Aislamiento y cuantificacin de glucgeno.

Introduccin.
Los seres vivos almacenan glcidos en forma de polisacridos, que sirven como
materiales de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente como
almidn, en los animales se presentan en forma de glucgeno. El glucgeno es una
biomolcula que est conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces
glucosdicos (1-4) con ramificaciones mediante enlaces (1-6).



El glicgeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos animales. El
depsito principal de glicgeno son el hgado (de 2 a 5%) y los msculos (de 0.5 a 2%),
en los cuales esta acumulado hasta en un 60% de su contenido en el organismo. En
situacin de inanicin, el glucgeno es la primera reserva que se moviliza para
mantener la glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del
glucgeno est asociado al nivel de la glucosa sangunea, durante una buena
alimentacin se presenta su sntesis o glucogenognesis, en condiciones de ayuno
ocurre su degradacin o glucogenlisis El glucgeno del msculo esqueltico tiene
como finalidad suministrar glucosa para que sea degradada oxidativamente y se pueda
obtener ATP para la actividad muscular. En contraste, el glucgeno heptico sirve
como fuente de glucosa para los tejidos extrahepticos, incluido el msculo
esqueltico, ante un descenso de la glucemia. Una vez agotado el suministro de
glucosa va glucogenlisis y para cubrir requerimientos tejidos del organismo la ruta
para sntesis de glucosa es a travs de la gluconeognesis, la cual procede a partir de
sustancias distintas a los carbohidratos, tales como aminocidos y lactato glicerol. La
extraccin del glucgeno de tejidos, como el hgado, se realiza mediante un proceso de
homogenizacin y ruptura celular, as como la extraccin y la eliminacin de las
protenas para evitar interferencias en el anlisis posterior del polisacrido.
Competencia.
Determinar el contenido de glucgeno en tejidos de un animal acutico, para estimar
su capacidad de almacenamiento y relacionar con su funcin metablica, con
organizacin y compromiso.
Materiales y reactivos.

Materiales.
Estuche de diseccin, esptula, homogeneizador manual, tubos de ensaye, pipetas
volumtricas de 1 y 5 mL, pipeteros, tubos de centrifuga, celdas para
espectrofotmetro.
Instrumental.
Balanza analtica, bao de temperatura controlada, centrifuga, espectrofotmetro.
Reactivos.
KOH acuoso al 30%, etanol, K
2
SO
4
al 10%, fenol 5%, H
2
SO
4
concentrado.
Metodologa.













1) A partir de peces recin sacrificados obtener muestras de hgado y
musculo, enseguida pesar por duplicado 1.0 g de hgado y 2 g de msculo.
2) Homogeneizar las muestras de tejidos con 5 mL de KOH al 30%.
3) Calentar los homogenizados en un bao de agua a ebullicin por 15
minutos, agitar ocasionalmente.
4) Centrifugar los homogenados a 3000 rpm por 5 minutos, separar la capa de
cada sobrenadante y colocarla en tubo de ensaye.
5) Tomar 0.1 ml del sobrenadante y aadir 3 mL de etanol y 0.1 ml de K2SO4
al 10%, agitar.
6) Reposar los tubos con la mezcla en bao de hielo por 5 minutos.
7) Centrifugar los tubos 5 minutos a 3000 rpm, desechar el sobrenadante y
separar el glucgeno precipitado.
8) Solubilizar el precipitado en 3 mL de agua.
9) Colocar en dos tubos de ensaye alcuotas de 0.5 mL de la solucin de
glucgeno, adicionar a cada tubo 0.5 mL de solucin de fenol al 5%,
mezclar perfectamente, enseguida adicionar cuidadosamente 2.5 mL de
cido sulfrico concentrado y homogeneizar.
10) Calentar los tubos en bao de agua a 90 C por 15 minutos
11) Enfriar los tubos a temperatura ambiente y determinar la respectiva
absorbencia 490 nm, ajustar el equipo con un blanco preparado de la
misma manera reemplazando la muestra con agua destilada.
12) Calcular la cantidad de carbohidratos presentes en la muestra a partir de
una curva patrn preparada con glucgeno en el intervalo de sensibilidad
del mtodo colorimtrico.

1.1.1. Resultados a reportar.

Grfica, ecuacin y coeficiente correlacin de la curva de calibracin de
glucgeno.
Contenido de glucgeno (mg/g) en los tejidos analizados.