TINCION DE CROMOSOMAS MEDIANTE CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS

MONTAJE DE CARIOGRAMAS HUMANOS.

Julio de 2014
Yuli Tamayo, Yulieth Bermdez, Diana Quintero, Janier Hoyos
Estudiantes de Biologa, Universidad del Cauca, Popayn, Cauca, Colombia.
yulli@unicauca.edu.co, yuliethbermudez@unicauca.edu.co, diana.14-quintero @ hotmail.com,
janierhoyos@unicauca.edu.co



1. MARCO TEORICO
La citogentica constitucional se ocupa del anlisis de los cromosomas en clulas que representan
la lnea germinal del individuo (habitualmente linfocitos de sangre perifrica), y se llama as para
distinguirla de los estudios citogenticos sobre poblaciones celulares concretas que no
representan la constitucin gentica de todo el individuo (clulas somticas, por ejemplo las
clulas de un tumor). La citogentica constitucional refleja, por tanto, la estructura cromosmica
que ha sido heredada y que, a su vez, se transmitir a la descendencia.
La citogentica clsica se basa en la creacin y anlisis del cariotipo, que es la presentacin
ordenada de los cromosomas cuando se hacen visibles en metafase. Hasta los aos 50 se crea que
los humanos tenamos 48 cromosomas y que el sexo dependa del nmero de cromosomas X,
como sucede en Drosophila. En 1956 se determin el nmero exacto de cromosomas de la especia
humana, y en 1959 ya se haban identificado las anomalas cromosmicas caractersticas de los
Sndromes de Down, Turner y Klinefelter. Esto se debi a mejoras tcnicas que permitieron
cultivar leucocitos de sangre perifrica (estimulando el crecimiento en cultivo con
fitohemaglutinina y mitgenos), detener el ciclo celular especficamente en metafase (utilizando
sustancias como colchicina) y realizar tinciones especficas del ADN. En 1968 Caspersson introdujo
las bandas Q, y en 1971 se introdujeron las bandas G, que son el mtodo ms utilizado para
generar cariotipos.
El mtodo habitual de cariotipado incluye la adicin de un mitgeno (habitualmente
fitohemaglutinina) a una suspensin de linfocitos, tras lo cual se cultivan las clulas durante 48-72
horas; cuando hay suficiente nmero de clulas, se detiene el ciclo celular en mitosis utilizando
colchicina, de modo que todas las clulas se habrn parado en metafase (momento en que los
cromosomas se hacen visibles). El tratamiento con una solucin hipotnica rompe las clulas y
separa los cromosomas, tras lo cual se procede a la fijacin de la muestra. A continuacin se
aplican distintas tinciones, que producen patrones de bandas caractersticos en los distintos
cromosomas. En el mtodo de bandas Q, el primero en aparecer histricamente, los cromosomas
se tien con un colorante fluorescente con afinidad por regiones ricas en adeninas y timinas, lo
cual produce unas bandas caractersticas en los cromosomas cuando se observan con luz
ultravioleta. El mtodo de bandas G consiste en someter las preparaciones a una digestin suave
con tripsina antes de teirlas con Giemsa, un colorante con afinidad por el ADN; cuando se
analizan las preparaciones al microscopio de luz, se observan unas bandas oscuras (bandas G)
separadas por unas bandas claras. Para teir los cromosomas segn el mtodo de bandas R se
someten las preparaciones a un tratamiento de calor en solucin salina antes de la tincin con
Giemsa, lo cual produce un patrn de bandas claras y oscuras que es justamente el inverso al que
se obtiene con el mtodo de bandas G. Esto es as porque el tratamiento por calor hace que se
desnaturalicen las regiones ricas en adeninas y timinas, por lo que las bandas R oscuras
corresponden a las bandas G claras. El mtodo de bandas C se utiliza para teir la
heterocromatina constitutiva (centrmeros), y consiste en la tincin con Giemsa tras la
desnaturalizacin en una solucin saturada de hidrxido de bario.
En conjunto, utilizando estos mtodos, y otros que son menos utilizados, se pueden ver cuatro
tipos principales de estructuras:
- bandas de heterocromatina constitutiva (bandas C) que corresponden a las regiones que
permanecen condensadas durante la interfase.
- bandas de eucromatina, formando un patrn de bandas claras y oscuras alternas a lo largo de
todo el cromosoma; se ven como bandas G, R Q.
- regiones organizadoras del nucleolo, correspondientes a las regiones cromosmicas donde
residen los genes del ARN ribosomal; se tien con una tincin especial de plata.
-quinetocoros, las estructuras centromricas que aparecen en mitosis y meiosis a las que se unen
los microtbulos del huso; se tien con tinciones especiales que usan anticuerpos especficos.
Los patrones de bandas G que definen cada cromosoma humano se publican peridicamente en el
International System for Cytogenetics Nomenclature (ISCN), mostrando distintas resoluciones:
desde 350-550 bandas por cariotipo cuando se estudian clulas en metafase, hasta 850 bandas
por cariotipo cuando se analizan clulas en prometafase. Los cromosomas (22 pares de autosomas
ms los cromosomas sexuales X e Y) se ordenan en parejas de cromosomas homlogos, cada uno
de los cuales tiene a su vez las dos cromtides que resultan de la replicacin del ADN en la fase S
previa, aunque en ocasiones las dos cromtides estn pegadas y no se distinguen al microscopio.
La forma de ordenar los cromosomas responde a un convenio (Pars, 1971) y se lleva a cabo
teniendo en cuenta el tamao del cromosoma y la posicin del centrmero, asignando a cada
uno un brazo corto (p) y un brazo largo (q). As se pueden distinguir cromosomas metacntricos
(ambos brazos de la misma longitud), submetacntricos (con el brazo p ms corto que el brazo q)
o acrocntricos (cuyo brazo corto est formado por ADN satlite con ADN ribosomal en el centro).
As, el cromosoma 1 es el de mayor tamao, y el cromosoma 21 el ms pequeo. Teniendo en
cuenta todas estas caracterstica, el cariotipo humano se divide en varios grupos (que van del
grupo A hasta el grupo G), con los cromosomas sexuales X e Y formando un grupo aparte.
Adems de las tcnicas convencionales de bandeo, hoy contamos con una serie de tcnicas que se
engloban bajo una nueva disciplina llamada Citogentica Molecular, que combina la citogentica
clsica con la hibridacin especfica de sondas marcadas con fluorocromos (FISH = Fluorescence In
Situ Hybridisation). La tcnica de FISH, muy utilizada hoy en da, consiste en la hibridacin de
sondas especficas con cromosomas metafsicos, que previamente han desnaturalizados como en
cualquier reaccin de hibridacin.
Aunque inicialmente se utilizaban preparaciones de metafases, tambin se puede hacer FISH
directamente en ncleos interfsicos, lo que permite detectar anomalas numricas o
estructurales especficas (utilizando sondas especficas) incluso en poblaciones celulares que no
pueden dividirse o que no producen buenas metafases (clulas fijadas e includas en parafina, por
ejemplo). Algunas variantes de la tcnica de FISH incluyen el llamado pintado cromosmico
(painting), que permite resaltar un cromosoma concreto, incluyendo los fragmentos del mismo
que se hayan translocado a otras posiciones. Igualmente, la tcnica de SKY (Spectral Karyotyping)
consiste en el pintado de cada cromosoma con un color distinto, gracias a combinaciones de
fluorocromos y tcnicas interferomtricas en la deteccin de la fluorescencia emitida. A pesar de
su complejidad y alto coste, el SKY-FISH es una tcnica valiossima para detectar pequeas
alteraciones cromosmicas que, de otra forma, pasaran totalmente desapercibidas. Otra variante
es la tcnica de CGH (Comparative Genomic Hybridisation, Hibridacin Genmica Comparativa),
que permite detectar ganancias o prdidas de material gentico en un ADN prueba cuando se
compara con un ADN de referencia, y es muy utilizada en la bsqueda de regiones cromosmicas
amplificadas o delecionadas en tumores.
El ISCN tambin es responsable de unificar la nomenclatura para la descripcin de cariotipos
normales o alterados. Las reglas bsicas ms importantes que hay que conocer son las siguientes:
seguido de los cromosomas
sexuales y, si las hay, las alteraciones que se encuentren. Estos datos van separados por comas, sin
espacios antes ni despus de la coma. Por ejemplo, el cariotipo de un varn normal se expresara
como "46,XY".
Los individuos denominados "mosaicos" (es decir, aquellos que tienen dos o ms constituciones
cromosmicas distintas) se describen separando cada constitucin cromosmica por una barra
"/".
viaturas
apropiadas. Por ejemplo, "del" significa delecin, "dup" duplicacin, "inv" inversin, "ins"
insercin, "t" translocacin, "i" isocromosoma, "r" cromosoma en anillo. Despus de cada una de
estas alteraciones se indican los cromosomas implicados (entre parntesis) y a continuacin las
regiones implicadas (en otro parntesis distinto).
Las ganancias o prdidas de cromosoma completos se indican con el signo +
correspondiente al cromosoma implicado. (NOVO- VILLAVERDE.FJ .2012)
2. OBJETIVOS
-Conocer las tcnicas de cultivo de clulas in vitro y de coloracin directa.
-Aprender a reconocer los diferentes grupos de cromosomas por su tamao y posicin del
centrmero.
-Relacionar diferentes cariogramas con variaciones fenotpicas.
-Relacionar la importancia del desarrollo de la gentica clnica.


3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
Para la obtencin de sangre.
MATERIALES CANTIDADES
Jeringas estriles
Agujas hipodrmicas
Heparina de 1000
unid/ml

Alcohol
Algodn
Torniquete


Para el cultivo celular
MATERIAL CANTIDAD
Tubos cnicos de polipropileno estriles de
15 ml

Pipetas de 5, 10ml y Pasteur
Jeringas desechables de 1ml
Guantes quirrgicos
Placas cubre objetos
Medio completo RPMI1640
Para la cosecha y preparacin de placas.
MATERIAL CANTIDAD
KCL 0.075M
Fijador Carnoys
Acetona
Etanol
Coplin
Para la coloracin directa.
MATERIAL CANTIDAD
Colorante Giemsa 10%
4. METODOS.

CULTIVO DE LINFOCITOS HUMANOS.
Sembrar 1cc de sangre total en 9 cc de medio de cultivo RMI-1640 suplementado con suero
bovino fetal (10%) 100u/ML de penicilina 100UG/ML de estreptomicina 2 Mm DE L-glutamina 0,25
ml de fitohemaglutamina.
Incubar a 37,5C por un lapso de 72h.

PREPARACIN DE PLACAS.
Sumergir las placas en etanol, someter a la flama del mechero, realizar esto tres veces luego
limpiar fuertemente con un pao luego se dejan en alcohol absoluto al menos por 10 min.
Antes de pipetear se deben sumergir en un coplin que contiene cido actico el cual debe estar en
una cubeta con hielo.

CONDICIONES DE COSECHA CELULAR Y PREPARACIN DE LAS PLACAS.
A las 50 -72 horas despus
Centrifugar los cultivos a 800-1000rpm por 5-7 min,
Remover el sobrenadante con pipeta Pasteur y deje 0,5ml de sobrenadante cuidando de no
perturbar el botn celular
Resuspenda el botn celular agitando el tubo con lo dedeos suavemente.

Aadir 10ml de solucin hipotnica (0, 075 M KCl) previamente calentada a 37C por las paredes
del tubo y agitando suavemente y de forma constante.
Resuspender las clulas pipeteando de forma cuidadosa
Dejar la suspensin celular por 6-10 min. A 37C
Agregar con fuerza 1-2 ml de fijador Carnoy mezclar bien y dejar reposar por 1 min.
Centrifugar la suspensin celular a 800 rpm por 5-7 min
Remover le sobrenadante y resuspender el botn celular
Agregar 0,5 -1,0 ml de fijador Carnoy lentamente y agitar hasta agregar 5-10 ml.
Colocar la suspensin de clulas en refrigeracin por 20 min.
Centrifugar, remover y repetir el proceso de fijacin dos veces.
Centrifugar y remover el sobrenadante dejando una pequea cantidad (0.2-0,2ml) de fijador.
Resuspender el botn celular con cuidado y agregar suficiente fijador hasta obtener una
suspensin homognea de clulas y con apariencia lechosa (0.5-1,0ml).

OBTENCION DEL EXTENDIDO MITOTICO
Aspirar con la pipeta Pasteur la suspensin celular y dejar caer 3-3 gotas sobre una placa a una
altura de 40cm.Cada gota debe caer sobre una pelcula de cido actico.
Colocar las placas sobre un tolla de papel para escurrir el exceso de solucin y luego colocarlas
sobre un plato caliente hasta que se observen completamente secas.

COLORACION DIRECTA DE LOS CROMOSOMAS METAFASICOS.
Diluir 6ml de sol madre en 54 ml de agua destilada luego se filtra.
Sumergir las placas por 7 min
Limpiar las placas
Dejas secar completamente.

COLORACION DIRECTA DE LOS CROMOSOMAS METAFASICOS
Usando objetivos de 10x y 20x buscar los mejores campos visuales y las mejores metafases y luego
contar el nmero cromosmico con el objetivo de 100x en aceite de inmersin.
Seleccionar la mejor metafase y tomar fotos

MONTAJE DE CARIOTIPO HUMANO
Imprimir a la imagen y marcar cada cromosoma con su pareja segn las caractersticas de cada
par, recortar y pegar.

5. RESULTADOS.
TABLA 1.Frecuencia del nmero de cromosomas en 20 metafases
NUMERO MODAL DE CROMOSOMAS.
N de cromosomas FRECUENCIA
43 2
44 4
45 2
46 12


GRAFICA 1.Frecuencia del nmero de cromosomas en 20 metafases


El nmero modal o cromosmico del individuo es de 46 o 23 parejas la explicacin para los
numero inferiores se deben a que algunos cromosomas pequeos pares 21 y 22 puede quedar
por debajo de los cromosomas granes como los pres 1 y 2.
CARIOTIPO NORMAL: 44XX






FIGURA 1.Cariograma de un individuo humano de sexo femenino.
0
2
4
6
8
10
12
14
42.5 43 43.5 44 44.5 45 45.5 46 46.5
F
r
e
c
u
e
n
c
i
a

N de cromosomas
Frecuencia modal

6. CONCLUSIONES
-La diferencia en cuanto al nmero de cromosomas se debe a superposiciones de los cromosomas
grandes y pequeos
-El cariotipo corresponde a un individuo hembra normal en cuanto al nmero cromosmico
7. BIBLIOGRAFIA.
ANORMALIDADES CROMOSMICAS.2002. Tamayo. M. Instituto de Gentica Humana
Disponible en:
www.javeriana.edu.co/.../PDFDOC/ANORMALIDADES%20%20cromos...
Consultado:
Julio 12. 2:00pm.

NOVO- VILLAVERDE.FJ .2012.GENETICA HUMANA. Conceptos, Mecanismos y Aplicaciones de la
Gentica en el campo de la Biomedicina. UNIVERSIDAD DE NAVARRA
Disponible en:
www.unav.es/genetica/GH/TEXTO.pd
Consultado:
Julio 12. 2:00pm.

RODRGUEZ, P.A. ORTIZ, M. L.2003. Buenos Agentes mitognicos para cultivos de linfocitos en
quelonios Orinoquia, vol. 7, nm. 1-2, julio, 2003, pp. 47-49, Universidad de Los Llanos
Colombia. 1-2, julio, 2003, pp. 47-49, Universidad de Los Llanos Colombia
Disponible en:
www.redalyc.org/pdf/896/89670208.pdf
Consultado:
Julio 12. 2:00

(1)http://www.vitrocell.com.br/esp/vitrocell_esp_bularpmi.html

ANEXO
COMPOSICIN MEDIO RPMI 1640(1)
SALES INORGNICAS mg/L L-triptofano 5,00
Ca(NO3)2.4H2O 100,00 L-prolina 20,00
KCL 400,00 L-tirosina 28,33
MgSO4.7H2O 100,00 L-serina 30,00
NaCl 6.000,00 L-valina 20,00
NaHCO3 2.000,00 L-treonina 20,00
Na2HPO4 800,00
VITAMINAS mg/L
AMINOCIDOS mg/L biotina 0,200
L-arginina.HCL 200,00 pantotenato de calcio 0,250
L-asparigina.H2O 50,00 cloruro de colina 3,000
L-cido asprtico 20,00 cido flico 1,000
L-cistina 65,20 inositol 35,000
L-cidoglutmico 20,00 nicotinamida 1,000
L-glutamina 300,00 cido p-aminobenzico 1,000
glicina 10,00 piridoxina.HCL 1,000
L-histidina.HCL.H2O 15,00 riboflavina 0,200
hidroxiprolina 20,00 tiamina.HCL 1,000
L-isoleucina 50,00 vitaminaB12 0,005
L-leucina 50,00
L-lisina.HCL 40,00 OTROS COMPONENTES mg/L
L-metionina 15,00 glucosa 2.000,00
L-fenilalanina 15,00 glutationa 1,00






Medio de cultivo RMI-1640 suplementado con:
Suero bovino fetal (10%):
100u/ML de penicilina:
100UG/ML de estreptomicina:
2 Mm DE L-glutamina:
0,25 ml de fitohemaglutamina: activador de la divisin celular de los linfocitos T (Rodrguez, ET
AL.2003)

PRINCIPALES SNDROMES POR EL CAMBIO A NIVEL DEL PAR SEXUAL Y DE PARES AUTOSOMICOS
(Tamayo 2002)

Trisoma 21 (Down)
Trisoma 18(Edwards)
Trisoma 13 (Patau)
X0 (Turner)
XXY o XYY
Triploida
Mosaicismos

ORDEN DE FRECUENCIA
[Mayor a Menor]:
TRISOMA 21
TRISOMA 18
TRISOMA 13

ORDEN DE SEVERIDAD
[Mayor a Menor]:
TRISOMA 13
TRISOMA 18
TRISOMA 21

SINDROME DE DOWN
Anomalas Pabelln auricular (60%)
Baja talla (con posterior tendencia a obesidad)
Cardiopata congnita
Catarata congnita
Diastsis de rectos abdominales anteriores
Displasia de cadera (70%)
Facies aplanada (90%)
Fisuras parpebrales inclinadas
Fisuras parpebrales oblicuas (80%)
Hipertensin pulmonar
Hipoplsia falange media 5o dedo (60%)Hipoplasia mediofacial
Hipotona (80%)
Laxitud articular (80%)
Orejas pequeas
Piel redundante en cuello (80%)
Pobre reflejo de moro (85%)
Protrusin de la lengua

SINDROME DE EDWARDS - [Trisoma 18]
Incidencia: 0,3:100 nacidos vivos
Mayor Frecuencia Femenina: 3:1
Sobrevida: 55% Fallecen 1er mes antes del ao de vida
Arteria umbilical nica
Clenched Hand
Esternn corto
Hipoplsia tejido adiposo
Llanto dbil
Muy bajo peso
Pobre capacidad de succin
Prematuro-postmaduro
Severas alteraciones cardiopulmonares y mal estado neurolgico

RN con antecedentes de polihidramnios, hipo e hipertnico (postneonatal), baja respuesta a
estmulos, occipucio prominente, pabelln auricular malformado y mal posicionado, alteraciones
parpebrales, poca apertura bucal, micrognatia, paladar alto, alteraciones en mano, dermatoglifos,
hipoplsia uas, hallux corto, hirsutismo, cardiopata, anomalas en cadera y en genitales.

SINDROME DE PATAU - [Trisoma 13]
Defectos SNC severos
Severas alteraciones en Ojos y Odos
Alteraciones nasales y labiales - Lnea media
Polidactilia
Defectos en piel y articulaciones cardio-pulmonares
Severo R.M.

TRIPLOIDIA
Placenta grande
Mola hidatidiforme
Severo retardo del crecimiento
Alteraciones en manos y pies
Anomalas Craneofaciales y cardio-pulmonares
Mal pronstico: Productos de Abortos o Mortinatos.

DELECION 5 P [Cry du Chat]
Llanto caracterstico: Maullido de gato
Microcefalia
Alteracin de fisuras parpebrales
Bajo peso al nacer
Retardo Mental e Hipotona
Alteraciones cardiopulmonares


ALTERACION DE LOS CROMOSOMASSEXUALES
SINDROME XYY
Crecimiento acelerado y Alta estatura
Moderado Retardo Mental (?)
Alteraciones del comportamiento/malas relaciones interpersonales
Alteraciones de lenguaje
Acn noduloqustico severo en adolescencia
Aracnodactilia

SNDROME DE KLINEFELTER - [XXY]
Crecimiento acelerado y alta talla
Habitus Marfanoide (Aracnodactilia)
Hipogenitalismo e Hipogonadismo
Retardo Mental
Problemas de comportamiento (relaciones interpersonales)
Infertilidad en todos

SINDROME DE TURNER - [45X0]
Afecta 1:2000 RN mujeres vivas
Crecimiento lento y baja talla
Hipertelorismo mamario
Cubitus valgus
Torax ancho
Linfedema congnito Infantilismo sexual (hipogenitalismo con hipogonadismo)
Cuello palmeado

SINDROME DE X- FRGIL - [Martin Bell]
Retardo Mental
Pabellones Auriculares alados
Prognatismo mandibular
Macro-orquidismo
Alteracin de conducta (60% autismo)
Fragilidad en el brazo largo del cromosoma X (q27-.3) ->Mayor repeticin Tripletas CGG (N: 6-54
repeticiones)
Madre portadora (54 a 200 repeticiones)