Fre

DIAGNOSTIC
DE LULCRE DE BURULI
AU LABORATOIRE
UN MANUEL DESTIN
AU PERSONNEL
DE SANT
Le prsent manuel est un guide spcialis sur les techniques et les mthodes de laboratoire utiliser
pour le diagnostic de lulcre de Buruli, une maladie provoque par Mycobacterium ulcerans. Destin aux
techniciens et aux scientiques de laboratoire travaillant sur cette maladie, le prsent manuel dcrit
les mthodes exactes mettre en uvre pour raliser un certain nombre de tests diagnostiques. Les
procdures recommandes, utilisables dans lensemble du systme de sant, sont adaptes aux services
priphriques, des districts et centraux et ce, conformment aux ressources, comptences et matriel
variables que lon trouve classiquement dans les pays o lulcre de Buruli est endmique.
La trentaine de photos en couleur, les tableaux, les diagrammes et les modles de formulaires de
demandes pour les laboratoires renforcent encore lutilit pratique du manuel. Les divers chapitres
donnent des explications quant au recueil et au transport des chantillons cliniques et aux diffrentes
mthodes disponibles pour le diagnostic de lulcre de Buruli. Le manuel dcrit essentiellement les
mthodes de diagnostic et dtaille pas pas les instructions pour raliser un grand nombre danalyses en
microbiologie et histopathologie. Les changements histopathologiques durant le traitement antibiotique
et les ractions paradoxales sont parmi les nouveauts de ce manuel. Le rle des programmes nationaux,
des tablissements de sant et des laboratoires (en mettant tout particulirement laccent sur lassurance
de la qualit) pour contribuer la conrmation de lulcre de Buruli, sont bien dcrits. Le manuel donne
galement des conseils trs complets sur linterprtation des rsultats.
D
I
A
G
N
O
S
T
I
C

D
E

L
U
L
C
R
E

D
E

B
U
R
U
L
I

A
U

L
A
B
O
R
A
T
O
I
R
E

U
N

M
A
N
U
E
L

D
E
S
T
I
N

A
U

P
E
R
S
O
N
N
E
L

D
E

S
A
N
T
Edit par : Franoise Portaels

French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013_cover.indd 1 04/03/2014 10:36:31
DIAGNOSTIC DE LULCRE DE BURULI
AU LABORATOIRE
UN MANUEL DESTIN AU PERSONNEL
DE SANT
Edit par : Franoise Portaels
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd 1 11/03/2014 14:47:38
Organisation mondiale de la Sant 2014
Tous droits rservs. Les publications de lOrganisation mondiale de la Sant sont disponibles sur le site Web de lOMS (www.who.int) ou peuvent
tre achetes auprs des ditions de lOMS, Organisation mondiale de la Sant, 20 avenue Appia, 1211 Genve 27 (Suisse) (tlphone : +41 22
791 3264 ; tlcopie : +41 22 791 4857 ; courriel : bookorders@who.int . Les demandes relatives la permission de reproduire ou de traduire des
publications de lOMS que ce soit pour la vente ou une diffusion non commerciale doivent tre envoyes aux ditions de lOMS via le site Web
de lOMS ladresse http://www.who.int/about/licensing/copyright_form/en/index.html
Les appellations employes dans la prsente publication et la prsentation des donnes qui y gurent nimpliquent de la part de lOrganisation
mondiale de la Sant aucune prise de position quant au statut juridique des pays, territoires, villes ou zones, ou de leurs autorits, ni quant au trac
de leurs frontires ou limites. Les lignes en pointill sur les cartes reprsentent des frontires approximatives dont le trac peut ne pas avoir fait
lobjet dun accord dnitif.
La mention de rmes et de produits commerciaux ne signie pas que ces rmes et ces produits commerciaux sont agrs ou recommands par
lOrganisation mondiale de la Sant, de prfrence dautres de nature analogue. Sauf erreur ou omission, une majuscule initiale indique quil
sagit dun nom dpos.
LOrganisation mondiale de la Sant a pris toutes les prcautions raisonnables pour vrier les informations contenues dans la prsente publication.
Toutefois, le matriel publi est diffus sans aucune garantie, expresse ou implicite. La responsabilit de linterprtation et de lutilisation dudit matriel
incombe au lecteur. En aucun cas, lOrganisation mondiale de la Sant ne saurait tre tenue responsable des prjudices subis du fait de son utilisation.
Imprim en Italie
WHO/HTM/NTD/IDM/2014.1
Catalogage la source: Bibliothque de lOMS:
Diagnostic de lulcre de Buruli au laboratoire : manuel destin au personnel de sant / edit par Franoise Portaels.
1.Ulcre de Buruli - diagnostic. 2.Ulcre de Buruli prvention et contrle. 3.Mycobacterium ulcerans. I.Portaels, Franoise. II.Organisation mondiale
de la Sant.
ISBN 978 92 4 250570 2 (classication NLM : WC 302)
Design & mise en page: Patrick Tissot, WHO/HTM/NTD
TABLE DES MATIRES
REMERCIEMENTS | iv
ILLUSTRATIONS ET TABLEAUX | vi
ABBRVIATIONS | viii
1. INTRODUCTION ET IMPORTANCE DE LA CONFIRMATION EN
LABORATOIRE DE LULCRE DE BURULI | 1
2. RECUEIL DES CHANTILLONS CLINIQUES | 2
2.1 TYPES DCHANTILLONS CLINIQUES | 2
2.1.1 ASPIRATION LAIGUILLE FINE | 2
2.1.2 COUVILLONS | 2
2.1.3 BIOPSIES ( LEMPORTE-PICE OU CHIRURGICALES) | 3
2.2 RECUEIL DES CHANTILLONS SUR LE TERRAIN | 3
2.3 RECUEIL DES CHANTILLONS DANS LES CENTRES DE TRAITEMENT | 3
3. CONSERVATION ET TRANSPORT DES CHANTILLONS CLINIQUES | 4
3.1 EN VUE DANALYSES BACTRIOLOGIQUES | 4
3.2 EN VUE DUNE RECHERCHE DADN PAR AMPLIFICATION
GNIQUE (PCR) | 5
3.3 EN VUE DANALYSES HISTOPATHOLOGIQUES | 5
4. LES DIFFRENTES MTHODES DE CONFIRMATION EN LABORATOIRE ET
LEURS LIMITES | 6
4.1 ANALYSES DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DE LULCRE
DE BURULI | 6
4.2 PRPARATION DES CHANTILLONS | 7
4.3 EXAMEN DIRECT DES FROTTIS | 7
4.4 CULTURE IN VITRO | 8
4.4.1 DCONTAMINATION AVANT MISE EN CULTURE | 8
4.4.2 MILIEU DE CULTURE | 8
4.4.3 CONDITIONS DE CULTURE ET DURES DINCUBATION | 8
4.4.4 IDENTIFICATION DE MYCOBACTERIUM ULCERANS | 8
4.5 PCR POUR IS2404 | 9
4.5.1 MTHODES DEXTRACTION DE LADN | 9
4.5.2 IDENTIFICATION DE MYCOBACTERIUM ULCERANS PAR LA PCR | 10
4.5.2.1 PCR EN GEL | 10
4.5.2.2 PCR EN TEMPS REL | 10
4.6 IDENTIFICATION DAUTRES MYCOBACTRIES POSITIVES POUR IS2404 | 11
4.7 MTHODES EN HISTOPATHOLOGIE | 11
4.7.1 SLECTION DU SITE POUR LE PRLVEMENT DE LA BIOPSIE | 11
4.7.1.1 LSIONS NON ULCRATIVES | 12
4.7.1.2 LSIONS ULCRATIVES | 12
4.7.2 FIXATION DES TISSUS | 12
4.7.3 PRPARATION DES COUPES HISTOPATHOLOGIQUES | 12
4.7.4 MODIFICATIONS GROSSIRES | 12
4.7.5 MODIFICATIONS HISTOPATHOLOGIQUES AVANT LE
TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE | 13
4.7.5.1 MODIFICATIONS CUTANES | 13
4.7.5.2 GANGLIONS LYMPHATIQUES | 18
4.7.5.3 MODIFICATIONS DE LOS | 19
4.7.5.4 PATIENTS SOUFFRANT DUNE FORME TENDUE DE LA
MALADIE | 21
4.7.6 IMMUNOCHIMIE ET ANALYSE DES RACTIONS
IMMUNITAIRES LOCALES LIES LA CHIMIOTHRAPIE | 21
4.7.7 RACTIONS PARADOXALES | 25
5. ASSURANCE DE LA QUALIT | 26
6. RLE DES PROGRAMMES NATIONAUX, DES TABLISSEMENTS DE
SANT ET DES LABORATOIRESS | 27
6.1 PROGRAMMES NATIONAUX DE LUTTE CONTRE LULCRE DE BURULI | 27
6.2 TABLISSEMENTS DE SANT | 27
6.3 LABORATOIRES | 27
6.3.1 LABORATOIRES DE NIVEAU PRIPHRIQUE | 27
6.3.2 LABORATOIRE NATIONAL DE RFRENCE | 27
6.3.3 LABORATOIRE INTERNATIONAL (SUPRANATIONAL) DE
RFRENCE | 28
6.3.4 RSEAU MONDIAL DE LABORATOIRES CONFIRMANT LA
MALADIE CAUSE PAR MYCOBACTERIUM ULCERANS
(ULCRE DE BURULI) | 28
7. PROPOSITION DALGORITHME POUR DIAGNOSTIQUER LULCRE DE BURULI | 30
RFRENCES | 31
ANNEXES | 35
ANNEX 1. RECUEIL DES CHANTILLONS CLINIQUES | 37
ANNEX 2. MILIEUX DE TRANSPORT UTILISS EN VUE DANALYSES
BACTRIOLOGIQUES | 41
ANNEX 3. PRPARATION DES CHANTILLONS EN VUE DANALYSES
BACTRIOLOGIQUES | 43
ANNEX 4. EXAMEN DIRECT DES FROTTIS | 44
ANNEX 5 CULTURE IN VITRO DE MYCOBACTERIUM ULCERANS | 51
ANNEX 6. PROTOCOLES DE LAMPLIFICATION GNIQUE (PCR) | 62
ANNEX 7. TECHNIQUES DE COLORATION EN HISTOPATHOLOGIE | 76
ANNEX 8. ASSURANCE DE LA QUALIT | 94
ANNEX 9. FORMULAIRES UTILES (UB 01 ET UB 03) | 98
ANNEX 10. GUIDE DES TECHNIQUES DE PRLVEMENT DCHANTILLONS
POUR LA CONFIRMATION EN LABORATOIRE DE LULCRE DE
BURULI (MALADIE CAUSE PAR MYCOBACTERIUM ULCERANS) | 100
|v
Un manuel destin au personnel de sant
REMERCIEMENTS
Rdig par :
Professeur Franoise Portaels, Unit de Mycobactriologie, Dpartement des Sciences biomdicales,
Institut de Mdecine Tropicale, Anvers (Belgique)
Dr Miriam Eddyani, Unit de Mycobactriologie, Dpartement des Sciences biomdicales, Institut de
Mdecine Tropicale, Anvers (Belgique)
Mme Caroline Lavender, Laboratoire de Rfrence des Mycobactries, Laboratoire de Rfrence de
ltat de Victoria pour les Maladies Infectieuses, Victoria (Australie)
Dr Richard Phillips, Dpartement de Mdecine, Komfo Anokye Teaching Hospital, Kumasi (Ghana)
Dr Gisela Bretzel, Dpartement des Maladies infectieuses et de Mdecine tropicale, Universit Ludwig-
Maximilian de Munich, Munich (Allemagne)
Dr Marcus Beissner, Dpartement des Maladies infectieuses et de Mdecine tropicale, Universit
Ludwig-Maximilian de Munich, Munich (Allemagne)
Dr Dissou Affolabi, Laboratoire de Rfrence des Mycobactries, Cotonou, (Bnin)
Avec la participation de :
Dr Kingsley Asiedu, Dpartement de la Lutte contre les Maladies tropicales ngliges, Organisation
mondiale de la Sant, Genve (Suisse)
Dr Luc Brun, Universit de Parakou, Parakou (Bnin)
Professeur Bouke de Jong, Unit de Mycobactriologie, Dpartement des Sciences biomdicales,
Institut de Mdecine Tropicale, Anvers (Belgique)
Dr Sara Eyangoh, Laboratoire des Mycobactries, Centre Pasteur du Cameroun, Yaound (Cameroun)
Dr Janet Fyfe, Laboratoire de Rfrence des Mycobactries, Laboratoire de Rfrence de ltat de
Victoria pour les Maladies Infectieuses, Victoria (Australie)
Dr Solange Kakou-Ngazoa, Microbiologie, Institut Pasteur de Cte dIvoire, Abidjan (Cte dIvoire)
Professeur Anatole Kibadi Kapay, Unit de Chirurgie Plastique, Hpital Universitaire de Kinshasa,
Facutl de Mdecine, Universit de Kinshasa, Kinshasa (Rpublique dmocratique du Congo)
Dr Wayne M. Meyers, Institut de Pathologie des Forces Armes, Washington D.C. (Etats-Unis
dAmrique)
Dr Kazue Nakanaga, Centre de Recherche sur la Lpre, Institut national des Maladies infectieuses,
Tokyo (Japon)
Dr Daniel OBrien, Dpartement des Maladies infectieuses, Hpital de Geelong, Barwon Health,
Geelong (Australie)
Professeur Gerd Pluschke, Parasitologie mdicale et Biologie infectieuse, Institut Tropical et de Sant
Publique Suisse, Ble (Suisse)
Dr Jean-Jacques Roux, Service dAnatomie et Cytologie Pathologiques, Centre Hospitalier de Chambry,
Chambry (France)
Dr Marie-Therese Ruf, Parasitologie mdicale et Biologie infectieuse, Institut Tropical et de Sant
Publique Suisse, Ble (Suisse)
Dr Armand Van Deun, Unit de Mycobactriologie, Dpartement des Sciences biomdicales, Institut
de Mdecine Tropicale, Anvers (Belgique)
Mr Koen Vandelannoote, Unit de Mycobactriologie, Dpartement des Sciences biomdicales, Institut
de Mdecine Tropicale, Anvers (Belgique)
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec2:v 11/03/2014 14:47:47
vi|
Diagnostic de lulcre de Buruli au laboratoire
Professeur Dorothy Yeboah-Manu, Institut Noguchi pour la recherche mdicale, Facult des Sciences
de la Sant, Universit du Ghana, Accra (Ghana)
Groupe de travail du rseau de laboratoires de lOMS sur lulcre de Buruli.
Le prsent document a t produit avec lappui dAnesvad (Espagne) (http://www.anesvad.org).
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec2:vi 11/03/2014 14:47:47
|vii
ILLUSTRATIONS ET TABLEAUX
ILLUSTRATIONS
Figure 1. Cultures de souches africaines, australiennes et japonaises de Mycobacterium ulcerans
Figure 2. lectrophorse en gel additionn de bromure dthidium sous clairage UV
Figure 3. Coupe dun nodule excis chirurgicalement, prsent dans lulcre de Buruli
Figure 4. Coupe microscopique dun nodule
Figure 5. Tissu cutan et sous-cutan provenant dune lsion non ulcrative trs tendue provoque
par M. ulcerans, qui couvrait 50 % de la surface abdominale dun enfant de 9 ans
Figure 6. Base ncrose dun ulcre de Buruli faisant apparatre de nombreux adipocytes fantmes
(dans la partie suprieure) et de nombreux bacilles acido-alcoolo rsistants (BAAR) (dans la
partie infrieure)
Figure 7. Vascularite svre dans le tissu sous-cutan dune lsion de lulcre de Buruli
Figure 8. Adipocytes fantmes et vascularite
Figure 9. La coloration Ziehl-Neelsen (ZN) dune coupe parallle celle de la Figure 4 met en
vidence des BAAR conns au centre de la lsion
Figure 10. Tissu sous-cutan provenant des bords dun ulcre de Buruli : on observe des adipocytes
fantmes accompagns de BAAR dans lespace interstitiel
Figure 11. Des amas de BAAR inltrent la base des bords dun ulcre de Buruli
Figure 12. chantillon de biopsie provenant du bord dun ulcre de Buruli et montrant le dcollement
du derme et une ncrose massive de lpiderme, du derme, de lhypoderme et de laponvrose
Figure 13. Tissu sous-cutan provenant du bord dun ulcre de Buruli et montrant la ncrose et
lpaississement dune cloison interlobulaire
Figure 14. Gurison dun ulcre de Buruli un stade prcoce, dans la phase dorganisation :
lymphocytes, cellules pithliodes et cellules gantes
Figure 15. Granulome bien form au cours de la raction dhypersensibilit retarde dans un ulcre de
Buruli en voie de gurison
Figure 16. Gurison dun ulcre de Buruli un stade avanc, avec des cicatrices sur la plus grande
partie de la coupe
Figure 17. Adnopathie associe un ulcre de Buruli
Figure 18. Adnite ncrosante dun ganglion lymphatique proximit dun ulcre de Buruli
Figure 19. Radiographie de la jambe mettant en vidence la destruction de los
Figure 20. Ostomylite du tibia avec ncrose de la moelle et rosion de la trave osseuse
Figure 21. Ostomylite du tibia avec des amas de BAAR dans la moelle ncrose
Figure 22. Ostomylite du tibia avec ncrose de la moelle et une trave osseuse en voie de dissolution
dans la zone des BAAR
Figure 23. Aperu schmatique des prols dinltration cellulaire et de la rpartition dlments
mycobactriens dans des lsions de lulcre de Buruli traites par antibiotiques
Figure 24. Bandes de leucocytes entourant le centre ncros non inltr dune lsion de lulcre de
Buruli.
Figure 25. Accumulation de lymphocytes B dans des lsions de lulcre de Buruli
Figure 26. Organisation dtaille dun granulome prsent dans une lsion de lulcre de Buruli traite
par antibiotiques
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec2:vii 11/03/2014 14:47:47
viii|
Figure 27. Algorithme pour diagnostiquer lulcre de Buruli aux niveaux priphrique, national de
rfrence et supranational
Figure 28. Coloration Zielh-Neelsen dun frottis dune lsion dun ulcre de Buruli
Figure 29. Coloration dun frottis avec un uorochrome (auramine O)
Figure 30. PCR en temps rel avec la technologie damplication gnique TaqMan
Figure 31. Courbes damplication pour la PCR quantitative en temps rel
Figure 32. Coupe colore selon la mthode de Harris lhmatoxyline-osine mettant en vidence une
panniculite chez un cas dulcre de Buruli
Figure 33. Coupe de ganglion lymphatique color selon la mthode de ZiehlNeelsen et provenant
dun cas dulcre de Buruli
Figure 34. Coupe histologique dun kyste phaeomycotique, imprgne la mthnamine argentique
selon la mthode de Grocott
Figure 35. Coloration de Gram selon Brown-Hopps dun tissu infect par Rhodococcus spp.
Figure 36. lments fongiques dans un ulcre cutan color lacide periodique-Schiff (PAS) et examin
fort grossissement
TABLEAUX
Tableau 1. Avantages et inconvnients des mthodes utilises pour la conrmation en laboratoire de
lulcre de Buruli
Tableau 2. Rseau mondial de laboratoires pour la conrmation de la maladie cause par Mycobacterium
ulcerans (ulcre de Buruli)
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec2:viii 11/03/2014 14:47:47
|ix
ABRVIATIONS
AFF aspiration laiguille ne
BAAR bacilles acido-alcoolo rsistants
dNTP dsoxynuclotide triphosphate
EDTA acide thylnediaminettraactique
FAM colorant uorescent 6-carboxyuorescine
OADC acide olique, albumine, dextrose et catalase
OMS Organisation mondiale de la Sant
PANTA polymyxine B, amphotricine B, acide nalidixique, trimthoprime et azlocilline
PCR amplication gnique par raction en chane de la polymrase
TE tampon chlorhydrate de trisaminomthane [Tris] plus acide
thylnediaminettraactique [EDTA]
Tris trisaminomthane
ZN Coloration Ziehl-Neelsen
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec2:ix 11/03/2014 14:47:47
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec2:x 11/03/2014 14:47:47
|1
1. INTRODUCTION ET IMPORTANCE DE LA
CONFIRMATION EN LABORATOIRE DE LULCRE
DE BURULI
Pour des personnes exprimentes, le diagnostic clinique de lulcre de Buruli est en gnral simple
quand il concerne un patient provenant dune rgion connue pour tre endmique, qui se prsente
avec un ulcre non douloureux typique caractris par des bords creuss. Toutefois, dans les rgions
o le personnel soignant ne rencontre pas beaucoup de cas dulcre de Buruli, le diagnostic clinique
peut tre problmatique. Par consquent, le nombre de cas peut tre surestim et il se peut que des
maladies autres que lulcre de Buruli soient mal prises en charge. En 2012, lOrganisation mondiale de
la Sant (OMS) a publi un document sur la diagnostic clinique et le traitement de lulcre de Buruli (1).
La conrmation microbiologique est essentielle pour plusieurs raisons :
1) pour conrmer quil sagit bien de lulcre de Buruli ;
2) pour dterminer la prvalence et lincidence prcises de lulcre de Buruli dans une zone
gographique donne ;
3) pour conrmer de nouveaux foyers ;
4) pour prendre convenablement en charge la maladie laide dune thrapie antimycobactrienne
avec ou sans chirurgie ;
5) pour conrmer lchec dun traitement, ou une rechute ou une rinfection aprs traitement.
Puisque de plus en plus de professionnels de sant ont recours aux mdicaments antimycobactriens
pour traiter lulcre de Buruli, lusage appropri de ces mdicaments et la conrmation du succs ou
de lchec dun traitement (points 4 et 5) sont appels prendre une importance croissante.
Il nexiste pas de test diagnostique extemporan able pouvant tre fait sur le lieu mme des soins.
Les chercheurs travaillent pour en mettre un au point. Quatre analyses de laboratoire sont disponibles
pour conrmer le diagnostic clinique (Chapitre 4) :
1) lexamen direct des frottis la recherche de bacilles acido-alcoolo rsistants (BAAR) ;
2) la culture in vitro ;
3) lamplication gnique (PCR) ciblant la squence gnomique IS2404 ;
4) lexamen histopathologique.
Il rgne cependant une certaine confusion autour de la notion de conrmation en laboratoire et
sur les rsultats rapporter. En 2001, lOMS recommandait quau moins 50 % de la totalit des
cas soient conrms par PCR (2). Certains cliniciens et programmes nationaux dclarent 50 % de
conrmation lorsquils ont envoy les chantillons de 50 % de leurs patients au laboratoire pour
analyse. Or lenvoi dun chantillon un laboratoire en vue dune conrmation microbiologique ne
signie pas que lchantillon est positif pour Mycobacterium ulcerans. Le terme cas conrm dsigne
un cas ayant t trouv positif pour M. ulcerans par au moins une analyse de laboratoire. Comme les
rsultats de lassurance externe de la qualit rvlent des performances peu satisfaisantes pour certains
laboratoires, il est prfrable que la positivit soit obtenue pour deux tests de laboratoire au lieu dun,
comme le recommande le manuel de lOMS de 2001 sur le diagnostic de lulcre de Buruli (3).
Lors de la Runion de lOMS sur lulcre de Buruli, organise en 2013, une nouvelle recommendation
concernant le diagnostic en laboratoire a t mise: Les programmes nationaux de lutte devraient
renforcer la conrmation des cas en laboratoire de faon conrmer par un rsultat positif la PCR
au moins 70 % des cas notis.
1
1
http://www.who.int/buruli/archives/en/index.html
French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec1:1 11/03/2014 14:47:47
2|
2. RECUEIL DES CHANTILLONS CLINIQUES
Un guide des techniques de prlvement dchantillons pour la conrmation en laboratoire est
disponible sur le site Web de lOMS
1
et gure lAnnexe 10.
Pour le diagnostic, les chantillons doivent tre recueillis avant le traitement du patient. Compte tenu
de la rpartition htrogne des mycobactries dans les lsions, il convient de recueillir au moins deux
chantillons cliniques de chaque lsion. Le type dchantillons cliniques recueillir dpend :
du lieu o les chantillons sont recueillis (sur le terrain ou dans un centre de traitement) ;
de la forme clinique de la maladie ;
des raisons qui ont ncessit une conrmation microbiologique.
Des ressources supplmentaires sont disponibles :
sur le site Web du consortium Stop Buruli
2
;
sur le site Web du BuruliVac
3
;
et lAnnexe 10.
2.1 TYPES DCHANTILLONS CLINIQUES
Pour les plaques non ulcres et les formes dmateuses de la maladie, il faut demander au patient ou
un proche dindiquer lendroit o la lsion est apparue, cet endroit tant celui qui permettra le plus
probablement de poser un diagnostic.
2.1.1 ASPIRATION LAIGUILLE FINE
Laspiration laiguille ne (AAF) peut tre ralise sur nimporte quelle lsion non ulcrative, telle
que les papules, les nodules, les plaques, les dmes, ou les ulcres qui nont pas de bords dcolls
(autrement dit quand la prsence de bords cicatriciels pourrait empcher lcouvillonnage). Dans le cas
de lAAF, les chantillons doivent tre prlevs laide daiguilles de petit calibre (par exemple calibre
21, calibre 22 ou calibre 23, de 25 mm de diamtre) xes une seringue. La technique daspiration
optimale est dcrite lAnnexe 1. Lutilisation de cette technique garantit lobtention dune quantit
sufsante de matriel. Dans la majorit des cas, on considre que deux chantillons prlevs par AAF
conviennent.
2.1.2 COUVILLONS
Lcouvillonnage est la technique la plus utile face des ulcres qui ont des bords creuss (voir lAnnexe 1
pour les techniques utiliser lorsque les ulcres ont des bords cicatriciels qui empchent lutilisation
dcouvillons). Au moins deux couvillons doivent tre passs sous les bords dcolls des ulcres. Le
centre de lulcre ne doit pas tre couvillonn car M. ulcerans ny est gnralement pas prsent. La
technique utiliser pour les couvillons est dcrite lAnnexe 1.
1
http://www.who.int/entity/buruli/Guidance_sampling_techniques_MU_infection.pdf
2
http://www.stopburuli.org/index.php/FNA-e-tutorial.html
3
http://www.burulivac.eu/index.php?id=17923
|3
2.1.3 BIOPSIES ( LEMPORTE-PICE OU CHIRURGICALES)
Les biopsies lemporte-pice ne constituent pas les prlvements de choix bien quelles puissent tre
utilises dans un nombre limit de circonstances telles que celles indiques ci-dessous. Les biopsies
lemporte-pice (de 3 mm ou 4 mm de diamtre) doivent tre prleves aprs anesthsie locale ;
les biopsies chirurgicales peuvent tre prleves sous anesthsie gnrale au cours dune excision
chirurgicale. Les biopsies doivent tre prleves au centre des lsions non ulcratives, ou dans le bord
ncros des ulcres qui bordent le tissu sain (viable). Les biopsies de tissu devront contenir toute
lpaisseur du tissu infect, y compris le tissu adipeux sous-cutan. Cependant, il se peut que les
chantillons provenant des bords des lsions non ulcratives soient ceux qui conviennent le mieux
pour lhistopathologie.
Pour la conrmation en routine de lulcre de Buruli, les couvillonages et laspiration laiguille ne
sufsent. Les indications pour les biopsies lemporte-pice ou chirurgicales sont les suivantes :
poser le diagnostic diffrentiel de lulcre de Buruli ;
chercher la cause dune raction paradoxale (voir note ci-dessous et section 4.7.7 pour plus
dinformations) ;
dterminer sil y a chec thrapeutique malgr une administration russie dantibiotiques de
qualit avre ;
tablir lventualit dune volution cancreuse ;
reconrmer, dans des essais cliniques, le diagnostic clinique par au moins deux mthodes de
laboratoire (voir note ci-dessous), et valuer le processus pathogne et lefcacit thrapeutique.
N.B. Au sens le plus large, une raction paradoxale est une raction un traitement mdical qui est
oppose leffet normalement attendu.
N.B. Si la lsion sest ulcre, on prfre lcouvillonnage plutt que la biopsie.
2.2 RECUEIL DES CHANTILLONS SUR LE TERRAIN
Ce sont les techniques moins invasives (telles que les couvillons ou lAAF) qui peuvent tre utilises
pour le recueil dchantillons sur le terrain, an de permettre le diagnostic dcentralis ncessaire aux
tudes de prvalence ou dincidence, ou de conrmer de nouveaux foyers. Les biopsies lemporte-
pice ou chirurgicales ne doivent pas tre prleves sur le terrain car le geste ncessite des conditions
striles rigoureuses qui peuvent tre difciles maintenir dans ce contexte.
2.3 RECUEIL DES CHANTILLONS DANS LES CENTRES DE TRAITEMENT
Pour la conrmation en routine dun cas suspect dulcre de Buruli, les chantillons prlevs par
couvillon doivent tre obtenus sous les bords dcolls des ulcres; les chantillons prlevs par AAF
doivent tre recueillis sur les papules, les nodules, les plaques, les dmes et les ulcres non creuss.
Les chantillons prlevs par couvillon ou AAF sufsent pour poser un diagnostic en laboratoire
dans la plupart des cas. Le recours aux biopsies lemporte-pice doit tre rserv aux situations
exceptionnelles telles quindiques dans la section 2.1.3. Si les patients ncessitent un traitement
chirurgical, les chantillons chirurgicaux seront ventuellement transmis au laboratoire pour analyse
(voir galement les indications pour les biopsies chirurgicales dans la section 2.1.3).
Si la radiographie met en vidence la prsence dune ostomylite ou si une ostomylite est dcouverte
loccasion dune intervention chirurgicale, des chantillons dos doivent tre recueillis pour conrmer
limplication de M. ulcerans.
4|
3. CONSERVATION ET TRANSPORT DES
CHANTILLONS CLINIQUES
Avant dtre amens au laboratoire, les chantillons doivent tre tiquets avec les informations
appropries (par exemple, le nom du patient, la date dobtention de lchantillon, ou le code de
lchantillon), selon les pratiques habituelles. Pour crire sur les tiquettes, il faut utiliser un marqueur
indlbile. De plus, tous les formulaires (par exemple, les ches de donnes normalises de lOMS et
les autres ches propres chaque projet) doivent tre correctement remplis et transmis au laboratoire
en mme temps que lchantillon.
Plusieurs mthodes de recueil, de transport et de traitement des chantillons ont t utilises dans des
contextes diffrents ; par exemple, les chantillons peuvent tre fractionns en sous-chantillons qui
subissent des tests de laboratoire diffrents, ou on peut recueillir pour chaque test des chantillons
distincts. Diverses approches pour la conservation et le transport des chantillons ont t valides dans
des conditions de terrain ; par exemple, dans certains cas, diffrents types de tubes striles, de milieux
de transport ou de sacs de prlvement dchantillons ont t utiliss.

En rgle gnrale, lorsquil est possible deffectuer les analyses microbiologiques dans les 24 heures, il
faut garder les chantillons cliniques 4 C jusqu lanalyse. Lorsquil nest pas possible de procder
aux analyses microbiologiques dans les 24 heures ou lorsquon ne dispose pas de rfrigrateurs, il faut
utiliser un milieu de transport appropri pour lchantillon. Il est important de noter, toutefois, que
certains milieux de transport conviennent aux analyses microbiologiques et molculaires (telles que la
PCR) (voir lAnnexe 2 pour les milieux de transport appropris), mais que les milieux utiliss seulement
pour lanalyse PCR (tampon trisaminomthane [Tris] plus acide thylnediaminettraactique [EDTA],
ou une solution dalcool et deau distille) ne conviennent pas la mise en culture.
3.1 EN VUE DANALYSES BACTRIOLOGIQUES
Sil est possible de traiter dans les 24 heures les chantillons destins la mise en culture, on peut
alors les placer sans additifs dans un rcipient strile et les conserver 4 C. Si lon ne dispose pas
de rfrigrateurs ou si le transport jusquau laboratoire doit prendre plusieurs jours, les milieux de
transport sont alors essentiels parce quils protgent la viabilit des mycobactries.
On recommande de transporter les chantillons prlevs par AAF dans un milieu de transport liquide
contenant un bouillon de base de Dubos additionn dacide olique, dalbumine, de dextrose et de
catalase (OADC, Becton Dickinson) et de polymyxine B, damphotricine B, dacide nalidixique, de
trimthoprime et dazlocilline (PANTA, Becton Dickinson).
Les couvillons et/ou les fragments tissulaires prlevs par biopsies lemporte-pice ou chirurgicales
(fragments de tissu cutan ou dos rcolts lors dexcisions chirurgicales) doivent tre transports
dans un milieu de transport liquide additionn de glose 0,5 % ; cet ajout permet dobtenir un
milieu de transport semi-solide (4,5).
Tous les types dchantillons recueillis pour le diagnostic de lulcre de Buruli ont t transports avec
succs dans un bouillon de base de Dubos avec de lalbumine pour bouillon de Dubos additionne de
PANTA ou un bouillon de Dubos avec 10 % dOADC et du PANTA (48).
Les chantillons placs dans les milieux de transport doivent tre conservs 4 C, mais ils peuvent
tre envoys temprature ambiante des laboratoires nationaux ou internationaux de rfrence en
vue dune conrmation microbiologique. Les milieux de transport sont dcrits en dtail lAnnexe 2.

|5
3.2 EN VUE DUNE RECHERCHE DADN PAR AMPLIFICATION GNIQUE (PCR)
Tous les milieux de transport bactriologiques dcrits dans la section 3.1 permettent lanalyse des
chantillons (ou des sous-chantillons) par PCR (4,5,8).
Les chantillons qui seront utiliss uniquement pour la PCR peuvent galement tre placs dans une
solution dalcool et deau distille (en proportions 1:1), dans du tampon phosphate, ou dans du tampon
TE (Tris chlorhydrate plus EDTA).
N.B. Lalcool peut perturber certains protocoles dextraction dADN, tels que la trousse dextraction
dADN Gentra Puregene DNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Allemagne), que lon dcrit lAnnexe 6.
Une solution de lyse cellulaire commercialise par Qiagen permet de conserver les chantillons tester
par PCR pendant plusieurs mois temprature ambiante et galement de les transporter temprature
ambiante (6,7,9,10). Il est aussi possible de transporter les chantillons dans lazote liquide (11).
3.3 EN VUE DANALYSES HISTOPATHOLOGIQUES
Les biopsies destines lanalyse histopathologique doivent tre places dans du formol 10 %
(7,11,12). On xe de prfrence le tissu dans une solution 10% de formol neutre tamponn (pH 7,4)
(voir section 4.6.2).
6|
4. LES DIFFRENTES MTHODES DE CONFIRMATION
EN LABORATOIRE ET LEURS LIMITES
4.1 ANALYSES DE LABORATOIRE POUR LE DIAGNOSTIC DE LULCRE DE BURULI
Quatre analyses de laboratoire sont disponibles pour conrmer le diagnostic clinique de lulcre de
Buruli :
1) lexamen direct des frottis pour la recherche de BAAR ;
2) la culture in vitro ;
3) lamplication gnique (PCR) ciblant la squence gnomique IS2404 ;
4) lexamen histopathologique.
Ces analyses prsentent chacune des avantages et des inconvnients, et la mthode utilise dpendra
du type dchantillon recueilli, de la nalit de lanalyse ( savoir, poser un diagnostic ou surveiller
le rsultat dun traitement) et du lieu o lanalyse est ralise (par exemple, dans un laboratoire
priphrique ou dans un laboratoire de rfrence) (Tableau 1).
Lexamen direct des frottis destin mettre les BAAR en vidence est disponible dans la plupart
des zones dendmie en tant que test de diagnostic de premire intention. LOMS recommande
actuellement quau moins 70 % des cas cliniques suspects dulcre de Buruli soient conrms par
un test positif par PCR. Un rseau de laboratoires effectuant la PCR a t mis en place dans les pays
dendmie (une liste de ces laboratoires est donne dans la section 6.3.4). Toutefois, seuls quelques rares
laboratoires de district sont en mesure de pratiquer la PCR, si bien que celle-ci se limite gnralement
aux laboratoires de rfrence spcialiss, bien quips. Laccs la culture et lhistopathologie ne sest
pas encore gnralis dans les rgions o lulcre de Buruli est endmique.
Le taux de positivit des diffrents tests dpend de la qualit des chantillons, et peut varier en
fonction du type dchantillon et de la forme clinique de la maladie. Pour la microscopie et la culture,
des taux de positivit allant de 30 % 60 % ont t rapports (57,9,1317). Parmi les vrais cas dulcre
de Buruli (cest--dire, ceux conrms par au moins deux analyses de laboratoire positives), lexamen
direct des frottis et la culture donnent des rsultats moins souvent positifs lorsque lanalyse est
faite sur des nodules (60 % de positivit) que lorsque les chantillons sont recueillis sur des formes
dmateuses (80 % de positivit). M. ulcerans est particulirement difcile cultiver partir de los
(20 % de positivit) (18). Des tudes menes dans diffrents pays dAfrique font tat de taux de
positivit pour la PCR compris entre 70 % et plus de 90 % (9,16,17,1922), et une sensibilit allant de
85 % 89 % (5,6,23,24). La sensibilit de lhistopathologie est denviron 90 % (6,7,10,12).
Pour viter toute erreur de diagnostic due des rsultats faux-positifs ou faux-ngatifs, on recommande
dobtenir un rsultat positif pour deux analyses diffrentes avant dtablir un diagnostic dnitif.
Une autre mthode de diagnostic en laboratoire est base sur une nouvelle mthode damplication de
lADN appele amplication isothermique mdie par boucle (ou LAMP pour loop mediated isothermal
ampli cation) (2527). Bien que cette technique ne soit pas utilise actuellement pour le dpistage de
routine, elle pourrait bien devenir un moyen rapide, simple et peu coteux de dpister M. ulcerans, qui
pourrait tre mis en uvre au niveau local quand laccs un laboratoire bien quip nest pas possible.
|7
4.2 PRPARATION DES CHANTILLONS
Si des chantillons distincts ont t recueillis pour chaque test, on traite chaque chantillon de la
manire dcrite dans les annexes. Si le mme chantillon doit tre utilis pour un certain nombre
de tests diffrents, on doit fractionner lchantillon initial en sous-chantillons de la manire dcrite
lAnnexe 3. Des portions aliquotes de la suspension (sous-chantillons) sont alors prpares pour
chaque test.
4.3 EXAMEN DIRECT DES FROTTIS
On connat plusieurs techniques de coloration des mycobactries : ZiehlNeelsen, Kinyoun et
lauramine O. En gnral, la mthode utilise localement pour le diagnostic en laboratoire de la
tuberculose peut galement tre utilise pour diagnostiquer lulcre de Buruli. Dans la plupart des
cas, il sagira de la mthode de ZiehlNeelsen (Annexe 4). Le rsultat de la lecture des frottis se fera
en utilisant la mme mthode que celle employe localement pour lexamen des frottis de crachats
servant au diagnostic de la tuberculose.
TABLEAU 1. AVANTAGES ET INCONVNIENTS DES MTHODES UTILISES POUR LA CONFIRMATION EN
LABORATOIRE DE LULCRE DE BURULI
a
Mthode Avantages Inconvnients
Examen direct de
frottis
Peut tre effectu sur des chantillons
prlevs par couvillon, AAF ou biopsie
Facile excuter au niveau local
Pas besoin de matriel ni dquipement
coteux
Rsultats obtenus rapidement
Faible sensibilit (< 60 %)
Ncessite un personnel quali
Ne fait pas la distinction entre organismes
viables et non viables
Ncessite un contrle rigoureux de la
qualit
Culture in vitro
de Mycobacterium
ulcerans
Seule mthode qui peut faire la
distinction entre organismes viables et
non viables.
Mthode utilisable pour surveiller la
raction des patients au traitement
antimycobactrien
Ncessite un laboratoire bien quip
Long dlai dobtention des rsultats (au
moins 6-12 semaines)
Faible sensibilit (20-60 %)
Pas utile pour la prise en charge immdiate
des patients
qualit
Amplication
gnique (PCR)
pour IS2404
(frache ou incluse dans la parafne)
Sensibilit et spcicit leves (> 90 %)
Excution coteuse
Ncessite un personnel hautement quali
qualit
Ne fait pas la distinction entre organismes
viables et non viables
Histopathologie Rsultats obtenus assez rapidement
Grande sensibilit (environ 90 %)
Utile pour poser un diagnostic
diffrentiel et surveiller les ractions au
traitement
Excution coteuse
Ncessite un personnel hautement quali
Ncessite une procdure invasive (biopsie)
AAF, aspiration laiguille ne PCR, amplication gnique par raction en chane de la polymrase.

a
Adapt partir de : Guide des techniques de prlvement dchantillons pour la conrmation en laboratoire de lulcre de Buruli (infection
Mycobacterium ulcerans). Genve, Organisation mondiale de la Sant, 2004. http://www.who.int/buruli/Guidance_sampling_techniques_MU_
infection_fr.pdf; consult en fvrier 2014)
8|
4.4 CULTURE IN VITRO
4.4.1 DCONTAMINATION AVANT MISE EN CULTURE
Pour lisolement de M. ulcerans, les chantillons utiliss pour la primoculture sont susceptibles de
contenir des agents contaminants ; la dcontamination est donc ncessaire avant de mettre en culture.
On obtient les meilleurs rsultats partir dchantillons frais traits et dcontamins immdiatement
aprs avoir t recueillis. Les problmes de prolifration bactrienne ou fongique et la perte de viabilit
des mycobactries saccroissent avec laugmentation du temps de conservation et de transport.
On a utilis plusieurs mthodes pour dcontaminer les chantillons avant leur mise en culture. En
gnral, lorsque les mthodes de dcontamination sont trop drastiques, elles rduisent la possibilit
dobtenir une culture positive pour M. ulcerans. La mthode de dcontamination choisie dpend du
milieu de culture utilis. Le milieu le plus largement utilis est le milieu de LwensteinJensen. Chacune
des mthodes dcrites lAnnexe 5 peut tre utilise avec le milieu de LwensteinJensen. Toutefois, la
mthode lacide oxalique est la mthode de choix car elle donne de faibles taux de contamination et
un nombre plus lev de cultures positives (8).
Un taux de contamination global de lordre de 2-5 % est acceptable pour la culture in vitro des
mycobactries partir dchantillons non striles. Le choix de la mthode de dcontamination revient
donc au microbiologiste et dpendra non seulement de la nature des chantillons mais aussi de leur
degr de contamination au laboratoire (4,8,28).
4.4.2 MILIEU DE CULTURE
Le milieu de LwensteinJensen additionn de 0,75 % de glycrol est le milieu le plus universellement
utilis (4,8,29), mais un certain nombre de milieux de culture solides et liquides ont t utiliss pour
isoler M. ulcerans (par exemple, le milieu dOgawa, le systme BACTEC [Becton Dickinson], le milieu
de Middlebrook 7H12B, le milieu de Middlebrook 7H11, et le tube avec indicateur de croissance
mycobactrienne BBL [galement connu sous le nom de MGIT, Becton Dickinson]). En Australie,
on a constat que M. ulcerans se dveloppait mieux sur du milieu de Brown et Buckle, qui permet
la croissance de la plupart des mycobactries et diffre du LwensteinJensen en ce quil contient
des jaunes dufs et de la glose au lieu dufs entiers, et donc na pas besoin dtre coagul. Les
compositions prcises du milieu de LwensteinJensen, du milieu de Brown et Buckle et du milieu
dOgawa sont prsentes lAnnexe 5.
4.4.3 CONDITIONS DE CULTURE ET DURES DINCUBATION
M. ulcerans se dveloppe dans les mmes conditions que M. tuberculosis sauf pour la temprature,
qui doit se situer entre 29 et 33 C. Les cultures primaires deviennent en gnral positives aprs
6 12 semaines dincubation (selon la charge bactrienne de linoculum), mais il arrive que certains
chantillons ncessitent une incubation beaucoup plus longue, jusqu 9-12 mois parfois (4). On
choisira la dure dincubation en fonction des objectifs de linvestigation (prise en charge du patient
court terme, ou recherche plus long terme).
Les colonies voquant M. ulcerans apparaissent jauntres, rugueuses et bords bien dmarqus. Les
souches africaines et japonaises sont plus jauntres que les australiennes (Figure 1), dont la pigmentation
est parfois trs lgre. Il convient de slectionner une colonie isole et typique pour la repiquer sur
un milieu de Lwenstein-Jensen, Brown et Buckle ou Ogawa.
4.4.4 IDENTIFICATION DE MYCOBACTERIUM ULCERANS
M. ulcerans appartient au groupe des mycobactries croissance lente. Les repiquages sont gnralement
positifs aprs 3 4 semaines dincubation 29-33 C, selon le nombre de bacilles dans linoculum.
|9
lheure actuelle, lidentication de M. ulcerans se fait par PCR. Les modes opratoires sont dcrits
lAnnexe 5 (section 5.4).
4.5 PCR POUR IS2404
La squence cible la plus courante pour la conrmation par PCR de lulcre de Buruli est la squence
dinsertion IS2404 (longue de 1274 pb), prsente raison de plus de 200 copies dans le gnome
de M. ulcerans. Plusieurs mthodes dextraction et damplication de lADN de M. ulcerans ont t
publies (30,31). La sensibilit de la PCR est leve, mais cette technique reste relativement onreuse. Les
laboratoires qui manquent dexprience dans cette technique peuvent tre confronts des rsultats
faux-positifs et faux-ngatifs, ce qui implique de mettre en place des mesures de contrle de la qualit
trs strictes.
4.5.1 MTHODES DEXTRACTION DE LADN
Dune manire gnrale, lextraction dADN peut tre ralise sur les chantillons spcialement recueillis
pour la conrmation par PCR, de mme que sur les chantillons ou des sous-chantillons qui doivent
tre analyss laide dautres mthodes bactriologiques. Toutefois, on recommande fortement de
raliser lextraction sur des chantillons nayant pas subi de procdures de dcontamination (30).
Les procdures dextraction comportent gnralement une lyse physique (par exemple, une
homognisation mcanique, un traitement aux ultrasons ou un traitement thermique) ou une
lyse chimique (par exemple, une digestion par la protinase K), ou les deux, en association avec des
procdures ultrieures de prcipitation et de purication (par exemple, au moyen de phnol et de
chloroforme) pour librer lADN des cellules de M. ulcerans. Les mthodes dextraction de lADN font
intervenir des techniques aussi bien manuelles quautomatises. Le volume nal dADN extrait dpend
de la mthode utilise (6,9,10,15,16,19,21,22,24,30-32).
LAnnexe 6 dcrit un certain nombre de mthodes dextraction couramment utilises.
cause du grand nombre de germes prsents dans certains chantillons cliniques et dans les cultures,
il faut travailler avec un soin extrme lorsquon extrait lADN des chantillons (par exemple, en vue
dune identication ou dun gnotypage), an dviter la contamination de la zone de travail, qui
pourrait entraner une contamination croise des chantillons cliniques. Dans la mesure du possible, il
faudra effectuer lextraction de lADN des cultures dans une zone spare du laboratoire, laide de
ractifs et de matriels rservs cet usage (par exemple, sous un poste de scurit biologique distinct,
et en utilisant des pipettes et une centrifugeuse distinctes).
FIGURE 1. CULTURES DE SOUCHES AFRICAINES, AUSTRALIENNES ET JAPONAISES DE MYCOBACTERIUM ULCERANS
Les souches africaines (a) et japonaises (c) sont plus jauntres que les australiennes (b). (Avec laimable autorisation de Franoise Portaels, Kazue Nakanaga et Janet Fyfe)
a b c
10|
4.5.2 IDENTIFICATION DE MYCOBACTERIUM ULCERANS PAR LA PCR
La PCR permet didentier M. ulcerans partir de lADN extrait directement des chantillons cliniques
(recueillis par couvillonnage, AAF, ou biopsies lemporte-pice ou chirurgicales) (voir section 2.2)
ou des colonies sur milieux de culture. La PCR a pour principal avantage de permettre au laboratoire
un diagnostic dnitif de linfection M. ulcerans dans un dlai de quelques jours 2 semaines aprs la
rception dun chantillon clinique. Les mthodes de PCR les plus frquemment utilises sont la PCR
en gel traditionnelle en une tape et la PCR en temps rel ciblant llment dinsertion IS2404.
4.5.2.1 PCR en gel
Les amorces et le protocole de PCR dcrits dans ldition prcdente de ce manuel (3) et lAnnexe 6
de la prsente dition sont diffrents de ceux initialement dcrits par Ross et ses collgues (33) et par
Stinear et ses collgues (34) : ils amplient une rgion de 515 pb de IS2404.
Plusieurs autres protocoles de PCR en gel ciblant IS2404 ont t publis. Guimaraes-Peres et ses
collgues ont mis au point une technique de PCR niche qui utilise les amorces MU1 et MU2 pour
le premier cycle damplication dun fragment de 568 pb de IS2404 ; les amorces PGP3 et PGP4
ont t utilises pour le deuxime cycle damplication dun produit de 217 pb (19). Phillips et ses
collgues ont dcrit un protocole de PCR modi, conu pour rduire le risque de contamination des
amplicons dans le mlange de PCR ; ce protocole utilise les amorces PU4F et PU7Rbio pour amplier
un fragment de 154 pb de IS2404 (21).
Pour rsoudre les difcults techniques lies lutilisation de procdures de diagnostic par PCR dans les
pays tropicaux, une PCR faisant appel des ractifs secs a t mise au point ; cette procdure amplie
une squence de 492 pb dans IS2404 et utilise des ractifs lyophiliss et les amorces lyophilises MU5
et MU6, qui sont stables temprature ambiante (10).
Aprs avoir t amplis dans un thermocycleur, les produits de la PCR sont dtects sous clairage UV
(transilluminateur) aprs une lectrophorse sur des gels dagarose colors, par exemple, au bromure
dthidium ou GelRed (Biotium). Pour viter la contamination, qui peut conduire des rsultats
faussement positifs, il faut faire attention effectuer la prparation de lchantillon, lextraction dADN,
la prparation du mlange ractif de PCR, lamplication PCR, et llectrophorse dans des zones
spares du laboratoire. Il est conseill dintgrer dans chaque analyse PCR des tmoins dextraction,
plusieurs tmoins ngatifs, des tmoins dinhibition et des tmoins positifs, comme dtaill lAnnexe 8.
Avec lexprience, un agent de laboratoire peut se er la comparaison visuelle entre la position du
produit de PCR issu de lchantillon test et celle du tmoin positif sur le gel pour dterminer le
rsultat. Si les deux produits de la PCR (le tmoin positif et lchantillon test) salignent prcisment
et si les tmoins ngatifs sont ngatifs, on peut conclure la prsence de M. ulcerans dans lchantillon
inconnu test. Toutefois, un systme dassurance de la qualit doit tre en place et, si possible, les
rsultats de la PCR devront tre compars ceux de lexamen direct des frottis et de la culture, pour
sassurer de leur exactitude.
La Figure 2 illustre des rsultats dchantillons tests par PCR.
LAnnexe 6 dcrit une PCR en gel traditionnelle en une tape (avec les amorces MU1new et MU2new),
lanalyse PCR base de ractifs secs et lanalyse PCR en temps rel.
4.5.2.2 PCR en temps rel
La PCR en temps rel, galement appele PCR en temps rel quantitative (ou qPCR), prsente plusieurs
avantages par rapport la PCR en gel traditionnelle : elle est plus spcique (donne moins de rsultats
faux-positifs) et plus sensible (donne moins de rsultats faux-ngatifs) et son dlai dexcution est
|11
plus rapide ; elle ncessite moins de main-duvre ; elle permet de quantier lADN prsent dans
lchantillon ; et elle prsente un risque moins lev de contaminations croises du fait du format
en tube ferm, qui vite la manipulation post-PCR dchantillons contenant des nombres levs
damplicons.
Diffrents types de PCR en temps rel ciblant la squence dinsertion IS2404 ont t dcrits. Le test
mis au point par Fyfe et coll. sest avr rapide et able, mais aussi trs sensible et spcique (32). Une
PCR en temps rel modie, faisant appel des ractifs moins coteux, a t dcrite par Beissner et
coll. (35). La limite de dtection de cette technique est au moins 100 fois plus basse que celle de la
PCR traditionnelle. De plus, puisque le test est multiplex avec un tmoin positif interne, il permet de
dtecter les inhibiteurs de la PCR ventuellement prsents dans les chantillons cliniques. Du fait de
la baisse de prix des consommables utiliss pour la PCR en temps rel, le cot de cette analyse est
comparable celui de la PCR en gel traditionnelle. Cependant, disposer dun service de laboratoire
appropri et dun thermocycleur en temps rel reste un prrequis. Lanalyse PCR en temps rel est
dcrite lAnnexe 6.
4.6 IDENTIFICATION DAUTRES MYCOBACTRIES POSITIVES POUR IS2404
Il se peut que dautres mycobactries que M. ulcerans soient porteuses de la squence IS2404 (36),
mais cela ninterfre pas avec le diagnostic de lulcre de Buruli par PCR dans la mesure o aucune
preuve nindique que ces mycobactries positives pour IS2404 provoquent des symptmes similaires
ceux de lulcre de Buruli chez lhomme. De plus, les mycobactries positives pour IS2404 autres que
M. ulcerans peuvent tre facilement distingues de M. ulcerans par des techniques molculaires qui
peuvent sappliquer directement aux chantillons cliniques (37,38).
4.7 MTHODES EN HISTOPATHOLOGIE
Il est trs important de connatre en dtail lhistorique et la description de la lsion excise pour que
lvaluation soit utile et aux ns darchivage. La description doit inclure lge et le sexe du patient,
le numro didentication du laboratoire ou de lhpital, et des informations sur le site de la lsion.
Il faut faire attention de bien identier les chantillons en crivant avec un marqueur indlbile sur
ltiquette du rcipient.
4.7.1 SLECTION DU SITE POUR LE PRLVEMENT DE LA BIOPSIE
On conseille lutilisation dchantillons obtenus aprs excision. Pour les analyses histopathologiques,
on recommande les biopsies lemporte-pice (de 3 mm ou 4 mm de diamtre).
FIGURE 2. LECTROPHORSE EN GEL ADDITIONN DE BROMURE DTHIDIUM SOUS CLAIRAGE UV
M = marqueur de 100 Kb, bandes 1, 2 et 4 =
couvillons de patients ayant une maladie due
M. ulcerans ; bande 3 = couvillon dun patient ayant
un ulcre chronique (qui nest pas d M. ulcerans),
bande 5 = Tmoin ngatif et bande 6 = tmoin positif.
(Avec laimable autorisation de Dorothy Yeboah-Manu)
12|
4.7.1.1 Lsions non ulcratives
Il faut prlever le spcimen au centre prsum de la lsion et inclure systmatiquement toutes les
couches de tissu cutan et sous-cutan, jusqu laponvrose.
4.7.1.2 Lsions ulcratives
On prlve le spcimen sur les bords de lulcre. L encore, il doit inclure toute lpaisseur de la peau
et du tissu sous-cutan, jusqu laponvrose.
4.7.2 FIXATION DES TISSUS
Le tissu doit tre x temprature ambiante aussi rapidement que possible aprs avoir t excis,
dans une solution 10 % de formol neutre tamponn (pH 7,4). Le tissu doit tre dcoup de faon
ce que lpaisseur de lchantillon ne dpasse pas 10 mm. Dans lidal, il faut prvoir pour le xer
un volume de formol au moins 10 fois suprieur celui du tissu. La xation initiale doit tre ralise
temprature ambiante car la pntration du formol est lie la temprature de la solution. Le tissu
doit tre laiss en contact avec la solution de xation pendant au moins 24 heures.
Aprs xation, les chantillons doivent tre transfrs dans un rcipient contenant de lthanol
70 %, avant de subir dautres traitements. Aprs xation, on peut expdier les chantillons dans des
volumes moins importants de xateur.
Il faut dabord xer les chantillons dos dans du formol puis les dcalcier, avant de les sectionner.
La coloration immunohistochimique nest pas indispensable au diagnostic, mais elle permet de mieux
apprhender ltat dune lsion et peut galement savrer utile pour le diagnostic diffrentiel. Elle
peut tre effectue rtrospectivement sur des chantillons xs dans du formol 10 % tamponn. La
xation du tissu ne doit toutefois pas durer plus de 24 heures car une xation prolonge peut dtruire
les sites antigniques.
N.B. Le xateur, savoir le formol 10 % tamponn, est sensible loxydation et ne doit pas tre
utilis pendant plus de 3 mois. Il doit tre limpide et ne pas contenir de prcipit ; son pH doit tre
de 6,5 ou plus.
4.7.3 PRPARATION DES COUPES HISTOPATHOLOGIQUES
Il suft de traiter comme dhabitude les tissus xs. On prpare des coupes de 4 6 m dpaisseur
que lon colore :
lhmatoxyline-osine ;
par la mthode de ZiehlNeelsen pour mettre les BAAR en vidence ;
lacide periodique-Schiff ou la mthnamine argentique de Grocott pour la recherche des
champignons ; et
par la mthode de Gram pour mettre en vidence dautres bactries (Annexe 7).
Suivre les indications pour lemploi ventuel des autres colorations. La technique utilise pour
lhistochimie est dtaille lAnnexe 7.
4.7.4 MODIFICATIONS GROSSIRES
Les modications la surface des lsions non ulcratives font souvent apparatre une perte des repres
topographiques et une dpigmentation. On observe dans les coupes transversales des modications de
la pigmentation, une ncrose et une minralisation. Les ganglions lymphatiques apparaissent souvent
gristres la surface de la coupe.
|13
Aprs dcalcication, on observe dans les coupes transversales dos une ncrose jauntre de la moelle
et souvent, un amincissement de la zone corticale.
4.7.5 MODIFICATIONS HISTOPATHOLOGIQUES AVANT LE TRAITEMENT ANTIBIOTIQUE
4.7.5.1 Modications cutanes
Les modications cutanes dpendent du stade dvolution de la maladie.
Phase ncrosante (volutive) : lsions non ulcratives
Durant cette phase, lpiderme reste intact mais est souvent hyperplasique, daspect essentiellement
psoriasiforme ou pseudo-pithliomateux.
Le derme suprieur reste en gnral intact galement, mais on peut y observer des dgnrescences
divers stades avec linltration dun petit nombre de cellules inammatoires. Il y a une ncrose
de coagulation conuante dans le derme profond, le tissu sous-cutan et laponvrose sous-jacente
(Figure 3, Figure 4, Figure 5).
FIGURE 3. COUPE DUN NODULE EXCIS CHIRURGICALEMENT, PRSENT DANS LULCRE DE BURULI
La zone centrale blanchtre tmoigne de la ncrose
de coagulation. (Avec laimable autorisation de John
Hayman)
FIGURE 4. COUPE MICROSCOPIQUE DUN NODULE
Observer la ncrose massive de coagulation dans la
couche profonde du derme et du tissu sous-cutan.
Coloration lhmatoxyline-osine. (Avec laimable
autorisation de Wayne Meyers)
14|
On observe un dme avec trs peu de cellules inammatoires, moins que la lsion ne soit surinfecte
par une bactrie pyogne. Les adipocytes enent, mais peuvent perdre leur noyau tout en gardant leurs
parois cellulaires (on les nomme parfois adipocytes fantmes ) (Figure 6).
Dans le tissu sous-cutan, locclusion des vaisseaux par des thrombi est courante, et peut saccompagner
dune vascularite (Figure 7, Figure 8).
FIGURE 5. TISSU CUTAN ET SOUS-CUTAN PROVENANT DUNE LSION NON ULCRATIVE TRS TENDUE
PROVOQUE PAR M. ULCERANS, QUI COUVRAIT 50 % DE LA SURFACE ABDOMINALE DUN ENFANT DE 9 ANS
Lpiderme est intact. Il y a une ncrose massive de
coagulation conuante dans lensemble de lchantillon.
FIGURE 6. BASE NCROSE DUN ULCRE DE BURULI FAISANT APPARATRE DE NOMBREUX ADIPOCYTES
FANTMES (DANS LA PARTIE SUPRIEURE) ET DE NOMBREUX BACILLES ACIDO-ALCOOLO RSISTANTS (BAAR)
(DANS LA PARTIE INFRIEURE)
Coloration ZiehlNeelsen. (Avec laimable autorisation
de Wayne Meyers)
FIGURE 7. VASCULARITE SVRE DANS LE TISSU SOUS-CUTAN DUNE LSION DE LULCRE DE BURULI
Coloration Movat. (Avec laimable autorisation de John
Hayman)
|15
On observe diffrents degrs de minralisation, notamment chez les patients africains. La coloration
ZN classique met en vidence un grand nombre de BAAR extracellulaires, souvent en amas et conns
dans les zones ncroses (Figure 9).
FIGURE 8. ADIPOCYTES FANTMES ET VASCULARITE
FIGURE 9. LA COLORATION ZIEHLNEELSEN (ZN) DUNE COUPE PARALLLE CELLE DE LA FIGURE 4 MET EN
VIDENCE DES BAAR CONFINS AU CENTRE DE LA LSION
La ncrose stend loin au-del des BAAR. (Avec
laimable autorisation de Wayne Meyers)
La plupart des bacilles se trouvent dans les zones profondes de lchantillon mais peuvent envahir
lespace interstitiel dans le tissu adipeux et les cloisons interlobulaires du tissu sous-cutan (Figure 10).
FIGURE 10. TISSU SOUS-CUTAN PROVENANT DES BORDS DUN ULCRE DE BURULI : ON OBSERVE DES
ADIPOCYTES FANTMES ACCOMPAGNS DE BAAR DANS LESPACE INTERSTITIEL
de Wayne Meyers)
16|
La ncrose persistante du derme aboutit en gnral une dgnrescence de lpiderme et nalement,
lulcration. Il arrive nanmoins que la ncrose stende latralement, avec une prolifration des
BAAR dans le tissu sous-cutan et laponvrose (Figure 11). Dans ce cas, lulcration de lpiderme ne se
produit alors que trs tardivement. Quand la maladie volue de cette manire, les patients dveloppent
la forme en plaque ou la forme dmateuse.
Phase ncrosante (volutive) : lsions ulcratives
Les ulcres sont dcolls et lon observe la formation dun nouvel pithlium sur les bords de la lsion
et la surface en dessous du lambeau de derme qui la recouvre (Figure 12). Lpiderme adjacent est en
gnral hyperplasique. La base de lulcre dorigine comporte une escarre ncrose de dbris cellulaires
et de brine, et parfois une escarre centrale. On observe une ncrose de coagulation du tissu sous-
cutan et de laponvrose semblable celle dcrite pour les lsions non ulcratives (Figure 11, Figure 13).
Les BAAR se localisent la base de lescarre centrale et du tissu sous-cutan ncros. La maladie
stend rarement au muscle sous-jacent. On observe parfois une vascularite et une minralisation
(Figure 7).
FIGURE 11. DES AMAS DE BAAR INFILTRENT LA BASE DES BORDS DUN ULCRE DE BURULI
Amas de BAAR typiques. Coloration ZiehlNeelsen.
(Avec laimable autorisation de Wayne Meyers)
FIGURE 12. CHANTILLON DE BIOPSIE PROVENANT DU BORD DUN ULCRE DE BURULI ET MONTRANT LE
DCOLLEMENT DU DERME ET UNE NCROSE MASSIVE DE LPIDERME, DU DERME, DE LHYPODERME ET DE
LAPONVROSE
|17
Organisation (phase granulomateuse prcoce)
La phase prcoce de la gurison se caractrise par une raction granulomateuse mal organise dans le
derme et le tissu sous-cutan (Figure 14). Lorganisation des granulomes intervient souvent au cours
de la quatrime semaine du traitement antibiotique.
FIGURE 13. TISSU SOUS-CUTAN PROVENANT DU BORD DUN ULCRE DE BURULI ET MONTRANT LA NCROSE
ET LPAISSISSEMENT DUNE CLOISON INTERLOBULAIRE
La cloison contient des amas de BAAR. Coloration
ZiehlNeelsen. (Avec laimable autorisation de Wayne
Meyers)
FIGURE 14. GURISON DUN ULCRE DE BURULI UN STADE PRCOCE, DANS LA PHASE DORGANISATION :
LYMPHOCYTES, CELLULES PITHLIODES ET CELLULES GANTES
Linltration granulomateuse renferme des macrophages ens (cellules pithliodes), des cellules
gantes de Langhans et des lymphocytes, qui nissent par former des granulomes tuberculodes. On
observe parfois des macrophages spumeux, des lymphocytes et des plasmocytes sur les bords de la
graisse ncrose. Les BAAR sont rares ou absents.
18|
Phase de gurison
Avec la progression de la gurison, le tissu de granulation se forme, suivi dune brose et dune
cicatrice affaisse (Figure 15, Figure 16). On observe rarement des BAAR.
Quelques patients prsentant des lsions anciennes, non traites, peuvent galement dvelopper des
granulomes au cours de la gurison spontane.
4.7.5.2 Ganglions lymphatiques
Bien que ladnopathie clinique soit rarement manifeste, on observe souvent des adnites importantes
lhistopathologie, la fois au niveau des ganglions adjacents la lsion et au niveau des ganglions
rgionaux. Pour ceux qui sont adjacents, il arrive quil y ait une invasion importante de la capsule
par les BAAR (Figure 17). On observe souvent une ncrose marque du parenchyme avec destruction
du tissu lymphode cortical (Figure 18). Dans ce cas, il arrive que le ganglion soit entirement envahi
par les BAAR. Les ganglions lymphatiques rgionaux, cependant, peuvent prsenter une histiocytose
sinusodale. On observe rarement de modications granulomateuses, ni de BAAR.
FIGURE 15. GRANULOME BIEN FORM AU COURS DE LA RACTION DHYPERSENSIBILIT RETARDE DANS UN
ULCRE DE BURULI EN VOIE DE GURISON
FIGURE 16. GURISON DUN ULCRE DE BURULI UN STADE AVANC, AVEC DES CICATRICES SUR LA PLUS
GRANDE PARTIE DE LA COUPE
|19
4.7.5.3 Modications de los
Los peut tre atteint par contamination directe partir dune lsion dans les tissus suprieurs,
ou partir de lsions connues distantes, probablement par propagation hmatogne de M. ulcerans
(Figure 19).
FIGURE 17. ADNOPATHIE ASSOCIE UN ULCRE DE BURULI
Le parenchyme du ganglion est ncros et fortement
envahi de BAAR. Coloration ZiehlNeelsen. (Avec
laimable autorisation de Wayne Meyers)
FIGURE 18. ADNITE NCROSANTE DUN GANGLION LYMPHATIQUE PROXIMIT DUN ULCRE DE BURULI
Le centre est dtruit et il ne reste que des traces du tissu
lymphode cortical. Coloration lhmatoxyline-osine
(les colorations ZiehlNeelsen de coupes parallles
mettent en vidence de nombreux BAAR sur la Figure 17).
FIGURE 19. RADIOGRAPHIE DE LA JAMBE METTANT EN VIDENCE LA DESTRUCTION DE LOS
Le patient souffrait dun ulcre de Buruli au-dessus de la
zone atteinte. (Avec laimable autorisation de Giovanni
Battista Priuli)
20|
lhistopathologie, une ncrose tendue de la moelle et une rosion de la trave osseuse apparaissent
(Figure 20). On constate la prsence de BAAR en nombre variable, le plus souvent dans la moelle
ncrose (Figure 21, Figure 22).
FIGURE 21. OSTOMYLITE DU TIBIA AVEC DES AMAS DE BAAR DANS LA MOELLE NCROSE
de Wayne Meyers)
FIGURE 22. OSTOMYLITE DU TIBIA AVEC NCROSE DE LA MOELLE ET UNE TRAVE OSSEUSE EN VOIE DE
DISSOLUTION DANS LA ZONE AVEC DES BAAR
de Wayne Meyers)
FIGURE 20. OSTOMYLITE DU TIBIA AVEC NCROSE DE LA MOELLE ET ROSION DE LA TRAVE OSSEUSE
|21
FIGURE 23. APERU SCHMATIQUE DES PROFILS DINFILTRATION CELLULAIRE ET DE LA RPARTITION
DLMENTS MYCOBACTRIENS DANS DES LSIONS DE LULCRE DE BURULI TRAITES PAR ANTIBIOTIQUES
On peut distinguer trois principaux types dinltration cellulaire (A :
granulomes, B: inltrats htrognes diffus, C : accumulations de lymphocytes
daspect folliculaire proximit des vaisseaux) (50). (Avec laimable
autorisation de Gerd Pluschke)
Bien que certaines lsions dans los semblent exclusivement tre le rsultat de la prsence de M. ulcerans,
environ 50 % sont surinfectes par des micro-organismes pyognes, streptocoques, staphylocoques ou
corynbactries par exemple. Dans ce cas, on observe une suppuration et ces germes apparaissent la
coloration de Gram. Des granulomes bien forms peuvent se dvelopper et produire une ostomylite
chronique, probablement cause par M. ulcerans.
4.7.5.4 Patients souffrant dune forme tendue de la maladie
Les patients souffrant de lsions dmateuses agressives atteignant de grandes parties du corps
prsentent souvent des dmes tendus et des troubles de la fonction rnale ou dautres symptmes
voquant une atteinte viscrale. Ils meurent parfois assez rapidement au dbut de lvolution de
la maladie. Certaines autorits souponnent un effet systmique de la toxine pour expliquer ces
vnements, mais pour en tre certain, il faudra intensier les efforts pour tudier la physiopathologie
de ces formes cliniques chez le malade et les chantillons provenant des autopsies.
4.7.6 IMMUNOCHIMIE ET ANALYSE DES RACTIONS IMMUNITAIRES LOCALES LIES LA
CHIMIOTHRAPIE
lexamen histopathologique, les lsions de lulcre de Buruli prsentent des caractristiques bien
spciques, notamment la prsence damas extracellulaires de BAAR rpartis en foyers, une ncrose
massive des tissus, des adipocytes fantmes et une inltration cellulaire extrmement faible au centre
des lsions (3941). Des signes dinammation chronique, des ractions granulomateuses et des BAAR
intracellulaires peuvent toutefois tre visibles la priphrie des lsions non traites, en particulier chez
les malades ayant tendance gurir spontanment (42).
Pendant la chimiothrapie, il se produit peu peu une inltration chronique par les leucocytes, trs
probablement sous leffet de molcules immunostimulantes et dantignes librs par les mycobactries
dtruites ; des inltrats diffus apparaissent alors dans toutes les zones du tissu conjonctif dermique
et du tissu adipeux atteints. Ce processus aboutit au dveloppement de structures lymphodes
ectopiques (Figure 23). Il est communment admis que les taux de mycolactone diminuent pendant
la chimiothrapie, ce qui permet linltration des leucocytes jusquaux mycobactries extracellulaires,
entranant leur phagocytose et leur destruction. Les BAAR commencent tre internaliss par les
phagocytes ds la n de la deuxime semaine de traitement, lorsque M. ulcerans peut encore tre cultiv
partir dhomognats de tissu (41).
22|
Les tudes immunohistochimiques donnent un aperu de la composition cellulaire des inltrats
leucocytaires chroniques. Les restes dinltration prcoce par les neutrophiles peuvent tre dtects
par immunohistochimie lintrieur des zones ncroses centrales (Figure 24). Dans les lsions traites,
les macrophages et les monocytes CD14
+
se retrouvent gnralement en abondance dans le tissu
adipeux et autour des zones ncroses (Figure 24), mais linltration simultane par les neutrophiles est
souvent la consquence dune infection secondaire. Le rassemblement de cellules prsentant lantigne
autour des zones ncroses, le dveloppement dagrgats de lymphocytes B (Figure 25), et la prsence
de granulomes pithliodes hautement organiss (Figure 26), indiquent que la reconnaissance et
lapprtement de lantigne stimule les ractions immunitaires locales M. ulcerans, actives et spciques.
FIGURE 24. BANDES DE LEUCOCYTES ENTOURANT LE CENTRE NCROS NON INFILTR DUNE LSION DE
LULCRE DE BURULI
Une couronne de macrophages et de monocytes CD14+ (A) simbrique dans une seconde couronne plus extrieure de lymphocytes T CD3+
(B). Dans le noyau ncros, on a mis en vidence des dbris de neutrophiles positifs pour la N-lastase (C), mais aucun neutrophile intact
(insert D). On observe des amas de lymphoycytes B CD20+ loin du noyau ncros (48). (Avec laimable autorisation de Gerd Pluschke)
|23
La couche extrieure des granulomes est essentiellement compose de lymphocytes T, les cellules
T CD4
+
tant gnralement plus nombreuses que les cellules T CD8
+
. Ces couronnes de lymphocytes
sont parsemes de dendrocytes dermiques. Des agrgats de lymphocytes B, en foyers, apparaissent
sur les bords extrieurs de la couche de lymphocytes T. Le centre des granulomes est occup par
des cellules prsentant lantigne, en particulier des cellules gantes de Langhans et des macrophages
pithliodes. Dans les granulomes de la tuberculose humaine, le noyau central est habituellement
ncros ; mais ce nest pas le cas dans les lsions des patients souffrant de lulcre de Buruli traits
par antibiotiques.
La rpartition des diffrents types de leucocytes nest pas forcment homogne dans les lsions de
lulcre de Buruli ; par consquent, lanalyse dune seule biopsie peut ne pas tre reprsentative de la
lsion tout entire. De plus, il existe une grande variation de rponse dun individu lautre en termes
dobservations histopathologiques et de rsultat clinique. Mme si un tissu lymphode ectopique est
suppos se former dans les maladies infectieuses, principalement pour squestrer les agents pathognes,
ce processus saccompagne souvent de dgts tissulaires. Dans lulcre de Buruli, le dveloppement de
ractions paradoxales pendant le traitement (43,44), notamment un agrandissement des ulcres et une
volution acclre des plaques non ulcratives et des dmes en lsions ulcratives, peut constituer
chez certains patients un syndrome inammatoire de reconstitution immunitaire (IRIS). Une telle
aggravation transitoire de lsions connues ou lapparition de nouvelles lsions caractristiques de la
maladie malgr un traitement adapt, ou les deux, est connue depuis longtemps dans le cas de la lpre
et de la tuberculose.
Dans lulcre de Buruli, la dtrioration des lsions aprs linstauration dun traitement antimycobactrien
peut tre lie certains facteurs tels que :
la charge de dbris mycobactriens et de tissu ncrotique qui subsiste dans la lsion (45) ;
une surinfection ; et
la composition et ltat dorganisation des inltrats cellulaires (46).
Le phnomne de ractivation, par exemple le dveloppement de nouveaux ulcres ou de nodules
douloureux plusieurs semaines plusieurs mois aprs la n du traitement, pourrait tre considr
comme un effet bnque, savoir la mise en route du systme immunitaire adaptatif, consquence du
traitement russi des lsions primaires, au lieu dtre considr comme un chec de la chimiothrapie
antimycobactrienne (47,48).
FIGURE 25. ACCUMULATION DE LYMPHOCYTES B DANS DES LSIONS DE LULCRE DE BURULI
(A) Bande de lymphocytes B CD20+ ; (B) Amas de lymphocytes B CD20+ parsems de quelques lymphocytes T CD3+ ; (C) (48). (Avec
laimable autorisation de Gerd Pluschke)
24|
FIGURE 26. ORGANISATION DTAILLE DUN GRANULOME PRSENT DANS UNE LSION DE LULCRE DE
BURULI TRAITE PAR ANTIBIOTIQUES
Des coupes histologiques sries ont t colores avec des anticorps dirigs contre diffrents marqueurs membranaires ou marqueurs
cytoplasmiques (contre coloration par lhmatoxyline). (A, B, C) Les marquages avec les anticorps anti CD3, CD4 et CD8, respectivement,
montrent une couronne de lymphocytes auxiliaires ainsi que des lymphocytes T cytotoxiques entourant le centre du granulome. (D) Des
dendrocytes dermiques S100+ se dissminent au sein des lymphocytes T dans la couche extrieure. (E) Marquage par lanticorps anti CD20
mettant en vidence des lymphocytes B en priphrie du granulome. (F) Cellules prsentatrices dantigne CD68+, au centre dun granulome ;
linsert montre de grandes cellules gantes de Langhans. (G) On peut observer de grandes quantits de CD14 lis la membrane (che) et
solubles (pointe de che). (H) Rpartition des lymphocytes activs (CD45RO+). (I) Des cellules (Ki67+) en prolifration rvlent ltat actif
des granulomes (50). (Avec laimable autorisation de Gerd Pluschke)
|25
4.7.7 RACTIONS PARADOXALES
Dans la tuberculose et dautres infections mycobactries, le terme de raction paradoxale
dcrit laggravation clinique de lsions prexistantes ou le dveloppement de nouvelles lsions
chez des patients dont ltat stait initialement amlior lorsquils recevaient le traitement
antimycobactrien (44,45,4749). Dans le traitement de lulcre de Buruli, le dlai dapparition
des ractions paradoxales est imprvisible (elles peuvent apparatre quelques jours quelques
mois aprs le dbut de la chimiothrapie) ; la dure et la gravit de ces ractions sont elles
aussi impossibles prvoir. Les ractions paradoxales qui se produisent pendant un traitement
antimycobactrien semblent plus frquentes et graves chez les individus sropositifs pour le
VIH qui suivent galement une thrapie antirtrovirale trs active. Pour ces cas, le mcanisme
sous-jacent de la raction paradoxale peut tre un syndrome inammatoire de reconstitution
immunitaire (galement nomm IRIS). Toutefois, il arrive que des ractions paradoxales se
produisent aussi chez des patients qui ne sont pas immunodprims, et pour ces cas, les
mcanismes exacts ne sont pas bien lucids.
La raction paradoxale, telle quelle a t dnie dans lulcre de Buruli, comprend lagrandissement
des ulcres, lvolution acclre des plaques non ulcratives et des dmes en lsions ulcratives,
et lmergence de nouvelles lsions pendant le traitement antibiotique. Diffrents mcanismes
sous-jacents peuvent coexister ; il est par consquent inexact de considrer toutes les ractions
paradoxales survenant pendant le traitement de lulcre de Buruli comme un IRIS.
Dans la mesure o la mycolactone provoque une suppression de limmunit locale (et parfois
gnrale) dans les lsions de lulcre de Buruli, pratiquement tous les patients souffrant de lulcre
de Buruli sous traitement antimycobactrien dveloppent de fortes ractions immunitaires
locales. Chez de nombreux malades, linltration massive des lsions et le dveloppement dun
tissu lymphode atopique ne semblent pas gner la cicatrisation des plaies. On considre que
les fortes ractions immunitaires locales constituent un bon marqueur du succs du traitement
antimycobactrien (avec la destruction de M. ulcerans et la chute correspondante des taux de
mycolactone), et quelles ne sont pas obligatoirement le signe de complications lies aux ractions
immunitaires. Chez les patients traits pour lulcre de Buruli, il est difcile de faire la diffrence
entre une dtrioration rsultant dune raction paradoxale et une dtrioration rsultant dun
chec thrapeutique.
26|
5. ASSURANCE DE LA QUALIT
Si le dpistage en laboratoire de lulcre de Buruli nest pas able, il peut arriver que des patients
souffrant de cette maladie ne soient pas diagnostiqus, ce qui risque de leur faire dvelopper une
forme plus grave de la maladie, mais aussi dentraner une sous-estimation de la charge de morbidit
dans une rgion donne. Inversement, des patients qui ne souffrent pas de cette maladie peuvent se
retrouver inutilement traits, et la charge de morbidit peut tre surestime. Il est donc indispensable
de sassurer de lexactitude et de la abilit de toutes les analyses de laboratoire, objectif qui peut tre
atteint travers un processus connu sous le nom dassurance de la qualit.
Lexactitude et la abilit des analyses de laboratoire sont indispensables au succs des programmes de
lutte contre lulcre de Buruli. Toutes les composantes du systme danalyse doivent tre contrles
pour garantir la qualit de lensemble du processus, pour dtecter et diminuer les erreurs, et pour
amliorer luniformit des rsultats entre les diffrents sites danalyse. Lassurance de la qualit doit tre
mise en uvre par chaque laboratoire (au titre du contrle interne de la qualit) et galement par un
laboratoire de rfrence (il sagit alors dune valuation externe de la qualit).

Contrle interne de la qualit : il comprend la surveillance systmatique en interne des
pratiques de travail, des procdures techniques, du matriel et des produits, et inclut la
surveillance de la qualit des ractifs (tels que les colorants).
valuation externe de la qualit : cest un processus qui value la performance dun
laboratoire. Il peut inclure lvaluation sur site des laboratoires, le recours lanalyse de
panels dchantillons, et le rexamen en aveugle des rsultats danalyses.
Les systmes de contrle interne de la qualit et dvaluation externe de la qualit sont dtaills
lAnnexe 8 ( partir du programme de formation sur lexamen direct des frottis par microscopie pour
la recherche des BAAR, Current Laboratory Practice Series) (51).
|27
6. RLE DES PROGRAMMES NATIONAUX, DES
TABLISSEMENTS DE SANT ET DES LABORATOIRES
Les programmes nationaux, les tablissements de sant et les laboratoires remplissent chacun un rle
important pour assurer la qualit de la conrmation de lulcre de Buruli au laboratoire.
6.1 PROGRAMMES NATIONAUX DE LUTTE CONTRE LULCRE DE BURULI
veillent ce que les laboratoires locaux et les laboratoires nationaux de rfrence disposent
des ressources appropries pour traiter les chantillons de diagnostic ;
surveillent les activits des laboratoires locaux et des laboratoires nationaux de rfrence ;
rassemblent les rsultats de tous les laboratoires et transmettent ces rsultats aux autorits
nationales et internationales (telles que les ministres de la sant et lOMS) ;
identient les besoins en matire de formation dans les laboratoires, et coordonnent la
formation avec les laboratoires pour le personnel des tablissements de sant le cas chant.
6.2 TABLISSEMENTS DE SANT
recherchent chez les patients prsums atteints de lulcre de Buruli des lsions non ulcratives
ou ulcratives ;
obtiennent des chantillons appropris pour une conrmation du diagnostic ;
tiquettent les chantillons et remplissent le formulaire UB 03 (Annexe 9) ;
transportent les chantillons jusqu un laboratoire local ou jusquau laboratoire national de
rfrence ;
recueillent les rsultats du laboratoire ;
reportent les rsultats sur les formulaires UB 01 et UB 03 (Annexe 9) ;
transmettent les rsultats au programme national.
6.3 LABORATOIRES
6.3.1 LABORATOIRES DE NIVEAU PRIPHRIQUE
reoivent et traitent les couvillons et les chantillons prlevs par AAF en effectuant lexamen
direct des frottis ;
enregistrent les rsultats des frottis dans les 24 heures, et transmettent ceux-ci au programme
national en respectant le dlai indiqu dans les lignes directrices relatives la notication des
cas ;
font parvenir au laboratoire national de rfrence 20 % de tous les chantillons traits, pour
que ces derniers y soient contrls dans le cadre de lassurance externe de la qualit.
6.3.2 LABORATOIRE NATIONAL DE RFRENCE
reoit et traite les couvillons, les chantillons prlevs par AAF et, si ncessaire, les pices
biopsiques prleves lemporte-pice ou excises, par les mthodes suivantes : examen direct
des frottis, amplication gnique (PCR), culture, et histopathologie (dans certains laboratoires) ;
fait parvenir les rsultats de lexamen direct des frottis ltablissement de sant dans un dlai
de 24 48 heures pour les frottis, 2 semaines pour la PCR, 4 semaines pour lhistopathologie
et 6 mois pour les cultures. Ltablissement de sant transmettra les rsultats au programme
national en respectant le dlai indiqu dans les lignes directrices nationales relatives la
notication ;
28|
reoit environ 20 % de tous les chantillons traits par les laboratoires priphriques, an de
procder une assurance externe de la qualit sur les rsultats de la microscopie ;
organise priodiquement des essais daptitude sur la microscopie destination des laboratoires
priphriques laide de panels dchantillons ; idalement, une frquence annuelle. Un
rexamen en aveugle des lames peut tre prvu de temps en temps pour les laboratoires qui
rencontrent rgulirement des problmes au cours des essais daptitude ;
organise des formations sur les mthodes en microscopie pour :
- les techniciens qui sont nouveaux dans le rseau des laboratoires de microscopie,
- certains techniciens dans le cas o le processus dassurance externe de la qualit a mis au
jour des problmes bien prcis,
- tous les techniciens si un changement important est intervenu dans les procdures utilises au
sein du rseau.
supervise priodiquement le travail des laboratoires priphriques ; idalement, une frquence
trimestrielle ;
organise priodiquement un rexamen en aveugle des lames manant des laboratoires
priphriques ; idalement, une frquence trimestrielle. Des analyses sur panels dchantillons
peuvent tre prvues pour les laboratoires qui rencontrent rgulirement des problmes au
cours du processus de rexamen en aveugle ; ce type danalyse peut tre prvu une fois par
an pour tous les laboratoires.
6.3.3 LABORATOIRE INTERNATIONAL (SUPRANATIONAL) DE RFRENCE
reoit et traite les couvillons, les chantillons prlevs par AAF et, si ncessaire, les pices
biopsiques prleves lemporte-pice ou excises, par les mthodes suivantes : examen direct
des frottis, amplication gnique (PCR), et occasionnellement, culture et histopathologie ;
fait parvenir les rsultats ltablissement de sant dans un dlai de 24 48 heures pour
les frottis, 2 semaines pour la PCR, 4 semaines pour lhistopathologie et 6 mois pour les
cultures. Ltablissement de sant transmettra les rsultats au programme national en respectant
le dlai indiqu dans les lignes directrices nationales relatives la notication ;
organise priodiquement des essais daptitude sur la PCR destination des laboratoires
nationaux de rfrence laide de panels dchantillons ; idalement, une frquence annuelle.
Un rexamen en aveugle des chantillons peut tre prvu pour les laboratoires qui
rencontrent rgulirement des problmes au cours des essais daptitude. Dans ce cas, 10 % de
tous les chantillons traits par le laboratoire national de rfrence sont ranalyss dans le
cadre de lassurance externe de la qualit ;
valide et met en place de nouvelles techniques de diagnostic ;
supervise priodiquement le travail des laboratoires priphriques ; idalement, une frquence
trimestrielle ;
organise priodiquement un rexamen en aveugle des lames manant des laboratoires
priphriques ; idalement, une frquence trimestrielle. Des analyses sur panels dchantillons
peuvent tre prvues pour les laboratoires qui rencontrent rgulirement des problmes au
cours du processus de rexamen en aveugle ; ce type danalyse peut tre prvu une fois par
an pour tous les laboratoires.
6.3.4 RSEAU MONDIAL DE LABORATOIRES POUR LA CONFIRMATION DE LA MALADIE
CAUSE PAR MYCOBACTERIUM ULCERANS (ULCRE DE BURULI)
Un rseau de laboratoires effectuant la PCR a t tabli dans les pays dendmie et dans les pays non
endmiques. Ces laboratoires sont indiqus dans le Tableau 2.
Les rsultats de lassurance de la qualit de la PCR, effectue par la plupart de ces laboratoires, ont
t publis (52).
|29
TABLEAU 2. RSEAU MONDIAL DE LABORATOIRES POUR LA CONFIRMATION DE LA MALADIE CAUSE PAR
MYCOBACTERIUM ULCERANS (ULCRE DE BURULI)
Pays Nom du laboratoire Personne contacter
1. Allemagne

Dpartement des Maladies infectieuses et de
Mdecine tropicale, Universit Ludwig-Maximilian
de Munich
Dr Gisela Bretzel
bretzel@lrz.uni-muenchen.de
Dr Marcus Beissner
beissner@lrz.uni-muenchen.de
2. Australie Laboratoire de rfrence de ltat de Victoria pour
les Maladies infectieuses, Melbourne*
Laboratoire de rfrence des mycobactries,
Pathologie Queensland
Dr Janet Fyfe
Janet.Fyfe@mh.org.au
Mme Caroline Lavender
Caroline.Lavender@mh.org.au
Dr Sushil Pandey
sushil_pandey@health.qld.gov.au
3. Belgique Institut de Mdecine Tropicale, Anvers* Professeur Franoise Portaels
fportaels@itg.be
Professeur Bouke de Jong
bdejong@itg.be
Dr Miriam Eddyani
MEddyani@itg.be
4. Bnin Laboratoire de Rfrence des Mycobactries,
Cotonou
Centre de dpistage et de traitement de lulcre de
Buruli Raoul et Madeleine Follereau de Pob
Dr Dissou Affolabi
affolabi_dissou@yahoo.fr
Professeur Sverin Anagonou
anagonou_severin@yahoo.fr
Dr Estelle Marion
stel.marion@yahoo.fr
5. Cameroun Centre Pasteur du Cameroun, Yaound Dr Sara Eyangoh
eyangoh@pasteur-yaounde.org
6. Cte dIvoire Institut Pasteur, Abidjan Professeur Mireille Dosso
mireilledosso@yahoo.fr
Dr Solange Kakou Ngazoa
ngazoa_solange@yahoo.fr
Dr NGuetta Aka
aka_nguetta@yahoo.fr
7. France Universit et CHU dAngers - Institut de Biologie
en Sant- IRIS
Dr Laurent Marsollier
laurent.marsollier@inserm.fr
8. Guyane franaise Institut Pasteur, Cayenne Dr Anne-Sophie Drogoul
anneso.drogoul@gmail.com
9. Ghana Institut Noguchi pour la recherche mdicale, Accra
Centre de Recherches collectives de Kumasi, Kumasi
Professeur Dorothy Yeboah-Manu
DYeboah-Manu@noguchi.mimcom.org
Dr Anthony Ablordey
AAblordey@noguchi.mimcom.org
Dr Richard Phillips
rodamephillips@gmail.com
Mr Michael Frimpong
mfrimpong28@gmail.com
10. Rpublique
centrafricaine
Institut Pasteur, Bangui Dr Fanny-Elodie Minime-Lingoupou
ingoupou@yahoo.fr
11. Rpublique
dmocratique du
Congo
Institut National de Recherche Biomdicale (INRB),
Kinshasa
Professeur Anatole Kibadi Kapay
akibadi@yahoo.fr
Mme Bibiche Mundabi
mbd852000@yahoo.fr
12. Japon Centre de Recherche sur la Lpre, Institut national
des Maladies infectieuses, Tokyo
Dr Kazue Nakanaga
nakanaga@nih.go.jp
13. Suisse Institut Tropical et de Sant Publique Suisse, Ble Professeur Gerd Pluschke
Gerd.Pluschke@unibas.ch
14. Togo Institut National dHygine, Lom Dr Abiba Banla-Kere
kerebanla@hotmail.com

* L Institut de Mdecine Tropicale Anvers, en Belgique, est un Centre collaborateur de lOMS pour le diagnostic et la suveillance de linfection
Mycobacterium ulcerans ; le Laboratoire de rfrence de ltat de Victoria pour les maladies infectieuses Melbourne, en Australie, est un
Centre collaborateur de lOMS pour Mycobacterium ulcerans
30|
7. PROPOSITION DALGORITHME POUR
DIAGNOSTIQUER LULCRE DE BURULI
FIGURE 27. ALGORITHME POUR DIAGNOSTIQUER LULCRE DE BURULI AUX NIVEAUX PRIPHRIQUE,
NATIONAL DE RFRENCE ET SUPRANATIONAL (53)
PCR: polymerase chain reaction , raction damplication en chane par polymrase.
Laboratoire priphrique
Microscopie
Microscopie positive
Ulcre de Buruli
conrm
Proportion de toutes
les lames envoye au
laboratoire national de
rfrence pour valuation
externe de la qualit
chantillons ngatifs
en microscopie
PCR positive
Ulcre de Buruli
conrm
PCR ngative
Ulcre de Buruli
non conrm
Laboratoire supranational
PCR
Envoyer les chantillons
de biopsie pour examen
histologique
(diagnostic diffrentiel)
Laboratoire national de rfrence
PCR pour IS2404
Proportion dchantillons de PCR
envoye pour valuation externe
de la qualit
Proposition dalgorithme pour les laboratoires diagnostiquant lulcre de Buruli aux niveaux priphrique, national de rfrence, et
supranational (53) (Avec laimable autorisation de Dissou Affolabi)
|31
RFRENCES
1. Treatment of Mycobacterium ulcerans disease (Buruli ulcer): guidance for health workers. Geneva, World
Health Organization, 2012 (WHO/HTM/NTD/IDM/2012.1).
2. Summary report of the meeting of the WHO Technical Advisory Group on Buruli ulcer, Geneva, World
Health Organization, 2008 (available at: http://www.who.int/entity/buruli/events/TAG_report_
FINAL.pdf; accessed February 2013).
3. Portaels F, Johnson P, Meyers WM, eds. Buruli ulcer: diagnosis of Mycobacterium ulcerans disease.
A manual for health care providers. Geneva, World Health Organization, 2001 (WHO/CDS/
CPE/GBUI/2001.4).
4. Eddyani M et al. Primary culture of Mycobacterium ulcerans from human tissue specimens after
storage in semisolid transport medium. Journal of Clinical Microbiology, 2008, 46:6972.
5. Eddyani M et al. Fine-needle aspiration, an efcient sampling technique for bacteriological
diagnosis of nonulcerative Buruli ulcer. Journal of Clinical Microbiology, 2009, 47:17001704.
6. Herbinger KH et al. Comparative study of the sensitivity of different diagnostic methods for
the laboratory diagnosis of Buruli ulcer disease. Clinical Infectious Diseases, 2009, 48:10551064.
7. Siegmund V et al. Dry reagent-based polymerase chain reaction compared with other
laboratory methods available for the diagnosis of Buruli ulcer disease. Clinical Infectious Diseases,
2007, 45:6875.
8. Yeboah-Manu D et al. Evaluation of decontamination methods and growth media for primary
isolation of Mycobacterium ulcerans from surgical specimens. Journal of Clinical Microbiology,
2004, 42:58755876.
9. Bretzel G et al. A stepwise approach to the laboratory diagnosis of Buruli ulcer disease.
Tropical Medicine and International Health, 2007, 12:8996.
10. Siegmund V et al. Dry-reagent-based PCR as a novel tool for laboratory conrmation of
clinically diagnosed Mycobacterium ulcerans-associated disease in areas in the tropics where
M. ulcerans is endemic. Journal of Clinical Microbiology, 2005, 43:271276.
11. Rondini S et al. Contiguous spread of Mycobacterium ulcerans in Buruli ulcer lesions analysed
by histopathology and real-time PCR quantication of mycobacterial DNA. Journal of Pathology,
2006, 208:119128.
12. Guarner J et al. Histopathologic features of Mycobacterium ulcerans infection. Emerging Infectious
Diseases, 2003, 9:651656.
13. Affolabi D et al. Effects of grinding surgical tissue specimens and smear staining methods on
Buruli ulcer microscopic diagnosis. Tropical Medicine and International Health, 2008, 13:187190.
14. Affolabi D et al. Setting up a national reference laboratory for Buruli ulcer: the case of Benin.
Tropical Medicine and International Health, 2008, 13:365368.
15. Bretzel G et al. Laboratory conrmation of Buruli ulcer disease in Togo, 20072010. PLoS
Neglected Tropical Diseases, 2011, 5:e1228 (doi:10.1371/journal.pntd.0001228).
16. Mensah-Quainoo E et al. Diagnosis of Mycobacterium ulcerans infection (Buruli ulcer) at a
treatment centre in Ghana: a retrospective analysis of laboratory results of clinically diagnosed
cases. Tropical Medicine and International Health, 2008, 13:191198.
17. Phanzu D et al. Mycobacterium ulcerans disease (Buruli ulcer) in a rural hospital in Bas-Congo,
Democratic Republic of Congo, 20022004. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene,
2006, 75:311314.
32|
18. Portaels F et al. Buruli ulcer and its bone lesions: about 73 cases. Bulletin des sancesAcadmie
royale des sciences doutre-mer, 2003, 49:161190.
19. Guimaraes-Peres A et al. Comparison of two PCRs for detection of Mycobacterium ulcerans.
Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37:206208.
20. Noeske J et al. Buruli ulcer disease in Cameroon rediscovered. American Journal of Tropical
Medicine and Hygiene, 2004, 70:520526.
21. Phillips R et al. Sensitivity of PCR targeting the IS2404 insertion sequence of Mycobacterium
ulcerans in an assay using punch biopsy specimens for diagnosis of Buruli ulcer. Journal of
Clinical Microbiology, 2005, 43:36503656.
22. Stienstra Y et al. Analysis of an IS2404-based nested PCR for diagnosis of Buruli ulcer disease
in regions of Ghana where the disease is endemic. Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41:794797.
23. Herbinger KH et al. Efciency of ne-needle aspiration compared with other sampling
techniques for laboratory diagnosis of Buruli ulcer disease. Journal of Clinical Microbiology,
2010, 48:37323734.
24. Phillips RO et al. Sensitivity of PCR targeting Mycobacterium ulcerans by use of ne needle
aspirates for diagnosis of Buruli ulcer. Journal of Clinical Microbiology, 2009,47(4):9246.
25. Ablordey A et al. Detection of Mycobacterium ulcerans by the loop mediated isothermal
amplication method. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2012, 6:e1590 (doi:10.1371/journal.
pntd.0001590).
26. de Souza D et al. A quick and cost effective method for the diagnosis of Mycobacterium ulcerans
infection. BMC Infectious Diseases, 2012, 12:8 (doi: 10.1186/1471-2334-12-8).
27. Njiru ZK et al. Rapid and sensitive detection of Mycobacterium ulcerans by use of a loop-
mediated isothermal amplication test. Journal of Clinical Microbiology, 2012, 50:17371741.
28. Palomino JC, Portaels F. Effects of decontamination methods and culture conditions on
viability of Mycobacterium ulcerans in the BACTEC system. Journal of Clinical Microbiology, 998,
6:402408.
29. Palomino JC et al. Effect of oxygen on growth of Mycobacterium ulcerans in the BACTEC
system. Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36:34203422.
30. Affolabi D et al. Effects of decontamination, DNA extraction, and amplication procedures
on the molecular diagnosis of Mycobacterium ulcerans disease (Buruli ulcer). Journal of Clinical
Microbiology, 2012, 50:11951198.
31. Durnez L et al. A comparison of DNA extraction procedures for the detection of Mycobacterium
ulcerans, the causative agent of Buruli ulcer, in clinical and environmental specimens. Journal of
Microbiologcial Methods, 2009, 76:152158.
32. Fyfe J et al. Development and application of two multiplex real-time PCR assays for the
detection of Mycobacterium ulcerans in clinical and environmental samples. Applied and
Environmental Microbiology, 2007, 73:47334740.
33. Ross BC et al. Development of a PCR assay for rapid diagnosis of Mycobacterium ulcerans
infection. Journal of Clinical Microbiology, 1997, 35:16961700.
34. Stinear T et al. Identication and characterization of IS2404 and IS2606: two distinct repeated
sequences for detection of Mycobacterium ulcerans by PCR. Journal of Clinical Microbiology, 1999,
37:10181023.
35. Beissner M et al. Detection of viable Mycobacterium ulcerans in clinical samples by a novel
combined 16S rRNA reverse transcriptase/IS2404 real-time qPCR assay. PLoS Neglected Tropical
Diseases, 2012, 6:e1756 (doi:10.1371/journal.pntd.0001756).
36. Yip MJ et al. Evolution of Mycobacterium ulcerans and other mycolactone-producing
mycobacteria from a common Mycobacterium marinum progenitor. Journal of Bacteriology,
2007, 189:20212029.
|33
37. Stragier P et al. Heterogeneity among Mycobacterium ulcerans isolates from Africa. Emerging
Infectious Diseases, 2006, 12:844847.
38. Stragier P et al. Genotyping Mycobacterium ulcerans and Mycobacterium marinum by using
mycobacterial interspersed repetitive units. Journal of Bacteriology, 2005, 187:16391647.
39. Hayman JA. Out of Africa: observations on the histopathology of Mycobacterium ulcerans
infection. Journal of Clinical Pathology, 1993, 46:59.
40. Meyers WM. Mycobacterial infections of the skin. In: Doerr W, Uehlinger E, eds. Spezielle
Pathologische Anatomie [Annals of Internal Medicine], 2nd ed. Berlin, Springer-Verlag,
1995:291377.
41. Schutte D, Umboock A, Pluschke G. Phagocytosis of Mycobacterium ulcerans in the course of
rifampicin and streptomycin chemotherapy in Buruli ulcer lesions. British Journal of Dermatology,
2009, 160:273283.
42. Silva MT, Portaels F, Pedrosa J. Pathogenetic mechanisms of the intracellular parasite
Mycobacterium ulcerans leading to Buruli ulcer. Lancet Infectious Diseases, 2009, 9:699710.
43. Nienhuis WA et al. Paradoxical responses after start of antimicrobial treatment in Mycobacterium
ulcerans infection. Clinical Infectious Diseases, 2012, 54:519526.
44. OBrien DP et al. Paradoxical immune-mediated reactions to Mycobacterium ulcerans during
antibiotic treatment: a result of treatment success, not failure. Medical Journal of Australia, 2009,
191:564566.
45. Ruf MT et al. Histopathological changes and clinical responses of Buruli ulcer plaque lesions
during chemotherapy: a role for surgical removal of necrotic tissue? PLoS Neglected Tropical
46. Schutte D, Pluschke G. Immunosuppression and treatment-associated inammatory response
in patients with Mycobacterium ulcerans infection (Buruli ulcer). Expert Opinion on Biological
Therapy, 2009, 9:187200.
47. Beissner M et al. Spontaneous clearance of a secondary Buruli ulcer lesion emerging ten
months after completion of chemotherapy--a case report from Togo. PLoS Neglected Tropical
48. Ruf MT et al. Secondary Buruli ulcer skin lesions emerging several months after completion
of chemotherapy: paradoxical reaction or evidence for immune protection? PLoS Neglected
Tropical Diseases, 2011, 5:e1252 (doi: 10.1371/journal.pntd.0001252.).
49. OBrien DP et al. Paradoxical immune-mediated reactions to Mycobacterium ulcerans during
antibiotic treatment: a result of treatment success, not failure. Medical Journal of Australia, 2009,
191:564566.
50. Schutte D et al. Development of highly organized lymphoid structures in Buruli ulcer lesions
after treatment with rifampicin and streptomycin. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2007, 1(1):e2
(doi:10.1371/journal.pntd.0000002).
51. Acid-fast direct smear microscopy training package. Atlanta, GA, International Union Against
Tuberculosis and Lung Disease, World Health Organization, Association of Public Health
Laboratories, Research Institute of Tuberculosis, Japan Anti-Tuberculosis Association, United
States Agency for International Development, United States Centers for Disease Control and
Prevention, 2006 (Current Laboratory Practice Series).
52. Eddyani M et al. Multicenter external quality assessment program for PCR detection for
Mycobacterium ulcerans in clinical and environmental specimens. PLoS ONE, 2014 (DOI: 10.1371/
journal.pone.0089407).
53. Affolabi D. Development of simple and inexpensive tools for the control of mycobacterial diseases in a
low-resource country [dissertation]. Antwerp, University of Antwerp, 2009.
34|
|35
ANNEXES
36|
|37
ANNEXES
ANNEXE 1:
RECUEIL DES CHANTILLONS CLINIQUES
Pour tous les chantillons cliniques, il faudra recueillir les informations cliniques pertinentes pour
chaque patient, laide du formulaire UB 03 labor par lOMS (voir http://www.who.int/buruli/
control/FR_UB_03.pdf ou lAnnexe 9). Dans la prsente section, nous allons traiter uniquement de
la collecte des chantillons pour le diagnostic en routine des cas ou des patients. De nos jours, les
biopsies chirurgicales et les biopsies lemporte-pice sont rserves certaines indications (voir
Annexe 10).
1.1 PROCDURE DE PRLVEMENT DCHANTILLON PAR ASPIRATION LAIGUILLE FINE
Utiliser la technique daspiration approprie permet avec certitude dobtenir une quantit sufsante
de tissu. La technique optimale est explique et illustre par des photos et des vidos dans le guide
dapprentissage tape par tape sur laspiration laiguille ne (AAF) et le prlvement par couvillon,
consultable sur le site Web du consortium Stop Buruli
1
.
1.1.1 MATRIEL POUR LAAF
On a besoin du matriel suivant :
1. une seringue de 10 ml et des aiguilles de calibre 21, 22 ou 23 ;
2. des microtubes avec du milieu de transport liquide ; le milieu de transport utilis dpend du
laboratoire et du type danalyse pratiqu ; autrement dit, du fait que lchantillon sera mis
en culture, ou test uniquement par PCR (Polymerase Chain Reaction). Les chantillons qui
seront utiliss uniquement pour la PCR peuvent tre placs dans une solution dalcool et deau
distille (en proportions 1:1), dans du tampon phosphate (PBS), ou dans du tampon TE
(chlorhydrate de trisaminomthane [Tris] 10 mM plus acide thylnediaminettraactique
[EDTA] 1 mM) ;
3. des lames de verre ;
4. un crayon papier et un marqueur encre indlbile ;
5. des gants en latex striles usage unique ;
6. des boules de coton ;
7. de lalcool dsinfecter ;
8. du matriel de pansement.
Assurez-vous que tout est prt avant de continuer :
tiquetez les lames de verre avec un crayon papier (en indiquant le numro didentication
du patient et la date) ;
tiquetez les microtubes avec un marqueur encre indlbile (en indiquant le numro
didentication du patient et la date).
1.1.2 MTHODES
Votre environnement de travail doit tre aussi propre que possible.
Recueillez les antcdents mdicaux du patient et ralisez lexamen clinique. Expliquez au patient ce que
vous allez faire. Dites au patient que vous avez besoin de raliser un test appel aspiration laiguille
1
http://www.stopburuli.org/index.php/fr/FNA-e-tutorial.html
38|
ne, pour dterminer la cause de la lsion (nodule, plaque, dme ou ulcre) et pouvoir administrer
le traitement appropri. Expliquez-lui que vous allez introduire une ne aiguille dans la lsion. La
procdure pourra tre lgrement douloureuse mais prendra moins dune minute. Dites au patient
que vous allez recueillir deux chantillons an daugmenter les chances de dcouvrir ce qui cause ses
symptmes.

Expliquez que si les rsultats du test sont ngatifs, il faudra peut-tre refaire un autre test 1 ou 2
semaines plus tard, parce quon a parfois besoin de plus dun test pour obtenir des rsultats exacts.
Demandez au patient sil a des questions.

Lassistant(e) doit avoir prpar un plateau avec des compresses ou des boules de coton imbibes
dalcool, une aiguille de calibre G 21, 22 ou 23 encapuchonne sur laquelle est adapte une seringue,
un morceau de compresse sec, un sparadrap et un acon pour chantillon qui a t obtenu auprs
du laboratoire.
Avant de raliser laspiration, enlez des gants striles pour vous protger et protger le patient.
Assurez-vous de ne rien toucher qui pourrait contaminer vos mains gantes.
Nettoyez avec soin la lsion avec des compresses ou des boules de coton imbibes dalcool. Assurez-
vous de bien dsinfecter la surface de la lsion, en badigeonnant plusieurs fois sur la peau de haut en
bas. Palpez doucement la lsion. Localisez lendroit o le tissu est le plus mou, ou estimez la position
du centre de la lsion. Ce sera le site o vous allez insrer laiguille. Vous pouvez utiliser le marqueur
pour dlimiter la lsion et marquer le point o vous allez introduire laiguille.

Prenez la seringue et enlevez dlicatement son capuchon. Insrez laiguille dans la lsion, et faites
doucement pntrer laiguille dans le tissu sous-cutan. Une fois laiguille lintrieur du tissu, aspirez
compltement an de crer une pression ngative. Faites bouger lentement la seringue davant en
arrire tout en maintenant la pression daspiration. Modiez trois fois langle de laiguille, puis relchez
doucement laspiration. Veillez ne pas aspirer de sang dun vaisseau sanguin pendant lopration. Le
patient peut ressentir un peu dinconfort, vous aurez donc besoin de surveiller sa raction et de le
rassurer si ncessaire.

Retirez laiguille et appliquez un morceau de compresse sec pour arrter un ventuel saignement.
Rexaminez le site de ponction. Si le saignement persiste, appliquez un deuxime morceau de compresse
sec et un sparadrap.
Videz doucement le contenu de laiguille dans le acon fourni par le laboratoire, tiquetez les microtubes
avec un marqueur encre indlbile (en indiquant le numro didentication du patient et la date).
N.B. Pour aspirer les bactries, laiguille doit pntrer travers le tissu sous-cutan jusquau tissu
adipeux. Cest cet endroit que se situent les bactries dans les lsions non ulcratives.
Assurez-vous que seul le bout de laiguille (environ 1 cm) pntre dans le tissu sous-cutan. Si laiguille
est insre trop profondment, elle pntrera au-del du tissu sous-cutan et de laponvrose. Utilisez
une nouvelle aiguille et une nouvelle seringue si vous avez besoin de prlever un deuxime chantillon.
N.B. Seuls des mdecins expriments ou des agents de sant expriments devraient pratiquer lAAF ;
les agents de sant doivent tre sufsamment forms (formation continue) et encadrs pour pouvoir
amliorer leurs comptences.
|39
1.1.3 TRAITEMENT DUN CHANTILLON OBTENU PAR AAF
Sil est possible de raliser un examen au microscope sur place, une goutte de laspirt est dpose
sur une lame de verre (Annexe 4). Le reste est expuls dans le milieu de transport liquide (Annexe 2).
Aspirez dlicatement un peu de milieu de transport liquide dans laiguille puis jectez-le dans le
microtube. Pour tre sr que tout lchantillon a t transfr, recommencez cette opration trois fois.
Bouchez ensuite le microtube.
Faites attention ne pas vous blesser avec laiguille. Jetez la seringue et laiguille dans une bote
collectrice daiguilles. Lchantillon (accompagn dun formulaire UB 03 correctement rempli) doit tre
envoy ds que possible au laboratoire le plus proche.
N.B. Dans certains types de lsions, notamment les plaques, laspiration peut avoir lair dun tube sec
(cest--dire quil peut sembler ny avoir aucun aspirt visible dans la seringue). Malgr cela, certaines
cellules auront t prleves par laspiration.
1.2 PROCDURE DE PRLVEMENT DCHANTILLON PAR COUVILLON
Le prlvement par couvillonnage est une procdure simple, mais qui doit dabord tre explique au
patient.
1.2.1 MATRIEL POUR LCOUVILLONNAGE
1. de lalcool pour nettoyer la peau ;
2. un couvillon imprgn dalcool (un morceau de boule de coton ou de compresse plong
dans lalcool) ;
3. un couvillon strile sur un applicateur en bois ou en plastique ;
4. des gants en latex propres usage unique ;
5. un marqueur indlbile ;
6. du milieu de transport ; le milieu de transport utilis dpend du laboratoire et du type
danalyse pratiqu ; autrement dit, du fait que lchantillon sera mis en culture, ou test
uniquement par PCR.
1.2.2 MTHODES
Votre environnement de travail doit tre aussi propre que possible.
Recueillez les antcdents mdicaux du patient et ralisez lexamen clinique. Expliquez au patient ce
que vous allez faire. Dites au patient que vous avez besoin de prlever une petite quantit de tissu
de lulcre pour dterminer la cause de la maladie et pouvoir administrer le traitement appropri.
Expliquez que vous allez vous servir dun petit bout de coton sec sur un applicateur pour passer
doucement le coton sous les bords de lulcre, an de recueillir un peu de tissu. Dites au patient que
vous allez recueillir deux chantillons an daugmenter les chances de dcouvrir ce qui cause ses
symptmes. La procdure pourra tre lgrement dsagrable mais prendra moins dune minute.
Expliquez-lui que si les rsultats du test sont ngatifs, il faudra peut-tre refaire un autre test 1 ou 2
semaines plus tard, parce quon a parfois besoin de plus dun test pour obtenir des rsultats exacts.
Demandez au patient sil a des questions.
40|
Demandez votre assistant(e) de prparer un simple plateau avec un marqueur encre indlbile,
un coton-tige, un microtube avec du milieu de transport semi-solide, des gants en latex propres
usage unique, et un morceau de coton tremp dans de lalcool ou un dsinfectant. Avant deffectuer
lcouvillonnage, enlez des gants propres pour vous protger et protger le patient. Assurez-vous de
ne rien toucher qui pourrait contaminer vos mains gantes.
laide du coton imprgn dalcool ou de dsinfectant, nettoyez soigneusement deux fois la peau qui
entoure lulcre, en vitant la base de lulcre.
Prenez le coton mont sur lapplicateur, et insrez-le dlicatement sous les bords de lulcre. Faites
rouler lcouvillon et frottez les tissus situs sous les bords de lulcre, dans un mouvement de va-
et-vient et dans le sens des aiguilles dune montre. Introduisez dlicatement lcouvillon dans le tube
strile, et tiquetez le tube en indiquant le nom, lge et le sexe du patient ainsi que la date dobtention
de lchantillon.
1.3. RESSOURCES SUPPLMENTAIRES
Une documentation plus dtaille est consultable sur les sites Web du consortium Stop Buruli
1
et de
BuruliVac
2
.
1
http://www.stopburuli.org/index.php/fr/FNA-e-tutorial.html
2
http://www.burulivac.eu/index.php?id=17923
|41
ANNEXE 2:
MILIEUX DE TRANSPORT UTILISS EN VUE DANALYSES BACTRIOLOGIQUES
Plusieurs milieux de transport sont recommands pour les analyses bactriologiques ( savoir, lexamen
direct de frottis, la culture et lamplication gnique par PCR) : un milieu de transport liquide pour
lAAF, un milieu de transport semi-solide pour les couvillons et les biopsies, et un milieu de transport
polymyxine B, amphotricine B, acide nalidixique, trimthoprime et azlocilline (PANTA), utilisable pour
tous les types dchantillons.
Si seule une analyse PCR doit tre effectue sur lchantillon, les solutions suivantes sont galement
utilisables : du tampon phosphate (PBS, voir lAnnexe 5 pour la prparation), du tampon TE (Tris
chlorhydrate 10 mM plus EDTA 1 mM, pH 8,0), une solution de lyse cellulaire (par exemple,
commercialise par Qiagen), ou une solution dalcool et deau distille en proportions 1:1.
2.1 MILIEU DE TRANSPORT LIQUIDE
Les tapes permettant de prparer 200 ml de milieu de transport liquide sont donnes ci-dessous.
Bouillon de base de Dubos (numro de produit Becton Dickinson : 238510)
1. Ajouter 1,3 g de bouillon de base de Dubos 180 ml deau distille.
2. Chauffer pour dissoudre.
3. Striliser 121-124 C pendant 15 minutes avec un bouchon vis desserr.
4. Laisser refroidir en dessous de 50 C.
5. Ajouter dans des conditions dasepsie 20 ml dun supplment base dacide olique,
dalbumine, de dextrose et de catalase (OADC) (voir ci-dessous pour la prparation).
6. Ajouter dans des conditions dasepsie 5 ml de PANTA (voir ci-dessous pour la prparation).
7. Incuber le milieu complet 37 C pendant 24 heures pour vrier sa strilit.
8. Rpartir 1 ml dans des acons striles de 2 ml.
Les tapes permettant de prparer 1 litre de supplment OADC sont donnes ci-dessous.
Supplment OADC
1. Ajouter 0,6 ml dacide olique 50 ml dhydroxyde de sodium (NaOH) 0,05 N.
2. Agiter pendant environ 30 minutes.
3. Ajouter 50 g de fraction V de srumalbumine bovine (numro de produit Acros Organics :
94349-60-7).
4. Ajouter 920 ml deau distille.
5. Ajouter 15 ml de glucose.
6. Agiter pour dissoudre pendant environ 2 heures.
7. Ajuster le pH 6-7.
8. Filtrer.
9. Incuber pendant 24 heures 37 C pour tester la strilit du supplment.
N.B. Il est galement possible dutiliser le tube avec indicateur de croissance mycobactrienne BBL de
Becton Dickinson (galement connu sous le nom de MGIT) additionn du supplment denrichissement
OADC et du mlange dantibiotiques PANTA (numro de produit : 245116). Le PANTA lyophilis est
prt lemploi aprs reconstitution.
Les tapes permettant de prparer 5 ml de supplment antimicrobien PANTA sont donnes ci-dessous.
42|
PANTA (Becton Dickinson, numro de produit : 442188)
1. Mettre 5 ml deau distille dans 1 acon de PANTA lyophilis.
2. Ajouter au milieu de Dubos dans des conditions dasepsie.
N.B. Le milieu de transport liquide peut se conserver 2-8 C pendant un maximum de 6 mois.
2.2 MILIEU DE TRANSPORT SEMI-SOLIDE
Les tapes permettant de prparer 200 ml de milieu de transport semi-solide sont donnes ci-dessous.
1. Ajouter 1,3 g de bouillon de base de Dubos 180 ml deau distille.
2. Ajouter 1,0 g de glose (concentration nale, 0,5 % de glose).
3. Chauffer pour dissoudre.
6. Ajouter dans des conditions dasepsie 20 ml de supplment OADC (voir section 2.1 pour la
prparation).
7. Ajouter dans des conditions dasepsie 5 ml de PANTA (voir section 2.1 pour la prparation).
8. Incuber le milieu complet 37 C pendant 24 heures pour vrier sa strilit.
9. Rpartir 1 ml dans des tubes striles de 2 ml.
N.B. Le milieu de transport semi-solide peut se conserver 2-8 C pendant un maximum de 6 mois.
2.3 Milieu de transport PANTA
Les tapes permettant de prparer 246 ml de milieu de transport PANTA sont donnes ci-dessous.
1. Dissoudre 1,5 g de bouillon de base de Dubos dans 204 ml deau distille. Il nest pas ncessaire
de chauffer.
4. Filtrer du glycrol (1,2,3-propanetriol) sur une unit ltrante strile pour acons de type Bottle
Top (cette opration prend du temps cause de la viscosit du glycrol).
5. Ajouter au bouillon, dans des conditions dasepsie, 12 ml du glycrol strilis par ltration.

Albumine pour milieu de Dubos (numro de produit Becton Dickinson : 230910)
1. Ajouter au bouillon strile, dans des conditions dasepsie, 24 ml dalbumine pour milieu de Dubos.
PANTA (Becton Dickinson numro de produit : 245114)
1. Dissoudre deux acons de PANTA lyophilis en ajoutant 3 ml deau distille dans chaque.
2. Ajouter au mlange Dubos-glycrol, dans des conditions dasepsie, les 6 ml du PANTA dissous.
3. Incuber le milieu de transport PANTA pendant 24 heures 37 C pour tester sa strilit.
4. Ajouter dans des conditions dasepsie 500 l de milieu de transport PANTA dans des tubes
striles de 2 ml, ce qui permet de prparer des rcipients de transport prts lemploi.
N.B. Le milieu de transport PANTA peut se conserver 2-8 C pendant un maximum de 6 mois.
|43
ANNEX 3:
PRPARATION DES CHANTILLONS EN VUE DANALYSES BACTRIOLOGIQUES
On recommande les approches suivantes.
3.1 ASPIRATION LAIGUILLE FINE
1. Ensemencer lAAF dans le milieu de transport appropri (Annexe 2) de la manire dcrite
lAnnexe 1.
2. Bien mlanger au Vortex.
3.2. COUVILLONS
1. Cassez lextrmit dun couvillon et placer celle-ci dans un acon ou un tube de 5 ml
contenant des billes de verre, ou dans un tube contenant du milieu de transport.
2. Mettre en suspension les couvillons dans un petit volume de tampon phosphate ou de srum
physiologique ; le volume ncessaire dpend du nombre de tests effectuer.
N.B. Les couvillons maintenus dans du milieu de transport semi-solide doivent dabord tre
retirs du milieu puis placs dans du tampon phosphate ou du srum physiologique.
3.3 CHANTILLONS DE TISSUS PROVENANT DUNE BIOPSIE LEMPORTE-PICE OU DUNE
BIOPSIE CHIRURGICALE
1. Dcouper le tissu (frais ou dans du milieu de transport) en petits morceaux (par exemple
dans une bote de Ptri) laide dune lame de bistouri ou dune paire de ciseaux strile
usage unique ou strilisable en autoclave. N.B. Si le matriel doit tre rutilis, il doit tout
dabord tre plong dans une solution dsinfectante approprie, puis bross soigneusement
avant dtre strilis an dviter les contaminations croises, notamment pour la PCR. Les
dsinfectants recommands sont le glutaraldhyde alcalin 2 %, le phnol 5 %, les
dsinfectants base de phnol 10 % (par exemple : Dettol), liode 10 % ou lalcool 70 %.
2. Placer le tissu dcoup dans un acon ou un tube de 5 ml contenant des billes de verre.
3. Ajouter du tampon phosphate ou du srum physiologique ; le volume ncessaire dpend du
nombre de tests effectuer.
4. Bien mlanger (par exemple avec un agitateur Vortex).
N.B. On peut galement broyer la biopsie de tissu laide dun mortier et dun pilon ou dun broyeur
de Potter, striles.
N.B. Il faut faire soigneusement attention dviter les contaminations croises lorsquon nettoie les
instruments.
44|
ANNEXE 4:
EXAMEN DIRECT DES FROTTIS
4.1.1 AAF (VOIR LANNEXE 1 POUR PLUS DE DTAILS SUR LE PRLVEMENT DCHANTILLONS
PAR AAF)
1. laide dun crayon papier, marquer sur une lame de verre le numro de srie indiqu sur
le registre du laboratoire.
2. Dtacher dlicatement laiguille de la seringue.
3. Aspirer doucement un peu dair dans la seringue, puis reconnecter laiguille.
4. Faire avancer le piston de la seringue tout doucement pour jecter une goutte de laspirt sur
une lame de verre.
5. Prparer un frottis de laspirt sur la lame marque, scher lair, puis xer la chaleur en
faisant passer la lame travers une amme trois fois de suite.
4.1.2 COUVILLONS
2. Placer lcouvillon dans un acon ou un tube de 5 ml contenant des billes de verre.
3. Ajouter 2 ml de tampon phosphate (PBS).
5. Prparer un frottis de la suspension sur la lame marque, scher lair, puis xer la chaleur
en faisant passer la lame travers une amme trois fois de suite.
N.B. Si lon ne dispose pas de billes de verre, ni dagitateurs Vortex, on peut galement prparer un
frottis comme suit :
1. marquage dune lame de verre ;
2. dpt dune goutte deau physiologique sur la lame ;
3. essuyage de lcouvillon dans leau physiologique ;
4. schage lair et xation la chaleur en faisant passer la lame travers une amme trois fois de suite.
4.1.3 TISSU
2. Prparer un frottis de la suspension sur la lame, scher lair, puis xer la chaleur en faisant
passer la lame travers une amme trois fois.
N.B. On peut galement prparer les frottis directement partir du tissu sans le broyer (13).
4.2 COLORATION DE ZIEHLNEELSEN
En gnral, la mthode utilise localement pour le diagnostic en laboratoire de la tuberculose peut
galement tre utilise pour diagnostiquer la maladie cause par Mycobacterium ulcerans. Dans la plupart
des cas, il sagira de la mthode de coloration de ZiehlNeelsen chaud. Le rsultat du nombre de
BAAR observs dans un frottis devra tre exprim laide des mmes chelles de cotation que celles
utilises localement pour lexamen des frottis de crachats servant au dpistage de la tuberculose.
Les ractifs dcrits ci-dessous sont strictement rservs la mthode de ZiehlNeelsen chaud.
La mthode chaud est suprieure aux mthodes froid, telles que la coloration de Kinyoun.
|45
Les concentrations recommandes ici diffrent lgrement de celles que lon trouve couramment
ailleurs. La concentration en fuchsine est lgrement augmente, et celle en bleu de mthylne
diminue, de faon obtenir le meilleur contraste possible ( savoir, des bacilles dun rouge prononc
sur fond bleu ple). Dautres concentrations et les mthodes froid peuvent donner des rsultats
satisfaisants dans des conditions par ailleurs optimales. Nanmoins, lorsque ces autres conditions
(microscope, lumire, exprience du technicien) ne sont pas optimales, nous recommandons fortement
les concentrations donnes ci-dessous et la technique chaud pour obtenir un meilleur contraste.
4.2.1 RACTIFS
Les tapes permettant de prparer les ractifs sont donnes ci-dessous.
4.2.1.1 Solution de coloration base de fuchsine phnique 1 %
Cristaux de phnol 50 g
thanol ou mthanol 95 % 100 ml
Eau distille 50 ml
Fuchsine basique 10 g
Eau distille 800 ml
La meilleure faon de prparer une solution de fuchsine phnique (1 litre) est la suivante :
1. Mlanger 100 ml dalcool (thanol ou mthanol 95 %) avec 50 g de phnol dans un
erlenmeyer de 1 litre au minimum.
2. Ajouter environ 50 ml deau distille, mlanger nouveau.
3. Ajouter 10 g de fuchsine basique en poudre, mlanger jusqu dissolution complte.
4. Ajouter 800 ml deau distille, bien mlanger (par exemple par transfert plusieurs reprises
dans un second erlenmeyer de 1 litre si lon ne dispose pas dun volume plus grand).
Un agitateur magntique peut savrer utile. Il nest pas ncessaire de chauffer.
5. Conserver dans un acon en verre teint et hermtiquement bouch.
6. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (fuchsine phnique) et les dates de prparation
et dexpiration.
7. Filtrer lavance ou extemporanment.
N.B. Ce ractif peut se conserver temprature ambiante labri de la lumire solaire directe pendant
12 mois. Les autres modes de prparation de cette solution ne donnent pas toujours de bons rsultats
et ne sont pas recommands.
4.2.1.2 Solution de dcoloration
thanol 70 % (qualit technique) 97 ml
Acide chlorhydrique (HCl) concentr 3 ml
1. Ajouter avec prcaution lacide chlorhydrique concentr lthanol 70 %.
2. Il faut toujours verser doucement lacide dans lalcool et non linverse.
3. Conserver dans un acon en verre teint.
4. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (solution de dcoloration ou acide-alcool)
et la date de prparation.
Mise en garde : lacide chlorhydrique (HCl) est un produit irritant et doit tre manipul avec prcaution.
N.B. La solution de dcoloration peut tre conserve temprature ambiante pendant trs longtemps.
46|
4.2.1.3 Colorant de contraste
Chlorure de bleu de mthylne 0,1 g
Eau distille 100 ml
1. Dissoudre le chlorure de bleu de mthylne dans leau distille dans un acon en verre teint
et hermtiquement bouch.
2. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (solution de bleu de mthylne) et les dates
de prparation et dexpiration.
N.B. Le colorant de contraste peut se conserver temprature ambiante pendant 12 mois.
La Figure 28 montre une coloration ZN dun frottis sur lequel les BAAR apparaissent sous forme de
btonnets rouges sur fond bleu.
FIGURE 28. COLORATION ZIEHLNEELSEN DUN FROTTIS DUNE LSION DUN ULCRE DE BURULI
Les BAAR extracellulaires apparaissent en rouge sur fond
bleu. (Avec laimable autorisation de Marcus Beissner)
4.2.2 MTHODE
Prparer un frottis (ni trop pais ni trop n) partir de la suspension obtenue aprs avoir prpar
lchantillon de la manire indique lAnnexe 3. Un frottis qui convient signie que lon doit pouvoir
lire un texte imprim travers le frottis non color plac une certaine distance du texte.
1. Placer des lots de lames tiquetes sur des portoirs coloration, avec au maximum 12 lames
par lot. Veiller ce que les lames ne se touchent pas.
2. Recouvrir tout le frottis avec la fuchsine phnique ltre ; le plus simple pour ce faire est de
verser le colorant sur la lame au moyen dun entonnoir muni dun papier-ltre.
3. Chauffer doucement chaque lame jusqu ce que des vapeurs sen dgagent ; chauffer pendant
15 minutes. Le colorant ne doit ni scher, ni bouillir aucun moment.
4. Rincer doucement leau courante jusqu ce quil ny ait plus de colorant libre sur la lame.
5. Verser sur la lame la solution de dcoloration et laisser 3 minutes en contact.
6. Rincer soigneusement la lame leau. liminer lexcs deau sur la lame.
7. Recommencer les tapes 5 et 6 si le frottis est rest trop rouge.
8. Verser le colorant de contraste sur la lame.
9. Laisser agir ; en gnral la coloration de contraste prend au maximum 60 secondes.
10. Rincer soigneusement les lames leau. liminer lexcs deau sur les lames.
|47
11. Laisser les frottis scher lair. Ne pas employer de buvard. Garder les lames labri de la
lumire solaire directe. Les examiner le plus rapidement possible loculaire x8 ou x10 et
lobjectif x100 dun microscope optique et immersion dhuile (grossissement x800 ou x1000).
12. Aprs lecture des lames, enlever lhuile immersion en la laissant imprgner un mouchoir en
tissu ou du papier toilette. Conserver les lames dans des botes.
4.2.3 CHELLE DE COTATION POUR LA COLORATION ZIEHLNEELSEN EN MICROSCOPIE
Nombre de BAAR observs en moyenne Nombre de champs examiner Rsultat
0 pour 100 champs immersion 100 Aucun BAAR observ
11-9 pour 100 champs immersion
a
100 Noter le nombre exact
10-99 pour 100 champs immersion 100 +
1-10 par champ immersion 50 ++
> 10 par champ immersion
b
20 +++
BAAR, bacilles acido-alcoolo rsistants
a
Un rsultat infrieur 3 bacilles pour 100 champs risque de ne pas tre suivi de la positivit de la culture, mais doit tre signal.
b
Mycobacterium ulcerans forme souvent des amas de BAAR trs denses qui sont trop nombreux pour tre dnombrs avec exactitude. Quand
on observe des BAAR en nombres trs levs, le rsultat noter est +++ .
4.3 COLORATION AU FLUOROCHROME
Certains laboratoires utilisent la microscopie uorescence avec lauramine O pour diagnostiquer la
tuberculose. La microscopie uorescence est indique lorsque le nombre dchantillons journaliers
analyser dpasse les 30 chantillons par technicien de laboratoire. Il a t dmontr que les colorants
ZiehlNeelsen ou auramine O permettent dobtenir des rsultats quivalents pour dtecter M. ulcerans (13).
4.3.1 RACTIFS
Les tapes permettant de prparer les ractifs sont donnes ci-dessous.
4.3.1.1 Solution de coloration
Auramine O (solution 1)
Auramine en poudre 0.1 g
Dissoudre lauramine dans lthanol.
N.B. Lauramine tant cancrigne, il faut viter le contact direct avec la peau.
Phnol (solution 2)
Phnol en cristaux 3,0 g
Eau distille 87 ml
48|
Dissoudre les cristaux de phnol dans leau.
1. Mlanger ensemble la solution 1 et la solution 2.
2. Conserver dans un acon en verre teint et hermtiquement bouch, labri de la chaleur et
de la lumire.
3. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (auramine O) et les dates de prparation et
dexpiration.
N.B. La solution peut se conserver temprature ambiante dans une armoire ferme pendant un
maximum de 3 mois.
N.B. On observe habituellement la formation dun prcipit qui nest cependant pas un signe de
dgradation ; il faut nanmoins ltrer la solution avant de lemployer pour les colorations.
4.3.1.2 Solution de dcoloration
HCl concentr 0,5 ml
4. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (solution de dcoloration ou acide-alcool)
et la date de prparation.
N.B. La solution de dcoloration se conserve sans limitation de dure.
4.3.1.3 Colorant de contraste
Permanganate de potassium (KMnO
4
) 0,5 g
Eau distille 100 ml
1. Dissoudre le permanganate de potassium (KMnO
4
) dans leau distille dans un acon en verre
teint et hermtiquement bouch.
2. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (permanganate de potassium) et les dates

N.B. La solution peut se conserver temprature ambiante pendant un maximum de 3 mois.
N.B. La solution de KMnO
4
0,5 % donne un fond trs sombre, ce qui rend difcile la mise au point
sur le frottis. des concentrations plus faibles, elle nest pas aussi sombre, mais ces solutions plus
faibles sont alors instables et peu de laboratoires les utilisent.
|49
FIGURE 29. COLORATION DUN FROTTIS AVEC UN FLUOROCHROME (AURAMINE O)
Les BAAR apparaissent sous forme de btonnets jaune
vif sur fond sombre. (Avec laimable autorisation de
Alfred Michael Emmerson)
4.3.2 MTHODE
Prparer des frottis relativement pais partir de spcimens de biopsie homogniss. Ces frottis sont
plus faciles examiner car le fond est plus visible.
1. Placer les frottis tiquets sur un portoir coloration (par lots de 12 au maximum). Veiller
ce que les lames ne se touchent pas.
2. Verser le colorant sur les lames, laide dun entonnoir muni dun papier-ltre Whatman n 1.
Faire en sorte que tout le frottis soit recouvert dauramine O.
3. Laisser en contact 15 minutes en veillant ce que la solution de coloration reste bien sur les
frottis. N.B. Ne pas chauffer les lames.
4. Rincer leau puis liminer le liquide. On recommande habituellement leau distille, mais il
risque souvent de ne pas y en avoir sur le terrain. Lexprience de certains laboratoires a
montr que leau du robinet donnait toujours satisfaction. Leau dchlore (par exposition
lair libre pendant 24 heures) reprsente une autre possibilit.
5. Dcolorer pendant 2 minutes avec la solution dacide-alcool 0,5 %.
6. Rincer leau puis liminer le liquide.
7. Recouvrir les frottis de colorant de contraste pendant 2 minutes. Il est essentiel de respecter
ce temps, car un contact plus long risque daltrer la uorescence des BAAR.
8. Rincer leau puis liminer le liquide.
9. Laisser les frottis scher lair. Ne pas employer de buvard. Examiner les lames le plus
rapidement possible un grossissement x200-250 (oculaire x20 ou x25 et objectif x10).
10. Aprs les avoir lues, conserver les lames dans lobscurit (cest--dire dans une bote lames
ferme).
La Figure 29 est une coloration dun frottis avec un uorochrome (auramine O) ; les BAAR apparaissent
sous forme de btonnets jaune vif sur fond sombre.
50|
4.3.3 CHELLE DE COTATION POUR LA MICROSCOPIE FLUORESCENCE
Le nombre de BAAR indique linfectiosit du patient. Il est donc important de noter exactement ce
que vous observez.
Ce que vous observez (x200) Ce que vous observez (x400) Ce quil faut noter
Aucun BAAR sur une longueur Aucun BAAR sur une longueur Aucun BAAR observ
1-4 BAAR sur une longueur 1-2 BAAR sur une longueur Conrmation requise
*
5-49 BAAR sur une longueur 3-24 BAAR sur une longueur Rare
3-24 BAAR dans un champ 1-6 BAAR dans un champ +
25-250 BAAR dans un champ 7-60 BAAR dans un champ ++
> 250 BAAR dans un champ > 60 BAAR dans un champ +++

*
Conrmation par un autre technicien requise ou prparation dun autre frottis, colorer et lire.
|51
ANNEXE 5 :
CULTURE IN VITRO DE MYCOBACTERIUM ULCERANS
La culture in vitro de M. ulcerans comporte quatre tapes :
1. la prparation de lchantillon ;
2. la dcontamination de lchantillon (pour liminer les micro-organismes contaminants) ;
3. lensemencement et lincubation sur du milieu de LwensteinJensen, de Brown et Buckle ou
mileu dOgawa ;
4. lidentication de M. ulcerans.
Utiliser les suspensions prpares de la manire indique dans lAnnexe 3.
5.2 DCONTAMINATION DES CHANTILLONS
Le choix de la mthode de dcontamination, parmi toutes celles existantes, revient au laboratoire et
dpendra du degr de contamination des cultures au laboratoire.
5.2.1 MTHODE LACIDE OXALIQUE
5.2.1.1 Ractifs
Solution de digestion (solution de NaOH 4 %)
Pastilles de NaOH (pour analyse) 20 g
Eau distille 500 ml
1. Peser 20 g de pastilles de NaOH.
2. Dissoudre dans 500 ml deau distille dans une bouteille de 500 ml.
3. Striliser lautoclave 121 C pendant 15 minutes avec un bouchon vis desserr.
4. Une fois la solution refroidie, revisser le bouchon.
N.B. La solution de digestion peut se conserver 2-8 C pendant un maximum de 6 mois.
Solution de tampon phosphate (PBS)
Tampon phosphate 1 comprim
Eau distille 100 ml
1. Dissoudre 1 comprim de tampon phosphate dans 100 ml deau distille.
N.B. La solution de tampon phosphate peut se conserver 2-8 C pendant un maximum de 12 mois.
52|
Solution de vert malachite 0,2 %
Vert malachite 200 mg
Eau distille 100 ml
1. Dissoudre 200 mg de vert malachite dans 100 ml deau distille.
N.B. Cette solution peut se conserver 2-8 C pendant un maximum de 12 mois.
Solution dacide oxalique 5 %
Acide oxalique 5 g
Eau distille 100 ml
1. Dissoudre 5 g dacide oxalique dans 100 ml deau distille.
Solution de cycloheximide (actidione) 0,8 %
Cycloheximide 0,4 g
Eau distille 50 ml
1. Peser 0,4 g de cycloheximide.
2. Dissoudre le cycloheximide dans 50 ml deau distille.
3. Striliser lautoclave avec un bouchon vis desserr.
5.2.1.2 Mthode
N.B. Il faut effectuer toutes les manipulations dans des conditions striles an dviter la contamination
des ractifs et des chantillons.
N.B. Mettre des gants, et travailler dans une enceinte de scurit biologique.
1. Placer du papier absorbant sur la surface de travail de lenceinte de scurit et imbiber le papier
avec une solution dsinfectante approprie, telle quune solution de dsinfectant base
de phnol 10 % (par ex., Dettol). N.B. Toutes les manipulations de matriel contamin doivent
tre effectues sur ce papier pour viter les claboussures de gouttes, et pour pouvoir essuyer
et dsinfecter immdiatement tout liquide renvers.
|53
2. Mettre lchantillon dans un rcipient de 50 ml, tel quun tube Falcon (par exemple des tubes
commercialiss par Greiner Bio-One ou Becton Dickinson), et ajouter les ractifs suivants en
faisant attention ne pas toucher le tube si la mme pipette doit servir pour plus dun tube.
a. 5 ml de solution de vert malachite 0,2 %
b. 5 ml de solution de digestion de NaOH 1 N
c. 1 ml de solution de cycloheximide 0,8 %.
3. Mlanger au Vortex, puis laisser 30 minutes temprature ambiante.
4. Centrifuger pendant 15 minutes temprature ambiante 3500 x g.
5. liminer le surnageant dans un rcipient dchets liquides.
6. Ajouter 10 ml de solution dacide oxalique 5 % au produit sdiment.
7. Laisser 20 minutes temprature ambiante.
8. Centrifuger pendant 15 minutes temprature ambiante 3500 x g.
9. liminer le surnageant dans un rcipient dchets liquides.
10. Remettre en suspension le culot obtenu aprs dcontamination, en y versant quelques gouttes
deau distille strile, et en mlangeant manuellement la pipette ou au Vortex si ncessaire.
11. Ensemencer immdiatement le milieu de culture.
5.2.2 MTHODE LHYDROXYDE DE SODIUM (MTHODE DE PETROFF MODIFIE)
5.2.2.1 Prparation
Solution de NaOH 4 %
Pastilles de NaOH (pour analyse) 4 g
Eau distille 50 ml
1. Dissoudre la soude dans leau distille en chauffant.
2. Striliser lautoclave 121 C pendant 15 minutes.
N.B. Cette solution se conserve trs longtemps et on peut la garder au rfrigrateur, mais ce nest
pas obligatoire.
Eau physiologique strile
Pastilles de chlorure de sodium (NaCl) (pour analyse) 0,85 g
Eau distille strile 100 ml
1. Dissoudre le chlorure de sodium dans leau distille.
3. Conserver la solution au rfrigrateur.
N.B. Cette solution se conserve trs longtemps.
54|
5.2.2.2 Mthode
1. Pour 2 ml de suspension prpare partir de lchantillon (obtenu partir dcouvillon,
dAAF ou de tissu homognis) ajouter 2 ml de solution de NaOH 4 %.
2. Boucher hermtiquement le rcipient et agiter pour la digestion.
3. Laisser reposer 15 minutes temprature ambiante ; agiter de temps en temps.
4. Centrifuger 3000 x g pendant 15 minutes.
5. liminer le surnageant.
6. Ajouter 15 ml deau physiologique ou distille strile, et remettre en suspension le sdiment.
8. liminer le surnageant. Remettre en suspension le culot obtenu aprs dcontamination, en
y versant quelques gouttes deau distille strile, et en mlangeant manuellement la pipette
ou au Vortex si ncessaire.
9. Ensemencer le milieu de culture.
5.2.3 MTHODE LA N-ACTYL-L-CYSTINE
5.2.3.1 Prparation
Pour 100 ml de solution de N-actyl-L-cystine/NaOH
Solution de NaOH 4 % strile (voir section 5.2.2) 50 ml
Solution de citrate de sodium dihydrat 2,9 % strile 50 ml
N-actyl-L-cystine 0,5 g
1. Ajouter la solution de citrate de sodium la solution de soude.
2. Rpartir dans des acons bouchon vis.
4. Le jour de lutilisation, ajouter de la N-actyl-L-cystine 1 % dans le acon, et bien mlanger.
N.B. Le ractif nal doit tre employ dans les 24 heures car la N-actyl-L-cystine perd son activit
mucolytique si elle est conserve trop longtemps.
Pour 1 litre de tampon phosphate
Hydrognophosphate disodique (Na
2
HPO
4)
(anhydre) 4,74 g
Dihydrognophosphate de potassium (KH
2
PO
4
) (anhydre) 4,54 g
Eau distille 1000 ml
1. . Dissoudre 4,74 g de Na
2
HPO
4
et 4,54 g de KH
2
PO
4
dans 1000 ml deau distille.
N.B. Le tampon phosphate peut se conserver temprature ambiante ou dans un rfrigrateur ; il
est stable pendant 6 mois. Le tampon phosphate peut aussi tre prpar en utilisant un comprim de
tampon phosphate prt lusage comme dcrit dans le point 5.2.1.1.
Solution de Tween 80 5 %
Le Tween 80 est disponible sous forme de prparation prte lemploi.
|55
5.2.3.2 Mthode
1. Pour 1 ml de suspension prpare (jusqu 10 ml) partir de lchantillon (obtenu partir
dcouvillon, dAAF, ou de tissu homognis dans un rcipient de 50 ml), ajouter la
mme quantit de solution de N-actyl-L-cystine/NaOH.
2. Incuber en agitant vitesse moyenne pendant 15 minutes temprature ambiante.
3. Ajouter 10 ml de tampon phosphate (PBS) strile.
4. Ajouter 2 gouttes de Tween 80 5 %.
7. Ajouter 1 ml de tampon phosphate strile et remettre en suspension le sdiment.
8. Ensemencer le milieu de culture.
5.3 ENSEMENCEMENT DES MILIEUX DE CULTURE
5.3.1 PRPARATION DU MILIEU DE LWENSTEINJENSEN
5.3.1.1 Composants
Le milieu de LwensteinJensen est constitu de trois composants, qui sont prpars sparment puis
additionns pour donner le milieu :
1. La solution de sels minraux ;
2. La solution de vert malachite ;
3. Les ufs entiers homogniss.
La solution de sels minraux
(KH
2
PO
4
) 2,40 g
Sulfate de magnsium (MgSO
4
.7H
2
O) 0,24 g
Citrate de magnsium 0,60 g
Asparagine 3,60 g
Fcule de pomme de terre 30,00 g
Glycrol (qualit ractif) 12 ml
Eau distille 600 ml
1. Dissoudre les ingrdients dans lordre indiqu dans le tableau ci-dessus, en les chauffant dans
leau distille.
3. Laisser refroidir temprature ambiante.
N.B. Cette solution se conserve trs longtemps et doit tre garde au rfrigrateur.
La solution de vert malachite 2 %
Colorant vert malachite 2 g
Eau distille strile 100 ml
56|
Dans des conditions dasepsie, dissoudre le colorant dans leau distille strile en mettant la solution
dans une tuve pendant 1 2 heures.
N.B. Cette solution peut se conserver pendant un maximum de 12 mois, et peut prcipiter ou voir sa
couleur sattnuer. Dans les deux cas, jeter la solution et prparer une nouvelle solution.
Les ufs entiers homogniss
1. Nettoyer des ufs de poule frais de moins de sept jours, en les brossant soigneusement
leau chaude avec un savon alcalin.
2. Laisser tremper les ufs 30 minutes dans la solution savonneuse.
3. Les rincer soigneusement, puis les immerger 15 minutes dans de lthanol 70 %.
N.B. Ne pas oublier de se laver les mains avant de manipuler les ufs propres et secs.
4. Casser les ufs avec une lame strile dans un rcipient strile, puis les battre avec un fouet ou
un mixeur strile.
N.B. Il arrive parfois que les ufs contiennent des antibiotiques inhibant la croissance des mycobactries.
Il faut donc en connatre lorigine pour sassurer de leur qualit.
5.3.1.2 Prparation du milieu nal
Solution de sels minraux 600 ml
Solution de vert malachite 20 ml
ufs homogniss ( 20-25 ufs ) 1000 ml
N.B. Un agitateur magntique strile peut savrer utile pour mlanger les composants.
1. Rpartir 6-8 ml du milieu complet avec les ufs dans des acons de McCartney de 14 ou
28 ml ; ou en variante, rpartir des volumes de 20 ml de ce mme milieu dans des tubes
essai bouchon vis de 20 x 150 mm qui sont ensuite hermtiquement ferms.
2. Mettre le milieu coaguler (voir instructions ci-dessous) dans les 15 minutes qui suivent la
rpartition dans les tubes ou les acons, de faon viter la sdimentation des lments les
plus lourds.
paississement (coagulation du milieu)
1. Prchauffer lappareil coaguler 80 C de faon faire monter plus vite la temprature avant
dy mettre les acons.
2. Mettre les acons en position incline dans lappareil et laisser coaguler le milieu 80-85 C
pendant 45 minutes. Il ne faut pas chauffer de nouveau le milieu.
3. La qualit des milieux luf se dgrade si la coagulation est ralise une temprature trop
leve ou dure trop longtemps. La dcoloration ventuelle du milieu coagul peut tre le
rsultat dune temprature excessive. Lapparition de trous ou de bulles en surface indique
galement des problmes dans le processus de coagulation.
4. liminer les milieux de mauvaise qualit.
Vri cation de la strilit
Aprs coagulation et pour vrier la strilit, lensemble du lot ou un chantillon reprsentatif de
acons ou de tubes de culture est mis incuber 35-37 C pendant 2 semaines. Une souche de
rfrence peut galement tre ensemence dans le milieu pour vrier quelle prsente une croissance
satisfaisante.
|57
Conservation
Le milieu doit tre dat, puis il peut tre conserv au rfrigrateur pendant plusieurs semaines, dans
des acons ou des tubes hermtiquement bouchs de faon viter la dessiccation.
N.B. On obtient un rsultat optimal pour lisolement des mycobactries avec un milieu qui na pas t
gard 2-8 C plus de 6 mois.
5.3.2 PRPARATION DU MILIEU DE BROWN ET BUCKLE
Selon le volume de milieu prpar, on peut obtenir avec cette mthode environ 600 acons (6,5 litres)
ou 150 acons de milieux de cuture en pente (1,625 litres).
5.3.2.1 Matriel
2 prouvettes gradues de 1 litre striles ;
3 botes de acons de 30 ml en plastique bouchon vis et fond conique striles ;
6 portoirs pour 100 acons ;
un tuyau strile pour la pompe pristaltique.
5.3.2.2 Ractifs
Ractifs Pour 6,5 litres Pour 1,625 litres
Hydrogno-orthophosphate dipotassique anhydre (K
2
HPO
4
) 36 g 9 g
Dihydrogno-orthophosphate de potassium (KH
2
PO
4
) 12 g 3 g
Glose n 3 (Oxoid LP0013) 68 g 17 g
Glycrol 50 % 100 ml 25 ml
Eau distille 4,8 l 1,2 l
Additifs
Jaunes dufs striles (entre 90 et 95 ufs)
a
1,6 l 400 ml
Solution de vert malachite 2 % (ltre et strilise)
a
64 ml 16 ml

a
Voir ci-dessous pour les instructions de prparation
Jaunes dufs striles
1. Mettre les ufs dans un rcipient en acier inoxydable muni dun couvercle, et ajouter de
lalcool 70 % pour recouvrir les ufs. N.B. Lalcool 70 % vers peut tre rutilis pendant
1 mois sauf si les ufs se sont casss et que lalcool est devenu trouble.
2. Laisser en contact 30 minutes.
3. Sortir les ufs avec des pinces striles, et poser ceux-ci sur une serviette strile ; les laisser
scher lair sous une hotte ux laminaire.
4. Enler des gants chirurgicaux striles, puis casser chaque uf dans des conditions dasepsie
sur le bord dun bcher strile ; rcuprer le jaune en ltrant luf sur une main gante ou
laide dun sparateur de blanc et jaune duf strile.
5. Verser le jaune duf dans une prouvette gradue de 1 litre strile et jeter le blanc.
6. Lorsque lprouvette est remplie jusquau repre voulu (cest--dire, 400 ml ou 800 ml selon le
volume de milieu prpar), agiter doucement avec un pilon strile pour homogniser les jaunes.
N.B. Il est possible deffectuer cette opration un jour lavance, et les jaunes peuvent tre gards
4 C pendant une nuit avant dtre utiliss le lendemain au plus tard. Il faut amener les jaunes
temprature ambiante avant de les utiliser.
58|
Solution de vert malachite 2 %
1. Peser 10 g de vert malachite.
2. Dissoudre le vert malachite dans 500 ml deau distille.
3. Poser le tout sur un agitateur pendant 1 heure.
5. Laisser refroidir jusqu 50 C.
6. Filtrer sur un ltre Sartorius P20 Plus (numro au catalogue : 18056 D) ou quivalent laide
dune pompe pristaltique et dun tuyau strile.
7. Conserver dans un acon strile.
N.B. Le vert malachite va garder des particules insolubles sil nest pas pass en autoclave puis ltr.
5.3.2.3 Mthode (prparation des milieux)
Au moyen dun automate de prparation de milieux de culture :
1. Mesurer 4,8 litres deau distille et 100 ml de glycrol 50 % et mettre ces deux solutions
dans la cuve dun automate de prparation de milieux (tel que lautoprparateur S8000 dAES
Chemunex, ou quivalent) ;
2. Peser les sels et la glose ; les introduire dans la cuve ;
3. Mlanger et laisser simprgner 10 minutes ;
4. Mesurer le pH et noter sa valeur ;
5. Striliser 121 C pendant 15 minutes ;
6. Laisser refroidir jusqu 56 C pendant au moins 45 minutes pour parvenir refroidir le haut
de lautoprparateur ;
7. Ajouter dans des conditions dasepsie les jaunes dufs striles et le vert malachite dans
lautoprparateur et laisser le mlange se faire ;
8. Modier la temprature de coule et la rgler sur 60 C, et distribuer dans des conditions
dasepsie 9 ml de milieu dans des tubes laide dune pompe pristaltique et dun tuyau strile ;
9. Mettre les acons encore chauds en position incline dans des portoirs qui contiennent 100
acons, et laisser solidier ;
10. Rincer le tuyau leau chaude immdiatement aprs emploi pour viter la solidication de la
glose ;
11. Mesurer et noter le pH. Le pH doit tre compris entre 6,8 et 7,0. Si le pH nest pas correct,
jeter les milieux de culture ;
12. Etiqueter et dater les acons ;
13. Prlever le nombre requis de milieux de culture pour les tests de contrle de la qualit.

N.B. Le milieu doit tre de couleur vert olive ple.
N.B. La dure de conservation du milieu de Brown et Buckle est de 6 mois temprature ambiante.
5.3.2.4 Contrle de la qualit
Avant dutiliser le milieu, un chantillon reprsentatif des acons de culture est mis incuber
35-37 C pendant 2 semaines pour vrier leur strilit.
|59
5.3.3 PRPARATION DU MILIEU DOGAWA
Le milieu dOgawa est appel milieu dOgawa 1 % , 2 % ou 3 % selon la concentration de
phosphate monopotassique (KH
2
PO
4
) dans la solution de sels minraux. Pour le diagnostic de lulcre
de Buruli au laboratoire ou dautres infections mycobactries non tuberculeuses, on utilise le milieu
dOgawa 2 %.
5.3.3.1 Matriel
2 prouvettes gradues de 200 ml striles et 2 erlenmeyers de 500 ml striles ;
2 entonnoirs striles et 3 morceaux (30 x 30 cm) de gaze de coton strile ;
un agitateur magntique strile, un bcher strile et 2 cuillres en acier inoxydable striles ;
40-45 tubes essai bouchon vis striles (18 x 180 mm).
5.3.3.2 Composants
Le milieu dOgawa est constitu de trois composants, qui sont prpars sparment puis additionns
pour donner le milieu :
1. La solution de sels minraux ;
2. La solution de vert malachite ;
3. Les ufs entiers homogniss.
N.B. La solution de sels minraux et la solution de vert malachite sont prpares sparment, et
peuvent se conserver longtemps au rfrigrateur. La solution dufs entiers est prpare au besoin.
La solution de sels minraux
Phosphate monopotassique (KH
2
PO
4
) 2,0 g
Glutamate monosodique 0,5 g
Citrate de magnsium 0,1 g
Amidon soluble (qualit ractif) 3,0 g
Pyruvate de sodium 0,2 g
Eau distille 100 ml
1. Dissoudre tous les composants indiqus dans le tableau ci-dessus.
La solution de vert malachite 2 %
Oxalate de vert malachite 1 g
Eau distille 50 ml
Preparer la solution de vert malachite comme dcrit ci-dessus (voir 5.3.2.2).
N.B. Cette solution na pas besoin dtre compltement dissoute ; elle sera ajoute la solution dufs
entiers laide dune pipette bout large qui permettra de transvaser la poudre insoluble.
60|
Les ufs entiers homogniss
1. Faire tremper les ufs pendant 10 minutes dans de lthanol 70 % ; les laisser scher lair
sous une hotte ux laminaire.
2. Casser les ufs dans un bcher strile laide dune cuillre en acier inoxydable strile, puis les
mlanger en utilisant une autre cuillre en acier inoxydable strile.
3. Filtrer la solution dufs entiers sur de la gaze de coton strile plie en deux paisseurs dans un
entonnoir strile qui est plac sur une prouvette strile de 200 ml.
5.3.3.3 Mthode (prparation du milieu)
Solution de sels minraux 100 ml
Glycrol (qualit ractif) 4 ml
Solution de vert malachite 4 ml
ufs homogniss (5 6 ufs) 200 ml
1. Mlanger tous les ractifs dans un erlenmeyer de 500 ml strile avec un agitateur magntique
strile, et ltrer sur de la gaze de coton strile plie en deux paisseurs dans un entonnoir
strile.
2. Rpartir 7 ml du milieu complet avec les ufs dans des tubes essai bouchon vis striles
(18x180 mm), puis boucher les tubes (sans trop serrer).
3. Contrler les milieux avant la coagulation. Enlever la mousse des milieux en crevant les bulles
avec une aiguille chauffe ou en aspirant les bulles avec une pipette strile. Il est possible de
conserver les tubes dans cet tat pendant une nuit.
4. Mettre chauffer lappareil coaguler 70 C.
5. Mettre les tubes en position incline dans lappareil et laisser coaguler les milieux 90 C
pendant 60 minutes.
6. Faire refroidir les milieux dans un bain deau immdiatement aprs la coagulation.
7. liminer les milieux de mauvaise qualit.
Vri cation de la strilit
Aprs coagulation et pour vrier la strilit, lensemble du lot ou un chantillon reprsentatif de
acons ou de tubes de culture est mis incuber 35-37 C pendant 2 semaines. Une souche de
rfrence peut galement tre ensemence sur le milieu pour vrier quelle prsente une croissance
satisfaisante.
Conservation
Le milieu doit tre dat, puis il peut tre conserv au rfrigrateur pendant plusieurs semaines, dans
des acons ou des tubes hermtiquement bouchs de faon viter la dessiccation.
5.4 ENSEMENCEMENT ET INCUBATION DES MILIEUX DE CULTURE
1. Ensemencer environ 0,2 ml de lchantillon sur chaque tube de milieu de LwensteinJensen,
de Brown et Buckle ou Ogawa.
2. Disperser la suspension ensemence sur tout le milieu en remuant doucement les tubes.
3. Laisser les tubes en position incline pendant une nuit dans un endroit o ils seront labri
de la lumire.
4. On peut les laisser en position incline sur la paillasse temprature ambiante ou dans une
tuve.
|61
5. Incuber le milieu ainsi ensemenc dans une tuve 33 C (30-35 C) pendant 6 mois (jusqu
9 mois parfois pour certains chantillons).
6. Au bout de 1 semaine dincubation, examiner les tubes pour voir sil y a eu dveloppement ;
laide dune lampe, rechercher la prsence dune ventuelle contamination ou croissance trop
prcoce. Une croissance douteuse peut tre contrle au microscope pour vrier sa puret.
Les tubes contamins devront tre jets (aprs enregistrement).
7. On peut repiquer les colonies mycobactriennes an dobtenir une croissance abondante, ou
les identier directement.
8. Les tubes dans lesquels on nobserve aucun dveloppement peuvent tre incubs plus
longtemps.
9. Au cours des 6 mois qui suivent, observer les cultures toutes les 1 2 semaines de la manire
dcrite ci-dessus. Le temps dincubation maximum pour lisolement primaire (ou primoculture)
de M. ulcerans est de 12 mois. Aprs cette priode, on considre que tous les tubes dans lesquels
rien ne sest dvelopp sont ngatifs.
5.5 IDENTIFICATION DE M. ULCERANS
M. ulcerans appartient au groupe des mycobactries croissance lente. Les cultures primaires deviennent
en gnral positives aprs 6 12 semaines dincubation, et les repiquages deviennent en gnral
positifs aprs 3-4 semaines dincubation 29-33 C sur du milieu de LwensteinJensen, de Brown et
Buckle ou Ogawa. Les colonies voquant M. ulcerans apparaissent jauntres, rugueuses et bords bien
dmarqus. Les souches africaines et japonaises sont plus jauntres que les australiennes (Figure 1), qui
ont une couleur crme.
Lidentication de M. ulcerans se fait par PCR. La squence cible la plus frquemment utilise pour la
conrmation par PCR de lulcre de Buruli est la squence dinsertion IS2404. LADN issu des cultures
primaires ou des repiquages est extrait par mise en suspension de quelques colonies dans du tampon
TE (Tris chlorhydrate 10 mM plus EDTA 1 mM, pH 8,0), et chauffage pour les inactiver 100 C
pendant 8-10 minutes.
Les procdures permettant dextraire lADN des cultures et de dtecter lADN de M. ulcerans par PCR
sont dcrites lAnnexe 6 ci-aprs.
62|
ANNEXE 6:
PROTOCOLES DE LAMPLIFICATION GNIQUE (PCR)
6.1 VITER LES FAUX-POSITIFS : LE PRINCIPE DES TROIS SALLES
Le risque de rsultats faux-positifs au cours des ractions PCR est bien rel. Lors de la ralisation de
la PCR, il est crucial dviter les faux-positifs dus des contaminations. An de minimiser le risque
de rsultats faux-positifs, il faut respecter des rgles strictes pour ce qui concerne les vtements,
les chantillons, les ractifs, le matriel dcriture, et la prparation des chantillons. Il est important
deffectuer lextraction dADN des cultures et des chantillons cliniques en utilisant des ractifs et du
matriel rservs cet usage.
Il convient de suivre le principe des trois salles.
Salle 1 :
strictement pas dextraits dADN, de matrices ou damplicons ;
salle rserve la prparation du mlange ractif pour la PCR.
Salle 2 :
salle faible niveau dADN (pas damplicons PCR) ;
prparation des chantillons de tissu et des couvillons pour la PCR ;
travail effectu dans une enceinte de scurit biologique de classe II ou une enceinte pour PCR.
Salle 3 :
salle haut niveau dADN (amplicons PCR prsents en nombres de copies levs) ;
salle o ont lieu lamplication gnique et les manipulations aprs la raction PCR ;
manipulation des gels dagarose.
N.B. Le matriel, les vtements, les ractifs, les chantillons et le matriel dcriture ne doivent pas tre
dplacs de la salle 3 aux salles 1 ou 2, ni de la salle 2 la salle 1.
Mthodes gnrales
Le port de la blouse et des gants de laboratoire est obligatoire dans chaque salle ; de plus, les
blouses doivent rester affectes des salles bien prcises autrement dit, les blouses de
laboratoire pour la salle 1 ne doivent tre portes que dans la salle 1.
Les dsinfectants, de mme que les rayons UV, dgradent lADN et lARN. La dsinfection
et le traitement des surfaces de travail aux UV peuvent donc rduire le risque de contaminer
les chantillons par de lADN ou de lARN.
la n de toute manipulation, les paillasses situes dans la zone dextraction de lADN
doivent tre nettoyes avec une solution dsinfectante et traites aux UV.
Les salles rserves lextraction dADN doivent tre nettoyes toutes les semaines avec
une solution deau de javel 0,5-1 % ; les plans de travail doivent tre nettoys avec une
solution dthanol 50 %.
N.B. Leau distille doit tre change tous les mois.
|63
6.2 VUE GNRALE DU PROTOCOLE DE DIAGNOSTIC PAR PCR
Le protocole de la PCR pour le diagnostic de la maladie cause par M. ulcerans comporte quatre tapes :
1. la prparation de lchantillon ;
2. lextraction de lADN ;
3. lamplication gnique par PCR (PCR en gel traditionnelle ou PCR en temps rel) ;
4. lassurance de la qualit.
Pour lanalyse par PCR, on peut utiliser des suspensions prpares en vue danalyses bactriologiques,
telles que dcrites lAnnexe 3, ou des chantillons mis dans lalcool, dans un tampon phosphate salin
ou dans un tampon TE (10mM TRIS chlorhydrate plus 1mM EDTA pH 8,0) ou une solution de lyse
cellulaire.
N.B. Si on utilise comme tampon de transport une solution de lyse cellulaire (par exemple commercialise
par Qiagen), on peut soumettre les chantillons une inactivation directe par la chaleur, et la faire
suivre dune extraction dADN laide de la procdure Gentra Puregene de Qiagen (voir 6.4.2).
N.B. Il faut toujours inclure dans lensemble de la procdure un tmoin ngatif dans du tampon
phosphate (pour lextraction Qiagen dans une solution de lyse cellulaire respectivement).
La procedure pour les chantillons prpars comme indiqu dans lAnnexe 3 est la suivante :
AAF
1. Transvaser 0,5 ml dchantillon dans un tube microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Laver (voir ci-dessous).
couvillons et chantillons de tissu
1. Transvaser 1 ml dchantillon dans un tube microcentrifugation de 1,5 ml.
2. Laver (voir ci-dessous).
Lavage
1. Passer le tube de 1,5 ml la microcentrifugeuse pendant 10 minutes grande vitesse.
2. liminer avec prcaution le tampon phosphate.
3. Laver le culot avec 1 ml de tampon phosphate, puis centrifuger pendant 10 minutes.
4. liminer avec prcaution le tampon phosphate et remettre en suspension le culot dans 180 ml
deau distille.
N.B. Leau distille doit tre conserve dans une bouteille en Ton et change tous les mois.
Blocs de paraf ne
1. Transfrer des coupes de tissu incluses dans la parafne dau moins 6 x 20 m dpaisseur
(dcoupes laide dun microtome strile, ou prleves avec prcaution dans le bloc laide
dune lame de bistouri strile) dans un tube bouchon vis de 1,5 ml.
2. Ajouter 1 ml dHistolne ou de xylne et incuber temprature ambiante jusqu ce que
la parafne se soit dissoute (1-5 minutes). N.B. il faut inclure un tube tmoin de ractif, donc
ne contenant pas de coupes de parafne.
3. Centrifuger les tubes vitesse maximale dans une microcentrifugeuse pendant 5 minutes pour
obtenir un culot de tissu.
64|
4. liminer le surnageant avec une pipette de transfert pointe ne, en faisant attention ne pas
toucher le culot.
5. Jeter le surnageant dans un rcipient prvu pour les solvants volatils.
6. Remettre en suspension le culot dans 1 ml dthanol absolu et incuber pendant 5 minutes
temprature ambiante.
7. Centrifuger vitesse maximale pendant 5 minutes.
8. liminer le surnageant avec une pipette de transfert pointe ne, en faisant attention ne pas
toucher le culot ; laisser rapidement scher lair.
9. Extraire lADN du tissu en utilisant la mthode de Maxwell ou la procdure Gentra Puregene
comme dcrit ci-dessous.
6.4 MTHODES DEXTRACTION DE LADN
Lextraction dADN a pour but :
dinactiver les agents infectieux ;
de purier et de concentrer lADN mycobactrien dans les chantillons cliniques en vue dune
analyse par PCR.
N.B. LADN issu des cultures est extrait par mise en suspension de quelques colonies dans du tampon
TE (Tris chlorhydrate 10 mM plus EDTA 1 mM, pH 8,0), et chauffage pour les inactiver 100 C
pendant 8-10 minutes.
6.4.1. MTHODE DE MAXWELL
6.4.1.1 Prparation
Tampon de lyse
Chlorhydrate de trisaminomthane (Tris HCl) 1 M, pH 7,5 0,5 ml
NaCl (5 M) 100 l
EDTA (0.5 M) 1 ml
Dodcylsulfate de sodium 10 % 2,5 ml
Eau distille 46,9 ml
Mlanger ensemble les solutions ci-dessus, dans lordre indiqu.
N.B. Le tampon de lyse peut se conserver 4 C pendant 6 mois.
Protinase K (20 mg/ml)
Proteinase K 1000 mg
Eau distille 50 ml
1. Dissoudre la protinase K dans leau.
2. Aliquoter 1 ml par tube.
N.B. La protinase K peut se conserver -20 C pendant un maximum de 2 ans.
|65
6.4.1.2 Mthode
1. Ajouter 50 l de protinase K 200 l de tampon de lyse.
2. Ajouter 250 l de ce mlange (tampon de lyse plus protinase K) 200 l de suspension
dchantillon.
3. Chauffer 62 C et agiter rgulirement pendant au moins 3 heures (de prfrence pendant
toute une nuit).
4. Utiliser 400 l du mlange avec la trousse de purication dADN partir de tissu Maxwell
16 Tissue DNA Purication Kit (commercialise par Promega, Leiden, Pays-Bas) et lappareil
Maxwell 16 (galement commercialis par Promega) en suivant les instructions du fabricant.
N.B. Le volume nal de lextrait dADN est de 300 l. Conserver lextrait dADN une temprature
infrieure ou gale 18 C, ou une temprature comprise entre 2 et 8 C sil est prvu des analyses
supplmentaires qui seront acheves dans les 2 jours qui suivent.
6.4.2 MTHODE GENTRA PUREGENE
La mthode dextraction Gentra Puregene Cell Kit de Qiagen peut tre utilise pour tous les types
dchantillons cliniques et de matriel de culture.
6.4.2.1 Ractifs
La trousse dextraction dADN Puregene contient :
une solution de lyse cellulaire, qui peut galement tre utilise comme tampon de transport ;
une solution dhydratation dADN ;
une solution de prcipitation des protines ;
du lysozyme (10 mg/ml) ;
de la protinase K (20 mg/ml).
Les alcools suivants sont galement requis :
thanol 70 % ;
isopropanol (2-propanol).
6.4.2.2 Prparation
1. Prparer un tube ractionnel destin servir de tmoin dextraction ngatif, en ajoutant
700 l de solution tampon de lyse cellulaire dans un tube microcentrifugation de 2.0 ml. Ce
tmoin sera trait de la mme faon que les chantillons cliniques mais ne doit contenir aucun
matriel de diagnostic.
2. Pour extraire lADN de M. ulcerans des chantillons cliniques, mettre les couvillons et les
biopsies de 3 mm dans 700 l de solution de lyse cellulaire, et les chantillons dAAF
(le contenu de la seringue) dans 300 l de solution de lyse cellulaire.
3. Pour extraire lADN de M. ulcerans partir des cultures, prlever du matriel de culture
laide dune seule anse ensemencer, et ajouter cette anse dans 700 l de solution de lyse
cellulaire.
4. Chauffer pour inactiver les chantillons cliniques, en les incubant 95 C pendant 20 minutes.
6.4.2.3 Mode opratoire
Les tapes doivent se drouler dans lordre indiqu ci-dessous.
66|
tape A. Lyse cellulaire
Pour les AAF, biopsies lemporte-pice et chantillons de tissu
1. Ajouter 10 l de protinase K (cest--dire, 20 mg/ml) chaque chantillon et incuber dans
le Thermomixer 55 C vitesse moyenne pendant une nuit jusqu la lyse complte du tissu.
2. Inactiver la protinase K par incubation dans le Thermomixer 80 C pendant 20 minutes.
4. Ajouter 15 l de lysozyme (cest--dire, 10 mg/ml) et incuber dans le Thermomixer 37 C
vitesse moyenne pendant 1 heure.
Pour les prlvements par couvillon et le matriel de culture
1. Ajouter 15 l de lysozyme (cest--dire, 10 mg/ml) aux chantillons et incuber dans le
Thermomixer 37 C vitesse moyenne pendant 1 heure.
2. Ajouter 10 l de protinase K (cest--dire, 20 mg/ml) aux chantillons et incuber dans le
Thermomixer 55 C vitesse moyenne pendant 4 heures (ou une nuit) jusqu la lyse
complte.
3. La protinase K est inactive par incubation 80 C pendant 20 minutes.
tape B. Prcipitation des protines
1. Mettre les chantillons dans un bain de glace pendant 5 minutes.
2. Ajouter 230 l de solution de prcipitation de protines.
3. Agiter vigoureusement au Vortex vitesse leve pendant 20 secondes pour obtenir un
mlange homogne.
4. Mettre les chantillons dans un bain de glace pendant 5 minutes.
5. Centrifuger 13000 x g pendant 5 minutes. Les protines prcipites vont former un culot
dense. Si le culot nest pas dense, recommencer les tapes 3 5.
6. Prparer le nombre appropri de nouveaux tubes microcentrifugation de 2 ml contenant
700 l disopropanol.
tape C. Prcipitation de lADN
1. Verser le surnageant contenant de lADN dans un tube microcentrifugation de 2 ml propre
contenant 700 l disopropanol (laisser de ct le culot de protines prcipites).
2. Mlanger en retournant doucement le tube 10 fois.
5. Ajouter 700 l dthanol 70 %, et retourner les tubes pour laver les culots dADN.
6. Centrifuger 13000 x g pendant 5 minutes. liminer soigneusement lthanol. Le culot peut
se dtacher, donc il faut verser lthanol lentement tout en surveillant le culot.
7. Retourner et vider le tube sur un papier absorbant propre (poser chaque tube un endroit
diffrent), et laisser scher lair, ou faire scher dans le Thermomixer 65 C jusqu ce
que le tube soit compltement sec (environ 20 minutes). N.B. Lthanol doit imprativement
tre compltement vapor, sinon il se peut quil inhibe la PCR.
tape D. Hydratation de lADN
1. Ajouter 200 l de solution dhydratation dADN (ou 50 l pour les chantillons obtenus par
AAF) chaque chantillon.
2. Rhydrater lADN par pipetage soigneux de haut en bas et inversement environ 20 fois.
3. Incuber dans le Thermomixer 65 C pendant 30 minutes.
|67
6.5 AMPLIFICATION GNIQUE PAR PCR
La PCR amplie de manire exponentielle lADN cible. Cette amplication se fait par une raction cyclique
entre diffrentes tapes conduites diffrentes tempratures. Les tempratures sont propres chaque
tape et chaque raction PCR, et dpendent essentiellement de la squence nuclotidique des amorces :
dnaturation : forme lADN simple brin (gnralement effectue 94 C) ;
hybridation : permet aux amorces de shybrider (gnralement effectue 50-70 C) ;
extension : prolonge la chane dADN complmentaire (gnralement effectue 72 C).
La raction PCR ncessite galement lutilisation de tampons corrects et la prsence de lADN cible,
de dsoxynuclotides triphosphates (dNTP) et dune enzyme, le plus souvent la Taq polymrase, une
enzyme thermostable provenant de Thermus aquaticus.
On considre que la raction PCR a fonctionn seulement si le tmoin de PCR positif et le tmoin de
PCR ngatif donnent le rsultat voulu.
LADN peut tre ampli par la PCR traditionnelle en gel ou par la PCR en temps rel.
6.5.1 PCR TRADITIONNELLE EN GEL
On ralise une simple dtection visuelle des amplicons au moyen dune lectrophorse en gel dagarose
suivie dune coloration au bromure dthidium.
N.B. Le bromure dthidium est un agent mutagne trs puissant qui doit donc tre manipul avec
prcaution.
6.5.1.1 PCR en un seul cycle
La PCR en un seul cycle comporte quatre tapes qui consistent :
1. prparer le mlange ractionnel ( master-mix ) ;
2. ajouter lADN matrice (tel que prpar dans la section 2 de cette annexe) ;
3. faire lamplication ;
4. visualiser le produit damplication.
tape A. Prparer le mlange ractionnel (au moyen, par exemple, de ractifs fournis par Promega)
On trouvera ci-dessous les quantits sufsantes pour une seule raction (en pratique, elles sont
multiplies pour permettre la ralisation de 10 ractions PCR ou plus).
Ractif (concentration de dpart) Quantit ajouter (en l)
Eau distille 9
Tampon Thermo (10 x) 2
Chlorure de magnsium (MgCl
2
) (25 mM) 1,2
dNTPs (2 mM) 2
Amorce 1 de M. ulcerans
a
(20 M) 1
Amorce 1 de M. ulcerans
a
(20 M) 1
Taq polymrase (5 units/l) 0,2
dNTP, dsoxynuclotides triphosphates.
a
M. ulcerans 1 GAT CAA GCG TTC ACG AGT GA.
b
M. ulcerans 2 GGC AGT TAC TTC ACT GCA CA.
68|
Ces quantits permettront dobtenir 16,4 l de mlange ractionnel; produit habituellement en
volumes de 164 l ou plus, on le rpartit ensuite en parts aliquotes dans plusieurs tubes.
tape B. Ajouter lADN matrice dans les tubes contenant le mlange ractionnel
1. Mettre 15 l de mlange ractionnel dans chaque tube de PCR.
2. Ajouter 5 l dADN tester ; on obtient alors dans chaque tube un volume total de 20 l.
3. Dans chaque essai, il faut toujours inclure des tmoins positifs et des tmoins ngatifs pour
la PCR.
4. Vrier la prsence ventuelle dinhibiteurs de la PCR dans chaque chantillon.
tape C. Faire lamplication
Lamplication se fait dans un thermocycleur automatis en suivant le protocole qui suit :
94 C pendant 4 minutes
94 C pendant 40 secondes
60 C pendant 40 secondes 35 cycles
a

72 C pendant 40 secondes
72 C pendant 5 minutes
4 C maintenir lchantillon cette temprature jusqu ce quil soit prt pour llectrophorse
en gel dagarose.

a
Un cycle comprend les trois phases (ou tempratures) indiques par laccolade.
tape D. Visualiser le produit damplication
1. Pour visualiser le produit de la PCR, 9 l des produits de la raction plus 1 l de tampon
dchantillon sont soumis une lectrophorse en gel dagarose 2 % contenant du bromure
dthidium 0,5 g/ml (voir notes ci-dessous).
2. Les gels sont prpars dans un tampon TAE (Tris base/actate 40 mM plus EDTA 1 mM), et
on leur applique une tension par exemple de 100 V pendant 20 minutes (en fonction de
lappareil utilis).
3. Visualiser les produits de la PCR colors au bromure dthidium sous clairage UV
(transilluminateur).
4. Les chantillons sont considrs comme positifs sils donnent un fragment 515 paires de
bases correspondant exactement au tmoin positif.
5. Tous les tmoins ngatifs doivent tre ngatifs.
6. Un rsultat ngatif pour lchantillon consacr lpreuve dinhibition (voir ci-dessus)
indique que la PCR a t inhibe. Il faut alors recommencer la procdure avec une dilution au
1/10 de lADN test. Sil y a encore inhibition, on ne peut pas donner de rsultat pour cet
chantillon.
N.B. Pour prparer le tampon dchantillon :
1. Dissoudre 250 mg de bleu de bromophnol dans 33 ml de Tris 150 mM (pH 7,6) ;
2. Ajouter 60 ml de glycrol et 7 ml deau distille ;
3. Conserver temprature ambiante.
N.B. Le bromure dthidium est un agent mutagne trs puissant qui doit donc tre manipul avec
prcaution.
}
|69
6.5.1.2 PCR base de ractifs secs
Ractifs
On aura besoin des ractifs suivants :
Billes pour PCR PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare Life Sciences) ;
amorces lyophilises MU5 et MU6 (voir note ci-dessous) ;
eau distille purie, qualit biologie molculaire ;
agarose lectroendosmose faible (agarose standard) ;
tampon 10 x prpar avec du Tris/borate 1 M plus EDTA 10 mM, pH 8,3 (galement connu
sous le nom de tampon TBE) ;
GelRed (Biotium) ;
solution tampon de colorant de charge 10 x (tel que BlueJuice, commercialis par Invitrogen) ;
marqueurs de taille dADN (chelle 100 pb) (tels que ceux commercialiss par Invitrogen).
N.B. En suivant les recommandations du fabricant pour le concentrateur sous vide utilis, 2,5 l
damorce (10 M MU5 (5`AGC GAC CCC AGT GGA TTG GT `3) et MU6 (5` CGG TGA TCA
AGC GTT CAC GA 3) sont lyophiliss par lots successifs dans des tubes de raction PCR de 0,2 ml.
Prparation des tubes de raction PCR
1. Ajouter une bille de PuReTaq Ready-To-Go-PCR Bead (contenant du tampon PCR, MgCl
2

et des dNTP) dans chaque tube de raction PCR contenant les amorces lyophilises MU5 et
MU6.
2. Ajouter 22,5 l deau distille pour dissoudre compltement les billes.
Ajout dADN matrice
chantillons de diagnostic
Chaque chantillon de diagnostic (extrait dADN) est test non dilu et une dilution de 10
-1
.
Mettre 2,5 l dextrait dADN initial ou dextrait dilu dans les tubes de raction PCR.
Ralisation de lampli cation
On place les tubes dans le thermocycleur. Lamplication est programme pendant 1 heure et 30
minutes comme suit.
tapes Temprature Dure Nombre de cycles
Dnaturation initiale 95 C 10 minutes 1
Dnaturation 95 C 10 secondes
Hybridation des amorces 58 C 10 secondes 35
a
Extension 72 C 30 secondes
Extension nale 72 C 10 minutes 1
Maintien 15 C Aussi longtemps que
ncessaire

a
Pour la dnaturation, lhybridation des amorces et lextension, un cycle comprend les trois phases (ou tempratures) indiques par laccolade.
}
70|
6.5.1.3 Contrle interne dela qualit
Tmoins dinhibition
On doit traiter en parallle les tmoins dinhibition (dilus et non dilus) et tous les
chantillons de diagnostic, an dviter les faux-ngatifs causs par le phnomne
dinhibition.
Pour la raction tmoin dinhibition, mettre 1,25 l dADN de diagnostic (inconnu) pur
ou dilu plus 1,25 l dADN tmoin positif, dans chaque tube respectif.
Tmoins positifs et ngatifs
En plus des chantillons de diagnostic et des tmoins dinhibition, on doit galement traiter les
tmoins suivants.
Type de tmoin Objectif Contenu de la raction
Tmoin dextraction ngatif Tmoin ngatif du processus dextraction
utilis pour exclure une contamination
survenant pendant lextraction
2,5 l du tmoin dextraction
ngatif
Tmoin sans matrice Tmoin ngatif de PCR utilis pour
exclure une contamination des ractifs
2,5 l deau distille sans
aucun ADN
Tmoin de PCR positif Tmoin positif (tmoin dessai) de
PCR destin tablir lamplication
spcique
2,5 l dADN positif
a
PCR, raction damplication en chane par polymrase.
a
Pour le tmoin positif, on peut prendre soit lADN extrait dun patient qui a dj t test positif, soit de lADN extrait de matriel de culture.
N.B. Pour prparer un chantillon positif dADN de M. ulcerans (preuve dinhibition et tmoin positif) :
1. extraire lADN de M. ulcerans en mettant en suspension quelques colonies dans du tampon
TE (Tris chlorhydrate 10 mM plus EDTA 1 mM, pH 8,0) ;
2. chauffer pour inactiver (100 C pendant 8 10 minutes) ;
3. prendre un volume de 1 l pour la raction PCR.
6.5.1.4 Analyse des amplicons obtenus par PCR et interprtation des rsultats
Ralisation dune lectrophorse en gel dagarose
Pour prparer la concentration de travail du tampon comprenant du Tris borate 1 M plus EDTA
10 mM pH 8,3 (galement nomme tampon TBE), diluer 50 ml de tampon TBE concentr 10x dans
950 ml deau dsionise (dilution 5 %).
1. Pour prparer un gel dagarose 1,5 %, chauffer 1,5 g dagarose et 100 ml de tampon 0,5x
dans un erlemeyer en plastique pendant 3 minutes 600 watts dans un four micro-ondes.
N.B. Les bulles indiquent que la temprature est correcte.
2. Aprs chauffage, laisser refroidir le uide jusqu environ 50 C. Par exemple en maintenant la
ole sous leau courante. Agiter la ole pour tre sr que le liquide refroidit de manire
uniforme.
3. Aprs refroidissement, ajouter 10 l de GelRed et agiter doucement la ole.
4. Boucher la cuve dlectrophorse et verser le liquide dans la cuve dlectrophorse en gel
dagarose. liminer soigneusement les bulles laide dun embout de pipette. Placer ensuite le(s)
peigne(s) lendroit correct dans la cuve. Laisser le gel dagarose refroidir temprature
ambiante, puis retirer le(s) peigne(s) avec prcaution.
|71
5. Mettre le gel g dans la chambre dlectrophorse en gel dagarose, qui doit tre remplie de
tampon 0,5x (jusquau trait de remplissage).
6. Pour charger le gel, mlanger 15 l damplicon PCR base de ractifs secs avec 3 l de colorant
de charge pour gel disponible dans le commerce (par ex., BlueJuice 10x) ; en variante, on peut
prparer 1 ml de colorant en mlangeant 500 l de glycrol avec 497,5 l deau distille et
2,5 l de bleu de bromophnol.
7. Dposer 10 l de la solution de marqueurs de taille dADN (chelle 100 pb), en vriant quon
utilise bien la solution de travail, dans 1 puits chantillon par piste.
8. Appliquer la tension correcte, et raliser llectrophorse de la manire dcrite ci-dessous.
Dimensions du gel Tension Nombre de peignes Dure de llectrophorse en gel
12 x 12 cm 100 volts 2 55 minutes

Analyse et interprtation de llectrophorse en gel dagarose
Une fois llectrophorse termine, les amplicons sont visualiss sous UV (302 nm) laide
dun transilluminateur.
Une raction positive produit une bande de 492 pb de longueur avec les amorces Mu5 + Mu6
(PCR base de ractifs secs) et de 515 pb avec les amorces Mu1 + Mu2 (PCR en un seul cycle) ;
en cas de raction ngative, il ny a pas de bande.
Les rsultats des chantillons de diagnostic doivent tre interprts en fonction des rsultats
des tmoins dinhibition.
Les rsultats possibles sont indiqus ci-dessous.
Rsultat de lchantillon Rsultat du tmoin dinhibition Interprtation des rsultats
Ngatif Positif chantillon ngatif
Positif Positif chantillon positif
Ngatif Ngatif chantillon inhib
a
Positif Ngatif chantillon positif
a
Si lon obtient ce rsultat, il faut tester les chantillons une dilution plus leve
On considre que la raction PCR base de ractifs secs a fonctionn seulement si le tmoin positif
donne un rsultat positif et si le tmoin ngatif donne un rsultat ngatif.
72|
6.5.2 PROTOCOLE DE LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REL
6.5.2.1 Gnralits
Lanalyse PCR en temps rel dcrite ci-dessous a t mise au point par Fyfe et coll.
1
et dcrite en dtail
dans larticle de Lavender et Fyfe
2
; elle utilise une sonde TaqMan qui est un ligand du petit sillon. Les
sondes TaqMan sont des sondes dhydrolyse conues pour accrotre la spcicit de la PCR en temps
rel. La chimie de la sonde dhydrolyse ou TaqMan repose sur lactivit 53-exonuclasique de la
Taq polymrase, capable de dgrader une sonde dADN hybride (non extensible) au cours de ltape
dextension de la raction PCR.
Cette sonde est conue pour shybrider une rgion situe lintrieur de lamplicon, et comporte un
double marquage (uorophore metteur ou rapporteur , et molcule suppresseur ou quencher ).
La proximit troite du quencher inhibe la uorescence du uorophore rapporteur. mesure
que lactivit exonuclasique de la Taq polymrase dgrade la sonde, la uorescence du rapporteur
augmente, une vitesse qui est proportionnelle la quantit de matrice prsente, ce qui permet de
quantier lADN dans le matriel de dpart (Figure 30). Cependant, dans un contexte de diagnostic, la
quantication nest gnralement pas ncessaire.
1
Fyfe J et al. Development and application of two multiplex real-time PCR assays for the detection of Mycobacterium ulcerans
in clinical and environmental samples. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73:47334740.
2
Lavender CJ, Fyfe JA. Direct detection of Mycobacterium ulcerans in clinical specimens and environmental samples. Methods
in Molecular Biology, 2013, 943:201216.
FIGURE 30. PCR EN TEMPS REL AVEC LA TECHNOLOGIE DAMPLIFIFICATION GNIQUE TAQMAN
(Avec laimable autorisation de Koen Vandelannoote)
Les sondes dhydrolyse permettent de dtecter plusieurs squences cibles en une seule et mme raction
parce quelles utilisent des sondes spciques portant des marqueurs colors diffrents (technique
connue sous le nom de multiplexage). Dans ce test, la sonde qui est conue pour dtecter une rgion
situe dans IS2404 (IS2404 TP) est marque par le colorant uorescent 6-carboxyuorescine (FAM)
lextrmit 5, et par un quencher non uorescent qui se lie au petit sillon (dsign sous lappellation
MGBNFQ) lextrmit 3.
|73
Un tmoin positif interne exogne pour TaqMan, disponible dans le commerce, est incorpor dans
chaque raction pour sassurer quun rsultat ngatif pour un chantillon particulier est un vrai
ngatif pour IS2404 et ne rsulte pas de la prsence dinhibiteurs de la PCR. La sonde pour le tmoin
positif interne comporte un uorophore VIC x son extrmit 5 et un quencher non uorescent
se liant au grand sillon x son extrmit 3.
Lamplication et la dtection de la squence sont ralises laide dun appareil de PCR en temps rel,
tel que les systmes de dtection ABI Prism 7000 Sequence Detector , Eppendorf Mastercycler
Realplex , ou quivalent.

6.5.2.2 Matriels
Pour la mise en uvre de la PCR quantitative en temps rel, on a besoin du matriel suivant :
mlange ractif pour PCR TaqMan (par exemple, fourni par Applied Biosystems ou quivalent) ;
amorces IS2404 TF et IS2404 TR (voir ci-dessous) ;
sonde IS2404 TP (voir ci-dessous) ;
ractifs pour tmoin positif interne exogne ( Exogenous Internal Positive Control Reagents ,
commercialiss par Applied Biosystems) ;
eau exempte de nuclases ;
plaque de raction 96 puits transparente (par exemple, fournie par Applied Biosystems ou
quivalent) ;
lm adhsif transparent (par exemple, fourni par Applied Biosystems ou quivalent).
6.5.2.3 Mode opratoire
Les tapes doivent se drouler dans lordre indiqu ci-dessous.
tape A. Prparation du mlange ractif
Les mlanges pour PCR en temps rel visant dtecter IS2404 et renfermant un tmoin positif interne
contiennent des concentrations de 0,9 M de chaque amorce, une concentration de 0,25 M de la
sonde, le mlange ractif pour PCR TaqMan (1x), et des ractifs pour tmoin positif interne TaqMan
(1x), dans un volume total de 24 l.
Amorce ou sonde Squence (53)
IS2404 TF AAAGCACCACGCAGCATCT
IS2404 TR AGCGACCCCAGTGGATTG
IS2404 TP 6 FAM-CGTCCAACGCGATC-MGBNFQ
On prpare le mlange ractif dans un tube de 1,5 ml ou 2,0 ml. En rgle gnrale, toutes les douze
ractions, on prvoit une raction supplmentaire en rajoutant un treizime tube ractionnel. Les
24 l du mlange sont ensuite rpartis dans chaque puits de la plaque de raction.
74|
Les ractifs ncessaires et les quantits ncessaires pour chaque raction sont indiqus ci-dessous.
Ractif (concentration de dpart) Quantit ajouter (en l) pour 1 raction
Mlange ractionnel pour PCR TaqMan (2x) 12,5
IS2404 TF (18 M) 1,25
IS2404 TR (18 M) 1,25
IS2404 TP (5 M) 1,25
ADN exogne pour tmoin positif interne (50x) 0,5
Mlange exogne pour tmoin positif interne (10x) 2,5
Eau exempte de nuclases 4,75
Total 24
tape B. Ajout de lADN matrice dans les tubes contenant le mlange ractionnel
Mettre dans les puits 1 l dADN matrice. Inclure dans chaque essai trois puits tmoins : un tmoin
sans matrice (1 l deau exempte de nuclases la place de lADN matrice), un tmoin positif (1 l dune
solution dilue dADN gnomique de M. ulcerans) et un tmoin ngatif (1 l dun extrait prpar pour
contenir seulement les ractifs utiliss pour lextraction de lADN des chantillons). Sceller les plaques
de raction avec des couvercles adhsifs transparents laide dun applicateur ; puis dposer les plaques
hermtiquement scelles dans lappareil de PCR en temps rel, avec ou sans tapis de compression (selon
le modle de machine PCR).
N.B. Il est important de souligner quun thermocycleur normal ne peut pas tre utilis pour la PCR en
temps rel. Il est indispensable dutiliser un appareil capable simultanment damplier et de dtecter
les signaux de uorescence.
N.B. La dilution de lADN gnomique choisie dpendra de la concentration initiale de la prparation.
Cette dilution sera dtermine de manire empirique. Il est possible de choisir une dilution de la
prparation de 10
-6
, qui donne un Ct (cycle seuil) de 25-30 dans lessai. Plus la prparation est dilue,
moins il y a de risques dintroduire une contamination, mais si elle est trop dilue, le risque dchec
augmente.
tape C. Ampli cation et dtection
On lance lamplication et la dtection dans un appareil de PCR en temps rel en programmant les
paramtres suivants :
1 cycle 95 C pendant 10 minutes (pour activer lenzyme Taq) ;
40 cycles 95 C pendant 15 secondes (fusion) ; et
1 minute 60 C (pour lhybridation et lextension).
N.B. Jeter les plaques de raction immdiatement aprs chaque preuve sans ouvrir le joint scell
thermique an de rduire le risque de contamination par les amplicons.
tape D. Analyse et interprtation des rsultats
Une fois lpreuve termine, analyser dabord les rsultats pour le dtecteur FAM pour IS2404. Si
ncessaire, dplacer manuellement la ligne de seuil pour quelle soit au-dessus du niveau du bruit de
fond.
|75
Rpter la procdure pour le dtecteur VIC pour le tmoin positif interne. En prsence dun signal
FAM de forte intensit pour le dpistage de IS2404, une assignation ngative ou un signal ngatif,
ou les deux, peuvent tre obtenus pour le dtecteur VIC pour le tmoin positif interne. Cest la
consquence des concentrations damorces limitantes utilises dans le test tmoin interne.
On interprte donc les rsultats pour chaque chantillon de la manire suivante.
Si le dtecteur FAM pour IS2404
est
Et si le dtecteur VIC pour le tmoin
positif interne est
Alors le rsultat pour
IS2404 est
+ +/ +
+
Possible inhibition
Pour les chantillons positifs pour IS2404, la valeur du cycle seuil pour le dtecteur FAM reprsente
le cycle auquel la courbe damplication franchit la ligne de seuil ; ceci donne une indication de
la concentration dADN de M. ulcerans dans lchantillon. La valeur du cycle seuil est inversement
proportionnelle la concentration dADN dans lchantillon (autrement dit, une valeur de cycle
seuil leve indique une concentration dADN faible ; une valeur de cycle seuil faible indique une
concentration dADN leve). La Figure 31 illustre les courbes damplication de la PCR quantitative
en temps rel.
6.6 ASSURANCE DE LA QUALIT
Il est capital de respecter toutes les pratiques dassurance de la qualit dcrites lAnnexe 8 si lon veut
viter les problmes de contamination et les faux-positifs. Le diagnostic de lulcre de Buruli ne devra
pas se faire par PCR si le laboratoire ne peut pas sengager prendre ces mesures de garantie de la
qualit.
(Avec laimable autorisation de Pieter Bomans, Miriam Eddyani et Koen Vandelannoote)
FIGURE 31. COURBES DAMPLIFICATION POUR LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REL
signal seuil
Valeur Ct
( Cycle threshold )
Standard, 10
5
copies IS2404/l
Standard, 10
3
copies IS2404/l
Standard, 10
1
copies IS2404/l
Echantillon positif Ct: 26,58
Echantillon ngatif
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
Nombre de cycles
76|
ANNEXE 7:
TECHNIQUES DE COLORATION EN HISTOPATHOLOGIE
7.1 LE FIXATEUR
Des dtails sur les procdures de xation sont donns dans la section 4.6.2 du manuel.
Le xateur connu sous le nom solution 10 % de formol neutre tamponn est en ralit une solution
de formaldhyde 4 % tamponne : ce nest pas une solution de formaldhyde 10 %. Historiquement,
il tait prpar en solution 10 % obtenue partir dune solution-mre de formaldhyde 37-40 %.
On peut se le procurer dans le commerce sous une forme prte lemploi, le formol 10 %
tamponn , ou le prparer extemporanment partir de para-formaldhyde cristallin.
N.B. Le para-formaldhyde est un produit dangereux. Un masque de protection, une paire de lunettes,
des gants et une hotte doivent tre utiliss pour le manipuler. Cest la raison pour laquelle on
recommande lachat de formol 10 %, neutre tamponn.

7.2 MTHODE DE HARRIS LHMATOXYLINE-OSINE (H & E) (SANS MERCURE)
N.B. On obtient avec cette mthode une coloration des lments tissulaires et des bactries bien
plus intense quavec toute autre mthode H & E. De plus, lutilisation de permanganate de potassium
(KMnO
4
) la place des sels de mercure est beaucoup moins dangereuse aussi bien pour lenvironnement
que pour la personne.
Cette mthode est employe pour les chantillons xs dans une solution 10 % de formol neutre
tamponn, et pour des coupes de tissu de 4 6 m dpaisseur. Le tissu tmoin doit renfermer des
noyaux, des structures cytoplasmiques, du tissu conjonctif et, si possible, des bactries.
7.2.1 SOLUTIONS
7.2.1.1 Hmatoxyline de Harris
Alun de potassium ou dammonium 100 g
Eau distille 500 ml
Dissoudre la chaleur.
Dans un rcipient spar, mlanger :
Hmatoxyline en cristaux 5 g
thanol absolu 50 ml
Eau distille 250 ml
Dissoudre (ventuellement la chaleur).
Puis ajouter :
0.25% KMnO
4
250 ml
|77
1. Agiter pendant au moins 3 minutes (jusqu dissolution complte).
2. Mlanger cette solution avec la solution dalun.
3. Refroidir leau courante.
4. Ajouter 20 ml dacide actique glacial ( 100 %).
5. Filtrer avant usage.

7.2.1.2 Solution de phloxine-osine
Acide-alcool 1 %
thanol 95 % 736 ml
Eau dsionise 263,2 ml
HCl concentr 10 ml
1. Ajouter leau dsionise dans lalcool 95 %.
2. Ajouter avec prcaution lacide chlorhydrique concentr dans la solution deau-thanol, et
non linverse.
N.B. Cette solution peut tre garde temprature ambiante pendant trs longtemps.
Eau ammoniaque
Eau dsionise 1000 ml
Hydroxyde dammonium 28 % 4 ml
Solution-mre dosine 1 %
osine Y (hydrosoluble) 1 g
Eau dsionise 100 ml
Solution-mre de phloxine 1 %
Phloxine B 1 g
Eau dsionise 100 ml
78|
Pour prparer la solution de phloxine-osine, mlanger :
Solution-mre dosine 100 ml
Solution-mre de phloxine 10 ml
thanol 95 % 780 ml
Acide actique glacial ( 100 %) 4 ml
N.B. Cette solution peut tre garde temprature ambiante et se conserve environ 1 semaine.
La Figure 32 montre une panniculite visible sur une coupe de tissu prlev sur un ulcre de Buruli et
color selon la mthode de Harris lhmatoxyline-osine.
7.2.2 MODE OPRATOIRE POUR LA COLORATION
1. Dparafner les lames et les hydrater leau.
2. Colorer pendant 10 minutes avec la solution de Harris lhmatoxyline frachement ltre.
3. Laver leau chaude du robinet pendant 5 minutes.
4. Tremper deux fois dans lacide-alcool 1 % pour obtenir la diffrenciation.
5. Stopper la diffrenciation en trempant la lame dans de leau chaude du robinet puis dans une
eau faiblement ammoniaque ou sature en carbonate de lithium jusqu ce que la coupe de
tissu commence prendre une teinte dun bleu clatant.
6. Laver leau chaude du robinet pendant 10 minutes. N.B. Si la coloration du noyau est trop
ple, recommencer les tapes 2 6. Si le fond nest pas clair, recommencer ltape 4 mais en ne
trempant la lame quune seule fois et rapidement dans la solution dacide-thanol. Puis
recommencer les tapes 5 et 6.
7. Appliquer le colorant de fond de phloxine-osine pendant 2 minutes.
8. Dshydrater la lame.
9. claircir les lames en les plongeant successivement dans de lthanol 95 % (deux fois,
chaque fois pendant 2 minutes), dans de lthanol 100 % (deux fois, chaque fois pendant
2 minutes), et dans du xylne (deux fois, chaque fois pendant 2 minutes).
10. Monter la rsine.
7.3 MTHODE DE ZIEHL-NEELSEN POUR LES GERMES ACIDO-ALCOOLO RSISTANTS
N.B. On met en uvre cette mthode pour tablir la prsence de micro-organismes acido-alcoolo
rsistants autres que Nocardia spp. ou le bacille de la lpre.
FIGURE 32. COUPE COLORE SELON LA MTHODE DE HARRIS LHMATOXYLINE-OSINE METTANT EN
VIDENCE UNE PANNICULITE CHEZ UN CAS DULCRE DE BURULI
Les noyaux des cellules apparaissent en bleu et le tissu
conjonctif en rose. (Avec laimable autorisation de
Wayne Meyers)
|79
tamponn, et pour des coupes de tissu de 4 6 m dpaisseur. Les chantillons tmoins devraient
tre des coupes contenant M. tuberculosis ou M. ulcerans.
7.3.1 SOLUTIONS
7.3.1.1 Solution de fuchsine phnique de ZiehlNeelsen
Phnol (cristaux fondus) 25 ml
thanol absolu 50 ml
Eau dsionise 500 ml
N.B. Conserver dans un endroit chaud dans une pice ou sur une tagre pour garder la solution
ltat liquide. Des ractifs bien prpars peuvent se conserver au moins 6 mois.
7.3.1.2 Acide-alcool
thanol 70 % 100 ml
HCl concentr 1 ml

7.3.1.3 Solution de travail de bleu de mthylne
Cristaux de bleu de mthylne 3 g
Eau dsionise 600 ml
1. Dissoudre le chlorure de bleu de mthylne dans leau dsionise dans un acon en verre
teint et hermtiquement bouch.
2. tiqueter le acon en indiquant le nom du ractif (solution de bleu de mthylne) et les dates
N.B. La solution de bleu de mthylne peut se conserver temprature ambiante pendant 12 mois.
1. Dparafner les lames et les hydrater avec de leau dsionise.
2. Appliquer la solution de fuchsine phnique pendant 30 minutes. N.B. Si les germes ne
prennent pas la coloration, prparer une nouvelle solution de colorant.
3. Laver leau froide pendant 10 minutes. N.B. Si leau est chlore, laver moins longtemps. Rincer
jusqu ce que leau soit claire.
80|
4. Diffrencier les lames individuellement lacide-alcool.
5. Laver les lames leau courante pendant 3 minutes.
6. Procder la coloration du fond en trempant sparment chaque lame dans la solution de
travail de bleu de mthylne, puis rincer leau.
7. Dshydrater la lame.
9. Monter la rsine.
7.3.2.1 Rsultats de la coloration
BAAR Rouge
Fond Bleu
La Figure 33 montre une coupe dun ganglion lymphatique provenant dun patient atteint de lulcre de
Buruli, colore selon la mthode de Ziehl-Neelsen.
FIGURE 33. COUPE DE GANGLION LYMPHATIQUE COLOR SELON LA MTHODE DE ZIEHL-NEELSEN ET
PROVENANT DUN CAS DULCRE DE BURULI
Les BAAR apparaissent en rouge et le fond tissulaire
en bleu. (Avec laimable autorisation de Wayne Meyers)
7.4 MTHODE DE GROCOTT LA MTHNAMINE ARGENTIQUE POUR LES CHAMPIGNONS
N.B. On met en uvre cette mthode pour tablir la prsence de toutes sortes de champignons ;
toutefois, Histoplasma capsulatum et Nocardia asteroides peuvent demander une exposition prolonge la
solution de mthnamine argentique.
tamponn, et pour des coupes de tissu de 4 6 m dpaisseur. Le tissu tmoin doit provenir dune
mycose connue et renfermer des lments fongiques : il ne faut se servir dun tissu provenant dune
histoplasmose ou dune nocardiose.
7.4.1 SOLUTIONS
4% chromic acid
Trioxyde de chrome 4 g
Eau distille 100 ml
|81
Mise en garde : le trioxyde de chrome est un produit irritant.
Nitrate dargent 5 %
Nitrate dargent 5 g
Eau distille 100 ml
Mthnamine 3 % (galement nomme hexamthylnettramine, hexamine, hexamthylnamine)
Mthnamine 30 g
Mtabisul te de sodium 1 %
Mtabisulte de sodium 1 g
Eau distille 100 ml
Chlorure dor 1 %
Chlorure dor jaune 5 g
Eau strile 500 ml
Chlorure dor 0,1 %
Chlorure dor 1,0 % 10 ml
Eau strile 90 ml
Thiosulfate de sodium 2 %
Thiosulfate de sodium 2 g
Eau strile 100 ml
Solution-mre de mthnamine-nitrate dargent
Solution de nitrate dargent 5 % 50 ml
Solution de mthnamine 3 % 1000 ml
N.B. On observe la formation immdiate dun prcipit blanc qui se dissout en remuant.
La solution limpide est stable pendant plusieurs mois si on la garde 4 C. Elle doit tre conserve
au rfrigrateur.
Borate de sodium 5 %
Borate de soude (dcahydrat) 50 g
82|
Solution de travail de mthnamine-nitrate dargent
Solution-mre de mthnamine-nitrate dargent 25 ml
Eau distille 25 ml
Solution de borate de soude 5 % 2 ml
N.B. Cette solution doit tre prpare extemporanment pour chaque lot dchantillons de tissu.
Solution-mre de vert lumire J 0,2 %
Vert lumire J (galement connu sous lappellation
CI n 42095)
0,2 g
Eau distille 100 ml
Acide actique glacial ( 100 %) 0,2 ml
Solution de travail de vert lumire J
Solution-mre de vert lumire J 10 ml
Eau distille 50 ml
1. Dparafner les lames et les hydrater leau distille.
2. Oxyder dans la solution dacide chromique 4 % pendant une heure.
3. Laver leau pendant au moins 20 minutes. Les lames doivent tre incolores.
4. Procder une rduction avec le mtabisulte de sodium 1 % pendant 1 minute pour
liminer les chromates rsiduels.
5. Laver leau pendant au moins 5 minutes.
6. Rincer dans six bains successifs deau distille.
7. Mettre dans la solution de mthnamine-nitrate dargent prpare extemporanment et
ltuve 60 C pendant 60 70 minutes ou jusqu ce que les coupes deviennent brunes (de
la couleur du pain grill). Vrier au microscope an de stopper la raction avant que les lames
ne soient trop colores.
8. Rincer dans six bains successifs deau strile.
9. Appliquer la solution de chlorure dor 0,1 % pendant 1 5 minutes. Vrier au microscope :
les champignons doivent apparatre noirs sur fond rose gris.
10. Rincer leau distille.
11. liminer largent qui na pas ragi en mettant les lames 2 5 minutes dans la solution de
thiosulfate de sodium 2 %.
12. Laver soigneusement leau.
13. Colorer le fond avec la solution-mre de vert lumire J 0,2 % pendant 4 minutes.
14. Rincer leau distille.
15. Dshydrater.
|83
FIGURE 34. COUPE HISTOLOGIQUE DUN KYSTE PHAEOMYCOTIQUE, IMPRGNE LA MTHNAMINE
ARGENTIQUE SELON LA MTHODE DE GROCOTT
On observe des laments noirs produits par lagent
causal, Phialophora repens. (Avec laimable autorisation de
Wayne Meyers)
La Figure 34 montre une coupe histologique dun kyste phaeomycotique, imprgne la mthnamine
argentique selon la mthode de Grocott.
7.5 MTHODES DE BROWN-HOPPS POUR LES BACTRIES GRAM POSITIF ET GRAM NGATIF
N.B. Cette mthode permet de mettre en vidence de nombreuses bactries Gram positif et la
plupart des bactries Gram ngatif.
tamponn, et pour des coupes de tissu de 4 6 m dpaisseur. Les tissus tmoins doivent renfermer
des germes Gram positif et des germes Gram ngatif, et les meilleurs proviennent souvent des
appendicites.
7.5.1 SOLUTIONS
Cristal violet
Cristal violet 1 g
Eau dsionise 100 ml
Solution diode de Gram
Iode (cristaux) 1 g
Iodure de potassium 2 g
Eau dsionise 5 ml + 295 ml
Aprs dissolution complte de liode et de liodure de potassium dans 5 ml deau dsionise, rajouter
295 ml deau dsionise.
Fuchsine basique 1 %
Eau dsionise 100 ml
84|
Solution de Gallego
Eau dsionise 100 ml
Formol concentr ( 37-40 %) 2 ml
Acide picrique-actone
Acide picrique (sec, voir ci-dessous) 0,05 g
Actone (dshydrate) 500 ml
Pour scher lacide picrique :
1. placer une couche dacide picrique humide (plus que la quantit ncessaire) de moins
de 2 mm dpaisseur entre quatre grandes feuilles de papier ltre (deux en dessous et
deux au-dessus) ;
2. exprimer autant deau que possible en faisant rouler une bouteille ou tout autre objet
rond sur le papier ltre ;
3. aprs cette vacuation deau, peser la quantit voulue dacide picrique ;
4. remettre le reste dans le acon dorigine ;
5. utiliser immdiatement lacide qui vient dtre pes ;
6. avant de le jeter, rincer le papier ltre leau courante jusqu ce que toute trace de
couleur jaune ait disparu.
N.B. Il faut toujours garder les cristaux dacide picrique dans leau pour viter une explosion.
Actone-xylne
Actone 100 ml
Xylne 100 ml
N.B. Utiliser un portoir horizontal pour les tapes 2 8 et des bacs de coloration pour toutes les
autres tapes.
1. Dparafner les lames et les hydrater avec de lthanol 95 %.
2. Dposer 15 20 gouttes de solution de cristal violet 1 % sur chaque lame. Laisser en contact
1 2 minutes, et remuer doucement.
3. Rincer leau.
4. Mettre les lames dans la solution diode de Gram pendant 1 minute.
5. Rincer leau.
6. Dcolorer les lames lactone jusqu ce que les derniers vestiges de coloration au cristal
violet commencent disparatre.
7. Laver immdiatement et soigneusement les lames leau.
8. Verser de la fuchsine basique 1 % sur les lames et la laisser en contact 5 minutes.
9. Rincer les lames leau.
10. Mettre les lames dans la solution de Gallego pendant 60 secondes et agiter vigoureusement.
Recommencer une fois.
11. Rincer les lames leau.
12. Mettre les lames dans lactone pendant 30 secondes.
|85
13. Mettre les lames dans la solution dacide picrique-actone pendant 2 3 minutes.
14. Mettre les lames dans la solution dactone-xylne pendant 30 secondes. Recommencer une fois.
15. claircir les lames en les plongeant dans du xylne (deux fois, chaque fois pendant 2 minutes).
La Figure 35 montre un tissu infect par des Rhodococcus spp., aprs coloration de Gram selon Brown-
Hopps.
FIGURE 35. COLORATION DE GRAM SELON BROWN-HOPPS DUN TISSU INFECT PAR RHODOCOCCUS SPP.
noter plusieurs groupes de bactries colores en bleu
( Gram positif). (Avec laimable autorisation de Wayne
Meyers)
7.6 COLORATION LACIDE PERIODIQUE-SCHIFF (PAS) POUR LES CHAMPIGNONS
N.B. Cette mthode est employe pour mettre en vidence le glycogne et les champignons ; elle est
galement utile pour le diagnostic diffrentiel de lulcre cutan.
7.6.1 SOLUTION
Acide periodique 0,5 %
Acide periodique 0,5 g
Eau distille 100 ml
Eau sulfureuse
Eau distille 180 ml
1N HCl 10 ml
Mtabisulte de sodium 10 % 10 ml
Bisul te de sodium 10 %
Eau distille 10 ml
86|
Ractif de Schiff
Eau distille (bouillante) 200 ml
HCl 1 N 20 ml
Charbon activ dshydrat 2 g
1. Agiter ensemble les deux premiers lments vigoureusement.
2. Refroidir jusqu 50 C.
3. Filtrer.
4. Ajouter 20 ml de HCl 1 N au ractif de Schiff.
5. Refroidir jusqu 25 C.
6. Ajouter 1 g de mtabisulte de sodium dans la solution.
7. Laisser au repos lobscurit pendant 24 heures dans un acon propre et hermtiquement
bouch.
8. Ajouter la solution 2 g de charbon activ dshydrat.
9. Agiter 3 minutes.
10. Filtrer.
11. La solution doit tre limpide.
12. Conserver 4 C dans une bouteille recouverte de papier daluminium.
Eau ammoniaque
Eau dsionise 1000 ml
Hydroxyde dammonium 28 % 5 ml
thanolformol
thanol 100 % 40 ml
Formol 4 % 160 ml
La Figure 36 montre des lments fongiques dans un ulcre cutan color selon la mthode de lacide
periodique-Schiff.
1. Dparafner les lames et les hydrater :
1.a. au tolune pendant 5 minutes (trois bains successifs de 5 minutes chacun) ;
1.b. lalcool 80 % pendant 5 minutes ;
1.c. lthanolformol pendant 5 minutes ;
1.d. leau courante.
2. Oxyder avec lacide periodique 0,5 % pendant 15 minutes.
3. Rincer leau courante.
|87
FIGURE 36. LMENTS FONGIQUES DANS UN ULCRE CUTAN COLOR LACIDE PERIODIQUE-SCHIFF (PAS)
ET EXAMIN FORT GROSSISSEMENT
(Avec laimable autorisation de Jean-Jacques Roux)
4. Colorer avec le ractif de Schiff pendant 15 minutes, puis rincer leau chaude (environ 60 C)
pendant environ 10 minutes pour dvelopper la couleur rose.
5. Plonger la lame dans une solution deau sulfureuse pendant 10 secondes (trois bains successifs
de 10 secondes chacun).
6. Laver leau courante pendant 5 minutes.
7. Appliquer le colorant de fond dhmatoxyline de Mayer pendant 5 minutes (lhmatoxyline
de Mayer peut sacheter sous forme de ractif prt lemploi).
8 Laver leau courante.
9. Plonger la lame dans de leau ammoniaque dilue 0,5 % pendant 1 minute.
10. Laver leau courante.
11. Dshydrater dans lthanol 100 % pendant 1 minute (trois bains successifs de 1 minute
chacun).
12. Passer dans le tolune (deux bains de 1 minute chacun).
7.6.3 RSULTATS DE LA COLORATION
Noyaux Bleu
Champignons Rouge
Fond Rose or pourpre
7.7 IMMUNOHISTOCHIMIE
N.B. Cette technique est employe pour colorer des antignes spciques grce une interaction
anticorps-antigne spcique.
Cette mthode est employe pour les chantillons qui ont t xs pendant 24 heures dans une
solution 10 % de formol neutre tamponn, et pour des coupes de tissu de 4 6 m dpaisseur.
88|
7.7.1 SOLUTIONS
Solution de tampon phosphate (PBS)
Chlorure de sodium (NaCl) 8 g
Chlorure de potassium (KCl) 0,2 g
Phosphate de potassium (KH
2
PO
4
) 0,2 g
Hydrognophosphate disodique dihydrat (Na
2
HPO
4
x 2 H
2
O) 1,42 g
Ajuster le pH 7,2.
N.B. Prparer une nouvelle solution chaque fois.
Tampon de prtraitement : EDTA
EDTA working solution
Solution du sel disodique de lacide
thylnediaminettraactique 0.5M
1,4 ml
Eau distille 700 ml
Ajuster le pH 8.
Tampon de prtraitement : citrate
Solution-mre dacide citrique 0,1 M
Acide citrique 19,2 g
N.B. Cette solution peut se conserver 4 C pendant 6 mois.
Solution-mre de citrate de sodium 0,1 M
Citrate de sodium dihydrat 29,4 g
Solution de travail
Solution-mre dacide citrique 0,1 M 14 ml
Solution-mre de citrate de sodium 0,1 M 56 ml
Eau distille 630 ml
Ajuster le pH 6.
N.B. Prparer une nouvelle solution de travail chaque fois.
|89
Tampon de prtraitement : trypsine
Solution-mre de tampon trypsine
NaCl 0,44 g
Chlorhydrate de trisaminomthane 0,4 g
Chlorure de calcium 0,05 g
Eau distille 50 ml
Ajuster le pH 7,8.
Solution-mre de trypsine 2 %
Trypsine bovine 0,02 g
Solution-mre de tampon trypsine 1 ml
N.B. Prparer la solution, et la fractionner rapidement en aliquotes de 50 l conserver -20 C pour
viter lauto-digestion.
Solution de travail
Solution-mre de trypsine 2 % ( -20 C) 50 l
Solution-mre de tampon trypsine 950 l
N.B. Prparer immdiatement avant usage.
Peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
) 0,3 %
Peroxyde dhydrogne (H
2
O
2
) 30 % 2 ml
Eau distille 200 ml
N.B. Prparer une nouvelle solution chaque fois, et utiliser immdiatement.
Solution de blocage
Srum animal 15 l
Solution de tampon phosphate 1 ml
Utiliser du srum de lanimal qui a servi produire lanticorps secondaire.
90|
Solution-mre de tampon de dilution de lanticorps 1
Tween-20 100 l
Solution de travail
Tampon de dilution de lanticorps 1
Solution-mre de tampon de dilution de lanticorps 1 10 l
Tampon de dilution de lanticorps 2
Srum animal 15 l
Utiliser du srum de lanimal qui a servi produire lanticorps secondaire.
Vectastain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, numro au catalogue : PK-6100)
Solution de tampon phosphate 2,5 ml
Ractif A 1 goutte
Ractif B 1 goutte
N.B. Prparer la solution ABC 30 minutes avant usage.
Vector NovaRED Peroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories, numro au catalogue : SK-4800)
Eau distille 5 ml
Ractif 1 3 gouttes
Ractif 2 2 gouttes
Ractif 3 2 gouttes
H
2
O
2
(included in the kit) 2 gouttes
N.B. Prparer la solution de coloration NovaRED immdiatement avant usage.
|91
Hmatoxyline de Mayer
Sulfate de potassium et daluminium (alun de potassium) 50g
Hmatoxyline 1 g
Iodate de sodium 0,2 g
N.B. Aprs dissolution complte de lhmatoxyline, ajouter liodate de sodium et lacide actique.
N.B. Porter brivement la solution bullition. Filtrer si ncessaire.
N.B. La solution dhmatoxyline de Mayer peut tre rutilise au moins 10 fois.
N.B. Utiliser une chambre humide pour le prtraitement la trypsine, et pour les tapes 6 12.
1. Dparafner les lames et les hydrater leau.
2. tape de prtraitement : la dtection de nombreux antignes peut tre amliore grce
des techniques de prtraitement qui dmasquent des sites antigniques normalement cachs.
De ce fait, il sera ncessaire de comparer les rsultats de diffrentes procdures de dmasquage
antignique sil savre que la coloration avec une combinaison particulire dantigne et
danticorps nest pas satisfaisante sans prtraitement.
a. Pas de prtraitement
i. Passer ltape 3.
b. Prtraitement lEDTA
i. Chauffer les lames mises dans le tampon EDTA dans un four micro-ondes jusqu ce
que le liquide commence bouillir.
ii. Arrter le chauffage et attendre 5 minutes, en laissant les lames dans le four.
iii. Recommencer les tapes i et ii trois fois au total.
iv. Laisser les lames refroidir pendant 20 minutes dans le tampon EDTA.
v. Refroidir lentement les lames en ajoutant de leau distille sur une dure de 5 minutes.
vi. Passer ltape 3.
c. Prtraitement au tampon citrate
i. Chauffer les lames mises dans le tampon citrate dans un four micro-ondes jusqu
ce que le liquide commence bouillir.
ii. Arrter le chauffage et attendre 5 minutes, en laissant les lames dans le four.
iii. Recommencer les tapes i et ii deux fois au total.
iv. Laisser les lames refroidir pendant 20 minutes dans le tampon citrate.
v. Refroidir lentement les lames en ajoutant de leau distille sur une dure de 5 minutes.
vi. Passer ltape 3.
d. Prtraitement la trypsine
i. Recouvrir la coupe tissulaire entire en ajoutant une grosse goutte de solution de
travail de trypsine sur chaque lame de tissu dans une chambre humide.
ii. Incuber pendant 30 minutes.
iii. Passer ltape 3.
3. Laver les lames dans du tampon phosphate pendant 1 minute ; effectuer cette opration trois
fois au total.
92|
4. Bloquer la peroxydase endogne en mettant les lames dans de leau oxygne (H2O2) 0,3 %
pendant 20 minutes.
5. Laver les lames dans du tampon phosphate pendant 1 minute ; effectuer cette opration trois
fois au total.
6. Recouvrir la coupe tissulaire entire en ajoutant une grosse goutte de solution de blocage sur
chaque lame ; attendre 30 minutes. N.B. Habituellement, un volume de 100 l de solution est
sufsant pour 1 coupe tissulaire. Un stylo spcial bloquant les liquides doit tre appliqu
autour des coupes de tissu.
7. liminer lexcs de solution de blocage avec un mouchoir en tissu.
8. Ajouter la dilution approprie de lanticorps primaire dilu dans du tampon de dilution de
lanticorps 1 ; incuber pendant 1 heure temprature ambiante ou aussi longtemps quune
nuit entire 1 C, selon lanticorps utilis.
9. Laver les lames dans du tampon phosphate pendant 1 minute ; recommencer cette tape de
lavage trois fois au total.
10. Ajouter lanticorps secondaire biotinyl dilu dans du tampon de dilution de lanticorps 2 ;
incuber pendant 30 minutes.
lavage trois fois au total.
12. Ajouter la solution ABC prmlange ; incuber pendant 30 minutes. N.B. Prparer la solution
ABC 30 minutes avant usage.
lavage deux fois au total.
14. Laver les lames leau distille pendant 1 minute.
15. Ajouter la solution de coloration NovaRED prpare extemporanment, et suivre au
microscope lapparition dun prcipit rouge-brun. N.B. Lapparition du prcipit peut prendre
de 30 secondes 10 minutes selon lanticorps utilis.
16. Arrter la raction en rinant les lames leau distille.
17. Colorer le fond en appliquant la solution dhmatoxyline de Mayer pendant 17 secondes.
18. Incuber les lames 3 minutes dans de leau du robinet (et non dans leau distille) pour
dvelopper la couleur.
19. Rincer rapidement leau distille.
20. Scher les lames.
7.8 RECOMMANDATIONS POUR LA CONSERVATION DES BLOCS DE PARAFFINE ET
DES LAMES
Pour permettre lutilisation des blocs de parafne et des lames dans les analyses de contrle de la
qualit ou dans des tudes complmentaires, il est important de bien organiser leur stockage. Un
numro didentication, commun avec celui du dossier du patient et avec celui des chantillons sur les
blocs et les lames, permettra didentier facilement chaque spcimen.
7.8.1 CONSERVATION DES BLOCS DE PARAFFINE
Les blocs de parafne doivent tre conservs de faon organise ; par exemple, on peut les classer et
les stocker dans un ordre chronologique, daprs leur date de rception. Les systmes de stockage
doivent permettre de les retrouver facilement ; ces systmes peuvent par exemple comporter des
tagres clairement tiquetes ou des botes bien ranges et tiquetes.
La temprature de la zone de stockage doit tre sufsamment basse pour viter que la parafne ne
fonde (donc infrieure 45 C). La dure de stockage doit tre conforme aux recommandations
nationales (par exemple, en France la dure de stockage impose pour les blocs est de 30 ans).
|93
7.8.2 CONSERVATION DES LAMES
Les lames galement peuvent tre archives par ordre chronologique pour pouvoir tre retrouves
facilement. Les diffrentes lames dun mme patient peuvent tre ranges ensemble. Les lames peuvent
tre stockes au mme endroit que les blocs de parafne. Toutefois, au bout de 10 ans, on considre
que les lames ont perdu leur coloration et doivent tre dtruites ; de nouvelles lames prpares partir
du bloc de parafne pourront tre utilises.
94|
ANNEXE 8 :
ASSURANCE DE LA QUALIT
8.1. CONTRLE INTERNE DE LA QUALIT
Le contrle de la qualit (ou CQ) est un ensemble de procdures qui contribue garantir lexactitude,
la abilit et la reproductibilit des rsultats obtenus par un laboratoire. Les dmarches du contrle de
la qualit doivent tre effectues priodiquement et, pour tre efcace, le processus doit tre pratique
et intgr demble dans les pratiques de notication normalises de chaque laboratoire. Tous les
techniciens de laboratoire sont responsables de lexcution, de lenregistrement et de la notication
des rsultats des analyses du contrle de la qualit.
De nombreux lments du CQ font partie des procdures pratiques de routine, ou sinscrivent dans le
cadre de la gestion normale du laboratoire.
Les analyses du contrle de la qualit se concentrent gnralement sur six grands domaines :
lamnagement et ladministration du laboratoire ;
le matriel de laboratoire ;
les chantillons et formulaires de demande ;
les ractifs ;
les analyses de laboratoire ;
lenregistrement et la notication des rsultats.
8.1.1 AMNAGEMENT ET ADMINISTRATION DU LABORATOIRE
Tous les laboratoires doivent prendre en compte les points suivants lorsquil sagit dvaluer lefcacit
de leurs amnagements et de leur fonctionnement administratif.
Veiller ce que toutes les portes du laboratoire soient toujours fermes. Les espaces de travail,
le matriel et les fournitures doivent tre organiss de manire faciliter la planication et
lexcution des tches dans un ordre logique et efcace.
Les zones de travail doivent tre exemptes de poussires. Les paillasses doivent tre nettoyes
au moins une fois par jour avec une solution dsinfectante approprie.
Les procdures de laboratoire doivent se conformer aux lignes directrices appropries.
Chaque procdure excute dans le laboratoire doit tre mene conformment aux modes
opratoires normaliss correspondants.
Des copies crites des modes opratoires normaliss doivent tre conserves au laboratoire, et
tout le personnel autoris doit y avoir accs facilement.
Le responsable du laboratoire doit signer et crire la date de tout changement apport aux
modes opratoires.
Les membres du personnel doivent possder la formation ncessaire, et leur performance doit
tre surveille priodiquement.
Dans un laboratoire qui pratique la PCR, les procdures dextraction, les procdures pr-PCR,
les procdures de PCR et les activits post-PCR doivent tre conduites dans des zones
strictement spares (pour plus de dtails, se reporter la discussion du principe des trois
salles expos lAnnexe 6, section 6.1).
8.1.2 MATRIEL DE LABORATOIRE
En ce qui concerne le matriel de laboratoire, il faut prendre en compte les points suivants.
Les manuels dutilisation et les instructions de nettoyage pour tous les quipements doivent
tre faciles daccs ; ce qui inclut les instructions et les manuels pour les appareils suivants :
microscope, balance, hotte ux laminaire, thermocycleur, centrifugeuse, incubateur ou tuve,
rfrigrateur et conglateur.
|95
Il faut tenir jour un registre contenant les dates de mise en service et dentretien de tous les
quipements.
Le matriel doit tre rgulirement inspect pour sassurer de la rgularit de ses performances.
8.1.3 CHANTILLONS ET FORMULAIRES DE DEMANDE
En ce qui concerne la manipulation des chantillons au laboratoire et la gestion des formulaires de
demande, il faut prendre en compte les points suivants :
Les analyses ne doivent tre effectues que sur demande crite dune personne autorise.
Il ne faut pas lancer une analyse si elle a t demande verbalement, sauf si cette demande
verbale saccompagne dun formulaire de demande dment rempli.
Le personnel doit insister pour que les formulaires de demande soient convenablement
remplis et pour que les chantillons soient correctement tiquets. Cette dmarche permet de
garantir lassociation correcte de chaque chantillon au patient correspondant.
Veiller ce que les chantillons soient rejets sils ne peuvent pas tre convenablement
identis, sils fuient, ou sils se prsentent dans des rcipients casss. Dans ce cas, demander
ce que le prlvement soit refait (nouvel chantillon).
Veiller ce que le personnel enregistre la date laquelle les chantillons arrivent au laboratoire.
Le personnel doit galement noter sur le formulaire de demande tout retard de livraison des
chantillons.
Il revient au personnel dvaluer la qualit des chantillons reus. Il doit galement enregistrer
et surveiller le nombre dchantillons reus par le laboratoire.
8.1.4 RACTIFS
En ce qui concerne la manipulation des ractifs au laboratoire, il faut prendre en compte les points
suivants :
tiqueter tous les ractifs en indiquant leur nom, leur date de prparation, et leur date de
premire ouverture ou utilisation.
Si les ractifs ont t prpars dans un autre laboratoire, indiquer la date laquelle ils ont t reus.
Tout produit qui savre non satisfaisant doit tre enregistr. Retirer ce produit du laboratoire
immdiatement pour quil ne soit pas utilis.
Garder un stock de produits pour 6 mois seulement. Faire tourner le stock pour tre sr
dutiliser en premier le produit le plus ancien.
8.1.5 ANALYSES DE LABORATOIRE
Les analyses de contrle interne de la qualit doivent faire partie intgrante du fonctionnement normal
du laboratoire ; elles sont utilises pour surveiller la performance de tous les tests.
8.1.5.1. Examen direct des frottis
Veiller inclure la fois des tmoins positifs et des tmoins ngatifs au moins une fois par
semaine dans les examens de microscopie.
carter comme tmoins les types de lames suivants :
les lames o le tmoin positif nest pas color en rouge ;
les lames o le tmoin ngatif reste rouge aprs dcoloration ;
les lames o le fond ne sest pas correctement dcolor.
Faire en sorte que les problmes apparus sur les frottis tmoins soient rsolus avant de
notier les rsultats des frottis des patients.
96|
Les rsultats de la microscopie doivent tre compars aux rsultats de la PCR. Les chantillons
de PCR ngatifs ne donnent quasiment jamais de frottis positifs cause des diffrences de
sensibilit de ces tests. Un chantillon qui est ngatif daprs la PCR mais positif lexamen
du frottis peut tre le rsultat dune PCR faussement ngative, dun frottis faussement positif
ou, rarement, dune lsion due une mycobactrie autre que M. ulcerans (telle que
M. tuberculosis, M. chelonae, M. marinum, M. haemophilum).
8.1.5.2 Amplication gnique (PCR)
Veiller inclure la fois des tmoins dextraction positifs (contenant une suspension
bactrienne trs dilue dans de leau de qualit biologie molculaire) et des tmoins dextraction
ngatifs (contenant seulement de leau de qualit biologie molculaire) dans chaque lot
dextraction dADN.
Veiller inclure des tmoins de PCR positifs (contenant une solution dilue dADN gnomique
de M. ulcerans, qui dans une raction PCR en gel donnerait une bande faible, ou dans une
raction PCR en temps rel donnerait une valeur de Ct de 25-30) et des tmoins de PCR
ngatifs (contenant seulement de leau de qualit biologie molculaire) dans chaque essai de PCR.
Si nimporte lequel des tmoins produit un rsultat incorrect, cest le lot entier dextraction
ou de PCR qui doit tre jet et lessai recommenc.
Les rsultats suivants sont considrs comme inacceptables pour les tmoins :
si le tmoin dextraction positif est ngatif, il se peut alors quil y ait un problme avec
lextraction dADN ou la PCR ;
si le tmoin dextraction ngatif est positif, cela veut dire quil y a eu contamination
pendant lextraction dADN ou la PCR ;
si le tmoin de PCR positif est ngatif, cela veut dire quil y a eu un problme pendant la PCR ;
si le tmoin de PCR ngatif est positif, cela veut dire quil y a eu contamination pendant
la PCR.
Les problmes apparus avec les tmoins dextraction dADN ou les tmoins de PCR doivent
imprativement tre rsolus avant danalyser les chantillons des patients et de notier leurs
rsultats.
Veiller comparer les rsultats de la PCR aux rsultats de la microscopie et de la culture. Un
chantillon qui est ngatif daprs la PCR mais positif daprs lexamen du frottis ou la culture
pourrait tre un faux-ngatif de PCR ou un faux-positif de frottis ou de culture. Il se
peut galement que les cultures ou frottis positifs dcoulent de la prsence dune autre espce
mycobactrienne dans la lsion (telle que M. tuberculosis, M. chelonae, M. marinum, M. haemophilum).
Veiller exclure les rsultats faux-ngatifs causs par linhibition de la raction PCR, en
ralisant chaque raction PCR traditionnelle en double. Dans ce systme, le premier tube
contient seulement lchantillon. Le second tube contient lchantillon auquel de lADN puri
de M. ulcerans a t ajout. Si le tube contenant le rajout dADN puri (tube tmoin
dinhibition) est ngatif, cela veut dire que la raction PCR a t inhibe. Dans la PCR en temps
rel, un tmoin positif interne exogne pour TaqMan, disponible dans le commerce, est
incorpor dans chaque raction pour garantir quun rsultat ngatif pour un chantillon
particulier est vraiment ngatif pour IS2404 et nest pas caus par des inhibiteurs de la PCR.
On peut souvent surmonter cette difcult pour les chantillons cliniques en recommenant
la PCR avec une dilution au 1/10 (ou 1/100) de lchantillon dADN extrait.
Faire en sorte que toute contamination dans le laboratoire soit rapidement suivie de mesures
correctrices. La surveillance du problme de contamination dans les laboratoires pratiquant
la PCR passe par lutilisation systmatique de tmoins ngatifs pour tous les travaux de PCR,
et par lanalyse, une fois par an, dchantillons exposs lenvironnement. Pour ce faire, six
microtubes contenant chacun 400 l de tampon Tris 1x plus EDTA sont placs ouverts dans
les enceintes de scurit biologique de la salle prPCR (salle 1), la salle 2 et sur le plan de
travail de la pice contenant le thermocycleur (salle 3) pendant environ 24 heures ; autrement dit :
deux tubes sont placs dans lenceinte de prparation du mlange ractif de PCR (salle 1) ;
deux tubes sont placs dans lenceinte dextraction dADN (salle 2) ;
deux tubes sont placs dans la pice contenant le thermocycleur (salle 3) ;
un volume de 5 l de chacun de ces six tubes est analys par PCR.
|97
8.1.5.3 Cultures
Les taux de contamination doivent tre vris une fois par mois. Sils sont suprieurs
5 %, la strilit des ractifs, des milieux et de la hotte ux laminaire doit tre contrle. La
qualit des spcimens reus peut galement inuencer les taux de contamination, de mme
que la mthode de dcontamination utilise (par exemple, les mthodes lacide oxalique
donnent moins de contamination que la mthode de Petroff modie).
Comparer les rsultats des cultures aux rsultats de la PCR. Les chantillons positifs daprs
la culture mais ngatifs daprs la PCR laissent penser que les cultures sont des faux-positifs,
que les rsultats de la PCR sont des faux-ngatifs, ou quune mycobactrie autre que
M. ulcerans a t cultive.
8.1.5.4 Histopathologie
Des tmoins doivent tre inclus pour vrier lefcacit de tous les ractifs de coloration. Les
tissus tmoins particuliers utiliser sont dtaills lAnnexe 7.
8.1.6 ENREGISTREMENT ET NOTIFICATION DES RSULTATS
Veiller ce que les rsultats soient transmis ds quils ont t valids. Surveiller les ventuels
retards dans le traitement des chantillons ou dans lobtention des rsultats, et noter ces
retards sur la che de compte-rendu.
Analyser les rsultats tous les mois pour dtecter dventuels changements qui pourraient
rvler lexistence dun problme.
Tous les rsultats doivent tre enregistrs selon un format normalis dans un registre de
laboratoire.
Tous les enregistrements et les dossiers doivent tre conservs pendant au moins 2 ans.
8.2 VALUATION EXTERNE DE LA QUALIT
Le but dune valuation externe de la qualit (ou EEQ) est daider les laboratoires identier leurs
erreurs et amliorer leurs pratiques pour quils deviennent plus performants. Participer une
valuation externe de la qualit ne doit pas tre considr comme une menace, mais plutt comme
loccasion de relever le niveau des prestations. La plupart des techniciens de laboratoire ont la volont
de raliser des analyses exactes. Si le laboratoire remplit bien ses tches pendant une valuation externe
de la qualit, le personnel sera alors assur de contribuer efcacement au diagnostic de lulcre de
Buruli et la lutte contre cette maladie.
Trois mthodes peuvent tre utilises pour valuer la performance dun laboratoire :
une valuation sur site ;
lanalyse dun panel dchantillons, galement dsign sous le terme de panel testing ;
un rexamen laveugle des chantillons (revrication des rsultats).
Il existe des valuations externes de la qualit en microscopie organises par des programmes nationaux
de lutte contre la tuberculose ; les programmes de lutte contre lulcre de Buruli devront collaborer
avec ces programmes pour sassurer que le diagnostic de lulcre de Buruli respecte les normes en
matire de microscopie.
En ce qui concerne la PCR, lInstitut de MdecineTropicale dAnvers (Belgique), un centre collaborateur
de lOMS, organise rgulirement des valuations externes de la qualit comprenant des essais daptitude
qui font appel un panel dchantillons cods. Cette dmarche consiste envoyer aux laboratoires
nationaux toute une srie dchantillons ngatifs et positifs analyser. LEEQ par analyse de panels
dchantillons est loccasion pour les laboratoires de comparer leurs performances, et peut rassurer les
techniciens quant leur capacit obtenir les mmes rsultats que leurs autres collgues techniciens.
98|
ANNEXE 9 :
FORMULAIRES UTILES
9.1. BU 01: FICHE CLINIQUE ET THRAPEUTIQUE POUR LULCRE DE BURULI NOUVEAU CAS
F
i
c
h
e

c
l
i
n
i
q
u
e

e
t

t
h
r
a
p
e
u
t
i
q
u
e

p
o
u
r

l
u
l
c
r
e

d
e

B
u
r
u
l
i

N
o
u
v
e
a
u
x

c
a
s

U
B
0
1
N
o
m

d
e

l
'
t
a
b
l
i
s
s
e
m
e
n
t

d
e

s
o
i
n
s

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

N
o
m

d
e

l
'
a
g
e
n
t

r
e
s
p
o
n
s
a
b
l
e

d
e
s

s
o
i
n
s

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

D
a
t
e

d
u

d
i
a
g
n
o
s
t
i
c

c
l
i
n
i
q
u
e

o
u

d
e

l
'
a
d
m
i
s
s
i
o
n

(
j
j
/
m
m
/
a
a
)

:

_
_
_
_
/
_
_
_
_
/
_
_
_
_

D
a
t
e

d
e

c
i
c
a
t
r
i
s
a
t
i
o
n

c
o
m
p
l
t
e

(
j
j
/
m
m
/
a
a
)

:

_
_
_
_
/
_
_
_
_
/
_
_
_
_

N
o
m

d
u

p
a
t
i
e
n
t

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

A
d
r
e
s
s
e

(
v
i
l
l
a
g
e

o
u

q
u
a
r
t
i
e
r
)

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

P
r
o
v
i
n
c
e
/
R
g
i
o
n
/
D
p
a
r
t
e
m
e
n
t

:
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

N

d
e

d
o
s
s
i
e
r

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

D
i
s
t
r
i
c
t

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

P
a
y
s

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

A
g
e

(
e
n

a
n
n
e
s
)

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

S
e
x
e

:

M
a
s
c
u
l
i
n

F
m
i
n
i
n

P
o
i
d
s

(
e
n

k
g
)

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

P
r
o
f
e
s
s
i
o
n
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

H
I
S
T
O
R
I
Q
U
E

C
L
I
N
I
Q
U
E

D
E

L
A

M
A
L
A
D
I
E
D
u
r
e

d
e

l
a

m
a
l
a
d
i
e

a
v
a
n
t

l
a

c
o
n
s
u
l
t
a
t
i
o
n

(
e
n

s
e
m
a
i
n
e
s
)

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

R
e
c
o
u
r
s

l
a

m
d
e
c
i
n
e

t
r
a
d
i
t
i
o
n
n
e
l
l
e

:

O
u
i

N
o
n

E
x
i
s
t
e
n
c
e

d
'
u
n
e

l
i
m
i
t
a
t
i
o
n

d
e

m
o
u
v
e
m
e
n
t
s

a
r
t
i
c
u
l
a
i
r
e
s

:

O
u
i

N
o
n

T
r
a
i
t
e
m
e
n
t

a
n
t
r
i
e
u
r

l
a

s
t
r
e
p
t
o
m
y
c
i
n
e

:

O
u
i

(
n
o
m
b
r
e

d
e

j
o
u
r
s

:

_
_
_

)

N
o
n

R
E
F
E
R
E

P
A
R

:

A
u
t
o
-
r

M
e
m
b
r
e

d
e

f
a
m
i
l
l
e

A
g
e
n
t

d
e

s
a
n
t

R
e
l
a
i
s

c
o
m
m
u
n
a
u
t
a
i
r
e

A
n
c
i
e
n

p
a
t
i
e
n
t

E
n
s
e
i
g
n
a
n
t

A
u
t
r
e

(
p
r
c
i
s
e
r
)

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
F
O
R
M
E
S

C
L
I
N
I
Q
U
E
S

N
o
d
u
l
e

(
N
)

C
d
m
e

(
E
)

O
s
t
o
m
y
l
i
t
e

(
O
)

P
l
a
q
u
e

(
Q
)

U
l
c
r
e

(
U
)

P
a
p
u
l
e

(
P
)

C
A
T
E
G
O
R
I
E
S

C
a
t
g
o
r
i
e

I
:

l
s
i
o
n

u
n
i
q
u
e

>

5

c
m

d
e

d
i
a
m
t
r
e

C
a
t
g
o
r
i
e

I
I
:

l
s
i
o
n

u
n
i
q
u
e

5
1
5

c
m

d
e

d
i
a
m
t
r
e

C
a
t
g
o
r
i
e

I
I
I
:

l
s
i
o
n

u
n
i
q
u
e

>

1
5

c
m

d
e

d
i
a
m
t
r
e
,

l
s
i
o
n
s

m
u
l
t
i
p
l
e
s
,

l
s
i
o
n
s

a
u
x

l
o
c
a
l
i
s
a
t
i
o
n
s

d
l
i
c
a
t
e
s

e
t

o
s
t
o
m
y
l
i
t
e
s

L
O
C
A
L
I
S
A
T
I
O
N

D
E

L
A

(
D
E
S
)

L
E
S
I
O
N
(
S
)

M
e
m
b
r
e

s
u
p
r
i
e
u
r

(
M
S
)

M
e
m
b
r
e

i
n
f
r
i
e
u
r

(
M

)

A
b
d
o
m
e
n

(
A
B
)

D
o
s

(
D
O
)

F
e
s
s
e
s

e
t

p
r
i
n
e

(
F
E
)

T
h
o
r
a
x

(
T
H
)

T
t
e

e
t

c
o
u

(
T
C
)

L
O
C
A
L
I
S
A
T
I
O
N
S

D
E
L
I
C
A
T
E
S

C
i
l

S
e
i
n
s

O
r
g
a
n
e
s

g
n
i
t
a
u
x

e
x
t
e
r
n
e
s

C
O
N
F
I
R
M
A
T
I
O
N

B
I
O
L
O
G
I
Q
U
E

P
r
v
e
m
e
n
t
(
s
)

f
a
i
t
(
s
)

:

O
u
i

N
o
n
D
a
t
e

d
u
(
d
e
s
)

p
r
e
m
i
e
r
(
s
)

p
r
v
e
m
e
n
t
(
s
)

:

_
_
_
/
_
_
_
/
_
_
_

T
y
p
e
(
s
)

d
e

p
r
v
e
m
e
n
t
(
s
)

:

E
c
o
u
v
i
l
l
o
n

A
s
p
i
r
a
t
i
o
n

p
a
r

a
i
g
u
i
l
l
e

f
i
n
e

(
A
A
F
)

B
i
o
p
s
i
e

R
s
u
l
t
a
t
s
Z
N

:

P
o
s
i
t
i
f

N
g
a
t
i
f
P
o
s
i
t
i
f
N
g
a
t
i
f
P
C
R

:

P
o
s
i
t
i
f

N
g
a
t
i
f
P
o
s
i
t
i
f
N
g
a
t
i
f
H
i
s
t
o

:

P
o
s
i
t
i
f

N
g
a
t
i
f
P
o
s
i
t
i
f
N
g
a
t
i
f
T
Y
P
E

D
E

T
R
A
I
T
E
M
E
N
T

(
C
o
c
h
e
r

s
i

a
p
p
l
i
c
a
b
l
e
)

:

P
a
n
s
e
m
e
n
t
s

A
n
t
i
b
i
o
t
i
q
u
e
s

C
h
i
r
u
r
g
i
e

(
d
a
t
e
:
_
_
_
_
_
/
_
_
_
_
_
/
_
_
_
_

P
r
v
e
n
t
i
o
n

d
e
s

i
n
c
a
p
a
c
i
t
s

D
O
S
A
G
E
S
R
i
f
a
m
p
i
c
i
n
e

:

_
_
_
_
_
_
_
_
(
m
g
)
S
t
r
e
p
t
o
m
y
c
i
n
e

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
(
g
)

A
u
t
r
e

(
p
r
c
i
s
e
r
)

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_

:

_
_
_
_
_
_
_
_
_
(
m
g
)
C
o
c
h
e
r

c
h
a
q
u
e

j
o
u
r

d
'
u
n
e

c
r
o
i
x

(
X
)

a
p
r
s

a
d
m
i
n
i
s
t
r
a
t
i
o
n

d
e
s

a
n
t
i
b
i
o
t
i
q
u
e
s

;

s
i

l
e
s

a
n
t
i
b
i
o
t
i
q
u
e
s

n
'
o
n
t

p
a
s

a
d
m
i
n
i
s
t
r
s
,

r
e
m
p
l
i
r

l
a

c
a
s
e

a
v
e
c

l
e

s
y
m
b
o
l
e

J
o
u
r
M
o
i
s
1

2

3

4

5

6

7

8

9

1
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
1
6
1
7
1
8
1
9
2
0
2
1
2
2
2
3
2
4
2
5
2
6
2
7

2
8
2
9
3
0
3
1
T
o
t
a
l

d
e
s

d
o
s
e
s
R
E
S
U
L
T
A
T
S

D
U

T
R
A
I
T
E
M
E
N
T

1
a

:

T
r
a
i
t
e
m
e
n
t

a
n
t
i
b
i
o
t
i
q
u
e

t
e
r
m
i
n

2
a

:

C
i
c
a
t
r
i
s

s
a
n
s

c
h
i
r
u
r
g
i
e

3
a

:

C
i
c
a
t
r
i
s

s
a
n
s

l
i
m
i
t
a
t
i
o
n

d
e

m
o
u
v
e
m
e
n
t
s

a
r
t
i
c
u
l
a
i
r
e
s

4

:

R

p
o
u
r

m
e
i
l
l
e
u
r

t
r
a
i
t
e
m
e
n
t

1
b

:

T
r
a
i
t
e
m
e
n
t

a
n
t
i
b
i
o
t
i
q
u
e

n
o
n

t
i

2
b

:

C
i
c
a
t
r
i
s

a
v
e
c

c
h
i
r
u
r
g
i
e

3
b

:

C
i
c
a
t
r
i
s

a
v
e
c

l
i
m
i
t
a
t
i
o
n

d
e

m
o
u
v
e
m
e
n
t
s

a
r
t
i
c
u
l
a
i
r
e
s

5

:

P
e
r
d
u

d
e

v
u
e

D

|99
9.2. UB 03: DEMANDE DE CONFIRMATION EN LABORATOIRE DUN CAS DULCRE DE BURULI
UB 03
DEMANDE DE CONFIRMATION EN LABORATOIRE
D'UN CAS D'ULCERE DE BURULI
I. INFORMATIONS GENERALES
Nom de l'tablissement de soins : _______________________________
Nom de l'agent de sant ayant fait la demande d'analyse : _______________________________
Nom du patient : ___________________________ N de dossier :___________
Age (ans) : ________ Sexe : M F
Adresse (village ou quartier) : _________________ District : __________________
Classification : Nouveau Rechute
Forme clinique : Nodule (N) Plaque (Q) Cdme (E) Ulcre (U) Ostomylite (O)
Date du prlvement (jj/mm/aa) : ___/___/___
Type of prlvement : Ecouvillon Aspiration par aiguille fine (AAF) Biopsie
II. RAISONS DE LA DEMANDE D'ANALYSE DE LABORATOIRE
Nature de(s) I'anaIyse(s) ZN PCR Culture Histopathologie
Raisons
Diagnostic d'un nouveau cas
*Suivi d'un patient pendant le traitement antibiotique (_____ semaines de traitement antibiotique)
Diagnostic d'un cas de rechute (date du dernier traitement antibiotique - date ou mois : ______________)
Suivi d'un patient aprs le traitement antibiotique
____________________________________________
III. RESULTATS
Examens ZN PCR Culture Histopathologie
Date (jj/mm/aa) : ___/___/___
Date (jj/mm/aa) : ___/___/___
Commentaires : ___________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________
Nom de la personne donnant les rsultats : ______________________________________________________
Nom du laboratoire : ________________________________________________________________________
Date : ___________________
* peut inclure un patient ne rpondant pas au traitement comme souhait
100|
ANNEXE 10 :
GUIDE DES TECHNIQUES DE PRLVEMENT DCHANTILLONS POUR LA CONFIRMATION
EN LABORATOIRE DE LULCERE DE BURULI (MALADIE CAUSEE PAR MYCOBACTERIUM ULCERANS)
GNRALITS
Grce aux progrs de la prise en charge clinique de la maladie cause par Mycobacterium ulcerans (ulcre
de Buruli), les options thrapeutiques ont volu de la chirurgie au traitement par une association
dantibiotiques. Le traitement avec la rifampicine et la streptomycine, ou avec la rifampicine et dautres
schmas thrapeutiques par voie orale, a permis une dcentralisation par rapport lpoque o le
traitement chirurgical en hpital tait la seule option disposition. Grce ces progrs, le nombre des
interventions chirurgicales a diminu (en 2012, environ 40 % des patients ont t traits sans geste
chirurgical) et les rechutes ont presque totalement disparu.
La conrmation des cas laide de mthodes de laboratoire, telles que lamplication gnique (PCR) et
lexamen direct des frottis, est devenue un aspect essentiel dans la prise en charge globale de la maladie.
Bien que les cultures ne soient pas indispensables pour le diagnostic de linfection ou la prise en charge
clinique immdiate des patients, lidentication des checs thrapeutiques et des rechutes de linfection
peut ncessiter la dtection de bacilles viables. Les cultures peuvent galement savrer ncessaires en
cas dapparition de souches de M. ulcerans rsistantes aux mdicaments.
Dans de nombreux pays o lulcre de Buruli est endmique, 70 100 % des patients se prsentent
avec des lsions ulcres et 0 30 % avec des lsions non ulcres. Depuis 2007, on a fait dexcellents
progrs dans la technique daspiration laiguille ne (AAF) pour prlever des chantillons sur des
cas ayant eu un diagnostic clinique dulcre de Buruli mais qui prsentent des lsions non ulcres.
Jusqualors, la biopsie classique, lemporte-pice, tait prfre la biopsie chirurgicale, plus invasive,
pour obtenir des chantillons partir de ce type de lsions. Elle reste utilise dans quelques pays,
principalement pour la recherche. Aujourdhui, un certain nombre de pays ont recours la biopsie par
aspiration laiguille ne pour prlever les chantillons en vue de la conrmation de linfection par le
laboratoire. La biopsie lemporte-pice nest plus la technique de choix, mais on peut y avoir recours
dans des circonstances spciales, prcises ci-aprs.
Bien que les interventions chirurgicales soient moins frquentes de nos jours, il faudrait toujours
proter de chaque cas passant en chirurgie pour se procurer des chantillons pour les analyses de
laboratoire.
|101
MTHODES UTILISES POUR LE DIAGNOSTIC
Les laboratoires font couramment appel quatre mthodes pour conrmer la maladie cause par
M. ulcerans : examen direct de frottis, amplication gnique (PCR), culture et histopathologie. Nous
allons rsumer ci-dessous les avantages et les inconvnients de chacune de ces mthodes.
MTHODES DE DIAGNOSTIC
Mthode Advantages Inconvnients
Examen direct de
frottis
Facile excuter au niveau local
Pas besoin de matriel ni
dquipement coteux
Peut tre effectu partir
dchantillons prlevs par
couvillon, AAF ou biopsie
Faible sensibilit (< 60 %)
Ne fait pas la distinction entre
organismes viables et non viables
Ncessite un systme dassurance
externe de la qualit
Amplication gnique
(PCR) pour IS2404
Rsultats obtenus assez rapidement
Peut tre effectu partir
Grande sensibilit et spcicit
(> 90 %)
Excution coteuse
Ncessite un contrle rigoureux de
la qualit
Culture de M. ulcerans Peut tre effectue partir
Seule mthode qui peut faire la
distinction entre organismes viables
et non viables.
Mthode utilisable pour surveiller la
rponse des patients au traitement
antimycobactrien
Rsultats obtenus en 6 12 semaines
au minimum
Faible sensibilit (20-60 %)
Pas utile pour la prise en charge
immdiate des patients
Histopathologie Sensibilit de 90 % environ
Rsultats obtenus assez rapidement
Utile pour poser un diagnostic
diffrentiel et surveiller les ractions
inattendues au traitement
Excution coteuse
Ncessite une procdure invasive
(biopsie)
102|
TECHNIQUES DE PRLVEMENT DES CHANTILLONS
On utilise trois techniques : couvillonnage, aspiration laiguille ne et biopsie ( lemporte-pice
ou chirurgicale). On peut utiliser les chantillons obtenus pour le dpistage de routine et la prise en
charge clinique des patients, ainsi que pour la recherche.
1. PRISE EN CHARGE CLINIQUE (EN ROUTINE) ET DPISTAGE DES CAS
Lcouvillonnage et laspiration par aiguille ne sont des procdures simples, pouvant tre faites
nimporte quel niveau des soins (centres communautaires, centres de sant, hpitaux), au cours de la
prise en charge en routine ou pendant la recherche des cas.
1.1 COUVILLONS
Les chantillons obtenus par couvillonnage doivent tre prlevs aprs diagnostic clinique sur les
bords creuss dun ulcre de Buruli. Cette technique peut tre excute par des mdecins ou des
agents de sant expriments. En gnral, la plupart des patients se prsentent avec des ulcres, de
sorte que lcouvillonnage peut tre utilis dans la plupart des situations. Il faut nanmoins sefforcer de
limiter le plus possible les douleurs et les saignements pouvant apparatre au cours de lintervention ;
les agents de sant qui excuteront cette technique devront tre sufsamment forms.
1.2 ASPIRATION LAIGUILLE FINE (AAF)
Elle est principalement utilise pour prlever, aprs le diagnostic clinique, des chantillons partir
de lsions non ulcres (telles que nodules, plaques ou dmes). Selon lendroit, cette technique
est ncessaire pour une proportion de patients allant jusqu 30 % et elle est sufsamment simple
pour pouvoir tre employe largement sur le terrain. On peut galement avoir recours lAAF pour
certaines lsions ulcres, lorsquil est difcile de prlever des couvillons cause de la cicatrisation
des bords. Seuls des mdecins expriments ou des agents de sant expriments devraient pratiquer
lAAF ; les agents de sant doivent tre sufsamment forms (formation continue) et encadrs pour
pouvoir amliorer leurs comptences.
Il faut faire extrmement attention lorsquon effectue une AAF dans la rgion de la tte ou du cou
(en particulier autour des yeux), ainsi quau niveau des organes gnitaux. Si ncessaire, un clinicien
expert excutera cette technique pour rduire le plus possible le risque de lsions involontaires des
structures ou organes importants.
LOMS recommande de prlever au maximum deux couvillons ou deux aspirations laiguille ne sur
chaque lsion, en fonction de lexprience de la personne procdant aux prlvements.

Il arrivera quun nouveau prlvement soit ncessaire si les rsultats de la PCR sont ngatifs, malgr
un diagnostic clinique reposant sur des bases solides.

1.3 BIOPSIE ( LEMPORTE-PICE OU CHIRURGICALE)
Les chantillons prlevs par couvillonnage ou aspiration laiguille ne sufsent dans la plupart des
cas. On aura recours aux autres formes de biopsie ( lemporte-pice ou chirurgicale) si le diagnostic est
dans lintrt direct du patient (par exemple, si on a essay sans succs ou abandonn les couvillons
ou lAAF). On prfrera la biopsie chirurgicale lorsque lon doit prlever de grands chantillons
de diagnostic pour lanalyse histopathologique (en cas de suspicion dvolution cancreuse, ou de
suspicion de maladies autres que lulcre de Buruli).
|103
INDICATIONS ET TECHNIQUES DE PRLVEMENT PRCONISES
Indication Technique de prlvement prconise
1. Poser le diagnostic diffrentiel de lulcre de Buruli Biopsie chirurgicale ou lemporte-pice
2. Chercher la cause dune raction paradoxale (voir
section 4.7.7 dans le manuel pour plus dinformations)
Biopsie chirurgicale ou lemporte-pice
3. Dterminer sil y a chec thrapeutique malgr une
administration russie dantibiotiques de grande qualit
4. tablir lventualit dune volution cancreuse Biopsie chirurgicale ou lemporte-pice
5. Reconrmer, dans des essais cliniques, le diagnostic clinique
par au moins deux mthodes de laboratoire, et valuer le
processus pathogne et lefcacit thrapeutique
Recueil des chantillons
Les biopsies seront prleves par un mdecin quali ou un agent de sant expriment qui a examin
le patient et qui a dcid que la biopsie tait la seule option pour obtenir un chantillon.
Les chantillons pour les analyses histopathologiques (ou microbiologiques) doivent tre
prlevs partir dune biopsie unique, plutt qu partir de multiples biopsies lemportepice.
Il ne faut pas prlever de biopsies sur des lsions faciales (pour des raisons esthtiques)
ou sur dautres sites dlicats (tte, cou ou proximit des organes gnitaux par exemple).
Les biopsies lemporte-pice ne doivent tre ralises que dans des structures o le risque
infectieux est aussi rduit que possible et o il existe des quipements pour prendre en charge
les hmorragies profuses.
Il faut prendre toutes les mesures ncessaires pour que les patients prouvent le moins de
douleur et dinconfort possible.
2. RECHERCHE
Nombre des techniques dcrites ci-avant et des conditions dans lesquelles on choisira de les utiliser
sont galement valables pour la recherche. Dans des cas exceptionnels, ou lorsque des justications sur
des bases thiques solides ont t donnes (par exemple les raisons pour lesquelles des chantillons
ou des procdures en routine ne peuvent pas tre utilises, ou la ncessit de rpondre des questions
essentielles de recherche), le protocole de recherche devra fournir des explications dtailles. Les
patients devront galement recevoir des informations (sur la procdure et lusage que lon entend faire
des chantillons) qui gureront sur le formulaire de consentement. Seuls des cliniciens expriments
pourront prlever des biopsies. Pour des sites tels que le visage, le cou et les organes gnitaux, les
biopsies lemporte-pice sont exclues.

La protection des patients participant aux travaux de recherche est dcrite dans des normes
internationales qui ne doivent pas varier dun pays lautre. Il est donc essentiel que les personnes
travaillant sur lulcre de Buruli mettent au point leur propre code dthique pour garantir ces normes
de la pratique mdicale dans le cadre de leurs travaux de recherche.
Il est toujours possible davoir des chantillons pour la recherche. Les chercheurs devraient tre srs
que les possibilits de se procurer des chantillons provenant de patients pour la conduite de leurs
travaux existent ou sont recherches.
104|
Histopathologie (et microbiologie)
Le parage des ulcres ncross ou des lsions, ou lexcision limite de tissus pendant ou aprs le
traitement antibiotique, donnent loccasion de se procurer des chantillons pour la recherche.
Cultures
Il est possible de faire des cultures satisfaisantes, mme partir des couvillons prlevs sur les lsions
ulcreuses, observes chez 70 100 % des patients. De nouveaux travaux sont ncessaires pour
dterminer le nombre de cultures quon peut obtenir partir des chantillons prlevs par AAF.
Il nest pas ncessaire dobtenir des cultures pour chaque patient ou lsion tant que rien nindique
lapparition de souches de M. ulcerans rsistantes aux antibiotiques.
|105

Fre

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Fre

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

DIAGNOSTIC

Edit par : Franoise Portaels

French_Laboratory of Mycobacterium ulcerans disease_2013.indd Sec1:98 11/03/2014 14:47:59

S-ar putea să vă placă și