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Este documento describe la extracción y acción catalítica de las amilasas. Explica que las amilasas son enzimas importantes para procesos industriales y biotecnológicos. Detalla las diferencias entre la alfa y beta amilasa, incluyendo sus orígenes, acciones y aplicaciones. Finalmente, resume un experimento sobre la hidrólisis ácida y enzimática del almidón.
Este documento describe la extracción y acción catalítica de las amilasas. Explica que las amilasas son enzimas importantes para procesos industriales y biotecnológicos. Detalla las diferencias entre la alfa y beta amilasa, incluyendo sus orígenes, acciones y aplicaciones. Finalmente, resume un experimento sobre la hidrólisis ácida y enzimática del almidón.
Este documento describe la extracción y acción catalítica de las amilasas. Explica que las amilasas son enzimas importantes para procesos industriales y biotecnológicos. Detalla las diferencias entre la alfa y beta amilasa, incluyendo sus orígenes, acciones y aplicaciones. Finalmente, resume un experimento sobre la hidrólisis ácida y enzimática del almidón.
INTEGRANTES : BAQUERIZO CHUQUILLANQUI, Guilliana CHOQUE MENDOZA, Sheyla Laura CORILLA HUAMN, Gaby HUANQUIS ALBINAGORTA, Lourdes LLACUA CHVEZ, Fabiola PALOMINO CESAR, William Ezer
2014 EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias UNI VERSI DAD NACI ONAL DEL CENTRO DEL PER BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS
La produccin de enzimas tienen una gran importancia para los procesos industriales o biotecnolgicos, ya que pueden ser de enorme ayuda para obtener: productos lcteos, edulcorantes, frmacos, alimentos, licores, detergentes, o con propiedades de degradacin de lignina o de compuestos txicos. Las nuevas industrias, juntamente con las nuevas tendencias y las nuevas altas exigencias ambientales han impulsado el desarrollo de nuevas tcnicas agroindustriales. Las nuevas plantas de alcohol para uso como combustible, a partir del almidn, requieren la transformacin de la materia prima por procesos de hidrlisis mediante la accin de un complejo de amilasas capaces de degradarlo en azucares. La implementacin de hidrlisis enzimtica conlleva generar altos costos de produccin, factor que genera una problemtica en las empresas de este gnero y a su vez en buscar soluciones para dicha temtica. Estas alfa amilasas son muy importantes para muchos procesos, tanto fisiolgicos, como las amilasas salivales, como industriales, las que son utilizadas en la fabricacin de etanol combustible (ya mencionado anteriormente). Debido a la importancia de conocer las enzimas, en especial la alfa amilasa, y sus aplicaciones en la industria, en el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos: Extraer amilasa de origen vegetal Evaluar y comparar su accin biocataltica.
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS 2.1. ALMIDN Probablemente no existe otro compuesto orgnico tan ampliamente distribuido en los vegetales como el almidn. Es el producto de asimilacin ms importante de la fotosntesis y constituye la principal sustancia de reserva delos vegetales. Qumicamente el almidn o fcula es un polisacrido homogneo que est formado por una mezcla de dos polisacridos estructuralmente diferentes: amilosa y amilopectina. Amilosa Es una molcula lineal compuesta por 250 a 300 unidades de - D-glucopiranosa enlazadas por uniones 1-4.- La Amilopectina Es ramificada, constituida por 1.000 a 3.000 unidades de glucosa conectadas por uniones 1-4 y 1-6 en los puntos de ramificacin. El almidn se encuentra en abundancia en:- Gramneas (cereales): trigo (Triticum sativum); arroz (Oryza sativa); maz (Zea mays;); avena (Avena sativa); centeno (Secale cereale); cebada (Hordeumvulgare).- Leguminosas (legumbres): porotos (Phaseolusvulgaris); arvejas (Pisumsativum); lentejas (Lens sculenta), etc.- Solanceas: papas (Solanum tuberosum).Industrialmente se le obtiene por va hmeda a partir de ellos. 2.1.1. Caracterstica y propiedades Se presenta como polvo blanco fino, inspido,constituido por granos caractersticos microscpicamente para cada especie.Para su caracterizacin se toma en cuenta: tamao (aprox. 2-150 u), BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS forma,hilio o ncleo, estratificaciones; granos simples o compuestos y aspectos a laluz polarizada.El almidn es insoluble en agua fra; en agua caliente se hincha formandoengrudo; se tie de azul a azul violeta con sol. R lugol; da glucosa como producto final de la hidrlisis total. (Smith L. y Cristol S.; 1990).
Grafico 1. Representacin esquemtica del Almidn. Fuente: Smith L. y Cristol S. (1990).
Grafico 2. Representacin esquemtica de una molcula de amilopectina. .., lmite de la degradacin inicial por la -amilasa y confn de la dextrina-I; - - - -, lmite de la segunda degradacin por la -amilasa, y confn de la dextrina-III; (representa el lmite de la degradacin de la -glucosidasa para dar dextrina-II). R, es un grupo reductor terminal. Fuente: Smith L. y Cristol S. (1990).
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS 2.2. ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del pncreas. Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote. La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda ms en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal. Acciones: Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados. BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarognica, pues acta sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina acta en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su accin a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa- 1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que acta sobre el terminal de la molcula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38). La beta-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al calor, inactivndose a 70C por 15 min. El pH ptimo de la beta-amilasa es de 4,5. Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhdrido carbnico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estn presentes en la masa, y cuya formacin depende, a su vez, de la accin sincronizada de la alfa- y la beta-amilasa; en mejor forma que por adicin de extracto de malta usado tambin para este objeto. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adicin. La alfa-amilasa de origen fngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitacin y una aireacin intensa), aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales, se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservndose as la maltosa, esencial para la fermentacin. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentacin de la masa, tiene las siguientes ventajas: BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS mayor contenido de azcares fermentescibles en la masa; aceleracin de la fermentacin desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad ms fina y de costra ms uniforme y ms coloreada. La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Por este motivo, su adicin debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38, 40). Por otra parte, una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante del envejecimiento. Al sustituir la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica, cuyas desventajas se han sealado anteriormente. Maldonado y Guerrero (2000); realizaron un ensayo experimental sobre hidrlisis cida y enzimtica del almidn, y para confirmar azcares reductores realizaron la reaccin de Benedict, lo realizaron en un bao de agua hirviendo por 5 minutos, retiraron los tubos y observaron; en el cuadro 1 reportaron sus resultados. Cuadro 1. Resultados hidrlisis cida y enzimtica del almidn.
Fuente: Maldonado y Guerrero (2000). BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS En la hidrlisis cida se produce un rompimiento total de los enlaces que mantienen unido a los monmeros del almidn y se forma glucosa, maltosa, isomaltosa. En la hidrlisis enzimtica se produce un rompimiento parcial de los enlaces que mantienes unido a las unidades del almidn y se formar maltosa, glucosa y dextrina lmite que es una cadena ramificada. 2.3. RECONOCIMIENTO QUIMICO DE LA GLUCOSA. El reconocimiento qumico de los principios inmediatos es una prctica de la que no debera abusarse en el medio escolar, dado que sus resultados no son fcilmente explicables en dicho mbito pedaggico. De todos modos, resulta interesante realizar algn ensayo de los de tipologa ms conocida. Presentamos aqu el clsico reconocimiento de la glucosa por medio de la solucin de Fehling. La solucin de Fehling se prepara como sigue: Sol. A: 17.3 gr. De sulfato de cobre en 250 cc. De agua destilada. Sol. B: 86.5gr. de tartrato sdico-potsico en 125 cc. De agua destilada. 25 gr. De hidrxido potsico en 125 cc. De agua destilada. Las soluciones A y B se guardan por separado. Para constituir la solucin de Fehling se mezclan ambas soluciones inmediatamente antes de su utilizacin. La mezcla se realizar a partes iguales. Para comprobar la reaccin con licor de Fehling, se prepara una solucin de glucosa a la que se le aade la solucin de Fehling, se prepara una solucin de glucosa a la que se le aade la solucin de Fehling y se calienta la mezcla al bao Mara. Se producir un precipitado rojizo de xido de cobre, reaccin tpica de la glucosa. Como complemento, podemos verificar que la citada reaccin no se produce con la sacarosa. (Nogus, 1988). BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS 3.1. MATERIALES: 100 g de Trigo
Almidn de papa
Reactivo de Fehling A y B
Tubos de ensayo
Vasos de precipitacin
Gradilla
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS Fiola
Probeta
Pipetas
Varilla de vidrio
Matraces Centrifuga Papel filtro
pH - metro
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS 3.2.- MTODO a) Extraccin de B-Amilasa de trigo Remojado del trigo Una vez seleccionado (separacin de pajas y semillas extraas) se pes la semilla (250-500g), se lav con agua potable, seguidamente se remojo en un recipiente hasta alcanzar el 45% de humedad, por un tiempo de 6-8h, a temperatura ambiente, se cambi el agua al menos 3 veces para oxigenar el material, luego se retir el agua y se coloc las semillas en papel absorbente por 30 minutos.
Germinacin Las semillas con 45 % de humedad en peso se colocaron en bandejas para la germinacin y se sometieron en el germinador en donde se mantuvo a una temperatura de 16 C, con una humedad relativa de 100%. Una vez que el acrospiro alcanzo de a o 9 mm de longitud del grano se detuvo la germinacin.
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS Molienda Las semillas se molieron en un moulinex, hasta obtener una partcula de 0,5 a 0,7 mm de tamao, se asegur que la corteza pajosa este molida.
Dilucin Las semillas molidas de diluyeron en una proporcin de 1:2, se agita, se filtra y centrifuga a 5000 rpm. El sobrenadante tuvo que ser transparente, seguidamente se guard en tubo falcon esterilizado en congelacin hasta el momento del anlisis.
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS b) Ensayos hidrolticos Preparacin del sustrato Se prepar una suspensin de almidn al 15 % (P/V) Y pH =5, se mezcl bien y se llev a coccin por 30 minutos a temperatura de ebullicin o tambin se pudo haber auto clavado a 120C por 15 minutos. Se enfri y se tom alcuota para los ensayos de hidrolisis enzimtica y acida.
Hidrolisis enzimtica y acida Se realiz en tubos de prueba con tapa rosca, se utiliz un equipo de bao mara, durante la hidrolisis y se agito en intervalos de tiempo de 15 minutos.
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS Brix inicial (antes de la hidrlisis)
Brix final(Despus de la hidrlisis) Acida amilasa salival amilasa amilasa y amilasa Blanco Brix 8,2 2,4 3,2 3,0 1.0
Resultados de la accin biocataltica de las amilasas Los resultados de son cualitativa, esencialmente en la coloracin, para la cual se muestra la siguiente tabla Acida amilasa salival amilasa amilasa y amilasa Blanco Hidrlisis No hubo Si Si Si No Color
Celeste Rojo ladrillo Rojo ladrillo Rojo ladrillo
Azul
Brix Muestra antes de la hidrlisis 3 BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS Al agregar el Fehling A y B se observ el cambio de color de azul a un rojo ladrillo por lo que se puede decir que hay presencia de azcares reductores. Discusiones: Segn Nogus (1988) refiere que la solucin de Benedict (y la solucin del mismo gnero de Fehling que contiene el ion complejo de tartrato cprico), dan un precipitado rojo ladrillo de
cuando oxidan a una aldosa. Los
azcares que dan pruebas positivas con las soluciones de Tollens o Benedict se conocen como azucares reductores.
Segn Smith L. y Cristol S. (1990)., en la cebada predomina la beta amilasa, suficiente para producir los azucares necesarios para el desarrollo de los microorganismos; durante el malteado, que es una germinacin controlada del grano, se producen las enzimas de alfa amilasa y beta amilasa, cuya actividad conjunta sobre el almidn se conoce como actividad diastsica.
Smith L. y Cristol S. (1990) nos dice que los cereales como la enzima alfa- amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y pequeos compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de degradar parcialmente la amilopectina y el glucgeno debido a que no es capaz de desdoblar los enlaces glicosidicos 1-6 encontrados en los puntos de ramificacin de la cadena del polisacrido.
La accin de la alfa amilasa sobre los almidones presentes en los granos de cebada depende de la estructura granular porosa que puedan tener y que los haga accesibles a la enzima.
La hidrlisis de la amilosa produce oligosacridos de bajo peso molecular abarcando desde maltosa a maltohexosa dependiendo del origen y naturaleza de la amilosa. Siendo una amilasa sacarognica, el almidn se hidrolizara inicialmente a dextrinas y posteriormente a maltosa y glucosa, que son azcares libres diferencindola as de las amilasas liquificantes que no los producen.
Los grnulos de almidn en la cebada estn compuestos casi enteramente de amilopectina, recubiertos por una capa delgada de protena y exteriormente por una capa delgada de celulosa, por lo que requiere un proceso de ruptura para facilitar el ataque enzimtico. La hidrolisis de la amilopectina produce glucosa, maltosa y una variedad de dextrinas alfa limitantes ramificadas que contienen enlaces alga 1,6 del polmero original; al estar presente la alfa BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS amilasa experimental, los almidones presentes se hidrolizan parcialmente produciendo dextrinas que originan un color pardo al reaccionar con iodo.
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS De lo realizado en la prctica, se llega a las siguientes conclusiones: Se consigui la extraccin de amilasas, mediante la germinacin de cereales. La amilasa, tiene mayor actividad hidroltica que la amilasa. Una combinacin de y amilasas, muestran una alta actividad enzimtica, a comparacin de las mismas por separado. La hidrolisis acida, no reacciono con el reactivo de Felhing, debido a que el acido utilizado, no tena la pureza requerida.
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS Smith L. y Cristol S. 1990. Qumica Orgnica. Primera edicin. Editorial Revert. Maldonado N. y Guerrero L. 2000. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad de Guayaquil. Nogus R. 1988. La observacin de los seres vivos. Primera edicin. Editorial Universidad Autnoma de Barcelona. http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas /schmidth02/parte07/08.html BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS a) Desarrollar y explicar el mecanismo bioqumico de hidrolisis enzimtica de la alfa, beta y acida del almidn. Hidrlisis del almidn. Como actan las enzimas La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la - amilasa y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la - amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa cuando an quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero solo sobre los extremos no reductores. La -maltosa cambia con rapidez, por mutarrotacin, para formar las mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la degradacin de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificacin. La actividad de ambas amilasas implica la incorporacin de una molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas hidrolasas. BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS
Figura 1: hidrolisis enzimtica de la alfa
b) Cuales son las ventajas y desventajas de la hidrolisis qumica e enzimtica desde el punto de vista tecnolgico, ambiental, econmico y alimentario. HIDRLISIS ENZIMTICA Ventajas Y desventajas La hidrlisis enzimtica en los ltimos 30 aos ha desplazado la hidrlisis cida, debido a que se dispone de nuevas enzimas. Hoy en da la mayor parte de la hidrlisis de almidn se realiza usando enzimas, ya que esta tcnica presenta ventajas como: Control de la formacin de productos no deseables y mayor flexibilidad del producto. La hidrolisis enzimtica, dichos azucares pueden ser aprovechados en la produccin de alcohol etlico para diferentes propsitos como la produccin de bebidas alcohlicas Mejores expectativas de futuro: Proceso especifico Altos rendimientos
BIOTECNOLOGA EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS HIDRLISIS CIDA Ventajas Y Desventajas La hidrlisis cida del almidn a glucosa es una tcnica que tiene muchas desventajas: Formacin de productos no deseables y flexibilidad muy pobre (el producto final slo se puede modificar cambiando el grado de hidrlisis), por ltimo es necesaria que el equipo resista el cido y las temperaturas requeridas durante el este proceso.
c) Cul es la importancia de la hidrolisis del almidn desde el punto de vista alimentario, farmacutico y qumico. La importancia de la hidrolisis del almidn desde el punto de vista alimentario, farmacutico y qumico se encuentra en gran variedad de aplicaciones industriales, algunas de ellas se indican en la Figura 2: