e excretados
atravs de um conjunto de vias metablicas (que constituem o metabolismo secundrio), mas
que no so essenciais para o crescimento e sobrevivncia do organismo (Betina, 1989). Estes
compostos esto presentes no meio de cultura ou substrato onde os fungos esto a crescer.
Alguns metabolitos secundrios fngicos tm propriedades antibiticas, e alguns demonstram
toxicidade para animais. Os metabolitos secundrios produzidos por fungos filamentosos que
demonstram propriedades txicas em animais so designados genericamente de micotoxinas
(CAST, 2003). Algumas destas micotoxinas foram detectadas em alimentos, e destes que se
ocupa a dissertao. Como tal, o termo micotoxina ao longo da dissertao usado com o
sentido de metabolitos secundrios produzidos por fungos que ocorrem naturalmente como
contaminantes de produtos agrcolas, e que demonstram toxicidade quando administrados
por uma via natural, essencialmente por via oral (Abramson, 1998).
As micotoxinas so um grupo diverso de substncias qumicas, que podem afectar muitos
rgos e sistemas, principalmente o fgado, rins e sistema nervoso, endcrino e imunitrio.
No se sabe quantas micotoxinas e metabolitos fungicos txicos existem ao certo, apesar de
ser possvel fazer uma estimativa. Turner (1978) catalogou aproximadamente 1200
metabolitos secundrios produzidos por fungos. Turner e Alderidge (1983) catalogaram mais
2000 metabolitos produzidos por aproximadamente 1100 espcies, o que, em mdia, d dois
metabolitos nicos por espcie. Hawksworth (1991) estimou que existem cerca de 69000
espcies fngicas conhecidas, o que representa 5% das espcies fngicas que se estima que
existam no mundo, isto , 1,5 milhes. Se assumirmos que existem dois metabolitos nicos
por espcie, podem existir cerca de 3 milhes de metabolitos secundrios produzidos por
fungos. Aproximadamente 10% dos metabolitos secundrios descritos por Turner e por
Turner e Alderidge foram classificados como sendo txicos por Cole e Cox (1981). Estes
investigadores listaram aproximadamente 300 compostos txicos, mas estima-se que possam
existir entre 20000 a 300000, bem como uma grande diversidade de mecanismos de aco
(CAST, 2003). Como tal, o nmero de metabolitos txicos e micotoxinas por descobrir
muito grande. No entanto, o nmero de micotoxinas que so detectadas com frequncia em
alimentos reduzido, entre 20 a 30 (V. seco 1.3, Tabela 1.2, p. 23).
12
A principal via de exposio dos animais a micotoxinas atravs da ingesto de alimentos
contaminados, apesar de existirem casos espordicos de inalao de micotoxinas e contacto
dermal. As culturas agrcolas, especialmente os cereais, so susceptveis ao ataque de fungos,
no campo ou durante o armazenamento. Os nveis de micotoxinas nos alimentos podem
flutuar grandemente e variar de ano para ano, consoante as condies para o crescimento de
fungos. Quando presentes em nveis elevados na dieta alimentar, podem levar a problemas
agudos de sade e at morte. A exposio prolongada a nveis baixos de micotoxinas pode
levar a manifestaes ocultas e insidiosas (imunidade debilitada, atrasos no crescimento,
susceptibilidade a doenas), e a problemas crnicos de sade, o que suscitou preocupao por
parte de diversas organizaes internacionais. Vrias micotoxinas foram classificadas pela
Agncia Internacional para a Investigao em Cancro (IARC) como carcinognicos humanos
ou potenciais carcinognicos humanos (IARC, 1993).
Em termos de exposio e severidade de leses crnicas, em particular cancro, estima-se
que as micotoxinas apresentem um risco maior que os contaminantes antropognicos,
pesticidas e aditivos (Tabela 1.1).

Tabela 1.1. Avaliao comparativa do risco (agudo e crnico) de diversos contaminantes alimentares (adaptado
de Kuiper-Goodman, 1998)
Agudo Crnico
Elevado
Microbiolgicos Micotoxinas
Ficotoxinas Contaminantes antropognicos
Algumas fitotoxinas Algumas fitotoxinas
Micotoxinas Dietas desiquilibradas
Contaminantes antropognicos Ficotoxinas
Aditivos alimentares Microbiolgicos
Resduos de pesticidas Aditivos alimentares
Resduos de pesticidas
Baixo

Apesar de haver variaes geogrficas e climticas na produo e ocorrncia de
micotoxinas, a exposio a estas substncias ocorre em todo o mundo e estima-se que muitos
dos alimentos mundiais estejam contaminados em alguma extenso. A contaminao dos
alimentos com micotoxinas especialmente relevante quando uma dada populao baseia a
sua alimentao num tipo de produto (v.g., arroz). Se essa fonte est contaminada, a
populao est continuamente exposta micotoxina, e a histria mostrou que essa situao
pode levar ao aparecimento de micotoxicoses graves.
13

1.1. Perspectiva histrica

Foi no final do sculo XIX e incio do sculo XX que o conceito de metabolismo
secundrio nos fungos e outros organismos ganhou aceitao. Simultaneamente, o conceito de
antibiose atraa cada vez mais as atenes dos cientistas.
A descoberta mais relevante para a humanidade sobre a importncia dos metabolitos
secundrios produzidos por fungos deu-se por Alexander Fleming em 1928-1929, ao
descobrir as potencialidades antibiticas da penicilina (Fleming, 1929). A relevncia da
descoberta foi devida ao facto de Fleming ter verificado que a penicilina era uma substncia
bactericida e bacterioltica, que no apresentava toxicidade para animais mesmo quando em
doses elevadas. Foi esta caracterstica que permitiu que mais tarde, Howard Florey e Ernst
Chain explorassem o uso da penicilina como agente teraputico na cura contra doenas
bacterianas (Chain et al., 1940), dotando a medicina duma arma importantssima na cura
destas doenas, salvando incontveis vidas desde a segunda guerra mundial at hoje.
A capacidade de certos fungos causarem doena por ingesto de alimentos contaminados
j era reconhecida desde a antiguidade. A micotoxicose mais antiga de que se tem
conhecimento o ergotismo, doena devida ingesto de produtos elaborados a partir de
cereais contaminados com esclercios do fungo Claviceps purpurea. Vrios surtos da doena
ocorreram na Europa durante a Idade Mdia. Os esclercios so estruturas de resistncia
visveis nas espigas. A contaminao do centeio por este fungo era to comum que estava
inclusive representado nas ilustraes da espcie de centeio. As micotoxinas de Claviceps
purpurea produzem uma sensao de fogo nas extremidades do corpo (mos e ps) e
alucinaes, podendo levar morte. Numa poca de misticismo e religiosidade, estes
fenmenos eram interpretados como bruxaria, conduzindo morte na fogueira de pessoas
apontadas como bruxas. Na Europa, a ligao da doena aos esclercios do fungo s foi
estabelecida no sculo XVII por Thuillier, mas a descoberta de que a estrutura esclerocial
observada pertencia a um fungo, Claviceps purpurea, s foi descoberta por Tulasne cerca de
200 anos depois (Frade & Alfonso, 2003). No entanto, os Assrios designavam o ergot de
gro louco, o que indica que j teriam conhecimento dos seus efeitos na antiguidade.
O facto de que a ingesto de cereais contaminados com fungos podia levar a doenas foi
tambm reconhecido na Rssia e na sia. Na Rssia, desde o incio do sculo XIX que se tem
conhecimento duma doena devida ingesto de cereais que foram deixados nos campos aps
14
o Inverno, a Aleukia Txica Alimentar (ATA). Os gros colhidos na primavera eram txicos,
ao contrrio dos colhidos no Outono. Mas a histria conturbada de guerras da Rssia nem
sempre permitiu a existncia de mo-de-obra para a colheita dos campos, o que se veio a
verificar mais uma vez na segunda guerra mundial e nos anos que a seguiram. Entre 1942-
1947, verificaram-se violentos surtos de ATA, levando morte milhares de pessoas.
No J apo, uma doena afligia os consumidores de arroz contaminado com fungos,
conhecida desde o sculo XIX: o beri-beri cardaco. Sakaki conduziu estudos pioneiros em
1891 e estabeleceu a etiologia da doena. Ao administrar arroz com bolor a coelhos, verificou
que este tinha efeitos neurotxicos. O problema continuou a ser investigado nos anos
seguintes, e culminou na descoberta da presena de fungos txicos no arroz, Penicillium
citreonigrum. O metabolito txico responsvel pela doena foi isolado em 1947 por Hirata
(Subramanian, 1983).
Poucos esforos foram feitos antes dos anos 60 do sculo XX para reunir a informao
dispersa sobre os registos de envenenamento em animais e humanos por fungos. Em 1933,
Steyn faz uma introduo ao tema da implicao dos fungos na sade humana e animal,
atravs de experincias dos efeitos da ingesto de alimentos contaminados com bolores em
animais. Em 1954, o russo Sarkisov faz uma reviso sobre as micotoxicoses na USSR,
descrevendo as toxicoses e os fungos causadores, entre as quais faz vrias referncias ATA
(Ainsworth & Austwick, 1959). Mas o termo micotoxicose, donde deriva o termo micotoxina,
foi popularizado por Forgacs e Carll (1955), sendo sinnimo de doena causada por toxinas
produzidas por fungos.
A associao da doena com o alimento contaminado era feita atravs da administrao de
doses orais conhecidas do alimento suspeito a animais, bem como testes dermatolgicos
usando extractos. Adicionalmente, era necessrio isolar e identificar os bolores presentes no
alimento e testar individualmente cada espcie por administrao oral e testes dermatolgicos
usando extractos do miclio em cultura pura e no substracto em que o fungo foi detectado. Os
investigadores verificaram que existiam estirpes toxignicas e estirpes atoxignicas. Mas
salvo raras excepes, as toxinas envolvidas no foram quimicamente identificadas.
Foi no incio dos anos 60, com a doena X dos pers, que se atrau a ateno para as
micotoxinas e as suas implicaes na sade humana e animal, impulsionando
verdadeiramente a micotoxicologia. A doena X dos pers vitimou milhares de pers na
Inglaterra, e foi assim designada pois a causa da morte dos animais era desconhecida.
Esforos de investigao mostraram que a morte se deveu ingesto de raes contaminadas
com um metabolito txico produzido por um fungo, Aspergillus flavus. O composto qumico
15
txico foi isolado e identificado: aflatoxina. Os trabalhos e a literatura cientfica sobre a
ocorrncia, toxicologia e produo de micotoxinas a partir desta data tm vindo a aumentar
(Figura 1.1).
Estudos subsequentes permitiram verificar que vrias doenas humanas eram devidas
ingesto de micotoxinas, ou em que micotoxinas estavam aparentemente implicadas (CAST,
2003). Permitiram tambm identificar os metabolitos txicos envolvidos em micotoxicoses
previamente descritas, como a ATA, cujos principais efeitos foram devidos a tricotecenos (em
particular, toxina T2).
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Patulina
Toxinas de
Fusarium
Ocratoxinas
Aflatoxinas

Figura 1.1. Nmero de artigos publicados entre 1956 at finais de 2004 em perodos de 4 anos sobre as
micotoxinas mais investigadas devolvidos pelo motor de busca Scirus
1
: aflatoxinas, ocratoxinas, patulina e
toxinas de Fusarium (deoxinivalenol, fumonisinas, zearalenona e toxina T-2)

A preocupao com a presena de micotoxinas em alimentos e suas implicaes na sade
aumentou medida que se foram descobrindo novas micotoxinas e se reunem dados sobre a
sua ocorrncia natural em alimentos e sobre a sua toxicidade em animais. Alm dos casos de
intoxicaes agudas, comeou-se a pensar em possveis efeitos crnicos derivados da sua
ingesto.
Mas o estabelecimento da etiologia de doenas humanas com micotoxinas provou no ser
tarefa fcil. Exemplo disso foi a tentativa de estabelecimento da ocratoxina A (OTA) como

1
URL: http://www.scirus.com(acedido em 12/12/2004)
16
causa etiolgica da Nefropatia Endmica dos Balcs (BEN), uma doena crnica renal de
longa latncia.
A OTA foi uma das primeiras micotoxinas a ser descoberta aps as aflatoxinas. Foi
isolada e identificada a partir duma cultura de Aspergillus ochraceus por van der Merwe
(1965). Os principais efeitos txicos observados foram danos no fgado e nos rins. Em 1973, a
presena de OTA e de outra micotoxina, a citrinina, foi associada com a nefropata suna
(Krogh et al. 1973). Estudos subsequentes parecem apoiar esta suposio, e ligam a OTA
etiologia da micotoxicose suna mais fortemente, quando se observa que possvel induzir a
doena experimentalmente por administrao de raes contaminadas com a micotoxina a
porcos e outros animais (Krogh, et al., 1974; 1976). Adicionalmente, a presena de OTA foi
detectada a ocorrer naturalmente em cereais e em rins de animais com nefropatia,
aparentemente confirmando a OTA como substncia causadora da doena (Krogh, 1977).
A micotoxina foi implicada numa nefropatia humana de etiologia desconhecida, cujos
sintomas e leses renais observados eram semelhantes nefropatia suna, a BEN (Elling &
Krogh, 1977). A associao da micotoxina doena foi feita devido semelhana da
patologia e ao facto de se terem encontrado nveis de OTA mais elevados nos alimentos de
habitantes na rea onde a doena era endmica comparativamente aos locais onde a doena
era ausente (Pavlovic et al., 1979). Rastreios ao sangue de pessoas de reas afectadas e no
afectadas pareciam indicar que a OTA era mais frequentemente detectada e regra geral, em
nveis mais elevados, no sangue de pacientes afectados (Petkova-Bocharova et al., 1988). Mas
os resultados eram contraditrios entre investigadores, e a ligao entre as toxinas fngicas e a
BEN puramente circunstancial e inconclusiva. Mais de 20 anos depois da suposio de que a
OTA poderia estar envolvida na etiologia da BEN, a etiologia da doena continuava
desconhecida (Bozic et al., 1995; Tatu et al., 1998). A doena foi associada a tumores nos rins
e uretra, verificando-se que o problema da BEN era no s renal, mas tambm oncolgico.
Apesar de parecer evidente que a doena era causada por factores ambientais, outras possveis
causas para a doena foram investigadas, em particular a presena de hidrocarbonetos
aromticos policclicos na gua, bem como outros compostos txicos derivados de minas de
carvo, como as lenhites do Plioceno (Orem et al., 1999). Esta ltima hiptese parecia muito
promissora, visto que se conseguiu estabelecer uma forte ligao entre a distribuio
geogrfica da BEN e a presena de compostos aromticos txicos na gua de poos. No
entanto, a controvrsia ainda parece estar longe de terminar. Poucos anos depois, foi
publicado um estudo em que se tambm se detectou uma associao entre a incidncia de
OTA em cereais e a distribuio geogrfica da BEN (Puntaric et al., 2001). Para uma reviso
17
recente da problemtica da BEN e micotoxinas, deve consultar-se a publicao de Pfohl-
Leszkowicz e colaboradores (2002).
O facto de no se conseguir estabelecer com frequncia uma relao directa entre a
ingesto de micotoxinas de reconhecidos efeitos txicos quando testadas em animais e entre
doenas de ocorrncia natural valeu-lhes a designao de venenos insidiosos. O nmero
crescente de micotoxinas detectadas em alimentos levanta questes de sade pblica de
resposta difcil, como quais as micotoxinas importantes para a sade e em que doses. A co-
ocorrncia de micotoxinas suscita preocupao, mas ainda se sabe pouco sobre potenciais
efeitos sinergsticos ou antagnicos com outras substncias. A determinao das doses
mximas de micotoxinas que se podem ingerir sem causar riscos para a sade so difceis de
determinar, mas a avaliao do risco das micotoxinas para a sade necessrio para a
proteco do consumidor e para o estabelecimento de limites legais quanto presena destes
contaminantes nos alimentos.

1.2. Avaliao de risco das micotoxinas para a sade

A avaliao de risco apresentada nesta dissertao est de acordo com o quadro de
anlise de risco proposto pela FAO/OMS (1995) (Figura 1.2). Segundo este quadro
conceptual, a anlise de risco composta por 3 partes: avaliao de risco, gesto de risco e
comunicao de risco. Cada uma destas grandes esferas de influncia sobrepe-se com as
outras. Esta abordagem considera tanto factores de risco baseados em princpios cientficos
como de no risco, de cariz socio-econmico englobados na gesto do risco, ou de
comparao de risco englobados na comunicao do risco, para conseguir solues prticas,
como directivas quanto aos limites mximos admissveis de contaminantes em alimentos e/ou
procedimentos que visem prevenir o problema.
18
Avaliao de risco
Identificao do perigo
Caracterizao do perigo
Avaliao da exposio
Caracterizao de risco
Comunicao de risco
Comparao
Interaco
Estabelecimento de prioridades
Educao
Gesto de risco
Riscos aceitveis
Preveno
Opes
Custo/Benefcio
Legislao
Avaliao de risco
Identificao do perigo
Caracterizao do perigo
Avaliao da exposio
Caracterizao de risco
Comunicao de risco
Comparao
Interaco
Estabelecimento de prioridades
Educao
Gesto de risco
Riscos aceitveis
Preveno
Opes
Custo/Benefcio
Legislao

Figura 1.2. Quadro conceptual de anlise de risco da FAO/OMS (1995)

Idealmente, a avaliao do risco duma micotoxina para as populaes requer um
levantamento toxicolgico completo, um estudo epidemiolgico, um estudo de exposio da
populao ao composto e a caracterizao do risco. H dois conceitos a ter em conta na
avaliao de risco: perigo e risco. Por perigo entende-se a propriedade intrnseca da
micotoxina que causa efeitos adversos na sade sob dadas condies. Esta definio implica
que, com algum grau de certeza, em condies semelhantes o agente causa efeitos adversos
semelhantes na sade. O risco definido como a probabilidade estimada de um efeito adverso
na sade, ponderado pela sua severidade, ocorra em humanos como resultado da exposio
micotoxina na alimentao.

Identificao do perigo. As micotoxinas tm um vasto espectro de efeitos toxicolgicos, e
afectam diversos processos celulares. Esta diversidade de efeitos biolgicos requer uma
avaliao caso a caso e pode requerer uma variedade de tcnicas de extrapolao (V.
caracterizao do risco). A vasta ocorrncia de micotoxinas fez delas causa de micotoxicoses
humanas e animais e, como tal, o estabelecimento de risco usa informao de estudos
epidemiolgicos de humanos expostos.
Muitas micotoxinas tm propriedades carcinogneas que afectam vrios rgos, bem
como outras actividades txicas (v.g. demonstram actividade teratognica, imunossupressora,
neurotxica) ou hormonais (caso da zearalenona). Alm destas aces especficas, foram
observados perturbaes gastrointestinais, irritaes de pele e efeitos hematolgicos. So
19
estes estudos que determinam empiricamente o nvel de efeito adverso no observado
(NOAEL), que pode ser visto como o limiar. No entanto, h processos para os quais se
considera que no h limiar, como para as propriedades iniciadoras e promotoras de
carcinognese e progresso de tumores.

Caracterizao do perigo. A caracterizao do perigo a fase de extrapolao do
estabelecimento de risco. Tem por objectivo fazer uma caracterizao preditiva do perigo para
humanos, baseado em estudos animais (extrapolao a espcies) sob condies de baixa
exposio (extrapolao de doses altas a baixas). O resultado final da caracterizao de risco
a estimativa duma dose segura, como a ingesto diria tolervel provisria (PTDI). O termo
tolervel implica a noo de que as micotoxinas no so necessrias para o nosso organismo.
As doses dirias tolerveis (TDI) s so determinadas quando provvel que haja um limiar
na relao dose/efeito, baseado no mecanismo e modo de aco. Para obter uma TDI para
humanos, prtica comum dividir-se o NOAEL por um factor de segurana de 100, quando
se extrapola para humanos e animais. Isto toma em considerao um factor 10 para diferenas
entre espcies e outro factor 10 para variao intraespecfica (neste caso, intra-humano).
Quando h efeitos irreversveis para os quais esto estabelecidos limiares (caso dos
carcinognicos no genotxicos) ou quando h dados insuficientes, podem ser adicionados
factores de incerteza. Para os carcinognicos genotxicos ou agentes genotxicos (patulina),
como se considera que no h limiar, uma TDI no pode ser determinada. Quando a sua
presena no pode ser evitada, podem-se estabelecer atravs de extrapolao de efeitos por
modelos matemticos doses em que se considera que o risco negligencivel.
Alternativamente, as estimativas de uma dose segura podem resultar de estudos
epidemiolgicos apropriados, sempre que estejam disponveis. Apesar de ser difcil de
determinar, a TDI pode ser vista como uma propriedade intrnseca duma dada micotoxina,
que toma em considerao tanto a potncia dos efeitos medidos como factores biolgicos,
tendo em conta a severidade, relevncia e significncia dos efeitos para humanos.

Avaliao da exposio. A exposio s micotoxinas depende do nvel destas substncias
nos diferentes alimentos e da ingesto desses alimentos pela populao. Podem existir grandes
diferenas nacionais e regionais quanto ingesto dos alimentos, devido a hbitos alimentares
diferentes, o que faz com que as avaliaes de exposio sejam especficas para cada pas. Os
rastreios aos alimentos so feitos ao longo de vrios anos, para reunir dados sobre os nveis de
contaminao a que as populaes esto expostas. Podem-se refinar as estimativas com outros
20
factores, como processamento dos alimentos tanto pela indstria como em casa. A exposio
varia com a idade, com as crianas, regra geral, mais expostas a certos alimentos como o leite.
Estudos da exposio podem ser conduzidos avaliando os nveis de micotoxinas presentes no
sangue ou outros fluidos da populao.

Caracterizao do risco. A caracterizao do risco a estimativa qualitativa ou quantitativa,
incluindo a incerteza, da gravidade e ocorrncia provvel de potenciais efeitos adversos de
sade conhecidos numa populao exposta. Baseia-se na identificao e caracterizao do
perigo e avaliao da exposio. A caracterizao do risco permite o estabelecer de nveis de
exposio dirios micotoxina em que o risco seja insignificante durante o tempo de vida.
Como tal, a exposio tem de ser mais baixa que a TDI ou outra medida de dose segura. Para
substncias em que no pode ser determinada a TDI, a margem de segurana entre exposio
humana e efeitos adversos observados em espcies animais pode ser usado como um
indicador da possibilidade de ocorrerem efeitos nefastos em humanos, e pode ser usado desta
forma no estabelecimento de risco. Alm de considerar a populao normal, a caracterizao
de risco precisa de considerar aqueles grupos que so mais vulnerveis exposio, como
crianas (devido ao seu baixo peso corporal) ou outros grupos para os quais haja diferenas na
bio-disponibilidade, metabolismo ou disposio gentica, como os mais idosos. A este
respeito, tem de se examinar se um factor de 10 adequado para englobar estas diferenas na
susceptibilidade humana devido variabilidade humana.

1.3. Micotoxinas frequentemente detectadas

As micotoxinas mais frequentemente detectadas em alimentos bem como os seus efeitos
txicos em animais esto indicados na Tabela 1.2. Dada a relevncia da OTA para esta
dissertao, fez-se uma reviso das matrizes alimentares em que foi detectada a micotoxina
at ao momento da escrita desta dissertao (Tabela 1.3). Das micotoxinas listadas, as nicas
para as quais existem dados suficientes que permitiram realizar a avaliao de risco pela
J ECFA (V. seco 1.4.1, p. 22) so as aflatoxinas, deoxinivalenol (DON), OTA, zearalenona,
fumonisinas, toxina T-2 e patulina. Actualmente, as micotoxinas consideradas mais relevantes
para a sade so todas as mencionadas com a excepo da patulina, que no suscita
demasiadas preocupaes, devido sua ocorrncia limitada, principalmente em sumos e
21
outros derivados de ma, e existncia de medidas efectivas de controlo e legislao da
micotoxina nos produtos mencionados.
Outras micotoxinas, devido sua frequente ocorrncia em alimentos, co-ocorrncia com
micotoxinas relevantes, ou que se pensa que podem ter envolvimento em micotoxicoses
ocasionais (v.g. cido ciclopiaznico, esterigmatocistina, citrinina, micotoxinas
tremorgnicas, penitrininas, citrioviridinas, cido peniclico, toxinas de Alternaria) suscitam
alguma preocupao, mas no h dados suficientes para se estabelecer o risco real destas
micotoxinas para a sade.

1.4. Controlo de micotoxinas

O reconhecimento dos potenciais perigos causados por micotoxinas em alimentos pe
em cena estudos cientficos e mecanismos legais, para assegurar a segurana da fonte
alimentar. A necessidade de legislao que imponha limites quanto concentrao de
micotoxinas nos alimentos para proteco da sade dos consumidores aceite por todo o
mundo industrializado. Governos nacionais e organizaes internacionais desempenham um
papel fundamental em assegurar que os direitos dos cidados so defendidos.

1.4.1. Aces das organizaes internacionais

Moy (1998) reviu os esforos internacionais para avaliar e reduzir os riscos humanos por
consumo de micotoxinas. Em 1963, a FAO e WHO estabeleceram a Comisso Codex
Alimentarius, um organismo intergovernamental cujo propsito proteger a sade dos
consumidores e assegurar boas prticas no mercado alimentar. O Codex composto
actualmente por mais de 150 pases membros, e tem desenvolvido directivas e outras
recomendaes cujo propsito facilitar o comrcio internacional de alimentos. Com o
estabelecimento da Organizao Mundial de Comrcio (OMC) em 1995, os textos adoptados
pelo Codex so vistos como representativos do consenso internacional quanto aos requisitos
de sade e segurana dos alimentos. Os textos adoptados pelo Codex permanecem voluntrios
at serem aceites ou usados pelos pases, mas os acordos implementados pela OMC
providenciam uma forma para a adopo colectiva de normas, directivas e recomendaes do
Codex por todos os pases membros da OMC.
22
Tabela 1.2. Alimentos destinados alimentao humana em que foram detectadas micotoxinas e seus efeitos
txicos (adaptado de CAST, 2003)
Micotoxina Ocorrncia em alimentos Efeitos patolgicos causados pela micotoxina
Aflatoxinas (B1, B2,
G1, G2)
Amendoins, milho, trigo, arroz,
algodo, copra, nozes, leite, ovos,
queijo, figos, alimentos variados
Hepatoxidade
Hiperplasia dos ductos biliares
Hemorragia renal e do tracto intestinal
Carcinognese (tumores no fgado)
Aflatoxina M1 Leite Semelhante a aflatoxina B1
Citrinina Trigo, cevada, milho e arroz Nefrotoxicidade (necrose tubular do rim)
Nefropatia porcina
cido
ciclopiaznico
Milho, amendoins, queijo Necrose muscular
Hemorragia intestinal e edema
Leses orais
OTA Cereais (trigo, cevada, aveia e
milho), feijes desidratados,
amendoins com bolor, queijo,
tecidos porcinos, caf, passas, uvas,
frutos secos, vinho
Nefrotoxicidade (necrose tubular do rim)
Nefropatia porcina
Danos no fgado
Enterite
Teratognese
Carcinognese (tumores renais e tumores do
tracto urinrio)
Imunosupressora
Patulina Mas podres, sumo de ma Edema cerebral e pulmes
Hemorragia pulmunar
Danos nos capilares do fgado, bao e rins
Paralisia dos nervos motores
Convulses
Carcinognese (no confirmada)
Antibitico
cido peniclico Milho armazenado, cereais, feijes
desidratados, tabaco com bolor
Danos no fgado (fgado gordo, necrose celular)
Danos renais
Aco tipo Digitalis no corao
Dilatao dos vasos sanguneos
Antidiurtico
Edema em pele de coelho
Carcinognese
Antibitico
Penitrininas Queijo em creme com bolor, nozes
inglesas, hamburger, cerveja
Tremores, morte, descoordenao, diarreia com
sangue
Esterigmatocistina Caf verde, trigo com bolor, queijos
duros, ervilhas, algodo
Carcinognese
hepatoxicidade
Tricotecenos (toxina
T-2,
diacetoxiscirpenol,
neosolaniol,
nivalenol,
diacetilnivalenol,
DON, toxina HT-2,
fusarenona X)
Milho, trigo, cevada, aveia Perturbaes digestivas (emesia, diarreia, recusa
de alimentos)
Hemorragias (estmago, corao, intestinos,
pulmes, bexiga e rins)
Edema
Leses orais
Dermatite
Desordens sanguneas (leucopenia)
Zearalenona Milho Efeitos estrognicos (edema da vulva, prolapse da
vagina, alargamento do tero)
Atrofia dos testculos, atrofia dos ovrios,
aumento das glndulas mamrias
Aborto
Fumonisinas Milho e derivados, ch preto Leucoencefalomalacia e edema pulmonar
Carcinognese (cancro do esfago)

23
Tabela 1.2. Alimentos destinados alimentao humana em que foram detectadas micotoxinas e seus efeitos
txicos (adaptado de CAST, 2003) (continuao)
Micotoxina Ocorrncia em alimentos Efeitos patolgicos causados pela micotoxina
Alcalides do ergot
(clavinas, cidos
lisrgicos, amidas de
cido lisrgico,
ergopeptinas)
Cereais (trigo, centeio), milho
mido
Ergotismo (sindrome nervoso e gangrenal)
cido tenuaznico Tomates, frutos podres Nefrotxico
Hepatxico
hemorrgico

Tabela 1.2. Reviso dos alimentos onde foi detectada a presena de OTA desde 2000 at ao momento da escrita
da dissertao
Produto alimentar Referncia
Alcauz Majerus et al., 2000
Azeite Miraglia & Brera, 2002; Papachristou & Markaki,
2004
Cacau, Chocolate Miraglia & Brera, 2002; Bonvehi, 2004; Tafuri et
al., 2004
Caf vd Stegen et al., 1997; Leoni et al., 2000; Romani et
al., 2000; Otteneder & Majerus, 2001; Varga et al.,
2001; Fazekas et al., 2002; Lombaert et al., 2002;
Miraglia & Brera, 2002; Pardo et al., 2004
Cereais e seus derivados Campbell et al., 2000; Varga et al., 2001; Beretta et
al., 2002; Czerwiecki et al., 2002; Fazekas et al.,
2002; J orgensen & J acobsen, 2002; Miraglia &
Brera, 2002; Palermo et al., 2002; Blesa et al.,
2004a; Aragus et al., no prelo; Molini et al., no
prelo
Cerveja Visconti et al., 2000; Soleas et al., 2001; Miraglia &
Brera, 2002; Odhav & Naicker, 2002; Tangni et al.,
2002; Aragus et al. (no prelo);
Derivados de carne (fiambre, fumados) Chiavaro et al., 2002; Miraglia & Brera, 2002
Especiarias Vrabcheva, 2000; Miraglia & Brera, 2002
Figos e frutos secos Miraglia & Brera, 2002; MacDonald et al., 2003
Milho Machinski et al., 2001; Puntaric et al., 2001
Outros Miraglia & Brera, 2002
Tecidos porcinos Dragacci et al., 1999; J orgensen & Petersen, 2002;
Miraglia & Brera, 2002
Uvas e produtos derivados V. captulo 2, Tabelas 2.2 e 2.3

24
Os propsitos do Codex quanto s micotoxinas e outros contaminantes alimentares so
conseguir uma abordagem comum que passa por solues prticas, como o estabelecimento
de recomendaes quanto aos nveis mximos residuais admissveis em alimentos, quanto aos
procedimentos que visem prevenir o problema, e quanto aos mtodos de anlise e de
amostragem. Idealmente, estas recomendaes devero ser aceitveis tanto para os pases
produtores como para os importadores. As avaliaes cientficas da anlise de risco so a base
das recomendaes feitas pelo Codex no que diz respeito regulamentao internacional de
micotoxinas.
O processo de controlo de contaminantes alimentares pelo Codex inicia-se geralmente
com a identificao de potenciais problemas de sade. O Programa Internacional de
Segurana Qumica, patrocinado conjuntamente pela OMS, Programa Ambiental das Naes
Unidas e Organizao Internacional do Trabalho, estabeleceu em colaborao com o Instituto
Internacional das Cincias da Vida da Europa, um grupo cujo objectivo era desenvolver uma
lista preliminar das toxinas de plantas de ocorrncia natural consideradas como constitundo
um perigo para o consumidor. Este grupo lidera a recolha de informao disponvel
avaliando-a de acordo com critrios uniformizados, e encoraja e apoia a pesquisa em tpicos
em que seja necessria mais informao. Vrias micotoxinas esto sob considerao por este
comit director, incluindo muitas das mencionadas. Desde que exista informao suficiente
para documentar um potencial perigo, a substncia referida ao Comit Conjunto de Peritos
da FAO/OMS (J ECFA) para a caracterizao do perigo.
A J ECFA responsvel por reunir e avaliar dados em aditivos e contaminantes
alimentares e fazer recomendaes quanto aos nveis de segurana. As recomendaes da
J ECFA servem de base cientfica para o codex desenvolver directivas e outras
recomendaes. Em termos gerais, os propsitos e funes da J ECFA incluem: 1) reviso do
conhecimento e informao de peritos e tornar essas informaes disponveis para a FAO,
OMS e seus pases membros; 2) formular recomendaes tcnicas; 3) fazer recomendaes
com o propsito de iniciar, estimular e coordenar a investigao necessria para se chegar a
concluses sobre as implicaes toxicolgicas ou outras sobre a presena duma dada
substncia na comida (Moy, ob. cit.).
Para a maior parte das micotoxinas, os dados disponveis so insuficientes para permitir
uma avaliao pela J ECFA. No entanto, as seguintes micotoxinas j foram avaliadas:
aflatoxina M1, DON, fumonisinas, OTA, toxina HT2 e T-2 (J ECFA, 2001); patulina (OMS,
1996); zearalenona (OMS, 2000), e PTDI estabelecidas. Para as aflatoxinas, no podem ser
25
estabelecidas doses mximas, e a sua exposio deve ser reduzida ao mnimo possvel (OMS,
1998).
A IARC realizou numerosos estudos para estabelecer a carcinogenicidade de vrias
micotoxinas. Segundo a IARC, as micotoxinas so classificadas como carcinognicas para
humanos (grupo 1), possveis carcinognicas para humanos (grupo 2B), no classificveis
quando carcinogenicidade em humanos (grupo 3).
A nvel internacional, foi criado um programa de monitorizao de qumicos em
alimentos, para contribuir para o estabelecimento da exposio, designado de GEMS/Food.
Este programa, que engloba cerca de 70 pases, tem como objectivos informar os governos, a
Comisso Codex Alimentarius e outras instituies relevantes, bem como o pblico, quanto
aos nveis de contaminantes presentes nos alimentos, a sua contribuio para a exposio
humana total, e a sua significncia em termos de sade pblica e mercados. As micotoxinas
monitorizadas pelo GEMS/Food so aflatoxinas, OTA, DON, patulina e fumonisinas, em
diversos produtos alimentares (OMS, 2001). Periodicamente a base de dados da GEMS/food
avaliada, para estabelecer nveis e tendncias na contaminao dos alimentos.
Quando o risco est suficientemente bem caracterizado, podem ser consideradas vrias
opes de controlo. No entanto, como foi referido na seco 1.2, as decises de gesto de
risco devem incluir consideraes econmicas, sociais e polticas (factores de no-risco). Se o
contaminante for relevante no mercado internacional alimentar, as opes de gesto de risco
podem ser consideradas pelo Comit do Codex em Aditivos e Contaminantes Alimentares
(CCFAC) para elaborao no sistema do Codex. O CCFAC tenta desenvolver limites
mximos (MLs) de micotoxinas em certos alimentos. O sucesso desta iniciativa no caso da
aflatoxina foi limitado, visto que os pases adoptaram diferentes nveis nos alimentos. Na
ausncia de dados de confiana e consenso cientfico, h desacordos frequentes entre os
pases importadores e exportadores quanto ao estabelecimento de nveis regulatrios com base
na sua percepo de que nveis so conseguidos por boas prticas agrcolas e de fabrico. Por
isso, os governos nacionais estabeleceram nveis muito diferentes para as aflatoxinas. O
cumprimento destas polticas acarreta custos econmicos considerveis. A rejeio de
carregamentos alimentares resulta em custos econmicos significativos, particularmente para
os pases em desenvolvimento. Alm disso, os governos nacionais e organizaes
internacionais devotam recursos considerveis quanto aos mtodos de preveno, reduo ou
eliminao das micotoxinas dos alimentos.

26
1.4.2. Aces dos governos nacionais no controlo alimentar

Cerca de 100 pases possuem legislao sobre uma ou mais micotoxinas em diversos
alimentos (FAO, 2004). A tomada de deciso sobre que micotoxinas regulamentar, em que
produtos e em que nveis complexa. Na maior parte dos pases, as regulamentaes sobre
micotoxinas no foram baseadas em estabelecimentos de risco slidos. O estabelecimento de
limites por parte dum pas influenciado por diversos factores, como os mtodos analticos
disponveis para o controlo legal, os dados sobre toxicologia e ocorrncia da micotoxina em
alimentos usados no estabelecimento de risco, bem como a existncia de legislao noutros
pases com que existam trocas comerciais. A falta duma abordagem unificada entre pases
resultou numa grande variedade de recomendaes e regulamentaes no que diz respeito s
micotoxinas. Vrios factores dificultam uma abordagem comum. Um destes factores diz
respeito a conflitos entre interesses nacionais e comerciais. Os interesses dos pases
produtores no coincidem necessariamente com os dos importadores e a presena de
micotoxinas em alimentos pode levar a barreiras comerciais a menos que todas as partes
concordem em definir nveis seguros de micotoxinas e respeitar os seus prprios interesses.
Em geral, os pases produtores tm limites mais elevados para as micotoxinas nos produtos
que os pases importadores. Outros factores impeditivos dizem respeito diferente
interpretao e anlise dos dados usados no estabelecimento de risco consoante os pases, bem
como diferenas nos padres alimentares (Moy, 1998).

1.4.3. Posies adoptadas pela Europa e Portugal

Esto a ser feitos esforos no sentido de harmonizar os nveis mximos admissveis de
micotoxinas presentes em alimentos nos pases da UE, e a Comisso Europeia emitiu
regulamentaes nesse sentido. Na UE, a responsabilidade do estabelecimento toxicolgico
do contaminante para a sade humana e ambiente cabe ao Comit Cientfico dos Alimentos
(SCF). De seguida, vrios grupos de trabalho e comits de peritos com delegados de todos os
estados membros preparam propostas. Aps consultas detalhadas, entregue uma proposta ao
SCF para uma avaliao final, aps a qual a Comisso Europeia estabelece uma Comisso
Executiva com representantes de todos os estados membros, o que conduz adopo da
directiva ou regulamentao resultante. Visto que a UE um parceiro importante no comrcio
27
internacional, no estabelecimento de nveis mximos de micotoxinas so levadas em conta
normas internacionais (v.g. Codex Alimentarius) de forma a assegurar que o comrcio
internacional no impedido sem justificao. Correntemente esto regulamentados os nveis
de aflatoxinas e OTA em diversos produtos alimentares (Tabela 1.4), e o estabelecimento de
nveis mximos admissveis em caf e seus derivados, bem como em sumos de uva e vinhos,
foi votado a favor pelo Comit da Cadeia alimentar e Sade Animal da UE que representa os
estados membros. As regulamentaes podem ser encontradas nas pginas da UE na internet:
http://europa.eu.int/eur-lex/en/index.html.

Tabela 1.3. Nveis mximos admissveis de micotoxinas em alimentos estabelecidos na UE
Tipo de alimento Nveis mximos admissveis (g/kg)
Patulina Aflatoxinas OTA
B1 B1+B2+G1+G2 M1
Nozes e frutos secos - 2 8 4 - 15 - -
Cereais - 2 4 - 3 - 5
Leite - - - 0,05 -
Especiarias - 5 10 - -
Uvas passas - - - - 10
Sumos de frutas (excepto
uvas), mas e seus
derivados
10 - 50 - - - -
Sumo de uva 50 - - - 2*
Vinho - - - - 2*
Caf e seus derivados - - - - 5 - 10*
* aguarda adopo formal pela Comisso

Em Portugal, a autoridade responsvel pela anlise dos alimentos a Direco Geral
de Fiscalizao e Controlo de Qualidade Alimentar. Entre 1999 e J ulho de 2003, mais de 1000
amostras de frutos secos, nozes, especiarias e leite foram analisadas quanto presena de
aflatoxinas. Algumas amostras de amendoins, figos secos, pistchios, caril e noz-moscada
excederam os limites mximos admissveis para aflatoxinas. Quanto OTA, das cerca de 400
amostras diversas analisadas, foram detectados nveis elevados em algumas amostras de uvas
passas e caf. A incidncia de OTA nas amostras elevada, mas em baixos nveis. Anlises a
28
36 amostras recolhidas no mercado de sumos de ma e pra e outros produtos derivados no
ultrapassaram o limite mximo proposto para a patulina (Peito & Venncio, 2004).

1.5. Gesto de risco de micotoxinas

Sendo as micotoxinas contaminantes naturais, impossvel assegurar a sua completa
eliminao dos produtos alimentares. Mas a sua presena pode e deve ser minimizada a nveis
que no apresentem risco para a sade. Em algumas situaes recomenda-se a aplicao do
princpio ALAR, que significa to baixo quanto seja razovel.
possvel reduzir os nveis de micotoxinas nos alimentos atravs da implementao
de medidas de controlo, como a anlise de perigos e pontos crticos de controlo (HACCP). O
HACCP baseia-se na identificao e estabelecimento de perigos em alimentos, e na
implementao de formas de os controlar. A ideia da implementao de medidas de controlo
pr-activas, baseadas nos processos de fabrico, surge da percepo de que no possvel
assegurar produtos seguros apenas com base em anlises ao produto final, visto que
impossvel testar 100% dos produtos. O HACCP assenta na suposio de que boas prticas de
higiene, fabrico e armazenamento resultam na obteno de produtos finais com perigos
controlados, e assenta em 7 princpios:

Princpio 1. Identificar todos os perigos possveis desde a entrada e aprovisionamento das
matrias primas at obteno e despacho do produto final;
Princpio 2. Identificar os pontos crticos de controlo (pontos em que se pode controlar o
perigo) de cada um dos perigos identificados;
Princpio 3. Definir os limites crticos para os vrios perigos em cada ponto crtico;
Princpio 4. Definir o procedimento de monitorizao dos pontos crticos;
Princpio 5. Estabelecer o plano de aco (aces correctivas) a adoptar sempre que os
limites crticos sejam ultrapassados;
Princpio 6. Implementar um sistema de verificao do funcionamento do plano adoptado
(anlises a produtos, inquritos e monitorizao das actividades do pessoal, auditorias
externas);
Princpio 7. Implementar um sistema efectivo de registo do resultado de todos os testes
efectuados em cada ponto crtico.

29
A aplicao destes procedimentos ao controlo de micotoxinas est descrita no manual
da FAO (FAO, 2001).
Para que seja possvel identificar os perigos micotoxignicos que podem ocorrer, bem
como os pontos crticos de controlo, necessrio ter-se conhecimento de como e quando se
processa a contaminao dos alimentos com fungos micotoxignicos e quando e em que
condies se d a sntese de micotoxinas.

2. Produo de micotoxinas e sua presena em alimentos

A contaminao dos alimentos com micotoxinas resulta da infeco da cultura/alimento
por fungos toxignicos, frequentemente sem sintomas visveis a olho n.
A produo de micotoxinas pode dar-se ao longo de fases distintas da produo dos
alimentos. O esquema genrico da produo de alimentos at chegarem ao consumo humano
est elucidado na Figura 1.3.

Cultivo agrcola
Armazenamento/
Transporte
Consumo
humano
Consumo animal
Processamento
Colheita Cultivo agrcola
Armazenamento/
Transporte
Consumo
humano
Consumo animal
Processamento
Colheita

Figura 1.3. Diagrama representativo das fases de produo de alimentos at consumo humano

Os fungos toxignicos podem estar presentes nas vrias etapas da produo dos alimentos
at que chegam nossa mesa: durante o cultivo, colheita, armazenamento, transporte e
processamento. No possvel descrever um nico conjunto de condies que favorecem o
crescimento e produo de micotoxinas por fungos, porque os fungos micotoxignicos
diferem nas suas caractersticas ecolgicas, bioqumicas e nichos ecolgicos (captulo 3).
Como tal, difcil generalizar sobre estratgias de controlo, dada a diversidade de fungos
produtores de micotoxinas em diversas culturas antes e depois da colheita. Mas a
30
compreenso dos factores relevantes para a produo de micotoxinas por um dado fungo
numa dada comodidade agrcola permitem a definio de estratgias para combater o
problema. Os factores envolvidos na produo de micotoxinas em campo, isto , pr-colheita,
so distintos dos envolvidos no perodo ps-colheita, e so apresentados nas seces
seguintes. Grande parte do conhecimento que se tem sobre o fenmeno da contaminao de
culturas e alimentos com micotoxinas advm dos cereais. As micotoxinas mais estudadas
nestas matrizes foram as aflatoxinas, e mais recentemente, as toxinas de Fusarium. Por isso, a
maior parte das referncias citadas dizem respeito contaminao destas culturas com as
micotoxinas referidas. Apesar de se separarem ecologicamente os fenmenos de
contaminao pr e ps colheita, a produo de micotoxinas em alimentos frequentemente
um processo aditivo, que se inicia no campo e aumenta durante a colheita, armazenamento ou
processamento.

2.1. Pr-colheita

O perodo pr-colheita inicia-se com a emergncia da planta do solo e termina com a
colheita da cultura. A produo de micotoxinas nas plantas pode dar-se durante o seu
crescimento e a produo de micotoxinas acumular-se em diferentes concentraes nos rgos
das plantas afectadas. Os pr-requisitos essenciais para a produo de micotoxinas antes da
colheita so: i) presena de estirpes toxignicas, ii) susceptibilidade do hospedeiro e iii) nicho
agroclimtico favorvel (Bilgrami & Choudhary, 1998). A interaco entre estas 3 esferas
est representada na Figura 1.4. Vamos falar de cada um destes conjuntos de factores em
pormenor.

2.1.1. Estirpes toxignicas

A distribuio mundial e a incidncia das espcies de fungos (micogeografia) varia de
acordo com factores bioclimticos e com o tipo de alimento (Arnolds, 1997). Comodidades
agrcolas diferentes no tm a mesma micoflora, mesmo em locais prximos, e as mesmas
comodidades agrcolas em variadas partes do globo exibem micofloras constitudas por
espcies que apresentam perigos micotoxignicos diferentes. Conhecer a micoflora dum dado
31
produto num local possibilita-nos prever os riscos de contaminao e restringir as nossas
pesquisas s eventuais micotoxinas presentes (Frisvad & Samson, 1991).

Estirpes
toxignicas
Cultura
susceptvel
Factores
ambientais
M M
Estirpes
toxignicas
Cultura
susceptvel
Factores
ambientais
M M

Figura 1.4. As 3 componentes necessrias para haver produo de micotoxinas em alimentos: presena de
estirpes toxignicas, cultura susceptvel e factores ambientais favorveis infeco do fungo e produo da
micotoxina na cultura/alimento (M =micotoxinas)

Nem todas as estirpes duma dada espcie so capazes de produzir micotoxinas. No caso
da espcie produtora de aflatoxinas, A. flavus, as estirpes no toxignicas so mais frequentes
que as toxignicas. Em termos de gentica populacional, as estirpes no toxignicas, mais
abundantemente distribudas, podem ser vistas como o tipo selvagem (wild-type), e as
toxignicas, mais restritas na sua distribuio, o tipo mutante. Alguns cientistas acreditam que
a produo de micotoxinas traz alguma vantagem s estirpes produtoras, defendendo-se com a
afirmao de Ernst Mayr de que nature does not believe in extravagance (Bilgrami &
Sinha, 1992). Lillehoj defende que as intensivas prticas agrcolas so responsveis pela
criao de agroeconichos nicos que sob certas condies seleccionam fungos produtores de
micotoxinas por mecanismos desconhecidos. O investigador pensa que as micotoxinas
funcionam como sinais qumicos entre as espcies num nicho ecolgico e podem
desempenhar uma funo no estabelecimento das espcies num dado nicho (Lillehoj, 1992).
O inculo de fungos micotoxignicos pode advir do ar, solo, vegetao em decomposio,
plantas infectadas ou insectos, entre outros. Em condies favorveis, estes fungos competem
com outros organismos do solo e produzem inculos abundantes (Payne, 1998). Os nveis de
inculo variam consoante os anos e os locais.
A presena de estirpes micotoxignicas um dos pr-requisitos para que haja produo de
micotoxinas em comodidades agrcolas, mas no implica a sua produo. Para produzir
32
micotoxinas numa dada planta, o fungo toxignico tem de ser capaz de colonizar e infectar a
planta bem como produzir a micotoxina nos tecidos do hospedeiro.
Na viso de Payne (1998), por colonizao entende-se o crescimento de fungos na
superfcie da planta, enquanto que por infeco entende-se uma relao mais ntima com o
hospedeiro, em que o fungo invade os tecidos da planta e obtm nutrientes de clulas vivas.
No entanto, o conceito de colonizao usado ao longo desta dissertao num sentido mais
abrangente: por colonizao entende-se a presena de propgulos fngicos na superfcie da
planta.
A capacidade de infeco da cultura depende por sua vez da patogenicidade da estirpe,
susceptibilidade da cultura, e de factores ambientais. Existem fungos micotoxignicos (v.g.,
espcies de Fusarium) que so patognicos para plantas, mas em geral, os fungos
micotoxignicos no so patognios agressivos, mas sim essencialmente saprfitas ou
parasitas oportunistas (v.g., espcies de Aspergillus e Penicillium), capazes de infectar as
culturas atravs de danos e injrias fsicas. Existem nas plantas vias naturais de entrada que
apresentam pouca obstruo fsica, que podem ser exploradas por estes fungos (Smart et al.,
1990). Como estes fungos tm capacidades parasticas limitadas, vrias condies ambientais
tm de ocorrer para que se d a infeco e a sntese de micotoxinas.
Aps a infeco, o fungo produz a micotoxina cumulativamente, at que o substrato seja
esgotado, o fungo morto ou que se estabeleam condies permanentemente desfavorveis
para a sntese de micotoxinas. A micotoxina, se no for degradada entretanto, permanece no
alimento at s fases finais da produo.

2.1.2. Susceptibilidade do hospedeiro

A planta cultivada tem de ser compatvel com o fungo toxignico presente para haver
produo de micotoxinas, isto , como foi referido na seco anterior, tem de ser possvel a
infeco e a produo de micotoxinas pelo fungo nos tecidos da planta.
Ao longo do seu ciclo de vida, a planta apresenta susceptibilidade diferente a fungos.
Por isso, factores relacionados com a colheita so essenciais no estabelecimento da infeco.
Regra geral, quanto mais tarde for feita a colheita, mais tempo existe para haver formao de
micotoxinas no campo e mais susceptvel a cultura se torna. No momento da colheita,
infligem-se danos s culturas, podendo-se abrir vias de entrada para fungos micotoxignicos.
33
A presena de danos mecnicos e injrias fsicas na planta, devidas a ataques de pestes
(v.g., insectos, pssaros, outros fungos) ou factores climticos (v.g., granizo, seca excessiva),
so um veculo de ataque por parte de fungos e outros invasores, e aumentam enormemente a
susceptibilidade da planta em qualquer estado de maturao. Mas alm dos danos fsicos,
outros aspectos, como o stresse da planta de cultivo, contribuem para a susceptibilidade a
infeces. Stresse hdrico em momentos crticos do ciclo de vida da planta pode ser
determinante (Bilgrami & Choudhary, 1998). Adicionalmente, existem variedades de plantas
mais resistentes que outras infeco por fungos micotoxignicos (Widstrom, 1992).
Uma vez a cultura infectada em campo, o crescimento fngico pode continuar nos
estados ps-colheita e armazenamento.

2.1.3. Nicho agroclimtico favorvel

Os factores ambientais so determinantes na produo de micotoxinas, porque
influenciam a quantidade de inculo, bem como a capacidade do fungo colonizar, infectar e
produzir micotoxinas na planta, alm de contriburem para a susceptibilidade do hospedeiro.
Os factores climatricos mais relevantes para a produo de micotoxinas em campo
so a temperatura, a precipitao e a humidade (Abramson, 1998). A chuva e vento facilitam
a disperso de inculo. A capacidade de germinao dos esporos depende essencialmente da
temperatura e da humidade ou actividade de gua do substrato e, se as condies climatricas
forem favorveis, d-se a germinao dos esporos e a colonizao das plantas, o que pode
conduzir infeco e formao de micotoxinas.
Factores biolgicos, como a comunidade microbiana do solo e plantas e a competio
de microrganismos, mostraram-se relevantes para a determinao da produo de micotoxinas
em plantas de cultivo e seus rgos (Bilgrami & Choudhary, 1998).
Os insectos so dos factores biolgicos mais relevantes na contaminao com
micotoxinas, pois no s danificam as plantas, como actuam como vectores de inculo
(Dowd, 1998).

34
2.2. Ps-colheita

Durante o armazenamento e transporte, o inculo de fungos micotoxignicos que estava
presente na comodidade agrcola, exceptuando se houve um pr-processamento que involva
desinfeco, continua presente. Podem tambm existir outras fontes de inculo (v.g., outros
produtos armazenados, instalaes de armazenamento ou transporte). Os ambientes de
armazenamento so mais secos que as condies de campo, e as actividades de gua do
substrato mais baixas, o que favorece o crescimento de fungos com requisitos ecolgicos
diferentes das condies antes da colheita. Nesta fase, a produo de micotoxinas depende da
presena de fungos toxignicos capazes de crescer e produzir a micotoxina no substrato e de
factores ambientais no armazenamento, dos quais a actividade de gua particularmente
importante. Outros factores, como o tempo de incubao, a temperatura, a atmosfera e o
potencial redox, bem como pH e comunidades microbianas so relevantes (Abramson, 1998;
Smith et al., 1998).

2.3. Processamento dos alimentos

As micotoxinas podem surgir de 3 formas nos alimentos processados: i) estando presentes
na matria-prima; ii) formando-se durante o processamento; iii) ou aps o processamento,
devido a ms condies de armazenamento ou acondicionamento. O tipo de processamento
pode afectar os nveis de micotoxina presentes nas matrias-primas, podendo eliminar, reduzir
ou aumentar a toxina no alimento processado. Por exemplo, sabe-se que a fermentao destri
a micotoxina patulina, que detectada em sumos de frutas, mas no em bebidas alcolicas
(Scott et al., 1977). No processamento do caf verde para caf torrado e solvel, pode ocorrer
uma reduo nos nveis de OTA at 90% (Viani, 2002). Kpodo e colaboradores (1996)
verificaram que a coco durante 3 horas de milho fermentado contribui para a reduo de
80% nos nveis de aflatoxina B1 e G1. No processo de fabrico de vinho, verificou-se que
vrios passos do processo contribuem para a reduo dos nveis da micotoxina OTA,
essencialmente sempre que h separao de matria slida do vinho (Hocking et al., 2003;
Fernandes et al., 2003; no prelo).
Por sua vez, passos que envolvam concentrao de matria-prima podem conduzir a nveis
de micotoxinas mais elevados nos alimentos processados. O aumento da concentrao de
35
OTA durante o fabrico de pekmez disso exemplo. O pekmez uma bebida turca feita de
sumo de uva concentrado e fervido. Verificou-se que a concentrao de OTA no pekmez era 5
a 6 vezes maior que o detectado nas uvas (Arici et al., 2004).
possvel que a produo de micotoxinas se d durante o processamento dos alimentos.
Bailly e colaboradores (2002) verificaram que durante o fabrico de queijo h potencial para a
produo de micotoxinas. Mas a produo de micotoxinas durante o processamento alimentar
no referida habitualmente.

2.4. Cadeia alimentar

As micotoxinas podem entrar na cadeia alimentar ao serem consumidas em raes por
animais. Os animais podem degradar as micotoxinas, acumul-las nos seus rgos e tecidos
ou transform-las noutros produtos e excret-las, como o caso da aflatoxina M1 nos
produtos lcteos (Galtier, 1999; Guerre et al., 2000; Mendona & Venncio, no prelo), e estar
presentes em alimentos destinados a consumo humano.

2.5. Presena e distribuio de micotoxinas em comodidades agrcolas

Devido sntese de micotoxinas em alimentos ser um fenmeno complexo que depende
de muitos factores, a produo de micotoxinas tipicamente pontual e particularizada,
distribuindo-se na colheita de forma no homognea. Estudos em milho com aflatoxinas
permitiram avaliar este facto. Na Figura 1.5 est representada a distribuio e o teor de
aflatoxina em gros de milho numa espiga. A contaminao varivel e nem todos os gros
infectados apresentam nveis detectveis de aflatoxina (Cotty et al., 1994). Em muitos casos, a
eliminao de componentes altamente contaminados resultaria em comodidades agrcolas
com teores de aflatoxinas aceitveis comercialmente.

36

Figura 1.5. Distribuio e teor de aflatoxina em gros de milho numa espiga (adaptado de Cotty et al., 1994).
Clulas brancas =no infectadas, aflatoxina no detectada; Clulas amarelas =infectadas, aflatoxina no
detectada; clulas cinzentas =concentaes de aflatoxina de 0,1 2,5 g/kg; clulas negras =mais de 2,5 g/kg

Devido a esta variabilidade na contaminao, a avaliao da produo de micotoxinas em
campo, bem como a amostragem de lotes armazenados torna-se particularmente difcil
(Whitaker, 2003a; Whitaker, 2003b).
A possibilidade de co-ocorrncia de micotoxinas em alimentos suscita preocupaes
acrescidas, visto que se desconhecem os efeitos das interaces entre estes compostos. J foi
detectada a co-ocorrncia de patulina e citrinina em mas portuguesas (Martins et al., 2002)
e de aflatoxina B1, fumonisina B1 e OTA em cereais (Park et al., 2002; Vargas et al., 2001).

2.6. Medidas de preveno e controlo na contaminao por
micotoxinas

Em campo, antes da colheita, algumas estratgias de controlo de micotoxinas bem
sucedidas basearam-se em boas prticas agronmicas, que maximizem o desempenho da
planta e minimizem o stresse, bem como no cultivo de variedades resistentes aos fungos
produtores. A maioria dos estudos diz respeito preveno de aflatoxinas em campo. A
aposta no desenvolvimento de variedades de milho resistentes produo de aflatoxinas por
Aspergillus flavus tem mostrado resultados promissores (Brown et al., 1998). O uso de
agentes biocompetitivos foi sugerido por diversas vezes. No caso das aflatoxinas, o uso de
estirpes no-aflatoxignicas para este fim parece ser o mais adequado, visto que estas estirpes
so adaptveis s condies ambientais de forma idntica s toxignicas, e so biologicamente
activas. Em experincias de estufa e campo, obtiveram-se redues grandes no teor de
aflatoxinas em algodo com a aplicao de estirpes atoxignicas de A. flavus em gros de
trigo. A reduo no teor de aflatoxinas parece ser devida excluso espacial de estirpes
toxignicas e competio por recursos necessrios produo de aflatoxinas. Pensa-se que os
37
amendoins tambm beneficiaro da reduo na contaminao com aflatoxinas com o uso de
estirpes atoxignicas como biocompetidores. Estes estudos foram realizados com estirpes
atoxignicas nativas, mas existe potencial para o desenvolvimento de estirpes de biocontrolo
mais eficazes atravs da bioengenharia, especialmente no que diz respeito virulncia das
estirpes.
A preveno da formao de micotoxinas uma abordagem mais desejvel que outras
formas de controlo, como a destoxificao dos alimentos. A maioria das micotoxinas
quimicamente estvel, e resistem s condies de processamento, por exemplo, temperaturas
elevadas. Uma das principais crticas apresentadas alternativa da destoxificao que
muitos dos tratamentos no so economicamente viveis. No entanto, adicionalmente
preveno, existem vrios esforos neste sentido, que se focalizam no processamento
alimentar, na remoo de micotoxinas por adsoro, filtrao, moagem, solventes, altas
temperaturas e destoxificao por microrganismos (Sinha, 1998).
Aps colheita, a nfase colocada em prticas adequadas de colheita e armazenamento,
bem como numa deciso cuidada do momento de fazer a colheita. Regra geral, culturas
tardias conduzem a maiores probabilidades de formao de micotoxinas. No caso dos cereais,
gros de caf, frutos e sementes oleaginosas, aps colheita, as culturas devem ser secadas
imediatamente. nfase deve ser colocado na limpeza do material em contacto com a cultura
antes do transporte para evitar fontes de inculo posteriores. Em condies de
armazenamento, o controlo de humidade essencial para prevenir a acumulao de
micotoxinas. O uso de agentes anti-fngicos pode ser usado como um complemento, mas no
substitui as boas prticas (CAST, 2003).

3. Fungos produtores de micotoxinas

Na Tabela 1.4 so apresentadas as principais espcies produtoras responsveis pela
produo de micotoxinas em alimentos. Existem outras espcies capazes de produzir as
micotoxinas listadas, mas a sua ocorrncia em alimentos no relevante ou no se consideram
fontes significativas da micotoxina.

38
Tabela 1.4. Principais espcies responsveis pela produo de micotoxinas
Micotoxina Espcies produtoras
Aflatoxinas Aspergillus flavus; A. parasiticus
Ocratoxina A Aspergillus ochraceus; A. alliaceus; A. niger; A. carbonarius
Penicillium verrucosum; P. nordicum
Tricotecenos Fusarium spp.
Zearalenona F. graminearum e outras Fusarium spp.
Fumonisinas F. moniliforme (=F. verticillioides); F. proliferatum
Citrinina P. citrinum; P. expansum; P. verrucosum; A. alliaceus
cido peniclico A. ochraceus; P. aurantiogriseum; P. viridicatum
Patulina P. expansum; P. griseofulvum; A. clavatus
Esterigmatocistina Aspergillus versicolor; Emericella nidulans
cido tenuaznico Alternaria alternata
Penitrem A Penicillium crustosum
Alcalides do ergot Claviceps spp.
cido ciclopiaznico A. flavus; A. tamarii; P. commune

Os gneros de fungos filamentosos responsveis pela produo de micotoxinas
consideradas mais relevantes para a sade (V. seco 1.3, p. 21) so Aspergillus, Fusarium e
Penicillium. A relao entre a micotoxina e o fungo produtor no nica, i.e., uma dada
micotoxina pode ser produzida por espcies diferentes (v.g., OTA), e um dado fungo pode
produzir vrias micotoxinas (v.g., P. expansum). A ligao entre as espcies e as micotoxinas
foi frequentemente obscurecida pela m identificao das estirpes ou das micotoxinas ao
longo do tempo. No entanto, esforos de vrios investigadores em diferentes grupos
taxonmicos, notavelmente de Frisvad e colaboradores na taxinomia e perfil de metabolitos
secundrios produzidos por espcies terverticiladas de Penicillium (V. seco 3.2.4),
permitiram clarificar a produo de micotoxinas pelas espcies (Frisvad & Filtenborg, 1983,
1989; Frisvad, 1989; Frisvad et al., 1998; Lund & Frisvad, 1994; Svendsen & Frisvad, 1994).
Apesar de nem todas as estirpes duma dada espcie serem capazes de produzir
micotoxinas, a produo de micotoxinas pelas estirpes bastante consistente em cultura pura,
desde que se usem condies ptimas de produo. No entanto, a composio do meio de
cultura afecta grandemente a produo de micotoxinas pelas estirpes. Da que as micotoxinas
produzidas em cultura pura podem no ser as mesmas produzidas em substratos naturais.
Exemplo disso foi o trabalho desenvolvido durante a dissertao de Abrunhosa (2001a,
2001b), em que se verificou que apesar de todas as 51 estirpes de P. expansum testadas
39
produzirem citrinina em meio agarizado de extracto de levedura e sacarose (YES), apenas
uma foi capaz de produzir a micotoxina num meio elaborado com base de extracto de uva. Por
sua vez, estirpes que no produziram patulina em YES demonstraram essa capacidade em
meio de uva.
Visto que cada comodidade agrcola tem a sua micoflora prpria, uma dada micotoxina
pode ser produzida por espcies diferentes consoante o local ou o alimento em questo. Na
Tabela 1.5 apresenta-se uma reviso das principais espcies produtoras de OTA detectadas em
diversas comodidades agrcolas em diferentes pontos do globo, onde se observam as
diferenas apontadas.

Tabela 1.5. Principais espcies produtoras de OTA isoladas de alimentos onde foi detectada a presena da
micotoxina
Alimento Pas Espcie Referncia
Figos Califrnia A. alliaceus Bayman et al., 2002
Uvas Vrios pases A. carbonarius, agregado A.
niger
V. captulo 2
Cereais Norte da Europa, Canad P. verrucosum Mills et al., 1995;
Lund & Frisvad,
2003
Cereais frica do Sul A. alliaceus Odhav & Naicker,
2002
Derivados de
produtos animais
(enchidos e queijo)
Europa P. nordicum Larsen et al., 2001
Derivados de milho Nigria A. ochraceus Adebajo et al., 1994
Caf Brasil A. ochraceus, A. sulphureus,
A. carbonarius
Batista et al., 2003;
Taniwaki et al., 2003
Caf Tailndia A. carbonarius J oosten et al., 2001
Castanhas Canad A. ochraceus Overy et al., 2003

3.1. Fisiologia e Ecologia

J foi referido em seces anteriores que a produo de micotoxinas pelos fungos depende
de factores ambientais e da cultura em causa, particularmente do seu estado de
susceptibilidade. Em campo, o estado da cultura apontado por Pitt e Hocking (1997) como o
40
principal factor que governa a ecologia da biodeteriorao dos alimentos por fungos. O estudo
da produo de micotoxinas em tecidos vivos das plantas mais um ramo da patologia
vegetal que da microbiologia alimentar. No entanto, em tecidos moribundos, dormentes, ou
mortos, os factores que governam a biodeteriorao e a produo de micotoxinas so fsicos e
qumicos. Segundo os autores citados, h 8 factores principais: 1) actividade de gua; 2); pH;
3) temperatura; 4) tenso de O
2
e CO
2
, 5) consistncia, 6) composio nutricional do
substrato; 7) solutos especficos; 8) conservantes.
A maioria dos fungos pouco afectada pelo pH numa larga gama de valores, tipicamente
entre 3 a 8. O pH um factor importante em termos competitivos a elevadas actividades de
gua, onde a biodeteriorao por bactrias provvel. Mas abaixo de pH 5, o crescimento de
bactrias menos provvel. A tenso de O
2
e CO
2
importante para os fungos visto que so
organismos aerbicos. A sensibilidade das espcies a estes parmetros tem particular
importncia durante o processamento de alguns alimentos, como queijos, e no embalamento
de alimentos. A consistncia do alimento importante quanto ao tipo de fungos filamentosos
mais provveis de causar estragos: duma forma geral, as leveduras causam mais estragos em
produtos lquidos, visto que o ambiente mais favorvel disperso de organismos
unicelulares, e os fungos filamentosos causam mais frequentemente estragos em substratos
slidos, onde tm acesso fcil ao oxignio. Quanto composio nutricional do substrato, a
sua importncia em termos de produo de micotoxinas j foi realado previamente neste
captulo. A presena de certos solutos pode ser importante para o crescimento de alguns
fungos, nomeadamente glucose, glicerol, cloreto de magnsio e cloreto de sdio, mas este
factor parece ter pouca importncia para as espcies anamrficas de Aspergillus e Penicillium.
No caso de resistncia a conservantes, em particular cidos fracos, verificou-se diferenas na
resistncia das espcies, mas obviamente que este aspecto s tem interesse quando se usam
conservantes alimentares. Indubitavelmente, dois dos aspectos considerados mais importantes
e estudados mais frequentemente quanto aos requisitos ecofisiolgicos para o crescimento de
fungos filamentosos e produo de micotoxinas so a actividade de gua e a temperatura.
Quanto actividade de gua, os fungos produtores de micotoxinas so divididos em
fungos de campo e fungos de armazenamento. Os fungos de campo s conseguem crescer
com actividades de gua elevadas (acima de 0,90 a
w
), e so relevantes antes da colheita, como
o caso dos Fusarium. Os fungos de armazenamento so fungos com capacidade de crescer
com baixas actividades de gua, e so relevantes em condies de armazenamento de
comodidades agrcolas secas, como cereais. nesta ltima categoria que se inserem
tipicamente Aspergillus e Penicillium, apesar dos fungos de armazenamento tambm estarem
41
presentes no campo, onde podem infectar as colheitas (v.g., Aspergillus flavus) e produzir a
micotoxina.
As espcies do gnero Aspergillus so na maioria saprfitas ou patognicos oportunistas
de plantas, capazes de crescer at baixas actividades de gua e com temperaturas elevadas,
dominando ambientes quentes e/ou secos. O teleomorfo Eurotium consegue crescer at 0,70
de a
w
(Figura 1.6). Adicionalmente, algumas espcies de Aspergillus so termfilas, capazes
de crescer at temperaturas mximas de 55 C (v.g., A. fumigatus). A distribuio de
Aspergillus nos solos mais abundante entre latitudes as 26 e 35 em ambos hemisfrios, e
menos abundantes entre 35 e 45 (Klich et al., 1992). So mais frequentes em climas
tropicais que em climas temperados e nos trpicos que dominam a micoflora dos alimentos
e que so responsveis pela produo de micotoxinas em diversas comodidades agrcolas,
como cereais, amendoins, cacau, caf. As espcies de Aspergillus regra geral crescem mais
rpido que os Penicillium, apesar de tardarem mais a esporular. Os seus esporos so
resistentes radiao solar e a agentes qumicos (Pitt & Hocking, 1997).
O gnero Penicillium dos 3 gneros indicados o mais diverso, em termos de nmero de
espcies e diversidade de habitats. So espcies pouco exigentes nutricionalmente, capazes de
crescer em qualquer ambiente com uma fonte de sais minerais e qualquer fonte de carbono
excepto as mais complexas, numa gama vasta de condies fsico-qumicas (v.g. a
w
,
temperatura, pH e potencial redox). A maioria das espcies descritas tem o seu habitat
primordial no solo e so consideradas saprfitas ubquos. Christensen e colaboradores (2000)
verificaram numa reviso a 74 rastreios de solo publicados que os Penicillium esto entre os
principais constituintes da micoflora, e que ao invs dos Aspergillus, so proeminentes numa
gama de amplitudes muito alargada (entre 3 e 71). No entanto, o gnero Penicillium tambm
compreende algumas espcies patognicas de frutos (v.g., P. digitatum, P. expansum, P.
italicum). Muitas espcies so psicrfilas, capazes de crescer a temperaturas abaixo de 0 C,
mas algumas espcies so capazes de crescer at 40 C (Pitt & Hocking, ob. cit.). Regra geral,
crescem num regime mais estreito de actividades de gua, apesar de existirem algumas
espcies xerfilas, como o caso notvel de P. brevicompactum, capaz de crescer abaixo de
0,80 a
w
. Os Penicillium dominam a micoflora micotoxignica dos climas temperados, onde
so responsveis pela produo de micotoxinas essencialmente em cereais e derivados de
carne.
42

Figura 1.6. Fungos e actinomicetes proeminentes e suas capacidades de crescer a diversas actividades de gua e
temperaturas. T. crust. =Thermoascus crustaceus; Sam. =Saccharomonospora; Stm. =Streptomyces (adaptado
de Lacey et al., 1991 por Kozakiewicz, com permisso da autora)

Regra geral, verifica-se que os limites ecofisiolgicos duma espcie para produzir
micotoxinas so mais estreitos que para crescer num dado produto (Frisvad & Samson, 1991).
Prova desta afirmao so os estudos recentemente publicados quanto aos requisitos de a
w
e
temperatura para a produo de OTA por estirpes toxignicas de Aspergillus seco Nigri em
uvas (Esteban et al., 2004; Mitchell et al., 2004). Uma vez estabelecidos estes limites,
possvel construir modelos preditivos de risco de produo da micotoxina.

3.2. Taxinomia e nomenclatura dos gneros produtores de
micotoxinas

Segundo a classificao de fungos de Alexopoulos (Alexopoulos et al., 1996), o Reino
dos fungos est dividido em 4 filos, definidos principalmente nos modos de reproduo
sexual: Chytridiomycota, Zygomycota, Basidiomycota e Ascomycota. Os fungos produtores
de micotoxinas pertencem diviso Ascomycota. Os Ascomycota apresentam reproduo
sexuada em estruturas especializadas designadas de ascos. No entanto, nem todos os fungos
43
deste filo exibem normalmente em cultura estruturas de reproduo sexuada. Os fungos cujo
estado de reproduo sexual no conhecido designam-se de fungos imperfeitos, ou
deuteromycetes. Aspergillus, Fusarium e Penicillium pertencem a este grupo.
Os deuteromycetes reproduzem-se assexualmente por estruturas de reproduo
especializadas designadas de conidia (sing. conidium), que so esporos mitticos que se
formam em estruturas de reproduo especializadas, designadas de conidiforos. Os
deuteromycetes no existem como grupo taxinmico, e no representam nenhum
agrupamento natural. Este agrupamento foi abandonado a favor de alternativas menos
artificiais, com base nos parceiros mais prximos que apresentam reproduo sexuada. O
reconhecimento dos deuteromycetes como um grupo artificial justifica abordagens
taxinmicas puramente pragmticas.
A taxinomia dos gneros deste grupo, em particular de Aspergillus, Fusarium e
Penicillium, complexa devido aos problemas apontados em seguida, apesar de se terem feito
grandes esforos para a sua resoluo.

3.2.1. Problemas gerais

A classificao de fungos assexuais foi tradicionalmente baseada na morfologia, isto ,
no aspecto das colnias e estruturas microscpicas. O conceito biolgico de espcie de Mayr,
que assenta em que a espcie um grupo de populaes naturais que se cruzam entre si e
esto retroactivamente isolados de outros, no aplicvel a organismos assexuais (Harrington
e Rizzo, 1999). A morfologia das estruturas de reproduo especializada dos fungos foi usada
na definio da espcie e na identificao. Mas a informao morfolgica obtida dependente
das condies de cultura e incubao usadas, e sujeita a interpretaes variadas consoante o
observador. A nomenclatura das prprias estruturas morfolgicas em que se baseia a
classificao complexa a tal ponto que, no primeiro encontro de Kananaskis em 1971 em
que se fez a tentativa de tornar a terminologia sobre a conidiognese dos deuteromicetes mais
simples e exacta, o captulo dedicado terminologia comea com a frase sugestiva de Samuel
Butler: A definition is the enclosing of a wilderness of ideas within a wall of words
(Kendrick, 1971). Por outro lado, a delimitao e identificao das espcies complicada pela
variabilidade morfolgica inerente s estirpes. Apesar de supostamente clonais, os fungos de
reproduo assexual mostram uma variao surpreendente. O pleomorfismo e dimorfismo dos
fungos complicaram ainda mais o esquema taxinmico, pois a diferentes estados de
44
reproduo de fungos foram dados nomes diferentes. Dadas as dificuldades metodolgicas
existentes, o estabelecimento das espcies, bem como as relaes e a delimitao das
espcies, baseou-se na opinio dos taxinomistas.
Alm dos problemas metodolgicos inerentes a uma classificao baseada
essencialmente na morfologia de organismos to variveis morfologicamente como os fungos,
os problemas taxinmicos dos gneros desta seco foram tambm nomenclaturais. Os
procedimentos correctos de nomenclatura para atribuir nomes s espcies foram
frequentemente ignorados, o que resultou em grande confuso, especialmente no que diz
respeito s ligaes entre anamorfos (designao do estado de reproduo assexual do fungo)
e teleomorfos (designao do estado de reproduo sexual do fungo). Esta confuso teve
origem parcial no facto do acesso literatura sobre a taxinomia de espcies ser difcil, dado
ser muito difusa e requerer enormes conhecimentos bem como acesso bibliografia adequada
(Pitt, 1991).
Outro dos problemas taxinmicos nos gneros deste grupo foi uma falha tremenda na
tipificao. O sistema de holtipos apresenta limitaes de base evidentes: ao designar uma
estirpe como tipo, representativa da espcie, no se tem em conta a variabilidade inerente
espcie. Mas sem este sistema de referncia, criaram-se obviamente problemas taxinmicos,
sendo por exemplo difcil verificar a sinonmia entre novas espcies criadas.
Alm dos problemas apontados, coloca-se uma questo de fundo a sistemas baseados
principalmente em caractersticas morfolgicas: pode um sistema de classificao baseado na
morfologia reflectir a biologia das espcies, e ser usado para prever caractersticas? Se a
presso para a evoluo das espcies for essencialmente fisiolgica, no devem ser esperadas
diferenas qualitativas ou quantitativas na morfologia. Como apontado por Parmasto e
Parmasto (1992), as diferenas morfolgicas entre espcies irms surgem lentamente por
deriva gentica, e espcies ecologicamente distintas apresentam diferenas morfolgicas
qualitativas e quantitativas subtis. Observa-se com frequncia sobreposio nas caractersticas
quantitativas mais usadas, como o tamanho dos esporos. A taxinomia dos principais gneros
produtores de micotoxinas, Aspergillus, Fusarium e Penicillium, reflexo destes problemas
(Pitt, 1991).
No caso dos Aspergillus, os problemas foram essencialmente nomenclaturais. O
manual de referncia de Aspergillus e seus teleomorfos o de Raper e Fennell (1965). Os
conceitos genricos e de espcie esto consideravelmente bem circunscritos, apesar de vrios
grupos serem de identificao e classificao problemtica (grupos A. niger, A. ochraceus, A.
nidulans, A. flavus, A. fumigatus, A. restrictus). Os problemas nomenclaturais no gnero
45
Aspergillus foram devidos recusa de Raper e Fennell aderirem ao cdigo internacional de
nomenclatura botnica (ICBN). Em primeiro lugar, Raper e Fennell no concederam nomes
aos teleomorfos, prtica contrria ao recomendado pelo ICBN. Em segundo lugar, a
subdiviso do gnero foi baseada em grupos de espcies semelhantes (v.g., espcies
semelhantes a A. niger eram referidas como pertencentes ao grupo A. niger). O uso do termo
grupo no tem estatuto no ICBN, e foi duramente criticado (Benjamin, 1966 em Pitt &
Hocking, 1997). Em terceiro lugar, no respeitaram as regras da prioridade de nomes, e
recusaram alguns nomes de espcies. Por ltimo, no tipificaram os nomes, o que levou a
variaes no conceito de algumas espcies (Pitt & Hocking, 1997).
A taxinomia de Penicillium foi mais problemtica. Raper e Thom (1949) publicaram
uma monografia para a identificao de Penicillium, que foi usada durante vrias dcadas.
Mas o seu conceito de espcie era aberto a interpretaes variveis. Novas classificaes
foram propostas, mas nenhuma foi aceite amplamente. A descoberta de antibiticos e de
compostos txicos nestes gneros conduziu a um interesse enorme nos metabolitos
secundrios, bioqumica e biodeteriorao por este gnero. A investigao rpida no gnero,
juntamente com as limitaes da taxinomia existentes, levou a um estado catico de ms
identificaes e consequente confuso sobre as espcies que estavam presentes nos alimentos.
Muitas das inexactides permaneceram at hoje, tanto em revises de literatura como em
coleces de culturas (Pitt, 1991). Esta situao prejudicou imenso o estabelecimento das
micotoxinas produzidas por que espcies, bem como estudos dos requisitos ecofisiolgicos
para o crescimento e produo de micotoxinas das espcies. Todas estas dificuldades fizeram
com que muitos investigadores questionassem o valor da taxinomia de Penicillium em
particular e, mesmo ainda hoje, alguns cientistas questionam a mais valia da classificao
deste gnero at espcie na micotoxicologia (Paterson et al., 2004).
Em Fusarium os problemas taxinmicos igualaram ou excederam os de Aspergillus e
Penicillium: existem conceitos de espcies to variados que oscilam entre o manual de Snyder
e Hansen (1945), que aceitam apenas 9 espcies no gnero, e o de Booth (1971), que lista 146
taxa.

3.2.2. Solues para Aspergillus, Fusarium e Penicillium

Dada a relevncia de Aspergillus, Fusarium e Penicillium para a cincia, sade e
indstria, idealmente a identificao das espcies nestes gneros deve ser inequvoca, exacta,
46
simples e imutvel. O conceito de espcie deve, pois, reflectir as necessidades prticas, bem
como ser intelectualmente satisfatria. Novas abordagens taxinomia destes gneros
resolveram alguns dos problemas apontados. A variabilidade morfolgica das estirpes foi
reduzida com a concepo de meios de cultura e condies de incubao padronizados. No
caso dos Fusarium, recomenda-se inclusive que as culturas sejam feitas a partir de um esporo
(Nelson et al., 1983). Fizeram-se esforos para reduzir a subjectividade do taxinomista na
observao das caractersticas morfolgicas com programas de anlise de imagem (Dorge et
al., 2000) e atravs de ensaios interlaboratoriais entre peritos (Frisvad et al., 2000). A
influncia de parmetros fisiolgicos como a temperatura e a actividade de gua foi includa
por Pitt na classificao e identificao de Penicillium (Pitt, 1979). Para as espcies
produtoras de micotoxinas mais relevantes, foram desenvolvidos meios de cultura selectivos,
como o caso do meio agarizado para Aspergillus flavus e A. parasiticus (AFPA), destinado
identificao das principais espcies produtoras de aflatoxina (Samson, 1991). Enfatizou-se a
necessidade de se identificarem as estirpes quando isoladas dos alimentos, para reduzir as
alteraes em cultura. Desenvolveram-se e aplicaram-se novas ferramentas e mtodos da
quimiotaxonomia a estes grupos de fungos. Estudos de ADN, ARN, protenas e
particularmente metabolitos secundrios, permitiram compreender as relaes filogenticas
entre gneros, subgneros e espcies definidas morfologicamente e clarificar a taxinomia,
sendo uma ferramenta valiosa na criao de novos taxa. Os dados resultantes destas
ferramentas podem ser complexos, mas tcnicas estatsticas multivariadas facilitam a anlise
destes dados (Frisvad et al., 1998).
Para Aspergillus e Penicillium, foram publicados manuais de identificao claros e
concisos, que enfatizam as principais caractersticas de cada espcie e as suas afinidades com
outros taxa. As espcies descritas nos manuais de referncia de Aspergillus (Raper & Fennell,
1965) e Penicillium (Raper & Thom, 1949) consideradas vlidas foram tipificadas (espcies
de Aspergillus por Samson & Gams, 1985; espcies de Penicillium por Pitt, 1979), e a
tipificao subsequente de espcies novas foi levada mais a srio pelos taxinomistas. Os
problemas nomenclaturais de Aspergillus foram solucionados. Subramanian e Malloch e Cain
providenciaram nomes para os teleomorfos de Aspergillus (Pitt & Hocking, ob. cit.), e Gams
et al. (1985) desenvolveram uma classificao nova de Aspergillus baseada em subgneros e
seces que substituiu o termo incorrecto grupo, e foi elaborado um novo manual de
Aspergillus onde se incorporaram os avanos desde 1965 (Klich & Pitt, 1988).
A existncia de novas ferramentas e a necessidade de estabilidade na taxinomia destes
gneros levou criao de comisses de peritos em sistemtica de Aspergillus e Penicillium e
47
em Fusarium para estes propsitos. A Comisso Internacional em Sistemtica de Penicillium
e Aspergillus (ICPAS) foi criada em 1985 e actualmente uma comisso da Sociedade
Microbiolgica Internacional (IUMS). Os trabalhos internacionais de peritos contriburam
para a estabilidade e clarificao da taxinomia (Samson & Pitt, 1986; Samson & Pitt, 1990;
Samson & Pitt, 2000).
A taxinomia de Fusarium ainda est em evoluo e muitas espcies no esto
tipificadas. Os manuais de identificao mais correntemente usados so os de Nelson et al.
(1983) e Burgess et al. (1988). Na Comisso Internacional em Taxinomia em Fungos foi
criada uma subcomisso para a sistemtica de Fusarium. Adicionalmente aos manuais de
identificao, foram criadas chaves assistidas por computador para alguns grupos de
Penicillium e Fusarium, destinadas a investigadores que no identificam espcies destes
gneros numa base regular, nomeadamente a PENNAME e a FUSKEY (Samson, 1991).
Para fungos com dois estados, teleomorfo e anamorfo, criou-se uma nomenclatura
dual. Se ambos estados esto presentes numa estirpe, o nome do teleomorfo mais
apropriado.
Com a clarificao dos sistemas de classificao, o refinamento dos conceitos de
espcie e com o estabelecimento de meios de cultura e condies de incubao padronizadas,
a identificao morfolgica tornou-se uma tarefa mais simples. Para identificaes rotineiras
de grandes nmeros de estirpes, a identificao morfolgica baseada em manuais e chaves
ainda a escolha de eleio. No entanto, certas espcies de fungos no so passveis de
identificao at espcie apenas com base na morfologia, visto que constituem agregados de
diferentes espcies definidas molecularmente e/ou com base no seu perfil metablico. Aps a
identificao morfolgica do agregado ou espcie sensu lato, necessrio usar outras tcnicas
de identificao especficas para discriminar as espcies num dado agregado.
Com os avanos na taxinomia, emergiu um quadro mais claro sobre o habitat de cada
espcie e os seus requisitos ecofisiolgicos para crescer e produzir micotoxinas (Frisvad &
Samson, 1991).
A taxinomia, especialmente de Aspergillus e Penicillium, no de momento um
entrave micotoxicologia e emerge cada vez mais como uma porta aberta para as
caractersticas ecofisiolgicas das espcies que as produzem, apesar do peso do seu passado
obscuro.

48
3.2.3. Caractersticas morfolgicas usadas na classificao e identificao de
Aspergillus

O gnero Aspergillus caracteriza-se pela produo de esporos assexuais se dar numa
estrutura especializada caracterstica do gnero, o aspergillum (pl. aspergilla: significa em
latim globo perfurado que contm uma esponja ou pincel usado para aspergir gua benta). A
terminologia usada para designar as estruturas varia consoante ou autores. Nesta dissertao,
usada a terminologia seguida por Klich e Pitt (1988). Na Figura 1.7 est representado o
conidiforo tpico do gnero e a designao de cada estrutura.

Figura 1.7. Conidiforo de Aspergillus bisseriado (A. ochraceus) e terminologia das estruturas usadas na
classificao e identificao. O conidiforo constitudo pelo aspergillum (designao que se d parte superior
da estrutura, ou seja, o conjunto da vescula e das clulas reprodutivas especializadas que contm) e pelo estipe.
So visveis nas figuras as mtulas (clulas estreis), filides (clulas conidiognicas) e conidia (esporos
assexuais) (barra de escala =10 m)

49
O estipe normalmente asseptado, e termina na forma de um T, onde se une hifa
vegetativa. Esta poro basal designa-se de clula basal, mas faz parte do estipe.
Existem dois tipos de aspergillum, unisseriados e bisseriados. O aspergillum
bisseriado, ao invs do unisseriado, tem uma paliada de clulas designadas metulae entre a
vescula e as filides.
Algumas espcies de Aspergillus so capazes de se reproduzir por esclercios (Figura
1.8). Os esclercios so massas compactas de clulas assexuais, observveis frequentemente a
olho n. Algumas espcies de Aspergillus produzem clulas de Hulle, que so clulas de
paredes muito espessas e refringentes, de funo desconhecida.
Existem espcies de Aspergillus capazes de reproduo sexuada. Estes estados
teleomrficos pertencem famlia Trichomataceae dos Ascomycota, e so caracterizados pela
formao de ascos que contm ascsporos (Figura 1.8). Os ascos esto dentro dum ascocarpo,
geralmente um cleistotcio.

Figura 1.8. Outras estruturas de Aspergillus. Em cima, esquerda: esclercios negros de A. alliaceus; em cima,
direita: clulas de Hulle de Emericella sp. (setas); em baixo, esquerda: cleistotcios de Eurotium vistos ao
estereomicroscpio (estruturas de cor amarela); em baixo, direita: preparao microscpica de Eurotium, em
que so visveis um conidiforo de Aspergillus, o cleistotcio, ascos e ascsporos soltos
50

As caractersticas microscpicas de maior valor na classificao e identificao das
espcies de Aspergillus so o tipo de aspergillum, a forma e ornamentao dos esporos e a cor
dos esporos. Para identificao dos teleomorfos, a natureza da parede do ascocarpo, bem
como o tamanho, forma, ornamentao e cor dos ascsporos so parmetros importantes.
Alm das caractersticas microscpicas, tambm so usadas caractersticas culturais
em meios e condies de incubao padronizados, como o tamanho, cor e textura da colnia.

Classificao. O texto de referncia quanto s espcies de Aspergillus The genus
Aspergillus de Raper e Fennell (1965). Os investigadores descreveram 18 grupos de
espcies, que foram reclassificados em seces pertencentes a 6 subgneros por Gams et al.
(1985) (Tabela 1.6). Desde ento, houve algumas alteraes quanto classificao e
nomenclatura das espcies, em particular dos teleomorfos, e novas espcies foram descritas.
Em 2000 estavam descritas 182 espcies de Aspergillus (Pitt et al., 2000). A classificao
seguida nesta dissertao essencialmente a de Klich e Pitt (1988).
Existem 9 teleomorfos de Aspergillus: Chaetosartorya Subram., Petromyces Malloch
& Cain, Neopetromyces, Fennellia, Emericella Berk. & Broome, Sclerocleista Subram.,
Hemicarpentales Sarbhoy & Elphick, Neosartorya Malloch & Cain, Eurotium Link: Fr. Os
anamorfos de Aspergillus esto divididos em 6 subgneros, de acordo com o tipo de estruturas
conidiognicas, cor dos condios e a relao de crescimento em CYA e CYA20S (Tabela 1.7).
A cor dos conidia frequentemente um intervalo de cores. A nomenclatura da cor e o
intervalo de cores aceite definido com base em referncias de livros de cor, como o
Methuen Handbook of colour (Kornerup & Wanscher, 1978).

51
Tabela 1.6. Classificao do gnero Aspergillus
Subgneros Seco Conidiforo Cor dos conidia CYA20S
/CYA
f
Aspergillus Unisseriado Verde a cinzento >2 Aspergillus
Restricti Gams et al Unisseriado Muito
lento
Fumigati Gams et al Unisseriado Verde, azul a cinzento <2 Fumigati
Gams et al. Cervini Gams et al Unisseriado Laranja a cinzento
Ornati
Gams et al.
Unisseriado Cinzento, amarelo-verde , castanho
azeitona

Clavati
Gams et al.
Clavati Gams et al. Unisseriado
a
Cinzento a verde
Nidulantes Gams et al. Bisseriado
d
Verde
Versicolores Gams et
al.
Bisseriado
e
Verde a azul
Usti Gams et al. Bisseriado Castanho a castanho azeitona
Terrei Gams et al. Bisseriado Creme a laranja acastanhado
Nidulantes
Gams et al.
Flavipedes Gams et al. Bisseriado Branco a creme
Wentii Gams et al. Bisseriado
b
Creme, amarelo acastanhado ou
castanho azeitona

Flavi Gams et al. Unisseriado/
Bisseriado
Amarelo esverdeado a castanho
azeitona

Nigri Gams et al. Unisseriado/
Bisseriado
Negros ou quase negros
Circumdati Bisseriado Creme, amarelo ou ocre
Candidi Gams et al. Bisseriado Branco ou quase branco
Cremei Gams et al. Unisseriado/
Bisseriado
Castanho-plido, amarelo ou verde
azulado

Circumdati
Gams et al.
Sparsi Gams et al. Bisseriado
c
Cinza claro a azeitona creme
a
vesculas clavadas;
b
unisseriado em espcies raras;
c
estipes constrictos abaixo da vescula;
d
cl. Hulle
abundantes;
e
cl. Hulle ausentes /raras;
f
razo entre o crescimento da colnia em CYA20S e em CYA

52
3.2.4. Caractersticas morfolgicas usadas na classificao e identificao de
Penicillium

No gnero Penicillium, os esporos assexuais produzem numa estrutura tpica do gnero
designada de penicillus (pl. penicilli, que em latim significa pincel). Os conidia nascem em
cadeias produzidas pelas filides. As filides estreitam no pice, e o pescoo designa-se
collula (pl. collulae). As filides esto em verticilos no estipe, e assentam nele directamente
ou com a interveno de clulas de suporte especializadas conhecidas por metulae e rami
(Figura 1.9). Nalgumas espcies, entre as metulae e os rami, podemos ter um nvel adicional,
os ramuli. O penicillus toda a estrutura suportada pelo estipe. O conjunto do penicillus e do
estipe designa-se por conidiforo. Os conidia so regra geral de cor verde, as filides tm
pescoos curtos e paredes lisas.

Figura 1.9. Conidiforos de Penicillium com penicilli do tipo mais simples (penicillus monoverticilado
vesiculado de P. glabrum, direita) e complexo (penicillus terverticilado de estipe liso de P. brevicompactum,
esquerda) (barra de escala =10 m)

Os tipos de penicilli distinguem-se pelo nmero de verticilos (pontos de ramificao)
entre a filide e o estipe. O tipo de penicillus mais simples designa-se monoverticilado, pois a
filide assenta directamente no estipe. o penicillus que est representado na Figura 1.9
53
direita. O penicillus diz-se biverticilado se tem apenas mtulas, e terverticilado se tem mtulas
e ramos. Quando existem ramulos, o penicillus designa-se quaterverticilado.
A classificao e identificao das espcies baseiam-se em caracteres microscpicos e
culturais. Nos caracteres microscpicos, alm do tipo de penicilli, so importantes a forma e
tamanho das filides, em particular das collulae, a forma, tamanho cor e ornamentao dos
condios, e a textura do estipe, ramos e mtulas (que pode ser lisa ou rugosa). Existem dois
tipos de filides: ampuliformes e acerosas. As ampuliformes so semelhantes a garrafas
(Figura 1.9) e as acerosas so semelhantes a agulhas de pinheiro, com lados paralelos que
convergem numa forma cnica para um orifcio estreito. As filides acerosas so
caractersticas do subgnero Biverticillium. As restantes espcies tm regra geral filides
ampuliformes. Nos caracteres culturais, so importantes o tamanho das colnias, a textura,
cor, presena de exudado, pigmento solvel, e presena, tamanho e cor de esclercios.
As espcies capazes de reproduo sexuada, envolvem a formao de cleistotcios ou
gimnotcios.

Classificao. Este gnero de taxinomia bastante complexa. A dificuldade de taxinomia
e identificao prende-se com a variabilidade inerente do gnero. Admite-se que cerca de 70 a
80% das estirpes so identificveis morfologicamente com bastante confiana. No entanto,
espera-se sempre uma dada proporo de estirpes extremamente difceis de identificar (Pitt,
1988).
A classificao de Penicillium baseia-se nos conceitos de Raper e Thom (1949). Este
manual foi usado universalmente por mais de duas dcadas. Em 1979, J ohn Pitt produziu a
primeira reviso taxinmica de Penicillium, aps 30 anos. Introduziu a classificao sub-
genrica, e tipificou as espcies includas no manual. Em 2000 estavam reconhecidas 225
espcies de Penicillium (Pitt et al., 2000). A classificao seguida nesta dissertao bem como
a designao de estruturas segue o esquema seguido por os manuais de 1979 e 1988. Segundo
este esquema de classificao, os teleomorfos de Penicillium pertencem a dois gneros:
Eupenicillium Ludwig, com reproduo sexuada em cleistotcios, e Talaromyces Benjamin,
com reproduo sexuada em gimnotcios. As espcies estritamente anamrficas so separadas
em 4 subgneros com diversas seces, de acordo com o tipo de estruturas conidiognicas e
forma de esporos.

54
Tabela 1.7. Classificao infragenrica de Penicillium
Subgnero Penicilli Seco
Aspergilloides estipe vesiculado
a
Aspergilliodes
Dierckx
Monoverticilados
Exicaulis estipe no vesiculado
Divaricatum penicilli irregulares Furcatum Pitt biverticilados com filides
ampuliformes Furcatum penicilli regulares
Coremigena penicilli em cormios ou synnemata Biverticillium
Dierckx
biverticilados com filides
acerosas Simplicia penicilli sem synnemata
Penicillium
Coronatum penicilli multiramulados
Inordinate penicilli irregularmente ramulados
Penicillium terverticilados
a quaterverticilados
Cylindrosporum Condios cilndricos
a
o estipe diz-se vesiculado se tem uma dilatao na extremidade apical junto s filides (Figura 1.9, direita)

A distino entre subgneros e seces nem sempre fcil, visto que ocasionalmente, uma
estirpe pode apresentar penicilli de tipos diversos, como mono e biverticilados, ou
biverticilados e terverticilados. Por isso, a classificao apresentada na tabela diz respeito aos
penicilli predominantes na seco.

4. Deteco, quantificao e identificao de fungos filamentosos em
comodidades agrcolas e alimentos

A deteco, quantificao e identificao dos fungos em alimentos e comodidades
agrcolas essencial para se compreender e prever o fenmeno da produo de micotoxinas.
Os mtodos para a micologia alimentar desenvolveram-se a partir dos usados na
patologia vegetal e bacteriologia alimentar, adequados para organismos que requerem
actividades de gua elevadas para crescer. A necessidade de mtodos micolgicos para anlise
dos alimentos fez-se sentir e novas abordagens foram discutidas tendo em vista uma eventual
normalizao internacional, que resultaram na formao dum grupo internacional, a Comisso
Internacional de Micologia Alimentar (ICFM), sob os auspcios da diviso de micologia da
IUMS. Dos encontros de especialistas, resultaram duas publicaes importantes, que resumem
os avanos da rea: King et al. (1986) e Samson et al. (1992).
55
A amostragem sempre um aspecto relevante de qualquer mtodo de anlise a
comodidades agrcolas e alimentos. Os mtodos de amostragem para fungos so semelhantes
aos usados para propsitos bacteriolgicos (ICMSF, 1986).
A escolha dos mtodos de deteco, quantificao e identificao de fungos em alimentos
depende dos propsitos do estudo. Os fungos filamentosos podem estar presentes nos
alimentos de 3 formas: i) no estado vegetativo, isto , sob a forma de miclio sem produo de
estruturas de reproduo especializadas; ii) no estado reprodutivo, com formao de esporos;
iii) sob a forma de esporos ou estruturas de resistncia. Nos dois primeiros casos, o fungo est
a crescer no substrato, podendo produzir e excretar enzimas de degradao e/ou metabolitos
secundrios, como micotoxinas; no terceiro caso, podem colonizar o substrato, mas no esto
activos metabolicamente.
Conhecer a micoflora total do alimento ou comodidade agrcola pode ser relevante
quando se quer conhecer a micoflora que pode estar presente em fases seguintes da produo
(v.g., gros destinados ao fabrico de farinha). Doutra forma, recomenda-se mtodos que
avaliem a micoflora que est a crescer no alimento, visto que uma melhor medida da
qualidade micolgica inerente.
Quanto ao modo de deteco de fungos em alimentos, existem mtodos de cultivo, que
detectam os propgulos fngicos viveis capazes de crescer em meio de cultura, e no cultivo,
em que a deteco de fungos se faz atravs da deteco de compostos presentes na parede das
hifas e/ou esporos por tcnicas imunolgicas ou moleculares, ou atravs da deteco de
produtos do metabolismo fngico no substrato (cido glucnico, compostos volteis,
micotoxinas).

4.1. Mtodos de cultivo

Os dois mtodos de referncia para estimar a presena de fungos em alimentos so o
plaqueamento por diluio e o plaqueamento directo. O primeiro adequado a alimentos
lquidos ou em p, e em situaes onde o conhecimento total da micoflora relevante. O
segundo adequado anlise de alimentos particularizados. Os alimentos podem ser
desinfectados superficialmente com uma soluo comercial de lixvia diluda dez vezes
durante alguns minutos, para remover a contaminao superficial inevitvel que se origina do
p e outras fontes, de forma a recuperar s os fungos que esto realmente a crescer nas
partculas. Nos mtodos por diluio, os resultados so expressos em contagens viveis por
56
grama de amostra. No plaqueamento directo, os resultados so expressos em n ou
percentagem de partculas colonizadas ou infectadas.
A escolha dos meios de cultura e das condies de incubao devem ser adequadas ao
tipo de fungos a pesquisar. Os meios recomendados para a deteco, enumerao e isolamento
de fungos a partir de alimentos podem ser encontrados em Pitt e Hocking (1997). Existem
meios generalistas e meios especficos (v.g. AFPA mencionado na seco anterior). Dois
meios generalistas so amplamente usados em alimentos: agar com diclorano e 18% de
glicerol (DG18), que se destina a pesquisar fungos capazes de crescer em alimentos secos,
com baixas actividades de gua, e o agar com diclorano, rosa de bengal e cloranfenicol
(DRBC), que se destina anlise micolgica de alimentos frescos, com actividades de gua
elevadas. Os meios de propsitos generalistas tm de cumprir vrios requisitos:
inibir o crescimento bacteriano, sem afectar o crescimento fngico;
serem nutricionalmente adequados e suportarem fungos de crescimento lento;
suprimirem o crescimento de fungos de crescimento rpido (v.g. Mucorales),
sem o suprimirem completamente, para que possam ser detectados;
abrandar o crescimento dos fungos, de forma a permitir uma contagem
razovel de colnias por placa, sem inibir a germinao dos esporos.

A combinao de diclorano e rosa de bengal restringe o crescimento das colnias e o
crescimento galopante de Rhizopus e Mucor no DRBC. No DG18, a baixa actividade de gua
e diclorano inibem o crescimento de Mucorales, geralmente irrelevantes para alimentos secos.
Os mtodos de cultivo permitem o isolamento das estirpes. Atravs da identificao
das estirpes e da avaliao dos seu potencial toxignico, podemos restringir as buscas a
eventuais micotoxinas em alimentos e prever os perigos, o que traz inegveis mais valias em
termos de futuros estudos de investigao e implementao de programas de controlo de
qualidade. Contudo, estes mtodos no so adequados para avaliaes rpidas da qualidade
micolgica de alimentos, visto que demoram semanas a conseguir resultados.

57
4.2. Mtodos de no-cultivo

A nvel industrial existe a necessidade de se detectarem fungos potenciais produtores
de micotoxinas ou medidas de crescimento fngico que estejam relacionadas com a produo
de micotoxinas o mais cedo possvel, de forma a avaliar a qualidade dos produtos e fazer
previses sobre o risco de contaminao com micotoxinas. Tcnicas rpidas de deteco que
permitem identificar espcies de relevo para a produo de micotoxinas por mtodos de no
cultivos foram desenvolvidas. Estes mtodos podem avaliar produtos do metabolismo fngico
que estejam correlacionados com o crescimento ou a produo de micotoxinas e que sejam de
fcil avaliao, como a determinao de compostos orgnicos volteis (VOCs) atravs de
narizes electrnicos (Olsson et al., 2002) ou outras tcnicas (Demyttenaere et al., 2003), e
foram sugeridos inclusiv ces treinados para detectar estes compostos (Kauhanen et al.,
2002). Pelo perfil de VOCs, possvel em alguns casos identificar-se as espcies presentes
(Magan e Evans, 2000). A deteco de VOCs aplicada principalmente em ambientes
fechados, como em armazns. Mtodos genticos e imunolgicos especficos para espcies
produtoras de micotoxinas foram desenvolvidos para a deteco rpida de fungos em diversos
alimentos (Niessen et al., 2004; Dewey & Meyer, 2004).
A observao directa da partcula alimentar, atravs de tcnicas de microscopia ptica
ou electrnica, pode ser de grande utilidade para ver de que forma os fungos esto no
substrato. Em caso de crescimento fngico visvel, a inspeco visual ao esteromicroscpio
pode fornecer elementos sobre as espcies envolvidas ou sobre o modo de infeco.
Outros mtodos de deteco rpida de fungos em partculas individualizadas
envolvem espectroscopia de infravermelhos com transformadas de Fourier (FT-IR). Estes
mtodos no so destrutivos, e tm aplicaes na anlise de partculas slidas secas, como por
exemplo gros de milho (Gordon et al., 1997; Kos et al., 2002).

4.3. Quantificao de fungos em alimentos

A quantificao de fungos pode levar a medidas mais exactas do risco de
contaminao com micotoxinas. Devido s diferentes formas de estar nos alimentos,
quantificar fungos filamentosos por contagem de clulas viveis apresenta dificuldades
maiores que quantificar bactrias ou leveduras, visto que quando ocorre esporulao, podem
58
ser produzidos esporos em grande nmero, que causam aumentos na contagem de clulas
viveis, mas no na biomassa (Pitt & Hocking, 1997). A biomassa pode ser quantificada mais
exactamente com recurso a diversas tcnicas, como ergosterol (Saxena et al., 2001) e PCR em
tempo real (Filion et al., 2003).

5. Mtodos de determinao de micotoxinas

A determinao de micotoxinas faz-se atravs de mtodos analticos adequados
finalidade a que se destinam. Vo ser aqui discutidos dois aspectos distintos: a avaliao da
capacidade micotoxignica das estirpes e a determinao das micotoxinas em alimentos.
A determinao da capacidade micotoxignica de estirpes de fungos pode ser relevante
para avaliar o potencial duma dada estirpe produzir uma dada micotoxina (rastreio) ou para
propsitos taxinmicos.
A deteco e quantificao de micotoxinas em alimentos essencial para avaliar as fontes
de exposio das populaes s micotoxinas, e para gerir e controlar os nveis de micotoxinas
nos produtos alimentares.

5.1. Mtodos de determinao da produo de micotoxinas por
fungos

Para fins de rastreio ou para propsitos taxinmicos, a produo de micotoxinas por
estirpes fngicas em cultura pura faz-se em condies padronizadas. Geralmente, os meios de
cultura usados so YES ou agar de Czapek com extracto de levedura (CYA). As culturas so
incubadas durante 7 dias, a 25 C. A preparao das culturas muito simples, consistindo em
retirar pores de diferentes zonas da colnia com um fura-rolhas de dimetro conhecido. As
anlises fazem-se a cerca de 3 cilindros de cultura e os resultados, quando quantitativos, so
expressos por gramas de agar.
Para rastreio de produo de metabolitos secundrios por fungos, os mtodos
cromatogrficos so os mais populares, em particular a cromatografia em camada fina (TLC)
e a cromatografia lquida de alto desempenho (HPLC) ou a cromatografia gasosa (GC).
59
O GC usado principalmente para anlise de tricotecenos tipo A, que no se separam
convenientemente por HPLC.
O TLC uma tcnica muito usada na quimiotaxonomia, para anlise do perfil dos
metabolitos. O procedimento mais usado pressionar os cilindros de agar contra a placa de
TLC, secar e correr com fase mvel. Os compostos presentes so separados de acordo com as
suas afinidades para a fase mvel e fase estacionria. A identificao dos compostos faz-se
pelo seu factor de reteno (Rf), que dado pela razo entre a distncia (cm) migrada pelo
composto e a distncia total migrada pelo solvente, e pela cor dos metabolitos a diferentes
comprimentos de onda (v.g., visvel, UV). Existem bases de dados com o Rf e cor dos
metabolitos, que podem ser usadas para identificaes presuntivas (Paterson & Bridge, 1994),
bem como padres para algumas micotoxinas, que so usadas para fins comparativos. As
principais vantagens do TLC so o seu baixo custo e a sua rapidez. As principais limitaes
so o limite de deteco relativamente elevado, a falta de preciso e quantificao limitada.
Estas limitaes so ultrapassadas com a anlise dos metabolitos por HPLC.
A cromatografia lquida de alto desempenho (HPLC) um mtodo que permite limites de
deteco muito baixos, com deteco por UV ou fluorescncia, e uma quantificao mais
exacta. um mtodo cromatogrfico atravs do qual se separam os compostos numa amostra
pela sua afinidade relativa para uma fase estacionria (coluna) e uma fase mvel. Um volume
conhecido duma amostra lquida injectado na coluna. Para obter uma amostra lquida, os
cilindros de meio de cultura so extrados com um solvente. Os compostos eludos pela
coluna passam por um detector (mais usualmente, UV ou fluorescncia, dependendo das
propriedades fsicas do analito de interesse) e comparando a resposta do detector com
quantidades conhecidas da micotoxina (curva de calibrao), quantifica-se o composto
presente na amostra. O resultado da anlise um cromatograma com diversos picos,
identificados pelo seu tempo de reteno, isto , pelo tempo que o composto tarda a ser
eludo.

5.2. Mtodos de determinao de micotoxinas em alimentos

A deteco e a quantificao de micotoxinas em alimentos apresentam um problema
inerente, que a distribuio no uniforme das micotoxinas no lote (seco 2.5, p. 36). A
amostragem apontada como a principal fonte de variao dos resultados. Normalmente s
uma pequena percentagem de partculas alimentares est contaminada, de distribuio no
60
homognea na comodidade alimentar a analisar. No caso de produtos lquidos (leite, vinho)
ou homogeneizados (v.g., farinhas), estes problemas so menos relevantes, visto que se
assume que o lote est homogneo.
A deteco e quantificao de micotoxinas em alimentos consistem geralmente em 3
passos: amostragem; preparao da amostra; anlise da micotoxina.

5.2.1. Amostragem

Regra geral, o procedimento o seguinte: a amostragem deve ser aleatria, tendo as
diferentes partculas a mesma probabilidade de ser escolhidas. Como as partculas
contaminadas podem no estar uniformemente distribudas pelo lote, as amostras devem ser
compostas de pequenas pores recolhidas de diferentes locais. Desta forma, constitui-se a
amostra composta (Ing. bulk sample). Se a amostra composta demasiado grande para ser
analisada, deve ser homogeneizada e subdividida. A unidade mais pequena usada para estimar
a concentrao do lote designa-se de amostra-teste.
Os mtodos de colheita de amostras para anlise oficial de alimentos (nmero de amostras
analisadas e dimenso) esto fixados para diversos compostos e alimentos por directivas
comunitrias (98/53/CE; 2002/26/CE).

5.2.2. Preparao da amostra

A amostra teste deve ser homogeneizada num moinho ou misturadora. Quanto menor o
tamanho das partculas, mais homogeneizada estar a amostra. No caso de alimentos slidos,
aps reduo do tamanho das partculas em moinhos, faz-se uma pasta semi-slida numa
misturadora, com gua ou outro solvente. Depois, retira-se uma sub amostra, onde se faz a
anlise da micotoxina.

5.2.3. Procedimento analtico

Independentemente do mtodo analtico usado, a anlise de micotoxinas envolve
extraco, limpeza e determinao.
61
Extraco. A extraco, no caso de alimentos slidos, implica a passagem da micotoxina
do slido para uma fase lquida. Desta forma, obtm-se a micotoxina em concentraes
possveis de serem analisadas. Assume-se que a micotoxina vai estar igualmente distribuda
na fase lquida e excluda da fase slida da mistura. A validade desta assuno vai reflectir-se
nas taxas de recuperao do mtodo. Tipicamente, usam-se solventes orgnicos ou misturas
de solventes orgnicos e gua para extrair micotoxinas de alimentos slidos. A forma fsica de
misturar o solvente com o alimento influencia a eficincia de extraco. Pode-se agitar ou
usar misturadoras para garantir um bom contacto entre o lquido de extraco e o alimento
slido. Tipicamente, usam-se misturadoras durante alguns minutos ou agitao durante 30
minutos a 2 horas. Procedimentos que envolvem misturadoras so mais rpidos, mas tem de
se assegurar que a totalidade da amostra est continuamente em contacto com o solvente e que
no h zonas mortas ou estagnadas. Se se analisa um nmero considervel de amostras, a
agitao prefervel (CAST, 2003).

Limpeza. A limpeza da amostra feita aps a extraco, para remover do extracto lquido
impurezas antes do passo determinativo ou quantificativo. A limpeza consiste em isolar a
micotoxina do extracto, e pode servir para concentrar a micotoxina. Este passo no
requerido em todos os procedimentos analticos (v.g., ELISA), mas na maioria dos
procedimentos de rastreio e confirmatrios necessrio, para adquirir a selectividade e
sensibilidade desejada. Geralmente, a limpeza de extractos faz-se recorrendo a colunas de
extraco em fase slida (SPE). O enchimento das colunas SPE normalmente de slica
porosa, cuja superfcie foi modificada para permitir uma adsoro selectiva do analito ou das
impurezas. Quando se passa o extracto lquido, se o analito retido, as impurezas so
lexiviadas. Retira-se selectivamente o analito por modificao da soluo de lavagem. Se a
coluna retm as impurezas, o analito permanece no extracto lquido, e no necessrio um
segundo solvente.
As colunas de imunoafinidade (IAC) so uma forma de colunas SPE. Neste caso, esto
ligados anticorpos para o analito num material inerte. Os anticorpos so altamente especficos,
e as impurezas passam. O analito depois removido da coluna com um solvente que
desnatura o anticorpo. Existem colunas de imunoafinidade disponveis para aflatoxinas, OTA,
fumonisinas, zearelanona e DON. Por vezes, interaces no especficas entre componentes
da matriz e o material de enchimento podem afectar o processo de limpeza, mas em geral, as
IACs so muito eficientes a remover impurezas. Como so os anticorpos que determinam a
62
especificidade do processo de limpeza, factores que influenciem a actividade dos anticorpos
vo influenciar a capacidade da coluna se ligar s micotoxinas e a capacidade de recuperar a
toxina dos alimentos. Por isso, essencial que estejam anticorpos suficientes na coluna para
se ligarem a concentraes elevadas de micotoxinas. Para obter resultados exactos e
reprodutveis, factores como a fora do solvente aplicado na coluna, a velocidade do fluxo e o
volume de extracto devem estar de acordo com as instrues dos fabricantes.
Determinao. Existem diferentes mtodos de determinao de micotoxinas, consoante os
objectivos, que se classificam em dois tipos: mtodos de rastreio e mtodos confirmatrios.
Os mtodos de rastreio so de determinao rpida, mas so pouco rigorosos na quantificao.
Como exemplo destes mtodos temos os kits de ELISA, disponveis comercialmente para
vrias micotoxinas.
Os mtodos confirmatrios permitem conhecer de forma mais exacta os nveis de
micotoxina presentes, bem como confirmar a identidade do analito. Envolvem normalmente
determinao da micotoxina por tcnicas cromatogrficas como HPLC ou GC.
Confirmao da identidade de analitos. A identidade presuntiva do analito faz-se por
comparao com o padro. Em caso de dvida ou face a uma situao no descrita, a
identidade do analito pode ser confirmada por recurso a processos de derivatizao do analito,
que lhe alterem as propriedades (v.g. tamanho do pico e tempo de reteno em HPLC; cor da
banda em TLC), ou por anlise do espectro (UV, fluorescncia ou espectro de massa).

5.3. Validao de mtodos

Assume-se como princpio bsico da validao de resultados:

Um resultado para ser dado como vlido tem de satisfazer os requisitos de qualidade que
lhe sejam exigidos (Comisso Tcnica RELACRE CTR03, 1996)

Um mtodo de ensaio um processo que envolve manipulaes susceptveis de
acumular erros, podendo assim em algumas situaes alterar de forma significativa o
resultado final. A validao dos mtodos permite atravs de critrios objectivos mostrar que
os mtodos conduzem a resultados credveis e adequados qualidade pretendida.
Duas das medidas da avaliao da qualidade dum resultado so a exactido e a
preciso. A exactido a concordncia entre o valor obtido e o valor convencionalmente
63
aceite como verdadeiro. A preciso definida como a concordncia entre os resultados
obtidos por aplicao do mesmo procedimento de ensaio vrias vezes em materiais idnticos,
em condies definidas. A preciso est dividida em dois conceitos distintos: repetibilidade e
reprodutibilidade. A repetibilidade refere-se preciso obtida nas mesmas condies
(mesmo laboratrio, mesmo operador e equipamento, durante um curto intervalo de tempo).
A reprodutibilidade refere-se preciso obtida fazendo variar as condies (diferentes
laboratrios, operadores, equipamentos, e/ou tempos). A variabilidade dos resultados num
laboratrio a longo prazo uma situao intermdia das definies anteriores. Designa-se por
preciso intermdia a concordncia dos resultados obtidos no prprio laboratrio, em ensaios
espaados no tempo e independentes, aplicando o mesmo mtodo de anlise mesma amostra
e nas condies normais de funcionamento do laboratrio com respeito aos operadores e
equipamento utilizado.
A medida de avaliao da preciso dum mtodo o desvio padro relativo (RSD) dos
resultados. O RSD calculado dividindo o desvio padro dos resultados pela mdia dos
resultados. O RSD
r
o desvio padro relativo em condies de repetibilidade, e o RSD
R

desvio padro relativo em condies de reprodutibilidade.
A definio de valor convencionalmente aceite como verdadeiro tem originado
controvrsia. Actualmente, internacionalmente aceite como valor convencionalmente
verdadeiro o valor de um Material de Referncia Certificado (MRC) ou o valor mdio obtido
em ensaios interlaboratoriais apropriados. Os MCR, na definio da Organizao
Internacional de Normas (ISO), so materiais certificados para valores de uma ou mais
propriedades certificadas por um procedimento tcnico vlido, acompanhado de um
certificado emitido pela entidade certificadora. Estes materiais tm portanto nveis de
micotoxinas rigorosamente definidos. Podem ser naturais ou artificialmente contaminados.
Em qualquer dos casos, a amostra sofreu anlises substanciais em mltiplos laboratrios para
estabelecer a concentrao de micotoxina. Os MRC para micotoxinas so fornecidos pelo
Programa de Testes da Comisso Europeia e pelo seu predecessor, Bureau Communautaire de
Rfrence (BCR). Esto disponveis em diferentes nveis para matrizes legalmente e
economicamente importantes.
Para estabelecer procedimentos analticos dentro dum laboratrio, recomenda-se que o
estudo dum procedimento analtico seja feito na matriz (ou matrizes) desejada e que se
avaliem vrios critrios de aceitao, como a repetibilidade e reprodutibilidade, para amostras
contaminadas artificialmente e naturalmente contaminadas. A exactido do mtodo deve ser
64
comparada com outro mtodo validado ou com MRC. Recomenda-se ainda que os estudos de
validao sejam feitos em nveis prximos dos regulamentados pela UE.
A UE definiu critrios especficos de desempenho para os mtodos de anlise
destinados ao controlo oficial de micotoxinas. Regra geral, os mtodos devem ter uma taxa de
recuperao entre 70 a 110% e valores de RSD
r
e RSD
R
menor ou igual a 20 e 30%,
respectivamente (Directiva 98/53/CE da Comisso de 16 de J ulho de 1998 que fixa os
mtodos de colheita de amostras e os mtodos de anlise para o controlo oficial dos teores de
certos contaminantes nos gneros alimentcios
2
; Directiva 2002/26/CE da Comisso, de 13 de
Maro de 2002, que fixa os mtodos de colheita de amostras e de anlise para o controlo
oficial do teor de ocratoxina A nos gneros alimentcios
3
; Directiva 2002/27/CE da Comisso,
de 13 de Maro de 2002, que altera a Directiva 98/53/CE, que fixa os mtodos de colheita de
amostras e os mtodos de anlise para o controlo oficial dos teores de certos contaminantes
nos gneros alimentcios
4
).
A validao de mtodos analticos para controlo oficial dos nveis de micotoxinas em
alimentos deve ser levada a cabo a um nvel nacional e internacional, de acordo com
protocolos internacionais harmonizados para estudos colaborativos da IUPAC/AOAC/ISO.
Os mtodos validados podem ser adoptados como mtodos oficiais internacionais ou como
normas europeias por organismos como a AOAC internacional ou CEN.
Qualquer mtodo validado e adoptado pela AOAC internacional, CEN ou ISO
reconhecido como um mtodo oficial para os propsitos de comrcio internacional.

2
Disponveis na URL: http://europa.eu.int/eur-lex/pri/pt/oj/dat/1998/l_201/l_20119980717pt00930101.pdf
3
4
65

Micotoxinas: introdução aos conceitos e definições

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