microbio\tp-initiationidentificationbacteries-galeriesentero.

odt JF Perrin maj 2012 page 1/3

Initiation l'identification d'une souche pure cultivable l'aide d'une galerie de tests
sur milieux de culture
1) Introduction
Identifier une culture pure isole, c'est lui donner son nom d'espce. En bactriologie, la dfinition de
chaque espce est une dfinition consensuelle base sur des critres gnotypes et phnotypiques (il ne peut
en effet y avoir de dfinition fonde sur le critre d'interfcondit des individus au sein de la mme espce
!. "a classification des espces # y compris pour les bactries # s'attache $ tre phylogntique.
En pratique de laboratoire, l'identification d'une souche pure $ une espce peut utiliser diffrents
moyens % conte&te d'origine de la culture, caractristiques phnotypiques $ l'observation microscopique,
caractristiques phnotypiques lors de cultures, analyses du gnome, analyse de mtabolites, analyse du
protome (ou d'une partie du protome par e&emple par spectromtrie de masse maldi'tof et dsorption
laser % trs peu co(teu& et trs efficace!
"es identifications par galerie de tests phnotypiques mtaboliques (lis $ une culture! $
rponse de type binaire () ou '! restent d'emploi trs courant au laboratoire. *es identifications utilisent la
dmarche suivante %
+! ,ne culture pure est isole dans un conte&te donn (mdical, vtrinaire ! $ l'aide de milieu&
d'isolements donns. ,n certain nombre de caractristiques fondamentales sont dtermines % allure
des colonies (taille, te&ture, pigmentation !, morphologie des bactries et aspect de la coloration au
gram, type respiratoire, prsence d'une cha-ne respiratoire $ cytochrome c, test catalase
*ette premire tape permet d'orienter l'identification vers un genre ou un groupement de genres
bactriens.
.! /n va dsormais pouvoir raliser une batterie de tests mtaboliques sur milieu& de cultures (galerie
d'identification! adapte $ l'identification.
Exemple
Etape 1. Contexte, tests et critres d'orientation, choix de la galerie
*onte&te agro'alimentaire d'hygine sur du lait.
,ne culture pure isole a t oriente
Enterobacteriaceae gr0ce au& critres suivants %
bacilles droits !ram ngatif, environ ",# $m
de diamtre sur % $m de longueur, aro&
anarobies, catalase positive, ox'dase ngative,
nitrate rductase positive, capables de cro(tre
sur des milieux ordinaires base de peptone ou
d'extraits de viande et sur milieu slectif avec
dtergent laur'l sulfate.
(1 comparer avec la dfinition complte figurant $
droite.!
/n choisit alors une galerie de tests ddie au&
Enterobactries, par e&emple les systmes
commerciau& 12I.3E ou
)ne dfinition classi*ue de la famille des
Enterobacteriaceae
4 5raditionnellement, la dfinition de la famille
des Enterobacteriaceae est la suivante % bacilles droits
$ 6ram ngatif, non acido'rsistants, de 3,7 $ +,3 8m de
diamtre sur +,3 $ 9,3 8m de longueur, non sporuls,
parfois capsuls, possdant une ciliature pritriche pour
les espces mobiles, aro'anarobies, chimio'
organotrophes, possdant $ la fois un mtabolisme
respiratoire et fermentatif, fermentant le glucose
(avec ou sans production de ga:!, catalase positive,
o&ydase ngative, nitrate rductase positive, capables
de cro-tre sur des milieu& ordinaires $ base de peptone
ou d'e&traits de viande, non halophiles, possdant
l'antigne de ;unin (galement appel E*1 pour
Enterobacterial *ommon 1ntigen! et ayant un 6 ) * p.
cent compris entre 7< et 93. =
>epris de ?.2. Eu:by,
http%@@AAA.bacterio.cict.fr@bacdico@ee@enterobacteria
ceae.html , .3+7
Etape %. Identification sur galerie ddie
On appliqe le mode op!ratoire de la galerie c"oisie.
On d!termine les caract!ristiqes p"!not#piqes de
la soc"e.
On en d!dit l$esp%ce de la soc"e gr&ce ' la base
de donn!es de la galerie.
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1vec de nombreuses galeries, l'utilisateur gre l'identification finale $ l'aide de calculs de
probabilits fonds sur une base de donnes d'identification construite sur des statistiques de rponse () ou
'! au& diffrents tests. *'est par e&emple le systme utilis par la galerie commerciale 12I.3E (galerie
ddie au& Enterobactries !.
>emarque % "es 4 orientations = sont gnralement facilement grables par approche dichotomiques. En
revanche, "es galeries $ systmes d'identification dichotomique sont peu frquents.
%) +ravail prati*ue , identification d'une souche pure isole oriente Enterobacteriaceae
"a souche pure fournie a t oriente Enterobacteriaceae selon les donnes de l'e&emple propos
dans le tableau du paragraphe d'introduction.
/n demande de %
Brifier le type respiratoire, les caractres o&ydase et catalase et nitrate rductase et tester la
mobilit (milieu mannitol'mobilit'nitrate disponible, voir document anne&e! C
Identifier sur galerie 12I.3E (ne pas oublier l'isolement de contrDle!.
1 disposition, l'ensemble de la documentation 12I.3E. /n peut aussi lire la fiche technique de
Etphanie Fas $ http%@@mas.stephanie.free.fr@microbiologieGbio+@fichesH.3pdf@galerie12I.3E.pdf
*ompte' rendu
*onfirmation (ou pas! des tests d'orientation $ vrifier (gram, type respiratoire, catalase, o&ydase,
nitrate rductase!.
>sultats e&primentau& bruts de la galerie 12I.3E.
2rofil numrique de la souche $ identifier, recherche de l'e&istence de ce profil dans le catalogue
(base de donnes! 12I, identification et qualit de l'identification (cf. donnes catalogue 12I!.
*alcul de probabilit d'identification et de la qualit de l'identification $ l'aide de la feuille de calculs
fournie (qui reprend les donnes statistiques de rponse au& tests fournies par 12I.3E! et donc il
faudra complter les formules de calculs.
Iibliographie
' ?.2. Eu:by , Jictionnaire de Iactriologie Btrinaire , inde& alphabtique des ta&ons, rubrique
Enterobacteriaceae, http%@@AAA.bacterio.cict.fr@bacdico@ee@enterobacteriaceae.html
Annexe : Milieu mannitol-mobilit-nitrates : composition, ensemencement, lecture
(e milie mannitol mobilit! nitrate est tilis! por l$orientation et/o la diff!renciation des
)nt!robact!ries par les tests simltan!s de la mobilit!* de l$tilisation d mannitol et de la r!dction des
nitrates en nitrites.
Composition en g/( + ,#drol#sat tr#psiqe de cas!ine 10*00 - .itrate de potassim 1*00 - /annitol
0*10 - 2oge de p"!nol 0*03 - 4gar 3*10 - p, final + 0*5 ' 2167
Ensemencement + 2!g!n!rer le milie 8100679* refroidir. )nsemencer les tbes par piq:re centrale '
l$aide d$n fil droit* jsq$a fond d milie. ;ncber ' 3067 pendant 1< ' 23 "eres.
Lectures
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19 /obilit!. 7ompte-ten de la faible c"arge en agar* les bact!ries mobiles diffsent ' partir de la
piqre centrale d$inoclation en troblant le milie.
29 =tilisation d mannitol. >i le mannitol est tilis!* il est la sorce principale d$!nergie d milie.
Por ne soc"e ?!rifi!e a!ro-ana!robie t#pe )nt!robact!rie + la fermentation d mannitol
entra@ne l$apparition de prodits terminaA de fermentations acides qi entra@nent l$acidification et
le ?irage a jane de l$indicater de p,. (es ent!robact!ries ne fermentant pas le mannitol
clti?eront sr les sels acides amin!s isss de la cas!ine et n$acidifiront pas le milie. ;l # a
mBme alcalinisation lors de $tilisation respiratoire des acides amin!s en raison de ler
d!samination et de l$acidit! tr%s faible d 7O
2
prodit.
39 2!dction des nitrates. ($ajot de r!actif de Criess 81 gotte de c"acn des composants d
r!actif global9 en srface d milie r!?%le la pr!sence !?entelle de nitrites 8coler roge
dense9 qi signe ne acti?it! nitrate-r!dctase 8qi pet Btre li!e ' la simple assimilation d$aDote
et/o ' ne acti?it! respiration nitrate ana!robie9. >i le test a r!actif de Criess est n!gatif* on
pet alors ajoter de la podre de Dinc* m!tal capable de r!dire les nitrates en nitrites. (e milie
contient alors d!j' le r!actif de Criess pr!c!demment ajot!* si acne coloration roge
n$appara@t* c$est q$acn nitrite n$a !t! form! et donc qe le milie !tait d!c"arg! de ses
nitrates. (e milie ne contenait donc pls ni nitrates ni nitrites* pre?e d$n acti?it! nitrate
r!dctase !le?!e 8par eAemple ne respiration d!nitrifiante a?ec prodction de .
2
dans la Done
ana!robie d milie9.
Remarque : La production de bulles de gaz n'est pas un bon indice de production de diazote par
respiration anarobie dnitrifiante sur ce milieu car le gaz des bulles pourrait aussi bien tre du
CO2 ou du H2 d'origine fermentaire.
(a r!action de Criess + ($ion nitrite forme a?ec l$acide slfaniliqe sel de diaDonimm 7e sel est r!?!l!
par ne coloration roge par adjonction d$alp"a-nap"t"#lamine. 2!actions ?isalisables '
"ttp+//c"imieorganiqe.jeanlois.migot.o?er-blog.com/article-1-d-o-?ient-ce-nom-le-reactif-de-griess-
<<5033<0."tml
Annexe : les dfauts de l'identification sur galerie de tests phnotypiues lis ! une
culture
L>trictement empiriqe et r!ser?!e aA esp%ces les pls fr!qentes
L Pas tojors co"!rente a?ec la taAonomie microbiologiqe actelle
L .!cessite ne pr!s!lection 8orientation9 por la r!alisation d$ne batterie de tests
appropri!s
L .!cessite ne incbation de plsiers "eres a?ant r!sltat
adapt de Ccile !ee"# CH$ de Li%ge# apport du !&L'()*O+ en bactriologie# 2,-,.