PCR Transcripcin reversa

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica "in vitro" que

imita la habilidad natural de la clula de duplicar el ADN.
Se trata de una tcnica usada para crear un gran nmero de copias de un
segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalizacin, apareamiento con
cebadores y extensin por una ADN polimerasa termoresistente.
Hasta la dcada de 1980, el nico mtodo para obtener grandes cantidades de un
fragmento de ADN era clonndolo en vectores adecuados e introducindolo y
multiplicndolo en bacterias. En el ao 1985, un investigador norteamericano,
Kary Mullis (acreedor del Premio Nobel en Qumica 1993 por este aporte),
desarroll un mtodo que permite, a partir de una muestra muy pequea de
ADN, obtener millones de copias de ADN in vitro, en unas pocas horas y sin
necesidad de usar clulas vivas. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucletidos de los extremos
del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para disear dos
oligonucletidos sintticos de ADN complementarios a una porcin de cada una
de las dos cadena de la doble hlice.


1. La mezcla de reaccin contiene la secuencia
de DNA que se quiere amplificar, dos
oligonucletidos sintticos (P1 y P2) que
servirn como cebadores, una DNA polimerasa
termoestable (Taq) y los cuatro
desoxirribonucletidos trifosfato dATP, dGTP,
dCTP





PCR a partir de ARN.
El genoma de muchos virus de importancia clnica est compuesto de ARN en
lugar de ADN, los ms sobresalientes son el Virus de la Inmunodeficiencia
Humana (VIH), el Virus de la Hepatitis C (HCV) y la familia de Enterovirus
(EV).

Transcripcin Reversa- PCR (RT-PCR).
Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es
necesario hacer una transcripcin reversa (RT) antes de iniciar la amplificacin
por PCR. La transcripcin reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero
esta copia es ADN complementario (cADN) el cual es estable al calor y puede
resistir la metodologa PCR.
Los pasos de la RT-PCR son:
1. Transcripcin reversa: Unin del partidor a la secuencia de ARN objetivo.
2. Transcripcin reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensin del partidor
mediante la incorporacin de nucletidos complementarios.
3. Fin de transcripcin reversa, se obtiene la hebra del cADN complementario al
ARN.
4. PCR.
1er paso: Retrotranscripcin a partir del ARN.
2 paso: Amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.
3er paso: Se procede a relaizar PCR de cualquier otro tipo.
Algunas aplicaciones de este tipo PCR son: La transcriptasa inversa se utiliza para
crear bibliotecas de cDNA de ARNm, Diagnostico molecular, Evalucacion de terapias,
Deteccin temprana de Citomegalovirus y otros patgenos en pacientes con
transplante de rganos, entre otras muchas mas.


2.5 Microscopia electrnica de transmisin: A diferencia de los anteriores
microscopios, este no explora superficies , por el contrario el haz de electrones
incidente atraviesa la muestra o espcimen observado y la sombra de detalles
finos o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente con
propiedades de emisin de luz, ubicada en la parte inferior de la columna. El
tener una adecuada preparacin de la muestra da lugar a una excelente
definicin de imagen. Son mltiples las facetas el las que interviene este tipo de
microscopio. As, en control de calidad sealamientos morfolgicos,
conformacin de agregados, tcnicas forenses, determinacin de estratos en
restauracin y diferenciacin histolgica entre otros.
En la construccin de microscopios electrnicos (1), se han usado con
resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostticas y magnticas.
Con todo, la mayor parte de los microscopios electrnicos hoy da en uso son
magnticos; Un esquema clsico de estos aparatos esta representado en la figura
2. Algunos instrumentos no poseen lente condensadora, otros en cambio tienen
dos, mientras otro grupo de aparatos posee solamente una lente proyectora.
Aunque los detalles de construccin varen de un tipo a otro, se puede obtener
una visin cualitativa de conjunto de sistema ptico.
La fuente de electrones
(2)esta constituida por un
hilo de volframio en forma
de horquilla, rodeado por
una pantalla cilndrica
polarizada negativamente
respecto al filamento( figura
3). Despus de atravesar el
nodo conectado a tierra, la
mayor parte de los
electrones del
haz se pierden en las
paredes y aberturas excepto
un estrecho cono que
atraviesa el diafragma del
condensador.
La lente condensadora se
usa tanto para controlar la
intensidad luminosa, como
para variar la abertura de
iluminacin relativa en el
objeto. Los dimetros de los diafragmas del condensador varan segn el tipo de
instrumento, pero suelen estar comprendidos entre 0,1 y 0,5 mm. Despus de
atravesar el objeto, donde muchos electrones se esparcen, el haz penetra en el
campo de la lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. En el
objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100 de dimetro para
interceptar los electrones esparcidos , pero generalmente esta precaucin se
omite en el estudio de muestras muy delgadas en las que el esparcimiento no es
excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre lente e imagen, el
aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300, sera
necesario el uso de una o mas lentes protectoras que vuelvan a aumentar la
imagen primaria. Algunos instrumentos
llevan incorporada una pantalla intermedia
para facilitar la alineacin, pero no poseen
en cambio este accesorio aquellos
aparatos dotados de dos lentes
proyectoras. La imagen final se observa en
una pantalla fluorescente , y separando
esta pantalla del camino del haz, se
impresiona una placa fotogrfica con dicha
imagen. Las dimensiones mas usuales para
un microscopio de transmisin pueden ser:
Del filamento a la lente condensadora 15
cm, y otro tanto de esta ltima al objeto, mientras que del objetivo a la pantalla
que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo
deber ser rgido y capaz de alcanzar un vaco de 0.0001 mmHg con ayudas de
bombas de difusin rpidas en serie con bombas rotatorias.
Otras partes importantes importantes del aparato que no han sido
representadas en los diagramas son la fuente de alimentacin para crear un
potencial del haz, fuentes de alimentacin para las lentes magnticas ,
medidores de vaco, tornillos de alineacin, vlvulas de vaco , controles de
aumento y enfoque, etc. De momento, nuestro inters mas inmediato se centra
en la tcnica de preparacin de muestras.
Comparacin entre
microscopia electrnica
de transmisin (MET) y
microscopia electrnica
de barrido (MEB).
Preparacin de
las muestras
El proceso
comienza con el tejido
altamente hidratado y
termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de
resina.
Existen muchos caminos para la preparacin de tejidos para Microcopia
electrnica de transmisin, pero los mtodos siguen bsicamente ocho pasos:
1. Fijacin primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los
procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su
accin se centra en las protenas as:
(COOH-protena-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO
Entonces:
COOH-protena-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O
La penetracin del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de
tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.
2. Lavado: Normalmente se
hace con un buffer.
Buffer: es necesario su uso
debido a que el pH de los
tejidos se baja drsticamente
durante el proceso de fijacin.
El uso de buffer mantiene el pH
fisiolgico (7,2 a 7,4) los
sistemas de buffer ms
comunes son: fosfato, s-
collidine, tris-maleato y
cacodylate.
3. Fijacin secundaria: es
llevada a cabo por la accin del
tetrxido de osmio, el cual
reacciona principalmente con
los lpidos. El tetrxido de
osmio generalmente no penetra
mas de 0,5 mm en una hora.
4. Deshidratacin: La filosofa
de la deshidratacin es el
reemplazo del agua usando
etanol en series 70% 85% 95%
y etanol absoluto.
5. Infiltracin con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay
transmisin de fluidos gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias
altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayora de los protocolos
emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.
6. Infiltracin con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son
introducidas reemplazando dentro de los tejidos despus de la deshidratacin. La
concentracin del solvente es minimizada gradualmente incrementando las
concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.
7. Inclusin: sumergir el tejido en la resina pura.
8. Polimerizacin de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerizacin
aumentando la temperatura.

Recipientes de uso comn para la inclusin de las muestras en MET.
Normalmente las muestras se marcan con un trozo de papel indicando algn tipo
de convencin que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo,
dependiendo del tipo de microtomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la ms
comn). Procesador automtico de tejidos.