DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL

INTRODUCCIN

Los organismos vivos pueden obtener y gastar la energa ms rpidamente debido a la
presencia de catalizadores biolgicos llamados enzimas. Como sucede con los
catalizadores inorgnicos, las enzimas modifican la velocidad de una reaccin sin alterar
el equilibrio final y solo se requieren pequeas cantidades para efectuar la concentracin
de un gran nmero de molculas de sustrato.
El alfa-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la
degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. El almidn est
formado por dos tipos de molculas: la amilasa y la amilo pectina, ambos polisacridos de
glucosa. La amilasa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces a-
C1-C4, mientras que la amilo pectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1
con C6, formando cadenas ramificadas. La a-amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la
amilasa como en amilo-pectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos)
como productos.
Si bien es cierto existen evidencias de que la enzima poli-ADP ribosa polimerasa-1
(PARP) Desempea un papel muy importante en la modulacin de la expresin gnica
durante el desarrollo y en respuesta a seales celulares especficas, ejerciendo su accin
a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que usando
NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren homopolmeros de ADH-ribosa en residuos
de cido glutmico en protenas aceptoras principalmente involucradas en el experimento
a realizar como la actividad enzimtica.
Para poder mostrar la actividad enzimtica se debe tener presente fundamentalmente
que la accin cataltica de las enzimas es de carcter especfico; o sea, cada reaccin
qumica debe ser catalizada por una determinada enzima. El reactante o sustancia
qumica que reacciona para dar un producto en un sistema enzimtico se llama
SUSTRATO, habra entonces tantos sistemas enzimticos como sustratos reaccionantes
existen en un organismo vivo.





I. OBJETIVOS

Determinar la actividad especfica el alfa-amilasa vegetal.

Determinar la actividad enzimtica de la amilasa extrada de la cebada
germinada, utilizando almidn residual.




II. MARCO TERICO
Qu es una enzima?
Las enzimas son protenas que ayudan a que las reacciones qumicas ocurran con mayor
rapidez. Sin enzimas nuestros cuerpos se detendran en seco.
Qu es el sustrato?
El sustrato es cualquier sustancia orgnica o inorgnica sobre las que actan las enzimas
produciendo su modificacin en productos finales de la reaccin. Cada enzima acta
sobre un sustrato en particular, ya que una de las caractersticas de las enzimas es su
especificidad de sustrato.
La Actividad De Cualquier Sistema Enzimtico Puede Ser Demostrada De Dos
Maneras:
1. Verificado el sustrato no transformado (sustrato residual) despus de un tiempo
determinado de incubacin en condiciones de PH y temperatura debidamente adecuada
para poder llevarse a cabo las reacciones.
2. Verificando los productos liberados despus de un tiempo de incubacin que este en
ptimas condiciones especficas de tanto de pH como de la temperatura para que los
procesos se lleven con mayor eficacia y poder obtener sustancias a partir de las
reacciones.
Factores Que Afectan Las Reacciones Enzimticas
Fuerza osmtica. La mayora de las enzimas no pueden tolerar concentraciones
de sal extremadamente altas. Los iones interfieren con los dbiles enlaces
inicos de las protenas. Las enzimas tpicas son activas en concentraciones
salinas de 1 a 500 mM. Existen excepciones como las enzimas de
las algas y bacterias halfilas.

Temperatura. Todas las enzimas trabajan en un rango
de temperaturas especficas del organismo al que pertenecen. Los aumentos de
temperatura generalmente provocan un incremento de la velocidad de reaccin.
Esto se debe a alteraciones de la estructura de la protena debidas a la
interrupcin de uniones inicas que resultan en la estabilizacin de la estructura
tridimensional de la enzima.


pH. La mayora de las enzimas son sensibles al pH y tiene un rango especfico en
el que se detecta actividad; todas tienen un pH ptimo. El pH puede detener la
actividad enzimtica al provocar la desnaturalizacin de la estructura proteica
rompiendo enlaces inicos y puentes de hidrgeno. La mayora de las enzimas
funcionan entre un pH 6 y 8; sin embargo, la pepsina estomacal tiene un pH
ptimo de 2 y la tripsina de 8.


Saturacin del sustrato. Aumentando la concentracin de sustrato aumenta la
velocidad de la reaccin o actividad enzimtica. Sin embargo, el lmite de
saturacin limita la velocidad. Una enzima est saturada cuando los sitios
activos de todas las molculas estn ocupados la mayora del tiempo.


III. MATERIALES


materiales muestras y reactivos equipos
Tubos de ensayo
Gradilla
Embudos
Vasos precipitados
Pipetas 1,5,10 ml
Pro-pipetas
Gasa para filtrar
Mortero
Germinados : cebada
Solucin de almidn al 1%
cido clorhdrico 0.5n
Lugol
Reactivo de Biuret
Solucin de buffer
Cloruro de calcio (0.1gr/1l)

Estufa
Espectrofotmetro


IV. PROCEDIMIENTOS

a. Extraccin de la amilasa:

Germinar 50 semillas de cebada por 3 das.
Triturar las semillas adicionando 10 ml de solucin de buffer+ Cloruro de
calcio (0.1gr/1m).
Filtrar en gasa.
Llevar a calentar por 5 minutos, con la finalidad de gelificarlo.




b. Determinacin de actividad enzimtica:

Para este proceso, armamos el siguiente sistema de cuatro tubos:


TUBOS (ml)
ALMIDN
INICIAL
ALMIDN
RESIDUAL
I II III IV
SUSTRATO (ALMIDN)
incubar: 30c x 5 min
1.0 1.0 1.0 1.0
EXTRACTO ENZIMA
Incubar: 30c x15 min
--- 0.1 0.2 0.3
CIDO CLORHDRICO 0.5N
Reposara T amb. x 5 min
1.0 1.0 1.0 1.0
AGUA DESTILADA 9.9 9.8 9.7 9.6
LUGOL 0.5 0.5 0.5 0.5

Mesclar y despus de 5 min medir la absorbancia (a 540nm) de los cuatro
tubos. Anote los resultados.


c. Determinacin de la actividad especfica:

Armamos el siguiente sistema de tubos.




Tubos (ml)
I II III
IV
PREPARADO ENZIMTICO
--- 0.2 0.1
0.05
AGUA DESTILADA
1.0 0.8 0.9
0.95
REACTIVO DE BIURET
4.0 4.0 4.0
4.0

Mesclar e incubar a 37c x 30 minutos

Realizar las lecturas de absorbancia a 540nm calibrando a cero en los tubos
n1



V. TABLA DE DATOS

a. Determinacin de actividad
enzimtica:
La calibracin utilizada fue a 620nm,
pero como nuestra solucin estuvo
muy concentrada por tal razn,
cambiamos a 540 nm.

N TUBOS absorbancia a (540nm)
I 2.420
II 3.850
III 3.852
IV 3.852
b. Determinacin de la actividad
Especfica:


La calibracin utilizada fue a 540nm


N tubos Absorbancia a (540nm)
I 0.106
II 0.118
III 0.132
IV 0.100


VI. CLCULOS Y RESULTADOS

a. Determinacin de la concentracin
del almidn (mg/ml), multiplicando
absorbancia por factor de
calibracin.

N tubos concentracin ()
I --
II 38.500
III 38.520
IV 38.520
promedio 38.513



b. Calculo de las unidades de enzima
U (de la siguiente forma U: mg de
almidn hidrolizado/15min).

n tubos UNIDADES ENZIMTICAS
I ---
II 2.567
III 2.568
IV 2.568
promedio 2.568

c. Determinacin de mg de
protena/ml = absorbancia por
factor.
n tubos % PROTENAS (mg/ml)
I
1.06
II
1.18
III
1.32
IV
1.00
promedio
1.140

d. Determinacin de la actividad de
especfica.
n tubos ACTIVIDAD ESPECIFICA
I ------
II
0.22
III
0.19
IV
0.26
promedio
0.223

VII. CONCLUSIONES

Primeramente para especificar bien las conclusiones, damos a conocer que la alfa
amilasa es producida por bacterias, hongos. Mientras que, la beta-amilasa es de
origen vegetal y producidas por algunas bacterias. Por tanto concluimos que la
actividad especfica de la beta amilasa es de un promedio de 0.223 ml/min

En conclusin el resultado deseado no se obtuvo por falta de una buena gua en el
laboratorio, sin embargo obtuvimos datos de absorbancia (3.494) muy altas, esto es
debido a la falta de germinacin de los granos de cebada, y al uso de la estufa en
lugar de la incubadora.

VIII. DISCUSIONES
Las amilasas, son enzimas que hidrolizan los almidones, se encuentran no solo en
los animales sino tambin en las plantas superiores y en los microorganismos.
Existen tres tipos principales de amilasas: -amilasas, -amilasas y glucoamilasas;
estas enzimas se extraen de cuatro fuentes principales: las alfa-amilasas pueden ser
de origen fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (Bacillus stearothermophilus,
Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens) creo y pancretico. Y en el caso de la -
amilasas pueden ser producidas a partir de cereales, soya. Entonces la amilasa
puede ser de tres tipos, la amilasa con la que hemos estado trabajando en laboratorio
es de origen vegetal, proveniente del grano de cebada y trigo, entonces la actividad
enzimtica determinada es de la - amilasa, mas no de la -amilasa.

Las -amilasas hidrolizan los enlaces -1,4 glicosidicos, comenzando por un extremo
no reductor de la molcula de almidn, formando maltosa. No producen una
alteracin de la viscosidad, yaqu solo actan sobre el extremo de la cadena del
sustrato. Su accin se detiene al llegar a las uniones -1,6 de la amilopectina
generando fragmentos conocidos como dextrinas -lmite. La actividad enzimtica

IX. CUESTIONARIO

1. Por qu se sometieron las raicillas del cereal a un proceso fsico y qumico
en el proceso de extraccin.

Proceso qumico: la agregacin de solucin de buffer de un pH=4.01, con la
finalidad de diluir la concentracin de la - amilasa vegetal.

Proceso fsico: se trituro la cebada, para extraer - amilasa vegetal.



2. Si se te da una solucin supuestamente contiene una enzima. Cmo
determinaras en la solucin la presencia de una enzima que cataliza la
hidrolisis del almidn?

Para determinar la actividad enzimtica se debe tener en cuenta
fundamentalmente que la accin cataltica de las enzimas es de carcter
especfico como es en cada reaccin debe ser catalizada por una determinada
enzima. El reactante o sustancia o sustancia qumica que reacciona para dar un
producto en un sistema enzimtico se llama sustrato, habra entonces tener
sistemas enzimticos como sustratos reaccionantes que existen en un organismo
vivo. En esta etapa se puede determinar de dos maneras:

a) Verificando el sustrato, el sustrato no transformado (sustrato residual)
despus de un tiempo determinado de incubacin en condiciones
especficas de pH y temperatura.

b) Verificando sus productos liberados despus de un tiempo determinado de
incubacin en condiciones especficas de pH y temperatura.

3. Cmo se puede incrementar la actividad enzimtica de una enzima?

La cintica de las reacciones enzimticas difiere de las reacciones inorgnicas
simples. Cada enzima es especfica de forma selectiva para la sustancia sobre la
que causa la reaccin, y es ms eficaz a una temperatura determinada. Aunque un
aumento de la temperatura puede acelerar una reaccin, las enzimas son
inestables cuando se calientan. La actividad cataltica de una enzima est
determinada sobre todo por su secuencia de aminocidos y por la estructura
terciaria, es decir, la estructura de plegamiento tridimensional de la
macromolcula.


X. BIBLIOGRAFA

Garzn de la Mora, P., Manual de prcticas de bioqumica Proyecto VI,
Condiciones ptimas para medir una actividad enzimtica, 111-125, 2002.
Rivas, G., Lpez, L. A., Velasco, A., Regresin no lineal, Revista Colombiana de
Estadstica, 14, 89-102, 1993.
Suzanne Nielen, anlisis de los alimentos. Ed. Acribia S.A. Espaa 2003.
Pag.117-119.