Pruebas de sensibilidad a antifngicos

Las pruebas de sensibilidad tienen como objetivo conocer si los microorganismos

ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos y sirven para elegir de forma
ptima el tratamiento antifngico.

Metodologas para la determinacin de sensibilidad antifngica
Existen dos procedimientos generales para determinar la sensibilidad de los
microorganismos a los antimicrobianos y estos son:
- Dilucin en agar o caldo
- Difusin en agar

Dilucin en agar o caldo
Se realiza la dilucin del antimicrobiano en un medio de cultivo adecuado para el
crecimiento del microorganismo que se va a ensayar. Se inocula el microorganismo, se incuba
a una temperatura determinada y se determina la concentracin del antimicrobiano que
produce la inhibicin del crecimiento del microorganismo definida como CIM (Concentracin
Inhibitoria Mnima).

64 32 16 8 4 2 64 32 16 8 4 2 64 32 16 8 4 2 64 32 16 8 4 2
- Inoculacin
- Incubacin
CIM = 16 g/mL Diluciones del antifngico


Esta metodologa puede realizarse en macroescala, utilizando tubos, o en microescala,
usando microplacas de 96 pocillos. La posibilidad de cuantificar la actividad antifngica a travs
de la determinacin de la CIM es la principal ventaja de los mtodos de dilucin ya que estos
valores cuantitativos se pueden utilizar, junto con la farmacocintica del antimicrobiano, para
calcular ndices teraputicos.

Difusin en agar con disco
Se inocula el microorganismo en la superficie del agar y se deposita un disco con una
concentracin conocida de antimicrobiano. Despus de incubar a una temperatura adecuada,
se produce una zona de inhibicin del crecimiento del microorganismo alrededor del disco.
Dependiendo del tamao de la zona, se puede determinar si el microorganismo es sensible,
intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano ya que los dimetros tienen una
relacin inversa con la CIM. La principal ventaja de la difusin con disco es el bajo costo unido
a la simplicidad de la tcnica y esto incluye desde la realizacin, la lectura y en la mayora de
las ocasiones, la interpretacin.

Placa con medio de
cultivo inoculada
Discos conteniendo
antifngicos
Halos de inhibicin
incubacin
Placa con medio de
cultivo inoculada
Discos conteniendo
antifngicos
Halos de inhibicin
incubacin



Estndares de Referencia
El Instituto de Estndares Clnicos de Laboratorio, CLSI (Clinical Laboratory Standards
Institute), desarroll Estndares de Referencia que describen detalladamente los parmetros
experimentales para la correcta realizacin de ambos mtodos para lograr, de esta forma, una
mayor exactitud y reproducibilidad de los resultados.

Documento M27-A3: Mtodo de referencia para determinar la sensibilidad de las
levaduras a los antifngicos a travs del mtodo de dilucin en caldo.

Introduccin
El mtodo que describe este estndar est pensado para evaluar levaduras que causan
infecciones invasoras: todas las especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Este
mtodo no se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimrficos como
Histoplasma capsulatum. Para algunos hongos filamentosos se puede utilizar el mtodo de
dilucin cuyas directrices se encuentran descriptas en el documento M38-A.

Medio de cultivo
El medio recomendado es completamente sinttico: RPMI con glutamina, sin bicarbonato
y rojo fenol como indicador de pH.

Preparacin del inculo
1. Subcultivar todos los microorganismos en agar Sabouraud a 35C durante 24 horas
para Candida spp. y 48 horas para Cryptococcus neoformans. Hay que asegurarse de
su absoluta pureza y que los aislamientos no estn contaminados.
2. Preparar el inculo se debe tocando 5 colonias de 1 mm de dimetro de cultivos
incubados y suspendindolas en 5 ml de solucin salina estril 0,85% (0,145 mol/L de
NaCl; 8,5 g/L=0,85% solucin salina).
3. La suspensin resultante se debe de agitar vigorosamente durante 15 segundos y
ajustar la densidad de la suspensin celular a una transmitancia equivalente a 0,5 de la
escala de McFarland a 530 nm. Este ajuste produce una solucin salina que contiene
entre 1-5 x 10
6
UFC/ml que se diluye 1:2000 con RPMI 1640 lo que produce una
concentracin celular entre 0,5 x 10
3
2,5 x 10
3
UFC/ml.

Soluciones de antifngicos
Las soluciones madre de los antifngicos se deben de preparar a concentraciones de al
menos 1280 g/ml o 10 veces la concentracin mayor ensayada en dimetilsulfxido y luego en
el medio de cultivo apropiado.
El intervalo de concentraciones elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos
crticos, o sea aquellos que definen si una cepa es sensible o resistente. Basados en estudios
previos, se recomiendan las concentraciones de antifngicos que estn recogidas en la
siguiente tabla.
Antifngico Intervalo (g/ml)
Anfotericina B 16 - 0,03
5-fluorocitosina 64 - 0,12
Ketoconazol 16 - 0,03
Fluconazol 64 - 0,12
Itraconazol 16 - 0,03
Voriconazol 16 - 0,03
Posaconazol 16 - 0,03
Ravuconazol 16 - 0,03
Anidulafungina 16 - 0,03
Caspofungina 16 - 0,03

Realizacin de la tcnica de microdilucin
Se utilizan placas de microdilucin estriles de 96 pocillos. Se dispensan 100 l de los
antifngicos a una concentracin 2x en las columnas de la 1 a la 10 con una pipeta multicanal.
La columna 1 contiene la concentracin ms alta del antifngico (64 o 16 g/ml) y la fila 10 la
ms baja (0,12 o 0,03 g/ml). Cada pocillo de la placa se inocula con 100 l de la suspensin
del inculo.
El pocillo 11 control de crecimiento, que solo contiene 100 l de RPMI 1640, se aaden
100 l del inculo. El pocillo 12 es control de esterilidad de la tcnica y por tanto debe contener
solo RPMI.












Incubacin
Candida spp. se debe de incubar, sin agitacin, en atmsfera normal, a 35C durante 24-48
horas y Cryptococcus neoformans, en las mismas condiciones durante 70-74 horas. Tras este
periodo de incubacin se procede a leer los resultados.

Lectura de los resultados
La CIM es la concentracin ms baja de antifngico que inhibe sustancialmente el crecimiento
del microorganismo detectado visualmente. Se compara el crecimiento en cada concentracin
de antifngico con el crecimiento en el tubo control de crecimiento y se califica de la siguiente
forma:
0 = pticamente claro
1 = ligeramente turbio
2 = disminucin prominente de la turbidez
3 = ligera disminucin de la turbidez
4 = sin disminucin de la turbidez

La CIM para la anfotericina B, se define como la concentracin ms baja que tiene una
puntuacin de 0 (pticamente claro). Para la 5-fluorocitosina, los azoles y las equinocandinas
es la concentracin ms baja que tiene una puntuacin de 2 (disminucin prominente de la
turbidez).
Para aquellos aislamientos que producen grumos en el fondo, la dispersin de los mismos
pipeteando o agitando puede ayudar a la interpretacin de los resultados.




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03
Control de crecimiento
Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
Puntos de corte (g/ml) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3

Antifngico Sensible Sensible
dependiente de
la dosis
Intermedio Resistente
Anfotericina B 1 ----- ----- > 1
Fluconazol 8 16-32 ----- 64
Itraconazol 0,125 0,25-0,5 ----- 1
5-fluorocitosina 4 ----- 8-16 32
Voriconazol 1 2 ----- 4
Equinocandinas 2 ----- ----- -----


Control de calidad
Los objetivos del programa de control de calidad son evaluar:
1. la precisin y exactitud del procedimiento de ensayo.
2. si los reactivos, las condiciones del ensayo y las instrucciones utilizadas en el
procedimiento fueron adecuadas.
3. el personal que realiza las tcnicas y lee los resultados.
Estos objetivos se alcanzan si se utilizan cepas de control seleccionadas por su
estabilidad gentica y por su utilidad para controlar el mtodo que se est ensayando. Las
cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se incluyen siempre que se
ensaye un aislado, se utilizan C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei 6258, los resultados
obtenidos deben estar dentro del rango recomendado

Microorganismo Antifngico Rango CIM
C. parapsilosis ATCC 22019
Anfotericina B 0,25 2
Anidulafungina 0,25 2
Caspofungina 0,25 1
5-fluorocitosina 0,06 - 0,25
Fluconazol 0,5 4
Itraconazol 0,125 - 0,5
Ketoconazol 0,03 - 0,25
Posaconazol 0,06 - 0,25
Ravuconazol 0,016 - 0,12
C. krusei ATCC 6258
Voriconazol 0.016 - 0.12
Anfotericina B 0,5 2
Anidulafungina 0.03 - 0.12
Caspofungina 0.12 1
5-fluorocitosina 4 16
Fluconazol 8 64
Itraconazol 0,12 1
Ketoconazol 0,12 - 1
Posaconazol 0,06 - 0,5
Ravuconazol 0,06 - 0,5



Documento M44A Mtodo de difusin en medio slido
El documento M44-A describe el mtodo de difusin en agar para levaduras del gnero
Candida. Las pruebas en medio slido y en especial las de difusin son simples de realizar y
los resultados se obtienen de forma rpida, siendo, en teora, muy fciles de interpretar. Sin
embargo, en este punto hay que ser muy estrictos, pues si las tcnicas no se realizan
siguiendo rigurosamente las instrucciones sugeridas por los fabricantes, es posible que se
obtengan resultados errneos.

Medio de cultivo
Es muy importante la eleccin del medio de cultivo ya que su composicin influye en el
tamao de la zona de inhibicin, en la actividad del antimicrobiano, en la velocidad de difusin
del antimicrobiano y en la velocidad de crecimiento del microorganismo. Debido a esto, se
acord que el medio de cultivo debe reunir las siguientes caractersticas:
1. La receta del medio debe especificar la composicin de productos
2. El medio debe permitir el crecimiento de la mayora de los patgenos.
3. El medio debe estar tamponado de forma que no se produzca un cambio
significativo en su pH cuando los microorganismos crezcan.
4. El medio no debe ser antagonista de ninguno de los antimicrobianos ensayados.
5. El medio debe ser isotnico con la sangre, de forma que se pueda aadir sangre
completa para permitir el crecimiento de microorganismos fastidiosos.
6. El medio debe producir resultados satisfactorios en los ensayos de sensibilidad con
las cepas de control de calidad.
7. El medio debe ser reproducible, es decir el uso de diferentes lotes debe producir
resultados similares.
Para los antibacterianos el medio recomendado es agar Mueller-Hinton, mientras que
para los antifngicos, se recomienda el uso de Agar Mueller-Hinton con 2% glucosa y 0,5 g/ml
Azul de Metileno.
Las placas de Petri deben de tener una profundidad de 4 mm (1) . Para lograr esa
profundidad, si la placa es de 9 cm de dimetro se necesitan 25 ml de medio y si es de 15 cm,
60 ml. Es necesario secar la superficie antes de utilizarlas, colocando las placas durante media
hora, en la estufa de 37C boca abajo y con las tapas ligeramente abiertas para permitir que la
humedad se evapore.

Preparacin del inculo
Para la preparacin del inculo se parte de un cultivo de 24 h, en Agar Sabouraud
dextrosa a 35 ( 2 C). De este cultivo, se tocan cinco colonias y se suspenden en 5 ml de
solucin salina estril (8.5 g/L NaCl; 0.85%). El resultado de la suspensin se homogeneiza
durante 15 segundos, y su turbidez se ajusta a 0,5 de la escala McFarland (equivalente a 1 x
10
6
a 5 x 10
6
UFC).

Inoculacin de las placas
Las placas se deben de inocular de forma que se produzca un crecimiento confluente o
semiconfluente. La utilizacin de inculos grandes que producen una zona limtrofe engrosada
o inculos pequeos que producen colonias separadas no es adecuada ya que la zona de
inhibicin resultante no refleja la sensibilidad o resistencia real del aislado.
La siembra de las placas puede realizarse de dos formas:

Siembra por dispersin con hisopo
Se debe aplicar el siguiente procedimiento: se sumerge un hisopo de algodn estril en el
inculo. El exceso de lquido es eliminado girando el hisopo varias veces contra las paredes
interiores del tubo. El inculo se extiende por toda la superficie de la placa 3 veces seguidas.
En cada repeticin, se gira la placa 60, de forma que se asegure la distribucin uniforme del
inculo.

Siembra por inundacin
Una vez que se prepar el inculo, se realiza una dilucin 1/10, se extraen entre 2-4 ml del
mismo y se vuelcan en la placa de Petri. Se distribuyen homogneamente por la superficie. El
exceso de lquido se retira con una pipeta Pasteur estril. Se deja secar la superficie durante
15 minutos a temperatura ambiente.

Antifngicos
Los antifngicos pueden colocarse en distintos reservorios: pocillos en el agar, cilindros que
contienen el antimicrobiano, tabletas o discos. La aparicin del disco de papel de filtro
impregnado de antimicrobiano revolucion esta tcnica y en la actualidad es el reservorio de
eleccin para las pruebas de susceptibilidad. Las tabletas son tambin un mtodo muy utilizado
que se encuentra disponible comercialmente.

Preparacin de los discos de papel de filtro
De acuerdo a las recomendaciones de la United States Food and Drug Administration
Standards, el papel de filtro debe pesar 30 4 mg/cm2 y debe tener la suficiente capacidad
para absorber 2-3 veces su propio peso en agua. Los discos deben tener un dimetro de 6,35
mm. Para prepararlos se puede utilizar un sacabocados cuyo dimetro interno sea de 6,35 mm.
Lo ms prctico es adquirirlos en el comercio.

Colocacin de los discos de antimicrobiano
Los discos de antimicrobianos se deben colocar no ms de 15 minutos tras la inoculacin de
las placas, de esa forma la difusin y el crecimiento ocurren en simultneo. Se pueden aplicar
con la ayuda de un dispensador o con pinza estril. Para asegurar un completo contacto se
aconseja presionar el disco contra la superficie del agar. Se deben de colocar al menos a una
distancia de 15 mm del borde de la placa y separados entre s por una distancia de 24 mm.
Esta disposicin reduce la posibilidad de superposicin de zonas de inhibicin, que dificulta la
lectura e interpretacin. Una vez colocados en el agar, es importante no moverlos ya que la
difusin comienza de forma inmediata.

Incubacin de las placas
Las placas inoculadas deben ser incubadas a 35 2 C durante 20-24 y hasta 48 horas en una
posicin invertida.

Lectura de las zonas de inhibicin
El dimetro de cada zona de inhibicin se mide con una regla, calibre, plantilla o instrumental
electrnico.

Interpretacin de resultados
Con el mtodo de difusin no se puede determinar una CIM ya que nicamente se mide el
dimetro del halo de inhibicin. Por tanto, se establecieron las siguientes categoras:
1. Sensible
2. Intermedio/ Sensible dependiente de dosis
3. Moderadamente sensible
4. Resistente
Estas categoras estn basadas en los puntos de corte que se establecieron mediante el
mtodo de dilucin en caldo, las concentraciones sricas que el antibitico alcanza en suero y
la distribucin de las CIMs para la especie estudiada.

Antifngico Concentracin Halo de inhibicin (mm) CIM (g/ml)
R* S-DD* S* R* S-DD* S*
Fluconazol 25 g 14 15-18 19 64 16-32 8
Anfotericina B 10 g 10 11-14 15 4 2
Itraconazol 8 g 10 11-14 15 1 0,25-0,50 0,12
Ketoconazol 15 g 20 21-27 28 0,5 0,25 0,12
Voriconazol 1 g 13 14-16 17 4 2 1

*Susceptible: S; *Susceptible-dependiente de dosis: S-DD; *Resistente: R


Rangos de dimetros (mm) para las cepas control de calidad
Antifngicos

Candida albicans
ATCC 90028
Candida parapsilosis
ATCC 22019
Candida krusei ATCC
6258
Fluconazol 28-39 mm 22-33 mm
Anfotericina B 18-23 mm 20-26 mm 17-23 mm
Itraconazol 21-30 mm 19-26 mm 16-22 mm
Ketoconazol 31-42 mm 26-35 mm 22-29 mm
Voriconazol 31-42 mm 28-37 mm 16-25 mm
Los rangos de control de calidad de estos aislamientos no han sido establecidos para estos
antimicrobianos debido a la extensa variabilidad inter laboratorio.

Etest (AB Biodisk)
Es una tcnica cuantitativa. Consiste en la utilizacin de una tira de plstico que, en una de sus
caras, lleva un gradiente de concentracin del antimicrobiano. Tras la incubacin, la
interseccin entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibicin en forma de elipse
indican la CIM.




Problemas
Problema 1
Se determin la sensibilidad antifngica, por el mtodo de difusin en agar, de dos cepas
de Candida causantes de Candidiasis orofaringea aisladas de pacientes HIV positivo.
a) Determine cules fueron los dimetros de los halos de inhibicin para los distintos
microorganismos frente a los antifngicos estudiados. Complete el cuadro.

Anfotericina Fluconazol Itraconazol
Halo Interpret. Halo Interpret. Halo Interpret.
Cepa 1 22 mm 20 mm 18 mm
Cepa 2 20 mm 10 mm 8 mm
Cepa 3 24 mm 12 mm 17 mm
C. parapsilosis ATCC 22019 22 mm 15 mm 18 mm
C. krusei ATCC 6258 20 mm 20 mm

b) De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede afirmar
que el mtodo fue realizado de forma correcta?
c) Qu puede concluir sobre la susceptibilidad antifngica de las cepas aisladas?
d) En pacientes infectados con HIV la infeccin oral causada por C. albicans es un cuadro
recidivante que suele precisar tratamientos con azoles de larga duracin o de numerosos
ciclos para conseguir su remisin. El crecimiento de la poblacin con SIDA multitratada
con azoles ha dado lugar a un aumento notable de las descripciones de casos de
candidosis oral o esofgica que no responden al tratamiento con fluconazol. Qu
importancia tiene la determinacin de susceptibilidad antifngica en estos casos?

Problema 2
a) Se determin la susceptibilidad antifngica de dos cepas de C. albicans provenientes de
flujo vaginal a travs del mtodo de microdilucin en caldo. Cules fueron las CIMs para
las distintas cepas estudiadas frente a Fluconazol e Itraconazol?
El diseo de las microplacas se encuentra debajo.
- Filas A y B: C. albicans. Cepa 1
- Filas C y D: C. albicans. Cepa 2
- Filas E y F: C. parapsilosis ATCC 22019
- Filas G y H: C. krusei ATCC 6258
b) De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede afirmar que
el mtodo fue realizado de forma correcta?
c) Qu puede concluir sobre la susceptibilidad antifngica de las cepas aisladas?

Fluconazol Itraconazol




Fluconazol Itraconazol
CIM Interpretacin CIM Interpretacin
Cepa 1
Cepa 2
Candida parapsilosis ATCC 22019
Candida krusei ATCC 6258

d) Algunos autores consideran que se est produciendo un cambio en los agentes etiolgicos
de Candidiasis vaginales siendo cada vez es ms frecuente la implicacin de especies
menos sensibles a los azoles o que desarrollan fcilmente resistencia. Se piensa que
puede existir una relacin entre resistencia secundaria a los azoles en las cepas de C.
albicans procedentes de mujeres inmunocompetentes, tratadas con fluconazol y la
recidivas de las vaginitis fngicas. Qu importancia tiene la determinacin de la
susceptibilidad antifngica en estos casos? A qu puede atribuir los resultados obtenidos
para la cepa 2? Qu antifngico utilizara en cada caso?
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03
Control de crecimiento
Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12
Control de crecimiento
Control de esterilidad