ANLISIS Y CUANTIFICACIN DE AMINOCIDOS

Reaccin de la ninhidrina
(espectrofotomtrica)
Reaccin con o-ftalaldehdo
(Fluorimtrica)
Cromatografa de
intercambio catinico
Actualmente: HPLC
Cromatografa en capa fina (aminocidos)
PURIFICACIN Y AISLAMIENTO DE PROTENAS
Suspensin de
Clulas tejidos: Ultrasonidos
Detergente
mbolo rotatorio (potter aspas)
Homogenado
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
FRACCIONAMIENTO DEL HOMOGENADO CELULAR
Centrifugacin a
baja velocidad
Homogenado
celular
PRECIPITADO 1
Clulas enteras,
ncleos,
citoesqueleto
Velocidad
media
20000g, 20min
1000g, 10 min
Velocidad alta
80000g, 1h
Velocidad
muy alta
150000g, 1h
SOBRENADANTE
1
SOBRENADANTE
2
SOBRENADANTE
3
PRECIPITADO 2
mitocondrias,
lisosomas,
peroxisomas
PRECIPITADO 3
Microsomas,
otras vesculas
pequeas
PRECIPITADO 4
Ribosomas,virus
macromolculas
CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
CENTRIFUGACIN ISOPCNICA
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Centrifugacin
Fraccionamiento
Muestra
Gradiente de
sacarosa
Componente
menos denso
Componente
mas denso
SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS
Se basa en la diferente:

Solubilidad

Tamao

Carga elctrica

Densidad

Afinidad por otras molculas
SEPARACIN DE PROTENAS
CROMATOGRAFA EN COLUMNA
Las diferentes protenas se retrasan segn sus interacciones con la
matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamao o unin a
grupos qumicos
Muestra
aplicada
El solvente se aplica
contnuamente a la
boca de la columna
Matriz
slida
Tapn
poroso
Tubo de
ensayo
tiempo
Molculas fraccionadas
eludas y recogidas
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
TRES CLASES DE CROMATOGRAFA EN COLUMNA
A) Intercambio inico:
en base a la carga
Depende del pH y
de la fuerza inica
B) Filtracin en gel:
en base al tamao
C) de Afinidad:
Flujo de solvente
Partcula cargada
positivamente


Molcula cargada
negativamente
unida
Molcula cargada
positivamente
libre
Flujo de solvente
Partculas porosas


Molcula pequea
retrasada
Molcula grande
no retrasada
Flujo de solvente
Partcula con
sustrato unido
covalentemente

Molcula de
enzima unida

Otras protenas
pasan de largo
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
A: CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO
(Ej: intercambio catinico)
Las protenas se separan segn
su carga a un pH determinado
B: CROMATOGRAFA DE FILTRACIN O EXCLUSIN
MOLECULAR
Las protenas se separan
segn su tamao
C: CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
Las protenas se separan en funcin de la
especificidad de unin a un ligando. En este ejemplo
el ligando es la glucosa y se separan aquellas
protenas que se unen a ella. Las protenas de inters
se eluyen aadiendo un exceso de ligando libre.
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
ELECTROFORESIS EN GEL
ELECTROFORESIS EN GEL:
Tras aplicar un campo elctrico las
protenas migran en funcin del
tamao y de la carga
(solubiliza
protenas)
Electroforesis en SDS-PAGE
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Ejemplo de anlisis de protenas por SDS-PAGE en cada paso
de una purificacin. En el ltimo paso hay una nica banda, lo
que indica que tenemos la protena de inters completamente
purificada
ISOELECTROENFOQUE
Es un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un
gradiente de pH. Cada protena migra hasta su punto
isoelctrico.
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/cellBreak1.html
Ejemplo de SDS-PAGE teido con azul de Coomassie
GELES
BIDIMENSIONALES (2D)
Primero isoelectroenfoque y
luego SDS-PAGE
Ejemplo de gel bidimensional
SEPARACIN Y PURIFICACIN DE PROTENAS
Se basa en la diferente:

Solubilidad

Tamao

Carga elctrica

Densidad (centrifugacin)

Afinidad por otras molculas
FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIN DE LA SOLUBILIDAD
(Voet)
(p.e. sulfato de amonio)
(Voet)