1

ENZYMOLOGIE
INHIBITIONS ENZYMATIQUES

Notes de cours


Casimir BLONSKI





Institut de Chimie Molculaire et des Matriaux dOrsay - UMR 8182
Groupe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique
LabEx LERMIT
Universit Paris-Sud 11
Orsay

2


Inhibition enzymatique

inactivation dune enzyme (ralentissement de la
raction enzymatique) par la liaison dune petite
molcule
diffrente que la dnaturation


Types dinhibition

rversible
comptitive
incomptitive
noncomptitive
irrversible
par marqueur daffinit
par inhibition suicide

3

Leonor Michaelis (1875-1940) and Maud Leonora Menten
(1879-1960)
The kinetics of invertase activity

Biochemische Zeitschrift 49, 333 (1913)










Saturation curve for an enzyme showing the relation between the
concentration of substrate and rate.

4

Inhibition comptitive
la liaison de linhibiteur, lenzyme libre, empche la
liaison du substrat







Exemple de linhibition competitive
lacide malonique ressemble lacide succinique et inhibe la
dhydrognase de succinate lors de sa liaison :



S
Enz
S Enz
I Enz
I
E ES E + P
k
1
, S k
2
EI
k
i
, I
k
-1
k
-i

5

quations pour linhibition comp.

Graphique dinhibition comptitive
[S]
V
i
t
e
s
s
e
,

v
V
m
a
x

/

2
K
M
v = V
max
= k
cat
[E]
0
K
M
app
[I] = 2 K
i
[I] = K
i
[I] = 0
K
M
app'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition comptitive

+ +
=
i
M
max
] I [
1 ] S [
] S [
K
K
V
v

6


7

Graphique dinhibition comptitive

1/[S]
1
/
v
0
pente = K
M
/ V
max
1

/ V
max
-1

/ K
M
Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition comptitive
-1

/ K
M
app'
-1

/ K
M
app
[I] = 0
[I] = K
i
[I] = 2 K
i

Dtermination de K
i
(comptitive)

max max
M
1
S] [
1
] I [
1
1
V V
K
K
v
i
+

+
=

8

quation pour IC
50
(comptitive)
quations de vitesse lorsque [I
comp
] = IC
50
:



9

Inhibition incomptitive
linhibiteur est li par le complexe ES

Exemple de linhibition incomptitive
inhibition de la phosphatase alkaline par la L-
phnylalanine:


10

quations pour linhibition incomp.


Graphique dinhibition incomptitive
[S]
V
i
t
e
s
s
e
,

v
V
m
a
x

/

2
K
M
v = V
max
= k
cat
[E]
0
K
M
app
[I] = 2 K
i
[I] = K
i
[I] = 0
K
M
app'
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incomptitive
V
m
a
x
a
p
p

/

2
V
m
a
x
a
p
p
'
/

2

+
+

+
=
i
M
i
max
] I [
1
] S [
] I [
1
] S [
K
K
K
V
v


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Graphique dinhibition incomptitive

Dtermination de K
i
(incomptitive)


12

quation pour IC
50
(incomptitive)
quations de vitesse lorsque [I
incomp
] = IC
50
:

Inhibition non-comptitive
linhibiteur est li par lenzyme libre et par le complexe
ES

13


Exemple de linhibition non-comp.
inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :

quations pour linhibition noncomp.

14


Inhibition non-comptitive simple
laffinit de linhibiteur est indpendante de la
prsence de substrat (i.e. K
i
= K
i
')
K
M
nest pas affect
V
max
est diminu par le facteur de

+
'
i
] I [
1
K

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Graphique dinhibition non-comptitive simple
[S]
V
i
t
e
s
s
e
,

v
V
m
a
x

/

2
K
M
v = V
max
= k
cat
[E]
0
[I] = 2 K
i
[I] = K
i
[I] = 0
Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncomptitive simple
V
m
a
x
a
p
p
'
/

2
V
m
a
x
a
p
p

/

2
M
i
max
] S [
] I [
1
] S [
K
K
V
v
+

+
=

Graphique dinhibition non-comptitive simple

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Dtermination de K
i
(non-comptitive simple)
quation pour la diminution de V
max
:



Inhibition non-comptitive mixte

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laffinit de linhibiteur dpend de la prsence de substrat
(i.e. K
i
K
i
')
V
max
est toujours diminu par le facteur de
K
M
est affect selon K
i
et K
i
'

Inhibition non-comptitive mixte
lorsque K
i
< K
i
', K
M
augmente et linhibition ressemble
linhibition comptitive :

+
'
i
] I [
1
K

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Inhibition non-comptitive mixte
lorsque K
i
> K
i
', K
M
diminue et linhibition ressemble
linhibition incomptitive :

Dtermination de K
i
' (non-comptitive mixte)
quation pour la diminution de V
max
:



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Dtermination de K
i
(non-comptitive mixte)
quation pour la variation de K
M
:



quation pour IC
50
(non-comp. simple)
quations de vitesse lorsque [I
noncomp
] = IC
50
:

20



21

Inhibition irreversible
pour des inhibiteurs rversibles, on utilise le K
i
comme
un indice de lefficacit de linhibition
pour les inhibiteurs irrversibles, on utilise le k
inact
et le
K
I

il y a deux types dinhibiteurs irrversibles :
ractifs du site actif (marquage par affinit)
inhibiteurs bass sur le mcanisme (substrats
suicide )
Marqueurs par affinit
dmontrent la spcificit envers un groupement
fonctionnel des acides amins du site actif
analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans
les site actif
comprennent aussi un groupement ractif
(pharmacophore) typiquement un lectrophile qui
ragit avec un nuclophile dans le site actif
possdent un seul site saturable et ragissent de manire
stchiomtrique (1 mol de I/mol de E)

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Marquage par affinit
lenzyme est protge contre cette inhibition par le
substrat (ou co-facteur)
la perte dactivit suit une cintique de premier ordre,
parce que lenzyme est consomme comme un ractif
pendant la raction
linhibition est accompagne de la modification covalente
de lenzyme :
lenzyme demeure inactive aprs la sparation de
lexcs de linhibiteur
linhibiteur reste li la protine aprs dialyse ou
filtration sur gel (ou sur membrane) mme aprs la
dnaturation de lenzyme


23

Exemples de marquage par affinit
TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)
ressemble un amide de la phnylalanine, mais le
groupement chloromthyle ctone effectue lalkylation de
la His57 de la chymotrypsine :





DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)
ragit avec le groupement hydroxyle des rsidus de
srine :





O
CH
2
Cl
NH
S O O
CH
3
N NH
Enz
N N
O
CH
2
NH
S O O
CH
3
Enz
Cl
H
Enz
HO
P
O
F
O O
Enz
O
P
O
O O
F
H

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PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)
utilis pour inhiber des protases et ragit aussi avec des
rsidus de srine :




Exemples de marquage par affinit

Enz
HO
F
H
CH
2
S
O
F
O
Enz
O
CH
2
S
O
O

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Analyse cintique
liaison rapide lquilibre de linhibiteur suivie de la
formation lente et irrversible dun complexe inactif :





la proportion denzyme sous forme EI augmente avec la
concentration de I
EI sinactive suivant une cintique du premier ordre
k
1

k
-
1
K
I
=
E I
EI E I +
k
1
k
-
1
k
inact
complexe
covalent
inactif

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Mesure de k
inact
k
inact
peut tre dtermine en mesurant la perte dactivit
en fonction du temps (k
obs
) diffrentes concentrations
dinhibiteur :
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%

a
c
t
i
v
i
t

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)
[I] = 0
[I] = 0.2 K
I
[I] = 0.5 K
I
[I] = 2 K
I
[I] = K
I
constante de vitesse = k
obs


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