Informe 3 Microbiología

Centro de Gestin Industrial
Informe de Laboratorio No 03
DEGRADACIN BIOTECNOLGICA DE LA HIERBABUENA (Mentha Spicata)
POR PARTE DE MICROORGANISMOS CELULOLTICOS.

Aprendices
Nidia Marcela Guayana Suavita
Ivn Daro Lozano Valerio
Estefana Muoz Paramo
Laura Giselle Ruiz Espinel

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE (SENA)
CENTRO DE GESTIN INDUSTRIAL
TECNOLOGIA EN QUMICA APLICADA A LA INDUSTRIA
FICHA SOFA: 518261
BOGOT D.C.
JUNIO DE 2014

Centro de Gestin Industrial

Informe de Laboratorio No 03
DEGRADACIN BIOTECNOLGICA DE LA HIERBABUENA (Mentha Spicata)
POR PARTE DE MICROORGANISMOS CELULOLTICOS.

Aprendices
Nidia Marcela Guayana Suavita
Ivn Daro Lozano Valerio
Estefana Muoz Paramo
Laura Giselle Ruiz Espinel

Instructor
Sonia Marcela Buitrago Morales

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE (SENA)
CENTRO DE GESTIN INDUSTRIAL
TECNOLOGIA EN QUMICA APLICADA A LA INDUSTRIA
FICHA SOFA: 518261
BOGOT D.C.
JUNIO DE 2014
CONTENIDO

INTRODUCCIN ............................................................................................... 7
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 7
Objetivos especficos ...................................................................................... 7
PROCEDIMIENTO ............................................................................................. 8
3.1 Alistamiento de material ............................................................................ 8
3.2. Preparacin de las muestras.................................................................... 8
3.4 Montaje del proceso biotecnolgico .......................................................... 9
3.5 Muestreos ............................................................................................... 10
3.6. Determinacin de variables: biomasa, pH, densidad, % de celulosa ..... 10
3.6.1 Determinacin de Biomasa (Recuento en Placa) ............................. 10
3.6.2 Determinacin de pH ........................................................................ 11
3.6.3 Determinacin de Densidad .............................................................. 11
3.6.4 Determinacin de % de celulosa....................................................... 11
CLCULOS ...................................................................................................... 12
RESULTADOS ................................................................................................. 15
ANLISIS DE RESULTADOS .......................................................................... 17
CONCLUSIONES ............................................................................................. 19

INDICE DE TABLAS

Tabla 1 : Variables seguimiento de la fermentacin ......................................... 15

INDICE DE GRAFICAS

Grafica 1: Biomasa vs Tiempo ......................................................................... 16
Grafica 2 : pH vs tiempo ................................................................................... 16
Grafica 3 : Densidad vs Tiempo ....................................................................... 17

TABLA DE IMGENES

Imagen 1: Tincin de Gram Fermentacin Hierbabuena (Mentha Spicata) Hora
Cero ................................................................................................................. 21
cuatro ............................................................................................................... 21
Imagen 3:Tincin de Gram Fermentacin Hierbabuena (Mentha Spicata) Hora
veinticuatro ....................................................................................................... 22
treinta ............................................................................................................... 22
Imagen 5:Tincin de Gram Fermentacin Hierbabuena (Mentha Spicata) Hora
noventa y seis .................................................................................................. 22

INTRODUCCIN
Las enzimas son molculas proteicas que actan como catalizadores
naturales en las reacciones qumicas, estas disminuyen la energa de
activacin, esto provoca que la reaccin se lleve a cabo de una manera ms
rpida; las enzimas no son consumidas en la reaccin y tampoco altera su
equilibrio qumico. (Brandan, 2008)
Las enzimas son muy especficas en el trabajo que realizan. Por ejemplo, las
enzimas de amilasa, solo trabajan en almidn, las enzimas de proteasa lo
hacen con protenas, etc., esto permite que las enzimas contengan
caractersticas que son de gran beneficio en procesamientos industriales. En
otros casos, algunas enzimas se utilizan juntas para lograr el resultado final
esperado. Por esta razn, tomando en cuenta el pH, la temperatura, adems
de otras condiciones del proceso, es importante seleccionar la enzima correcta
(Pedraza, sf)
Se lleva a cabo este ensayo con el fin de hallar un microorganismo, sea este
hongo o bacteria que pueda sintetizar una enzima capaz de hidrolizar celulosa
y as dejar vulnerable algunos compuestos de la materia prima (Hierbabuena);
para identificar el microorganismo capaz de excretar la enzima, se vigilara el
proceso de degradacin de la materia prima y as observar el comportamiento
de la enzima; el microorganismo debe ser capaz de cumplir con dicha tarea y
de esta manera optimizar la separacin de los componentes de
inters, persiguiendo con esto un aumento en los rendimientos en los
procesos de extraccin, disminuir costos y hacer un proceso ms amigable
con el medio ambiente

OBJETIVO GENERAL

Obtener un extracto crudo a partir de la materia prima (hierbabuena) a travs de
procesos biotecnolgicos usando microorganismos celulolticos.

Objetivos especficos

Elaborar inculos microbianos a partir de microorganismos
celulolticos para llevar a cabo el proceso biotecnolgico.
Realizar el montaje de la fermentacin de material vegetal para la
obtencin de un extracto crudo que pueda ser evaluado frente a
extractos crudos obtenidos qumicamente.
Controlar la temperatura del proceso de acuerdo con las
caractersticas propias de los microorganismos.
Cuantificar la biomasa producida en la fermentacin por medio de la
tcnica de recuento en placa.
Medir el pH del proceso fermentativo y su comportamiento durante la
fermentacin.
Determinar el porcentaje de celulosa mediante la recuperacin del
metabolito de inters.
PROCEDIMIENTO

3.1 Alistamiento de material

3.2. Preparacin de las muestras

INICIO
Tomar el sustrato (Hierbabuena),
Eliminar
manualmentepartculasextraas
de suelo.
Preparar el sustrato al 10% p/v de
materia prima con un volumen final
de 500 ml de agua destilada.
Cortar los sustratos con un
dimetro de 3mm, verificando
que el tamao sea uniforme.
FIN
Llevar el sustrato a un
frasco tapa azul de 1 litro.
Autoclavar a 15 lb de
presin, 121C por 15
minutos.
INICIO
Lavar las cajas de Petri, pipetas
graduadas, tubos tapa rosca,
esptulas de vidrio y Frasco shot.
Envolver en papel Kraft las
pipetas graduadas, las
cajas de Petri y esptulas
de vidrio.

Ingresar todo a la autoclave
a 121C, 15 lb de presin
por 15 minutos.
No retirar el papel Kraft hasta
que se utilicen los materiales
para evitar contaminacin.
FIN

3.3 Montaje del inculo

3.4 Montaje del proceso biotecnolgico

INICIO
Tomar la siembra masiva que
se tiene del microorganismo
seleccionado.
Tomar un asa estril, y raspar
las colonias de la siembra
masiva de microorganismos.
Adicionar lo que se raspo de
las colonias, en un tubo con
5ml de solucin salina.
Llevar a concentracin
igual al patrn N 5 de
McFarland.
Tomar un Erlenmeyer de
250 ml estril.
Adicionar 45 ml de caldo de
materia prima y los 5 ml de la
suspensin elaborada
previamente.
Llevar a cultivar a una
temperatura de 35C por 24
horas.
FIN
INICIO
Tomar el sustrato que se en el
frasco schott con el inoculo
Llevar al agitador orbital a 130
rpm a 35 c por 96 horas.
FIN
3.5 Muestreos

3.6. Determinacin de variables: biomasa, pH, densidad, % de celulosa

3.6.1 Determinacin de Biomasa (Recuento en Placa)

INICIO
Agregue en diferentes tubos
tapa rosca el ml, que contiene
agua peptonada.
Tome 1 ml de cada una de las
muestras (hora 0, 4, 24,30 y
96).
Realice para las muestras (30
y 96) diluciones seriadas de
10
-1
hasta 10
-4
.

FIN
Despus realice una siembra
en placa de las diluciones 10
-3

y 10
-4
.
INICIO
Para finalizar debe en
incubacin por 7 das a 30C.
Despus de transcurrido el
tiempo de incubacin del
inculo, retrelo del agitador
orbital
De manera asptica agrguelo
a los 450 ml de caldo materia
prima restantes.
Realice la lectura de
resultados con la tcnica de
Rojo Congo
Tome una alcuota de 5 ml del
caldo con el inculo para medir
variables
Llvelo de nuevo a agitacin, a
temperatura de 35 C con
agitacin de 130 rpm y por un
periodo de 4 das
Se realiza un muestreo a las 4
horas, 24 horas, 30 horas y a
las 96 horas.
El muestreo se toma con una
pipeta estril, tomando 10 ml
en cada hora del muestreo.
Las muestras se debern
guardar en el refrigerador
marcadas para su posterior
anlisis.
FIN
Luego realice una siembra en
placa de las diluciones 10
-5
y
10
-6
.
Realice para las muestras (0,
4, 24) diluciones seriadas de
10
-1
hasta 10
-6
.
3.6.2 Determinacin de pH

3.6.3 Determinacin de Densidad

3.6.4 Determinacin de % de celulosa

INICIO
Tome el pH-metro e introduzca
e electrodo en soluciones buffer
para calibrarlo.
Llevar cada una de las
muestras (hora 0, hora, 4, hora
24, hora 30, hora 96) a un
beaker.
Despus de calibrado,
introduzca el electrodo en la
muestra indicada y tome nota
del pH. As con cada muestra.
Cada vez que saque el
electrodo, lvelo con agua
destilada o desionizada.
Recordad queda vez que se
introduzca el electrodo en una
muestra hay que lavarlo con
agua destilada.
FIN
INICIO
Tomar la temperatura del agua,
y llenar el picnmetro con agua
hasta el capilar y pesar
Tomar un picnmetro de 10 ml
previamente lavado y seco y
pesarlo.
Realizar los clculos para cada
una de las muestras, haciendo
correccin con la temperatura
del agua.
Luego desocupar el
picnmetro y llenar el
picnmetro con muestra,
pesar.
FIN
INICIO
Tome un gramo de materia
prima antes de procesar y un
gramo de materia prima ya
procesada
Colocarlo en un baln y
adicionarle 20 ml de etanol y 5
ml de cido ntrico
concentrado.
Hervir en bao Mara a reflujo
durante 30 minutos
Terminado el tiempo, pasar por
un filtro Gooch de porosidad
media y peso conocido

CLCULOS

Para la preparacin del sustrato se pesaron 50.09g de materia prima
(hierbabuena) picada y se adicion a un frasco tapa azul con 500ml con agua
destilada.

Para la preparacin del Agar 500ml

Extracto de levadura

Peptona universal

Sulfato de amonio

Fosfato monobsico de potasio

Fosfato bibsico de potasio

El sobrenadante se descarta y
se toma el precipitado
El precipitado se debe someter
a una 2 digestin por 30
minutos de nuevo con 25 ml de
etanol-cido ntrico
Se realiza de nuevo una
decantacin y con el slido se
realiza una tercer digestin con
100 ml de agua destilada por
30 min
FIN
La muestra se debe filtra, se
lava con agua destilada
caliente y posteriormente con
100 ml de solucin saturada de
acetato de sodio y por ltimo
con 500 ml de agua destilada
caliente
Recoger el precipitado y
llevarlo a un crisol previamente
pesado al horno a una
temperatura de 93 C por un
periodo de 12 horas
Sacar el crisol del horno y llevarlo
a desecador por un espacio de 45
minutos y pesar el crisol.
Calcular el % de celulosa
utilizando la siguiente frmula:
% celulosa: (Peso seco del
residuo/ peso de la materia
prima sin procesar) x100

Cloruro de calcio

Clculos para la preparacin de agua peptonada 1000ml

Peptona universal

Cloruro de sodio

Luego de la preparacin del inculo y el sustrato se mezclaron para el
proceso de fermentacin se ajust el pH a 7.03

Clculos para la determinacin de densidad

Densidad Inicial

Peso del picnmetro vaco: 11,7215g
Peso del picnmetro con agua: 22,3990g
Peso del picnmetro con muestra: 22.4336g

Temperatura del agua: 18C
Densidad del agua a esa temperatura: 0,99868 g/ml

Para determinar la densidad inicial de la muestra se halla el volumen real del
picnmetro tomando la densidad del agua a la temperatura dada y despejando
en la formula.

Masa de agua 10.6775g
Densidad del agua a 18C 0.99868g/ml

Densidad inicial de la muestra

Masa de la muestra 10.7121g

Densidad Final

Peso del picnmetro vaco: 13,7172 g
Peso del picnmetro con agua: 23,8465 g
Peso del picnmetro con muestra: 23,8806g

Temperatura de agua a 21C
Densidad del agua a esa temperatura: 0,99808 g/ml

Masa de agua 10.1293g
Densidad del agua a 18C 0.99808g/ml

Densidad Final de la muestra

Masa de la muestra 10.1634g

Clculos para la determinacin de concentracin celular

Hora 0

UFC = 40 colonias * 65d = 2600 UFC
R = 2600 UFC * 10
6
* 10
R = 26*10
9
UFC/ml

Hora 4

R = 2340 UFC * 10
5
* 10
R = 23*10
8
UFC/ml

Hora 24

R = 1950 UFC * 10
6
* 10
R = 20*10
9
UFC/ml

Hora 30

R = 2665 UFC * 10
3
* 10
R = 27*10
6
UFC/ml

Hora 96

R = 1495 UFC * 10
4
* 10
R = 15*10
7
UFC/ml

Clculos para la determinacin del porcentaje de celulosa

Materia prima procesada: 0,9370 g
Materia prima sin procesar: 19,7157 g

Peso del filtro (crisol): 19,7154 g
Peso del papel filtro: 0,88 g

19,7157 - 19,7154 = 3x10
-4
(100) = 0,03 % de celulosa (materia prima sin
procesar) (dato terico 6,3)

0,9370 - 0,88 = 0,057 (100) = 5,7 % de celulosa (materia prima procesada)

RESULTADOS

De acuerdo con los clculos y las observaciones realizadas en la tabla 1 se
registraron los valores de las variables del seguimiento del proceso
biotecnolgico, al igual que las caractersticas del microorganismo en cada una
de las muestras tomadas durante el tiempo de la degradacin.

Tabla 1 : Variables seguimiento de la fermentacin
Muestra Hora Biomasa
Log
10
UFC
pH Densidad Microscopa
% de
Celulosa
1 0
26*10
9
UFC/
ml
10.41
7.03 1.002g/ml
Bacilos Gram
positivos (++)
esporulados
6,3%
2 4
23*10
8

UFC/ml
9.36
5.90
Bacilos Gram
positivos (+)
esporulados

3 24
20*10
9

UFC/ml
10.30
6.53
Bacilos Gram
positivos (+)
esporulados

4 30
27*10
6

UFC/ml
7.43
6.61
Bacilos Gram
positivos (+)
esporulados

5 96
15*10
7

UFC/ml
8.17
7.17 1.001g/ml
Bacilos Gram
positivos (++)
esporulados
5,7%

+ (Pocos microorganismos)
++ (Medio microorganismos)
+++ (Muchos microorganismos)

Se realiz el conteo de las UFC en las cajas de Petri y se plasmaron los
resultados del log
10
de las UFC con respecto al tiempo, marcando la
tendencia a la baja apreciada en la grfica 1

Grafica 1: Biomasa vs Tiempo

Se realiz seguimiento del pH con respecto al tiempo, haciendo la
determinacin a cada muestra tomada a lo largo del proceso como se puede
observar en la grfica 2.

Grafica 2 : pH vs tiempo

Se tom la densidad del caldo al iniciar y al finalizar el ensayo, para apreciar
los cambios con respecto al tiempo; los resultaron estn expuestos en la
grfica.

Grafica 3: Densidad vs Tiempo

ANLISIS DE RESULTADOS

Esta prctica se realiz para identificar y obtener el metabolito de inters para el
proyecto de formacin a partir de un extracto crudo obtenido de la materia prima
Hierbabuena, el cual fue sometido a un proceso de fermentacin; esta
fermentacin se realiz en un frasco schott de 250 ml y posterior a esto se ajust
a un pH inicial de 7.3, se llev a un shaker el cual ofreca una agitacin de 130
rpm y una temperatura de 35C, con el fin de que el microorganismo se
desarrollara favorablemente, puesto que estas son las condiciones necesarias
para obtener un extracto enzimtico.

Se tomaron cinco muestras; para la cual en la primera muestra se determin una
hora cero, para la segunda muestra una hora 4, para la tercera muestra una
hora 24, para la cuarta muestra una hora 30 y para la quinta y ltima muestra,
una hora 96. A cada una de estas muestras se les realiz: medicin de Biomasa,
pH, concentracin celular, densidad y tambin se realiz tincin de Gram para
observar su microscopia, durante el tiempo que se realiz el proceso de
degradacin.

Se realiz un recuento en placa para la determinacin de biomasa y se encontr
que esta disminua y aumentaba a medida que transcurra el tiempo, como se
puede observar en la (Grafica 1.), esto se debe a que la concentracin de la
biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente como resultado
del metabolismo de las clulas observndose en las cuatro fases tpicas de
crecimiento

(Echeverra, 2003), puesto que si se considera la actividad
metablica de un cultivo microbiano a lo largo de toda la curva de crecimiento, se
diferencian aquellos procesos metablicos asociados al crecimiento celular
(metabolismo primario) de aquellos que tienen lugar a la fase estacionaria, una
vez que ha cesado el crecimiento de la biomasa (metabolismo secundario)
(Parz, 1997).

Al realizar las mediciones de pH a cada una de las muestras se observ una
variacin de ste, como se puede evidenciar en la (Grafica 2.), esto es debido a
que los microorganismos al consumir O
2
para su adecuado crecimiento hacen
que este disminuya dando como resultado la produccin de CO
2
en el medio de
cultivo, al ser disuelto en el agua, produce cido carbnico el cual acidifica el
medio; el CO
2
es un compuesto que se produce pero no se consume; por lo
tanto disminuye debido a la agitacin. (Paz, 2010)

Posterior a esto, como se puede observar en la (Grafica 2.),hay un aumento
gradual del pH, lo que permite deducir que hubo un agotamiento de carbono en
el medio, por lo cual el microorganismo empez a consumir el nitrgeno presente
en la peptona del medio de cultivo, la cual es una fuente principal de nitrgeno
en medios de cultivos orgnicos para bacterias por su contenido de aminocidos
libres, que al ser consumidos por el microrganismo liberan iones OH
-
que
quedan en el medio neutralizndolo.

Al finalizar el proceso de degradacin se tom el volumen restante del frasco
schott para determinar la densidad final obteniendo un valor de 1,001 g/ml,
posterior a esto se elabora una rplica del caldo de cultivo con una relacin de
5:50 y se determina un valor de 1,002 g/ml de densidad inicial mediante la
tcnica de picnometra, de esto se puede inferir que al obtener un resultado un
poco mayor en la densidad inicial que en la densidad final como se puede
observar en la (Grafica 3.),es debido a que no se utiliz el mismo picnmetro
para la medicin de la densidad final que para la densidad inicial, puesto que en
la densidad microbiana la masa aumenta de forma continua durante el
crecimiento (Universidad Nacional Federico Villarreal, sf). Hay que tener en
cuenta que se realiz una simulacin de la fermentacin en la cual no se tiene el
mismo nmero de microorganismos que al realizar la fermentacin anterior; este
error se debe a la tcnica utilizada puesto que no fue la adecuada para obtener
un resultado ptimo en la medicin de densidad ya que se esperaba un aumento
de esta.

Despus de la determinacin de densidad del metabolito de inters se realiz
una identificacin microscpica de cada una de las fermentaciones en donde se
evidencio la presencia de microorganismos Gram positivos esporulados como se
observa en las imgenes; (Imagen 1, Imagen 2, Imagen 3, Imagen 4, Imagen 5),
en cada una de las muestras se pudo observar que a medida que pasaba el
tiempo el microorganismo cambiaba su morfologa por la imposibilidad de
generar ciertos componentes celulares hasta que llega un punto donde no
pueden realizar sus funciones biolgicas

(Cerdn, sf), de lo anterior podemos
argumentar que al observar al microscopio el microorganismo presento una
deformacin en su estructura.
Para finalizar la identificacin del metabolito de inters se realiz una tcnica
de digestin con el fin de determinar la porcentaje de celulosa presente en la
degradacin y al realizar la tcnica de filtracin, se perdi una gran cantidad de
materia prima sin procesar debido a un error de mtodo, por lo cual para
determinar la concentracin de celulosa se recomienda volver realizar el
proceso de digestin, para obtener un dato real, ya que no se encontraron
estudios previos que nos indique el valor terico de la celulosa en la
hierbabuena. El porcentaje de la concentracin de celulosa en la materia prima
procesada fue del 5,7%, como no se obtuvo un dato inicial no se puede realizar
una comparacin para verificar un aumento o disminucin de la concentracin
de celulosa, pero se puede inferir que si hay una disminucin del porcentaje de
celulosa la accin enzimtica es ptima.
El proceso biotecnolgico se realiz con el fin de producir un metabolito
primario, el cual es una enzima que se da en la idiofase en la curva de
crecimiento, donde hay una degradacin del material vegetal y este a su vez
sirve como medio de cultivo para la bacteria celuloltica, que excreta las
enzimas (endoglucanasas, exo-1,4--D-glucanasas y la -glucosidasa) las
cuales son de inters para el proyecto de formacin. Debido a los resultados
obtenidos se demuestra que este proceso biotecnolgico no es viable, puesto
que la materia prima contiene agentes inhibidores enzimticos como taninos y
fenoles (Hernndez, 2010); presentes en la hierbabuena afectando la
excrecin de la enzima, se recomienda trabajar con otro tipo de materia prima o
microorganismo para la produccin de las enzimas de inters.

CONCLUSIONES

Se prepar el inoculo microbiano a partir de la siembra del microorganismo
celuloltico aislado en prcticas anteriores para llevar a fermentacin y dar
inicio al proceso biotecnolgico, para la obtencin del metabolito de inters
enfocado al proyecto de formacin.

Se realiz el montaje de fermentacin del material vegetal (hierbabuena),
mezclando de manera asptica el inoculo obtenido, con el caldo de materia
prima restante; con lo que se obtuvo un extracto crudo para su posterior
evaluacin frente a los obtenidos qumicamente en el laboratorio.

Se controlaron variables como temperatura, pH, biomasa, densidad y
concentracin celular durante todo el proceso ofreciendo las caractersticas
propias al microorganismo para un posterior anlisis.

Se cuantifico la produccin de biomasa durante el proceso de fermentacin a
travs de la tcnica de recuento en placa; arrojando recuentos que se pueden
evidenciar en la (Tabla 1.) indicando la viabilidad del microorganismo durante
el proceso.

Se realiz la medicin de pH en el proceso de degradacin lo cual indico una
variacin del mismo, debido a los procesos metablicos que realiza el
microorganismo en el medio de cultivo.

Se determin el porcentaje de celulosa por el mtodo de Kurschner y Hoffer
tomando de forma paralela materia prima procesada y sin procesar, lo que
arrojo como resultado que el porcentaje de celulosa en la muestra procesada
fue del 5.7% y el porcentaje de celulosa de la muestra sin procesar no se
logr determinar de manera correcta puesto que en el momento de la
filtracin se produjo una perdida debido a que algunas de las partculas por
su tamao tan pequeo no fueron retenidas por el filtro, lo que impidi
realizar una comparacin entre un resultado y el otro.

Se obtuvo un extracto enzimtico por medio de una fermentacin discontinua
siguiendo una serie de procedimientos de manera adecuada y precisa de la
materia prima propia del proyecto de formacin, usando microorganismos
celulolticos y aplicando procesos biotecnolgicos que pueden generar
mejores resultados en la finalidad del proyecto de formacin.

BIBLIOGRAFA

Brandan, N. (2008). ENZIMAS. Recuperado el 11 de Junio de 2014, de UNNE
facultad de medicina:
http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/enzimas.pdf

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2014, de Cerveceros caseros:
http://www.cerveceroscaseros.com.ar/interior/todoslostitulos.php?aj_go=m
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Echeverra. (2003). CONSTRUCCION DE UN PROTOTIPO DIDACTICO PARA
LA FERMENTACION ALCOHOLICA Y ACETICA DE CICLO CERRADO.
Recuperado el 5 de Junio de 2014, de UNIVERSIDAD TECNOLOGICA
EQUINOCCIAL:
http://repositorio.ute.edu.ec/bitstream/123456789/5344/1/22259_1.pdf

Hernndez. (2010). Defensa de las plantas a los fitopatgenos. Recuperado el 5
de Junio de 2014, de Universidad Central de Venezuela:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_agronomia/Fitopatologia
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Meja. (2009). Hidrlisis y fermentacin alcohlica simultnea (HFS) del residuo
agroindustrial del mango comn (Mangifera indica L) utilizando levaduras
Saccharomyces Cerevisiae SPP y cepa recombinante RH 218*.
Recuperado el 5 de Junio de 2014, de Universidad San Buenaventura:
http://investigaciones.usbcali.edu.co/ockham/images/volumenes/Volumen
7N2/V702-04HidrOlisisyFermentaciOn.pdf

Parz, R. (1997). BIOQUMICA DE LOS MICROORGANISMOS. REVERT, S.A.

Paz, I. (2010). Diseo integral de biorreactores continuos de tanque agitado
aplicados a procesos de fermentacin. Recuperado el 5 de Junio de 2014,
de Universidad Nacional de Colombia:
http://www.bdigital.unal.edu.co/2356/1/isabelcristinapazastudillo.2009.pdf#
page=116

Pedraza, N. M. (s.f.). Enzimas. Recuperado el 11 de Junio de 2014, de Enzimas:
http://enzimasnelly.blogspot.com/

Universidad Nacional Federico Villarreal. (s.f.). Crecimiento Microbiano.
Recuperado el 5 de Junio de 2014, de Universidad Nacional Federico
Villarreal facultad F.I.I.S. Escuela Ing. Agroindustrial Microbiologa I.:
http://es.scribd.com/doc/17103580/crecimiento-microbiano-PARTE1

Anexos

Imagen 1: Tincin de Gram Fermentacin Hierbabuena (Mentha Spicata)
Hora Cero

Tomada en el Laboratorio de microbiologa. Autor Estefana Muoz

Hora cuatro

Hora veinticuatro


Hora treinta


Hora noventa y seis


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