Quim. Nova, Vol. 29, No.

5, 926-931, 2006
A
r
t
i
g
o
*e-mail: pezza@iq.unesp.br
DETERMINAO SIMULTNEA DE RESDUOS DE CLORANFENICOL, TIANFENICOL E FLORFENICOL EM
LEITE BOVINO POR CROMATOGRAFIA ELETROCINTICA MICELAR
Leonardo Pezza*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual Paulista, CP 355, 14801-970 Araraquara - SP, Brasil
ngel Ros
Departamento de Qumica Analtica e Tecnologia dos Alimentos Universidade de Castilla-La Mancha,
13004 Ciudad Real, Espanha
Leonor Nozal, Lourdes Arce e Miguel Valcrcel
Departamento de Qumica Analtica, Campus de Rabanales, Universidade de Crdoba, E-14071 Crdoba, Espanha
Recebido em 20/4/05; aceito em 22/11/05; publicado na web em 14/6/06
SIMULTANEOUS DETERMINATION OF CHLOROAMPHENICOL, THIAMPHENICOL AND FLORFENICOL RESIDUES
IN BOVINE MILK BY MICELLAR ELECTROKINETIC CHROMATOGRAPHY. A micellar electrokinetic chromatographic
method (MEKC) is described for determining residues of amphenicols(chloramphenicol,thiamphenicol and florfenicol) in bovine
milk. MEKC is conducted by using a separation buffer consisting of 20 mM Na
2
HPO
4
, 10 mM Na
2
B
4
O
7
, 50 mM SDS at pH 8.0;
UV detection at 210 nm and 10 kV of voltage. The limit of detection ranged from 4.3-5.3 g L
-1
. The MEKC method was
applied for the simultaneous determination of amphenicols in milk samples spiked with amphenicols at three concentration
levels: 10, 30 and 50 g L
-1
. Recoveries ranging from 91-105% were obtained by following a simple extraction/preconcentration
procedure.
Keywords: micelar electrokinetic chromatography; amphenicols; milk.
INTRODUO
O uso difundido de antibiticos pelos produtores e mdicos
veterinrios no tratamento de doenas infecciosas de vacas leitei-
ras, principalmente nas mastites, e a utilizao de drogas na ali-
mentao animal, como suplemento de dietas, tm contribudo para
a presena de antimicrobianos no leite bovino
1-3
. Outras condies
que podem determinar a presena de resduos de antimicrobianos
no leite so a higienizao de equipamentos e utenslios da inds-
tria e/ou a adio proposital de drogas para encobrir a deficincia
na qualidade higinica do leite e aumentar seu tempo de vida til
4
.
A presena de antibiticos no leite, resulta em grande preocu-
pao para a indstria de laticnios, alm de representar um risco
para a sade do consumidor.
Em relao ao consumidor, o leite contendo antibiticos pode
provocar reaes alrgicas, assim como choque anafiltico em indi-
vduos sensveis. Outro risco a ser considerado o consumo de leite
com altos nveis de resduos de antibiticos por gestantes, tendo em
vista que alguns antibiticos, como nitrofuranos e tetraciclinas, pos-
suem efeitos carcinognicos que podem levar a alteraes no desen-
volvimento sseo fetal. Alm de reaes alrgicas e de induo de
quadros patolgicos (ex.: cloranfenicol pode causar anemia crni-
ca), os resduos de antibiticos possibilitam o risco de induo
bacteriana e, posteriormente, a transferncia de multirresistncia entre
os microrganismos atravs de plasmdios
5,6
. Do ponto de vista da
indstria de laticnios, considera-se indesejvel a presena de res-
duos de antibiticos, em funo da sua interferncia no crescimento
dos cultivos iniciadores durante a elaborao de queijos e iogurtes,
causando srios prejuzos econmicos
7
.
O cloranfenicol um antibitico da classe dos anfenicis, de
amplo espectro e altamente efetivo, que foi isolado originalmente
em Streptomyces venezuelae, em 1948
8
. Sua ampla utilizao em
todo mundo tem variado, devido associao de anemia aplsica
(uma doena geralmente fatal) com a exposio ao cloranfenicol,
ainda que presente em baixos nveis de concentrao
9-11
. O uso de
cloranfenicol em animais produtores de alimentos est banido nos
Estados Unidos, na Unio Europia e em outros pases. Recente-
mente, resduos de cloranfenicol foram encontrados em carcaas
de peixes e em mel produzidos na sia
12
.
O tianfenicol e florfenicol so antibiticos com estruturas si-
milares ao cloranfenicol, os quais no esto associados com o apare-
cimento de anemia aplsica, sendo usados via oral para controle de
infeces em seres humanos. Esses antibiticos tambm so ex-
tensivamente utilizados no tratamento de doenas infecciosas de
bovinos, sunos e aves.
Embora nenhum desses anfenicis seja aprovado para uso em
gado leiteiro, existe a possibilidade que um ou mais possam ser uti-
lizados para tratamento de uma variedade de doenas que acometem
o gado leiteiro, gerando resduos desses antibiticos no leite.
Pelos fatos acima expostos e visando a proteo do consumi-
dor, a Unio Europia (EU) e o Food and Drug Administration
(FDA) dos Estados Unidos estabeleceram um limite mximo de
resduo (MRL) permitido (ou reconhecido como aceitvel) para
resduos de antibiticos em alimentos. A Tabela 1 mostra os valo-
res de MRL para os antibiticos pertencentes a classe dos anfenicis.
A grande maioria dos mtodos descritos na literatura para de-
terminao de resduos de anfenicis em leite, ovos, tecidos de
peixes e de animais produtores de alimentos so mtodos cromato-
grficos
10-21
. Todavia, apenas trs deles permitem a determinao
simultnea de cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol em amostras
reais, tais como msculos de peixes
15,19
e de animais
19
e leite bovi-
no
20
.
Nos ltimos anos, a eletroforese capilar (CE) tornou-se uma
tcnica popular devido simplicidade, ao alto poder de separao,
927 Determinao simultnea de resduos de cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol Vol. 29, No. 5
baixo tempo de anlise e pequeno consumo de amostra e de
solventes
22,23
. Dentre os diferentes modos de CE a cromatografia
eletrocintica micelar (MEKC)
24,25
, que faz uso de solues
micelares de tensoativos inicos, tem se mostrado uma tcnica muito
atrativa para separao de diversas classes de medicamentos, in-
cluindo antibiticos, agentes antiinflamatrios no esteroidais, este-
roidais e analgsicos
26
. Entretanto, a eletroforese capilar com detec-
o UV-Visvel no tem sido aplicada para anlise de resduos de
medicamentos em nveis de pequenas partes por bilho (g L
-1
),
devido sua menor detectabilidade intrnseca
27
.
No melhor do nosso conhecimento, no existe nenhum mtodo
descrito na literatura cientfica indexada para determinao de re-
sduos de anfenicis em leite bovino por CE. Em vista disso, e
dada a importncia de se monitorar a quantidade de antibiticos da
classe dos anfenicis tanto para a sade pblica, como para as in-
dstrias laticinistas, desenvolveu-se nesse trabalho um mtodo que
permite a separao e a quantificao simultnea de anfenicis
(cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol) em leite bovino, utilizan-
do a tcnica de eletroforese capilar em seu modo MEKC.
Foi obtida suficiente detectabilidade para a determinao de
resduos de anfenicis em leite bovino atravs de um procedimen-
to simples de tratamento das amostras, que permitiu a extrao e a
pr-concentrao dos referidos analitos.
Os limites de deteco obtidos neste trabalho foram suficien-
temente baixos para determinar concentraes de tianfenicol e
florfenicol abaixo dos MRL permitidos em leite bovino.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes e solues
Todas as solues utilizadas neste trabalho (solues padro,
solues estoque, solues tampo) foram preparadas utilizando gua
ultrapura obtida de um sistema de purificao de gua Millipore
milli-Q plus (Bedford, MA, EUA). Os anfenicis (cloranfenicol,
tianfenicol e florfenicol) foram de procedncia Sigma (St. Louis,
MO, EUA). Solues padro estoque (100 g mL
-1
) de cada anfenicol
foram preparadas em gua, sendo armazenadas em frascos escuros e
sob refrigerao para evitar possvel decomposio. Solues pa-
dro de trabalho de cada anfenicol (solues padro individuais) ou
de uma mistura de anfenicis (solues padro combinadas) foram
preparadas diaria ou semanalmente, por diluio adequada das cor-
respondentes solues padro estoque com gua. Padres prepara-
dos em gua foram empregados nos estudos envolvendo a otimizao
das condies de separao e quantificao simultnea dos anfenicis
por CE em seu modo MEKC.
Todos os solventes e reagentes utilizados foram de grau anal-
tico. Metanol, acetonitrila, acetato de etila foram de procedncia
Merck (Darmstadt,Germany). Os reagentes NaH
2
PO
4
, Na
2
B
4
O
7
,
SDS (Sigma, St. Louis, MO, EUA), NaOH e H
3
PO
4
(Merck,
Darmstadt, Germany) foram usados na preparao das solues
tampo. Essas solues foram filtradas atravs de unidades Millex-
HV de 0,45 m da Millipore (Bedford, MA, EUA).
Equipamentos
Todas as investigaes foram realizadas em um sistema de
eletroforese capilar
3D
HP (Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemanha)
equipado com um autoamostrador e um detector diode array. Um
software comercial (ChemStation, HP) foi usado para controlar o
sistema, coletar e manipular os dados.
Condies eletroforticas
A eletroforese capilar em seu modo MEKC foi realizada em
um capilar de slica fundida (HP, G1600-60311) de 75 m de d.i.,
48,5 cm de comprimento total e 40 cm de comprimento efetivo. A
separao foi conduzida aplicando-se um potencial de 10 kV (po-
laridade: do nodo ao ctodo) temperatura de 25
o
C. O tampo de
separao empregado foi Na
2
HPO
4
(20 mM), Na
2
B
4
O
7
(10 mM) e
SDS (50 mM), cujo pH foi ajustado ao valor 8,0 com uma soluo
de H
3
PO
4
1M. Antes de ser utilizado o capilar foi lavado sucessiva-
mente com H
2
O, HCl 1M, H
2
O, NaOH 0,1M e H
2
O por 5 min cada,
e finalmente lavado com o tampo de separao por 15 min. Antes
de cada anlise o capilar foi condicionado via o seguinte ciclo de
lavagem: H
2
O por 5 min, NaOH 0,1M por 5 min, H
2
O por 5 min e
tampo de separao por 5 min. O protocolo de injeo foi inicia-
do com 2 min de H
2
O, 2 min do tampo de separao, seguido da
injeo hidrodinmica de padres e amostras a 20 mbar por 7 s. As
medidas fotomtricas foram realizadas em um comprimento de onda
de 210 nm.
Amostras
Para a aplicao analtica do mtodo, utilizaram-se 6 amostras
recentes de diferentes tipos de leite bovino integral, de origem co-
nhecida e livres de antibiticos. Essas amostras foram fortificadas
com solues padro de anfenicis (cloranfenicol, tianfenicol e
florfenicol) a trs nveis de concentrao: 10, 30 e 50 g L
-1
.
Procedimento para a determinao de anfenicis em
amostras de leite bovino integral
Amostras de leite fortificadas com anfenicis (20 mL) foram
transferidas para tubos de centrfuga. Na seqncia, foram adicio-
nados 30 mL de acetato de etila e a mistura foi agitada mecanica-
Tabela 1. Limites mximos de resduos (MRL) de anfenicis
permitidos (ou reconhecidos como aceitveis) no leite e em outros
tecidos animais na Unio Europia (EU) e nos Estados Unidos
(EUA)
Anfenicol Espcies MRL (g/kg) Tecido
Cloranfenicol - 0 (EU e EUA) -
Tianfenicol Bovina 50 (EU)
a
Leite
50 (EU)
a
Msculo
50 (EU)
a
Rim
50 (EU)
a
Fgado
Frango 50 (EU)
a
Msculo
50 (EU)
a
Rim
50 (EU)
a
Fgado
Florfenicol Bovina 10 (EUA)
b
Leite
48
c
Leite
Frango 100 (EU)
d
Msculo
200 (EU)
d
Pele
2500 (EU)
d
Fgado
750 (EU)
d
Rim
a
Official Journal of the European Communities Commission Regu-
lation (EC) No 1000/98 of 13 May 1998, L 142/20;
b
FDA Compli-
ance Program Guidance Manual, National Drug Residue Milk
Monitoring Program, Food and Drug Administration, Rockville,
MD, 1997, Section 7303.039;
c
R.E. Baynes et al., Regulatory Toxi-
cology and Pharmacology 29 (1999) 287 e
d
Diario Oficial de las
Comunidades Europeas Reglamento (CE) No 2385/1999 de la
Comisin de 10 de novembre de 1999, L 288116.
928 Quim. Nova Pezza et al.
mente por 3 min. Aps centrifugao a 4000 rpm por 5 min a fase
orgnica foi separada, transferida para frasco apropriado e evapo-
rada at a secura em um evaporador rotatrio com banho de gua
mantido a 45
o
C. O resduo seco foi reconstitudo em 300 L de
gua desionizada, centrifugado por 3 min a 4000 rpm e injetado
diretamente no sistema de eletroforese capilar ou armazenado a
25
o
C at o momento da anlise. Para cada tipo de leite analisado
uma amostra no fortificada foi tratada segundo o procedimento
acima descrito, para um controle negativo.
RESULTADOS E DISCUSSO
A eletroforese capilar com deteco UV/Visvel no apresenta
detectabilidade suficiente para a quantificao de resduos de
anfenicis presentes em leite bovino nos nveis de MRL exigidos
pela UE e pelo FDA. Para contornar esse problema e aumentar a
detectabilidade, um procedimento simples de tratamento das amos-
tras visando o isolamento do analito da amostra biolgica (clean-
up) e sua pr-concentrao foi desenvolvido. As otimizaes das
variveis qumicas e instrumentais, bem como as etapas de trata-
mento da amostra para encontrar as condies mais adequadas do
mtodo e sua conseqente aplicao determinao de resduos de
antibiticos da classe dos anfenicis em leite bovino, so discuti-
das a seguir.
Variveis qumicas e instrumentais do mtodo
Os mtodos descritos na literatura que utilizam CE para deter-
minao de anfenicis em plasma humano
26,28
e em colrios medi-
cinais
29
empregam diversos tampes aquosos, tais como cido
actico/acetato de sdio, fosfato, tetraborato de sdio em presena
de dodecil sulfato de sdio e acetonitrila. Entretanto, esses mto-
dos s foram aplicados para determinao de um nico antibitico
da classe dos anfenicis. Assim, como primeiro objetivo, procu-
rou-se encontrar um tampo aquoso que permitisse a separao e
quantificao simultnea dos anfenicis estudados (cloranfenicol,
tianfenicol e florfenicol).
Testaram-se 4 sistemas tampo: 78% NH
4
Ac (10 mM), pH 4,6
e acetonitrila 22%; NaH
2
PO
4
(25 mM), pH 2,45; Na
2
B
4
O
7
(25 mM),
pH 9,24 e Na
2
HPO
4
(20 mM), Na
2
B
4
O
7
(10 mM), SDS (50 mM),
pH 9,3.
Os resultados obtidos mostraram que a melhor separao dos
anfenicis foi obtida com um sistema tampo constitudo por uma
mistura de Na
2
HPO
4
(20 mM), Na
2
B
4
O
7
(10 mM), SDS (50 mM),
pH 9,3. Escolhido o melhor tampo de separao, a influncia do pH
foi estudada no intervalo de 6,0 a 10,0, ajustado com uma soluo de
cido fosfrico 1M ou com uma soluo de NH
4
OH 1M. Obtive-
ram-se os melhores resultados em termos de resoluo, sensibilida-
de e tempo de anlise com o sistema tampo acima descrito em pH
8,0.
Um estudo da concentrao tima de cada componente do sis-
tema tampo em questo foi realizado em pH 8,0, mantendo-se
constante a concentrao dos outros componentes. A concentrao
de Na
2
HPO
4
foi variada de 10 30 mM, a concentrao de Na
2
B
4
O
7
de 5 20 mM e a concentrao de SDS de 25 75 mM. Os melho-
res resultados em termos de resoluo, sensibilidade e tempo de
anlise foram obtidos com o seguinte sistema tampo: Na
2
HPO
4
(20 mM), Na
2
B
4
O
7
(10 mM), SDS (50 mM), pH 8,0. Portanto, esse
sistema tampo foi utilizado como tampo de separao no pre-
sente trabalho.
A adio de modificadores orgnicos, tais como acetonitrila e
metanol, tambm foi estudada. Observou-se que a adio de tais
modificadores orgnicos em concentraes de 5 10% (V/V) au-
mentou o tempo de anlise, sem afetar a resoluo e, assim, o seu
uso foi descartado.
O efeito da temperatura na seletividade foi investigado entre
15 e 25
o
C. A temperatura de 25
o
C mostrou um melhor compro-
misso entre seletividade e tempo de corrida dos eletroferogramas.
A influncia da diferena de potencial (ddp) aplicada na sepa-
rao dos anfenicis foi estudada no intervalo de 5 25 kV, obser-
vando-se uma diminuio do tempo de anlise com o aumento da
ddp aplicada. Entretanto, a eficincia de separao dos anfenicis
diminui com o emprego de ddp elevadas. Em vista disso, selecio-
nou-se uma diferena de potencial de 10 kV como voltagem de
trabalho.
O melhor valor de comprimento de onda () para a deteco
dos analitos estudados, determinado com um detector por arranjo
de diodos, foi de 210 nm.
A injeo dos analitos (volume de injeo: 25,0 nL) foi efetu-
ada em modo hidrosttico a 20 mbar, sendo o tempo de injeo
hidrosttica fixado em 7 s, j que tempos maiores provocaram o
aparecimento de picos mal definidos.
Nos estudos acima descritos foram empregados padres de
anfenicis preparados em gua. Com as otimizaes acima
estabelecidas e utilizando injeo hidrodinmica, foi possvel al-
canar limites de deteco (determinado como a concentrao do
analito que produziu um sinal trs vezes maior que o rudo do sis-
tema) em torno de 0,30 mg L
-1
, sem pr-concentrao dos analitos.
Observa-se claramente pelos dados da Tabela 1 que a detectabilidade
acima obtida no suficiente para permitir a anlise de resduos de
anfenicis em leite bovino por CE. A fim de aumentar a detec-
tabilidade do mtodo e determinar os anfenicis em baixas con-
centraes, desenvolveu-se neste trabalho um procedimento sim-
ples de tratamento das amostras que permitiu a extrao e a pr-
concentrao dos analitos.
Etapas de tratamento das amostras
Amostras biolgicas so caracterizadas por sua complexidade.
Elas contm muitos componentes que podem interferir e tornar
sua anlise mais difcil. Em vista disso, necessrio um pr-trata-
mento dessas amostras (extrao, pr-concentrao, etc.) para que
possam ser obtidas em um meio apropriado e em concentraes
adequadas para sua injeo no sistema de CE.
Os mtodos analticos descritos na literatura para anlise de
antibiticos apresentam vrias etapas em comum. Um ponto con-
cordante que uma das primeiras e mais difceis etapas exigidas
para anlise de antibiticos sua extrao e o isolamento do analito
(clean-up) da amostra biolgica
30-34
. Este um pr-requisito para
todas as metodologias analticas, embora o grau em que feito
varie amplamente.
As tcnicas comumente utilizadas para extrao e clean-up
de antibiticos de amostras biolgicas (soro, plasma, urina, leite,
etc.) envolvem alguma forma de extrao lquido-lquido ou extra-
o em fase slida. A extrao por fluido supercrtico tem atrado
interesse devido ao seu potencial para anlise de antibiticos
35
, mas
devido exigncia de equipamento especializado no tem encon-
trado ampla aplicao.
A maioria dos mtodos existentes para a determinao de res-
duos de antibiticos em leite bovino exigem a precipitao das
protenas do leite e a extrao em solventes orgnicos polares.
Moats
36
analisou criticamente os vrios mtodos usados para ex-
trao e/ou desproteinizao de antibiticos no leite bovino e em
tecidos animais.
Os antibiticos da classe dos anfenicis podem ser extrados
de matrizes biolgicas com um solvente orgnico
3
. A desproteini-
929 Determinao simultnea de resduos de cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol Vol. 29, No. 5
zao/extrao geralmente realizada com metanol, acetonitrila
ou acetato de etila
31
.
No presente trabalho, todos esses solventes foram testados e o
que propiciou os melhores resultados foi acetato de etila. Conforme
observado por outros autores
3,37,38
, constatou-se tambm no presente
trabalho que uma nica etapa de extrao com acetato de etila
suficiente para a extrao quantitativa dos antibiticos da classe dos
anfenicis. Alm disso, obtiveram-se extratos extremamente lm-
pidos, sem resduos de gorduras. Portanto, a conjuno dos resulta-
dos experimentais acima descritos possibilitou o desenvolvimento
de um procedimento simples de desproteinizao/extrao com
acetato de etila, permitindo aps etapa de centrifugao e evapora-
o (para a pr-concentrao dos analitos) uma injeo direta dos
analitos no sistema de eletroforese capilar.
Os parmetros eletroforticos da anlise e detalhes gerais do
tratamento da amostra para anlise de resduos de anfenicis
(cloranfenicol, tianfenicol e florfenicol) em leite bovino so mos-
trados na Tabela 2.
Validao do mtodo analtico proposto
Nos mtodos bioanalticos, ao contrrio de muitos outros m-
todos analticos, as solues padro para calibrao devem ser pre-
paradas na mesma matriz biolgica das amostras (livre do analito)
e extradas da matriz segundo o mesmo procedimento empregado
para as amostras
39,40
.
As curvas analticas para os anfenicis selecionados (cloran-
fenicol, tianfenicol e florfenicol) foram obtidas pela fortificao
da matriz (leite bovino integral livre de antibiticos) com solues
padro combinadas de anfenicis, utilizando-se grficos de padro-
nizao externa e foram lineares em um intervalo de concentrao
de 9 65 g L
-1
. As solues padro preparadas no leite foram
tratadas segundo o mesmo procedimento de extrao/pr-concen-
trao descrito para as amostras antes de serem injetadas no equi-
pamento de CE.
Empregou-se o mtodo da padronizao externa j que para
propsitos quantitativos no se observou nenhuma vantagem sig-
nificativa usando o mtodo do padro interno. Na preparao das
curvas analticas foram empregadas seis solues padro combi-
nadas, de concentrao varivel. Cada ponto da reta de calibrao
de um determinado anfenicol corresponde ao valor mdio obtido a
partir de trs medidas independentes (n=3) da rea de pico dos
eletroferogramas. Os valores das reas de pico normalizadas versus
as concentraes foram utilizados para aplicar a regresso linear
via mtodo dos mnimos quadrados.
O limite de deteco (LOD)
41-43
foi considerado como a con-
centrao do analito que produziu um sinal trs vezes maior que o
rudo do sistema e variou de 4,3 a 5,3 g L
-1
. O limite de quantifi-
cao (LOQ)
41-43
, adotado como a menor concentrao do analito
que produziu um sinal dez vezes maior que o rudo do sistema com
um grau de confiana aceitvel (desvio padro relativo, RSD < 15%),
variou de 8,3 a 9,0 g L
-1
. A preciso do mtodo proposto (incluin-
do as etapas de extrao/pr-concentrao das amostras e a separa-
o por MEKC), expressa como RSD, foi determinada em condi-
es de repetibilidade (intradia) pela anlise sucessiva de dez
replicatas (n=10) de uma soluo padro combinada preparada na
matriz e contendo 20 g L
-1
de cada anfenicol. Em todos os casos o
valor de RSD foi menor que 6,0% para a quantificao dos
anfenicis. Uma boa preciso tambm foi obtida nos tempos de
migrao (menor que 0,8% em todos os casos, o que demonstra a
eficincia do tampo proposto).
Na Tabela 3 so mostradas as caractersticas de desempenho
investigadas no processo de validao do mtodo analtico propos-
to, as quais foram determinadas com o devido rigor estatstico
44,45
e segundo as diretrizes preconizadas nos procedimentos de valida-
o de mtodos cromatogrficos e eletroforticos
46,47
.
A Figura 1 ilustra um eletroferograma tpico de uma soluo
padro combinada contendo 3 mg L
-1
de cada anfenicol em H
2
O e
um eletroferograma para uma amostra de leite bovino fortificada
com 10 g L
-1
de cada anfenicol (aps sofrer o processo de extra-
o e pr-concentrao proposto). Os picos dos eletroferogramas
dessas amostras foram identificados pela comparao com uma
base de espectros previamente compilada pelos autores.
A Tabela 4 mostra os valores das recuperaes obtidas atravs
da adio de trs nveis de concentrao de anfenicis (10, 30 e 50
g L
-1
) a um conjunto de seis amostras reais livres de antibiticos.
Como pode ser visto, as recuperaes variaram de 91 a 105% (para
cinco determinaes independentes, n=5) e o desvio padro relati-
Tabela 2. Parmetros eletroforticos e tratamento da amostra para
anlise de resduos de anfenicis em leite bovino
Parmetros Mtodo Proposto
Comprimento de 210 nm
onda de deteco
Tampo de separao Na
2
HPO
4
(20 mM), Na
2
B
4
O
7
(10 mM),
SDS (50 mM), pH 8,0
Capilar utilizado Slica fundida, 75 m de d.i., 48,5 cm
de comprimento total e 40 cm de
comprimento efetivo
Modo de injeo Hidrodinmico: a 20 mbar por 7 s
Volume de injeo 25 nL
Diferena de 10 kV
potencial aplicada
Polaridade Do nodo ao ctodo
Temperatura 25
o
C
Tratamento da amostra Precipitao das protenas e extrao
(leite bovino) quantitativa dos anfenicis com acetato
de etila.
Evaporao do solvente em evaporador
rotatrio e reconstituio do resduo em
300 L de gua desionizada
Figura 1. Eletroferogramas obtidos analisando: (a) uma soluo padro
combinada contendo 3 mg L
-1
de cada anfenicol em meio aquoso, (b) uma
amostra de leite bovino fortificada com 10 g L
-1
de cada anfenicol aps
sofrer o tratamento de extrao e pr-concentrao proposto. 1. tianfenicol;
2. florfenicol; 3. cloranfenicol
930 Quim. Nova Pezza et al.
vo (RSD) variou de 5,4 a 7,5%, comprovando a eficincia do mto-
do proposto.
CONCLUSES
Foi desenvolvido um mtodo alternativo utilizando a tcnica de
eletroforese capilar em seu modo MEKC para determinao quanti-
tativa simultnea de resduos de anfenicis em leite bovino. O pro-
cedimento analtico proposto neste trabalho simples, rpido, pre-
ciso, exato e suficientemente sensvel para permitir o monitoramento
de resduos de tianfenicol e florfenicol abaixo dos valores de MRL
estabelecidos pela EU ou pelo FDA (EUA) para leite bovino.
AGRADECIMENTOS
Ao Ministerio de Cincia e Tecnologa de Espaa pelo suporte
financeiro por meio de auxlios pesquisa. L. Pezza agradece
FAPESP, CAPES e CNPq pelo suporte financeiro por meio de au-
xlios pesquisa, bolsa de estudo (ps-doutorado) e de produtivi-
dade em pesquisa, respectivamente.
REFERNCIAS
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Tabela 4. Anlise de amostras de leite bovino fortificadas com diferentes concentraes de antibiticos da classe dos anfenicis
Amostras
a
Anfenicol Adicionado Encontrado
b
Recuperao mdia RSD
c
(%)
(g L
-1
) (g L
-1
) (%), (n=5) (n=5)
A Cloranfenicol 10 9,1 91 7,5
Florfenicol 10 9,3 93 6,8
Tianfenicol 10 9,5 95 6,3
B Cloranfenicol 30 28,5 95 6,9
Florfenicol 30 29,1 97 6,6
Tianfenicol 30 30,9 103 5,9
C Cloranfenicol 30 28,8 96 6,5
Florfenicol 30 30,6 102 5,4
Tianfenicol 30 30,3 101 6,1
D Cloranfenicol 50 49,0 98 6,1
Florfenicol 50 51,5 103 6,3
Tianfenicol 50 50,5 101 5,8
E Cloranfenicol 10 9,5 95 6,3
Florfenicol 10 10,5 105 7,3
Tianfenicol 10 10,2 102 6,4
F Cloranfenicol 50 49,0 98 7,1
Florfenicol 50 51,0 102 5,7
Tianfenicol 50 50,5 101 5,9
a
Amostras de leite bovino integral conhecidas e livres de antibiticos;
b
valores determinados por padronizao externa e
c
desvio padro
relativo (RSD).
Tabela 3. Caractersticas de desempenho do mtodo eletrofortico proposto
Analito y = a + bx
a
r
b
RSD
c
rea(%)
c
RSD
c
tempo(%) LOD
d
(g L
-1
) LOQ
e
(g L
-1
)
Tianfenicol a = 0,006 ( 0,003) 0,9997 3,2 0,65 4,3 8,3
b = 0,463 ( 0,005)
Florfenicol a = 0,011 ( 0,004) 0,9995 4,7 0,78 4,8 8,6
b = 0,336 ( 0,009)
Cloranfenicol a = 0,005 ( 0,004) 0,9993 5,8 0,56 5,3 9,0
b = 0,244 ( 0,007)
a
a = intercepto; b = coeficiente angular. Valores obtidos a partir de 3 medidas independentes (n=3);
b
r = coeficiente de correlao;
c
RSD =
Desvio padro relativo das reas de pico e dos tempos de migrao (n=10);
d
LOD = limite de deteco e
e
LOQ = limite de quantificao.
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