Tesis Maestria - in Silico

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
SECRETARA DE INVESTIGACIN Y POSGRADO

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN

M MM Mecanismo de accin de la DNA ecanismo de accin de la DNA ecanismo de accin de la DNA ecanismo de accin de la DNA- -- -metiltransferasa metiltransferasa metiltransferasa metiltransferasa HgiDII HgiDII HgiDII HgiDII: Un : Un : Un : Un
estudio estudio estudio estudio in silico in silico in silico in silico

T E S I S
QUE COMO UNO DE LOS REQUISITOS PARA OBTENER EL
GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLGICAS DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLGICAS DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLGICAS DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLGICAS

PRESENTA
M. en C. J M. en C. J M. en C. J M. en C. Juan Arturo Casteln Vega uan Arturo Casteln Vega uan Arturo Casteln Vega uan Arturo Casteln Vega

Directores de tesis
Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes
Dr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo
Mayo 2010
ORIGINAL PAPER
Homology modeling and molecular dynamics simulations
of HgiDII methyltransferase in complex with DNA
and S-adenosyl-methionine: Catalytic mechanism
and interactions with DNA
Juan A. Casteln-Vega & Alicia Jimnez-Alberto &
Rosa M. Ribas-Aparicio
Received: 25 September 2009 / Accepted: 23 November 2009
# Springer-Verlag 2009
Abstract M.HgiDII is a methyltransferase (MTase) from
Herpetosiphon giganteus that recognizes the sequence
GTCGAC. This enzyme belongs to a group of MTases
that share a high degree of amino acid similarity, albeit
none of them has been thoroughly characterized. To study
the catalytic mechanism of M.HgiDII and its interactions
with DNA, we performed molecular dynamics simulations
with a homology model of M.HgiDII complexed with DNA
and S-adenosyl-methionine. Our results indicate that M.
HgiDII may not rely only on Glu119 to activate the
cytosine ring, which is an early step in the catalysis of
cytosine methylation; apparently, Arg160 and Arg162 may
also participate in the activation by interacting with
cytosine O2. Another residue from the catalytic site,
Val118, also played a relevant role in the catalysis of M.
HgiDII. Val118 interacted with the target cytosine and kept
water molecules from accessing the region of the catalytic
pocket where Cys79 interacts with cytosine, thus preventing
water-mediated disruption of interactions in the catalytic site.
Specific recognition of DNAwas mediated mainly by amino
acids of the target recognition domain, although some amino
acids (loop 8088) of the catalytic domain may also
contribute to DNA recognition. These interactions involved
direct contacts between M.HgiDII and DNA, as well as
indirect contacts through water bridges. Additionally, analy-
sis of sequence alignments with closely related MTases
helped us to identify a motif in the TRD of M.HgiDII that
may be relevant to specific DNA recognition.
Keywords DNA-methyltransferase
.
DNArecognition
.
Homology modeling
.
M.HgiDII
.
Molecular dynamics
.
S-adenosyl-methionine
Introduction
DNA-methyltransferases (MTases) catalyze the transfer of
methyl groups from cofactor S-adenosyl-methionine (SAM)
to adenines or cytosines in DNA [1]. Some MTases
methylate exocyclic amino groups to form either N6-
methyl adenine or N4-methyl cytosine, whereas others
methylate the C5 carbon to form C5-methyl cytosine
(C5mC). These modifications have important functions in
the cell, ranging from DNA repair in bacteria, to genetic
regulation and embryonic development in vertebrates [2].
Most of the MTases described thus far are from bacterial
origin and associate with restriction enzymes to form
restriction-modification (RM) systems [3]. These systems
are classified in four types (IIV) [4], of which type II are
J. A. Casteln-Vega
Center for Biologics Evaluation and Research, US FDA,
CBER/DBPAP [HFM-443],
1401 Rockville Pike,
Rockville, MD 20852, USA
A. Jimnez-Alberto
:
R. M. Ribas-Aparicio (*)
Departamento de Microbiologa, Escuela Nacional de Ciencias
Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional,
Prolongacin de Carpio y Plan de Ayala s/n, Distrito Federal,
CP 11340 Mexico, Mexico
e-mail: rmrj@encb.ipn.mx
Present Address:
J. A. Casteln-Vega
Departamento de Microbiologa, Escuela Nacional de Ciencias
Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional,
Prolongacin de Carpio y Plan de Ayala s/n, Distrito Federal,
CP 11340 Mexico, Mexico
J Mol Model
DOI 10.1007/s00894-009-0632-9

El presente trabajo fue realizado
la Food and Drug Administra
de Biolgicos de la Escuela Na
Nacional, bajo la direccin de la
Zepeda Vallejo. Forma parte d
Politcnico Nacional, Mxico

Juan A. Casteln - Mecanismo de acci
i
realizado en el Center for Biologics Evaluation and
tration, EE.UU., y en el Laboratorio de Produccin
scuela Nacional de Ciencias Biolgicas del Instituto P
ccin de la Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes y del Dr. Lui
parte del Proyecto SIP con clave 20091190,
Mxico.

ccin de M.HgiDII

nd Research, de
roduccin y Control
nstituto Politcnico
el Dr. Luis Gerardo
, del Instituto

Juan A. Casteln - Mecanismo de accin de M.HgiDII

ii

La realizacin de este trabajo de investigacin fue posible gracias al apoyo
de diversas instituciones.

Agradezco al CONACYT y al Programa Institucional de Formacin de
Investigadores (PIFI) del IPN, por el apoyo otorgado durante mis estudios
de doctorado. Agradezco al Comit Tcnico de Prestaciones a Becarios
(COTEPABE) por el apoyo brindado para realizar una estancia de
investigacin en la Food and Drug Administration (FDA) y al
Departamento de Energa de los Estados Unidos, que a travs del Oak
Ridge Institute of Science and Investigation (ORISE) proporcion apoyo
logstico y econmico durante la estancia en la FDA.

Agradezco a los National Institutes of Health y a la Food and Drug
Administration (USA) por la capacitacin y acceso al sistema Helix y
Biowulf de los National Institutes of Health.


iii

Este trabajo est principalmente dedicado a mi familia: Este trabajo est principalmente dedicado a mi familia: Este trabajo est principalmente dedicado a mi familia: Este trabajo est principalmente dedicado a mi familia:

A mi amor de toda la vida, Alicia Jimnez Alberto Alicia Jimnez Alberto Alicia Jimnez Alberto Alicia Jimnez Alberto.
Ambos sufrimos y gozamos este proceso, por lo que este logro es tuyo tambin.
Muchas gracias por disfrutar conmigo las bondades de la vida, y por apoyarme y
soportarme en mis momentos difciles. Te amo como ms se puede amar

A la prueba mxima de mi fe en el futuro, Dulce Natalia Casteln Jimnez Dulce Natalia Casteln Jimnez Dulce Natalia Casteln Jimnez Dulce Natalia Casteln Jimnez.
T fuiste la motivacin que me permiti finalizar este proyecto. Gracias por
sacarme de vez en cuando de mis pensamientos para integrarme a tu mundo. Te
amo hasta el infinito


iv

A la Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes
No hay palabras suficientes que expresen el infinito agradecimiento que tengo
hacia usted. Agradezco a la vida por haberla puesto en mi camino, pues gracias a
usted he llegado hasta donde estoy. Gracias por su confianza y dedicacin!

A Juan Luis Arciniega Juan Luis Arciniega Juan Luis Arciniega Juan Luis Arciniega
Gracias amigo y mentor por expandir mi visin de la vida y la ciencia. Nunca
antes haba aprendido tanto en tan poco tiempo. Gracias por brindarme tu
confianza y apoyarme cuando ms lo necesit.

Al Dr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo Dr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo Dr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo Dr. Luis Gerardo Zepeda Vallejo
Le agradezco infinitamente por el apoyo brindado para concluir con esta fase de
mi vida. Sus valiosos conocimientos y experiencia enriquecieron mucho este
trabajo.

A mis sinodales, Dr. Benjamn Nogueda Dr. Benjamn Nogueda Dr. Benjamn Nogueda Dr. Benjamn Nogueda, Dr. Eleuterio Burgueo Dr. Eleuterio Burgueo Dr. Eleuterio Burgueo Dr. Eleuterio Burgueo, Dra. Mara Dra. Mara Dra. Mara Dra. Mara
Elena Elena Elena Elena Vargas Vargas Vargas Vargas y Dr. Jos Dr. Jos Dr. Jos Dr. Jos Guadalupe Guadalupe Guadalupe Guadalupe Trujillo Trujillo Trujillo Trujillo. Gracias por el esfuerzo vertido en la
revisin de este trabajo y por sus excelentes consejos.


v

A mi madre, Guillermi Guillermi Guillermi Guillermina Vega na Vega na Vega na Vega. .. .
Gracias por darme la vida y por los enormes sacrificios que hiciste para
proveernos siempre lo mejor. Eres el ejemplo mximo de superacin.

A mi padre, Lucio Casteln Lucio Casteln Lucio Casteln Lucio Casteln
Gracias pap por brindarme la vida y darme todo tu cario. Tu nobleza es el
ejemplo que quiero seguir.

A mis hermanos, Reyna Reyna Reyna Reyna, Rosa Rosa Rosa Rosa, Dulce Dulce Dulce Dulce y Lucio Lucio Lucio Lucio
No pude tener mejor compaa desde la niez que la de ustedes. Gracias
hermanos por todos los momentos buenos (y uno que otro no tan bueno) que
hemos compartido a lo largo de nuestra vida.


vi

A mis entraables amigos y compadres, Nelson Nelson Nelson Nelson y Olga Olga Olga Olga. Nelson Nelson Nelson Nelson, amigo de tantos
aos que te considero mi hermano, gracias por brindarme tu amistad!

A Paty Cauich Paty Cauich Paty Cauich Paty Cauich, amiga y compaera. Gracias por el apoyo y el nimo que me has
brindado siempre.

A mis maestros de siempre, mis amigos: Alicia Alicia Alicia Alicia, Lupita Lupita Lupita Lupita, Aurora Aurora Aurora Aurora, Vctor Vctor Vctor Vctor y al Dr. Dr. Dr. Dr.
Mario Mario Mario Mario. Les agradezco infinitamente por sus enseanzas y por permitirme formar
parte de la mejor academia de la ENCB. Dr. Mario, gracias por brindarme la
oportunidad de expandir mis horizontes. Su apoyo fue determinante para
terminar este proyecto.

A las nuevas generaciones del lab: Vanessa Vanessa Vanessa Vanessa, Laura Laura Laura Laura, Francisco Francisco Francisco Francisco, Elian Elian Elian Elian, J JJ Je ee en nn nn nn ny yy y,
Gloria Gloria Gloria Gloria, Jane Jane Jane Jane, Jhoanna Jhoanna Jhoanna Jhoanna, Alejandra Alejandra Alejandra Alejandra, Esmeralda Esmeralda Esmeralda Esmeralda, Juan Carlos Juan Carlos Juan Carlos Juan Carlos. Muchas gracias por
la chispa de alegra e inocencia que imparten al lab. Sigan por la buena senda.
Les deseo xito en todos sus experimentos!


vii

NDICE
I. NDICE DE FIGURAS ........................................................................................................................ ix
II. NDICE DE TABLAS ......................................................................................................................... x
RESUMEN .................................................................................................................................................. 1
ABSTRACT ................................................................................................................................................ 3
1. INTRODUCCIN .................................................................................................................................... 5
1.1. Sistemas R-M .................................................................................................................................... 7
1.1.2. Nomenclatura de los sistemas R-M ..................................................................................... 8
1.1.3. Clasificacin de los sistemas R-M ......................................................................................... 9
1.2. Aspectos estructurales de las DNA-MTasas ......................................................................... 9
1.3.1. Catlisis enzimtica de la metilacin ............................................................................... 14
1.3.2. Reconocimiento del DNA blanco ....................................................................................... 16
1.4. Metiltransferasa M.HgiDII........................................................................................................ 17
2. JUSTIFICACIN ................................................................................................................................... 18
3. OBJETIVOS............................................................................................................................................ 20
3.1. Objetivo General .......................................................................................................................... 21
3.2. Objetivos Particulares ............................................................................................................... 21
4. MATERIAL Y MTODOS ................................................................................................................. 22
4.1. Equipo de cmputo ..................................................................................................................... 23
4.2. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA ............................................................. 23
4.3. Evaluacin de la calidad del modelo .................................................................................... 25
4.4. Definicin del sistema para la simulacin de dinmica molecular .......................... 25
5. RESULTADOS Y DISCUSIN ......................................................................................................... 29
5.1. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA ............................................................. 30
5.2. Evaluacin de la calidad del modelo .................................................................................... 34
5.3. Descripcin general de la estructura ................................................................................... 36
5.4. Interacciones dentro del sitio cataltico ............................................................................. 37
5.5. Interacciones con la secuencia blanco ................................................................................ 42
5.6. Aminocidos conservados en el TRD de MTasas relacionadas a M.HgiDII ........... 46

viii

6. CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 48
7. GLOSARIO DE TRMINOS ............................................................................................................. 50
8. BIBLIOGRAFA .................................................................................................................................... 53


ix

I. NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modificaciones llevadas a cabo por las DNA-metiltransferasas. .......................... 7
Figura 2. Estructura de algunas MTasas. ....................................................................................... 11
Figura 3. Orden lineal de los motivos conservados en las MTasas. .................................... 12
Figura 4. Rearreglos en M.HhaI en respuesta a la unin de DNA. ....................................... 13
Figura 5. Sitio cataltico de M.HhaI. ................................................................................................. 15
Figura 6. Mecanismo de transferencia del grupo metilo en M.HhaI. .................................. 16
Figura 7. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII mediante
modelamiento por homologa. ............................................................................................................ 24
Figura 8. Interacciones relevantes en la simulacin de dinmica molecular. ................. 26
Figura 9. Esquema que representa las condiciones de la simulacin. ............................... 27
Figura 10. Espectro conformacional explorado en la simulacin de dinmicas
moleculares. ............................................................................................................................................... 30
Figura 11. Validez del modelaje por homologa en relacin con el porcentaje de
identidad en los alineamientos. .......................................................................................................... 31
Figura 12. Alineamiento mltiple de M.HgiDII con los moldes M.HaeIII y M.HhaI....32
Figura 13. Monitoreo de RMSD y Rg de M.HgiDII durante la simulacin. ........................ 34
Figura 14. Evaluacin de la calidad de la estructura de M.HgiDII. ...................................... 35
Figura 15. Modelo de M.HgiDII en complejo con DNA y SAM. .............................................. 37
Figura 16. Interacciones en el sitio cataltico de M.HgiDII. .................................................... 39
Figura 17. Canales de agua en el sitio cataltico de M.HgiDII. ............................................... 40
Figura 18. Mecanismo de accin de M.HgiDII. ............................................................................ 41
Figura 19. Interacciones con la secuencia blanco. ..................................................................... 43
Figura 20. Motivo TL de M.HgiDII, M. HaeIII y M.HhaI. ........................................................... 44
Figura 21. Alineamiento multiple del TRD de M.HgiDII y MTasas relacionadas. .......... 46

x

II. NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Ejemplificacin de la nomenclatura de los sistemas RM. ......................................... 9
Tabla 2. Caractersticas de los sistemas de restriccin-modificacin. ............................... 10
Tabla 3. Etapas de la simulacin. ...................................................................................................... 28
Tabla 4. Distancias interatmicas relevantes para la actividad cataltica de M.HgiDII38


1

RESUMEN
M.HgiDII es una metiltransferasa (MTasa) de Herpetosiphon giganteus que reconoce la
secuencia GTCGAC. Esta enzima pertenece a un grupo de MTasas que comparten una
gran similitud a nivel de secuencia de aminocidos, aunque ninguna de ellas ha sido
caracterizada experimentalmente. El objetivo de este trabajo fue estudiar el
mecanismo de accin de M.HgiDII y sus interacciones con el DNA. La estructura
tridimensional de esta enzima se desconoce, por lo que se realiz un modelamiento
por homologa de esta enzima con el DNA blanco y el cofactor S-adenosil metionina;
las interacciones relevantes para la funcin de M.HgiDII (catlisis enzimtica y
reconocimiento especfico del DNA) se determinaron mediante el anlisis de
simulaciones de dinmica molecular. Los resultados indican que los primeros pasos
en la catlisis de M.HgiDII son diferentes a los de otras MTasas, en las cuales un cido
glutmico es necesario para activar el anillo de citosina en los primeros pasos de la
metilacin. En lugar del cido glutmico, M.HgiDII emplea las interacciones entre
Arg160, Arg162 y el oxgeno O2 de la citosina en los primeros pasos de la reaccin de
metilacin. Otro hallazgo importante en este trabajo es que el residuo del sitio
cataltico, Val118, tambin tiene un papel relevante en la catlisis de M.HgiDII. Val118
interacta con la citosina blanco y mantiene las molculas de agua alejadas de la
regin del sitio cataltico donde Cys79 interacta con la citosina, evitando de esta
forma la disrupcin de interacciones en el sitio cataltico. Se determin tambin que el
reconocimiento especfico del DNA por M.HgiDII est mediado principalmente por
aminocidos del dominio de reconocimiento del DNA (TRD), aunque algunos
aminocidos (asa 80-88) del dominio cataltico pueden contribuir al reconocimiento
especfico del DNA. Estas interacciones involucraron contactos directos entre
M.HgiDII y el DNA, as como contactos indirectos mediados por agua. Adicionalmente,
el anlisis de alineamientos de secuencias de MTasas relacionadas permiti identificar
un motivo en TRD de M.HgiDII que podra ser relevante para el reconocimiento
especfico del DNA. En conclusin, el anlisis in silico permiti conocer las regiones de
M.HgiDII que son relevantes para el reconocimiento del DNA blanco y para el
mecanismo cataltico. Asimismo, este anlisis permiti asignar una funcin a un

2

aminocido que se saba era importante para la funcin cataltica (Val118), pero no se
conoca su participacin exacta en el proceso de metilacin.

3

ABSTRACT
M.HgiDII is a methyltransferase (MTase) from Herpetosiphon giganteus that
recognizes the sequence GTCGAC. This enzyme belongs to a group of MTases that
share a high degree of amino acid similarity, albeit none of them has been thoroughly
characterized. Homology modeling of M.HgiDII in complex with DNA and cofactor S-
adenosyl methionine was required because there is no available structural
information for this enzyme. Interactions that were relevant for the function of
M.HgiDII (enzymatic catalysis and specific recognition of DNA) were determined by
analysis of molecular dynamics simulations. The aim of this work was to study the
catalytic mechanism of M.HgiDII and its interactions with DNA. To achieve it,
molecular dynamics simulations were performed with a homology model of M.HgiDII
complexed with DNA and S-adenosyl-methionine. Results indicate that the first steps
in the catalytic mechanism of M.HgiDII are different from other MTases, in which a
glutamic acid is required to activate the cytosine ring in the first steps of the
methylation process. Instead of the glutamic acid, M.HgiDII relies on interactions
between Arg160, Arg162 and cytosines oxygen O2 at the beginning of the
methylation reaction. Another important finding of this work is that the residue from
the catalytic site, Val118, also played a relevant role in the catalysis of M.HgiDII.
Val118 interacted with the target cytosine and kept water molecules from accessing
the region of the catalytic pocket where Cys79 interacts with cytosine, thus preventing
water-mediated disruption of interactions in the catalytic site. It was found that
specific recognition of DNA was mediated mainly by amino acids of the target
recognition domain, although some amino acids (loop 80-88) of the catalytic domain
may also contribute to DNA recognition. These interactions involved direct contacts
between M.HgiDII and DNA, as well as indirect contacts through water bridges.
Additionally, analysis of sequence alignments with closely related MTases helped us to
identify a motif in the TRD of M.HgiDII that may be relevant to specific DNA
recognition. In conclusion, this in silico analysis allowed the identification of regions in
M.HgiDII that are relevant for the recognition of target DNA and for the catalytic
mechanism of this enzyme. Likewise, this analysis enabled for the assignment of

4

function to one amino acid (Val118), which was known to be important for the
catalytic activity, but whose exact participation in the catalytic mechanism was not
known until now.


5

1 11 1
1 11 1
. .. .
. .. .
I II I
I II I
N NN N
N NN N
T TT T
T TT T
R RR R
R RR R
O OO O
O OO O
D DD D
D DD D
U UU U
U UU U
C CC C
C CC C
C CC C
C CC C
I II I
I II I

N NN N
N NN N


6

La metilacin del DNA tiene efectos muy importantes para la funcin celular. En
eucariontes, este tipo de modificacin forma parte de los mecanismos epigenticos de
regulacin, y resulta de vital importancia durante el desarrollo embrionario de
vertebrados [Bheemanaik et al., 2006]. En bacterias, las funciones mejor conocidas de
la metilacin del DNA son la reparacin de errores durante la replicacin, y la
proteccin del DNA de la accin de endonucleasas (ENasas) [Tock & Dryden, 2005]. Se
ha descubierto que la metilacin del DNA es importante para el inicio del proceso de
replicacin en ciertos grupos bacterianos [Collier et al., 2007], y tambin se ha
demostrado que afecta la expresin gentica de las bacterias. Lo que es ms
interesante, algunos agentes patgenos como Yersinia spp. y Haemophilus influenzae
ven reducida su virulencia cuando sus MTasas son mutadas [Heusipp et al., 2007];
adicionalmente, varios genes asociados a factores de virulencia se encuentran
regulados por metilacin [Heusipp et al., 2007; Flker et al., 2007].

Los efectores de este tipo de modificaciones son las DNA-metiltransferasas (MTasas),
las cuales catalizan la transferencia de grupos metilo del cofactor S-adenosilmetionina
(SAM) a adeninas o citosinas presentes en el DNA [Kozbial & Mushegian, 2005].
Algunas MTasas metilan grupos amino exocclicos para formar N6-metiladenina N4-
metilcitosina, mientras que otras metilan el carbn C5 de citosinas para formar C5-
metilcitosina (m5C) (Fig. 1). Los grupos metilo se encuentran orientados hacia el
surco principal de la hlice de DNA, en posiciones que no interfieren con el
apareamiento de las bases [Wilson & Murray, 1991]. El SAM sirve siempre como el
donador del grupo metilo, por lo que es cofactor esencial para la metilacin. En
bacterias, las MTasas pueden hallarse como entidades independientes (MTasas
hurfanas), o asociadas a endonucleasas formando parte de los sistemas de
Restriccin-Modificacin (R-M) [Bujnicki, 2001]. En este ltimo caso, las MTasas
tienen la funcin de proteger al DNA bacteriano de la accin de las endonucleasas,
discriminando as el DNA propio del extrao, el cual ser degradado por las
endonucleasas al carecer de la metilacin apropiada [Murray, 2002; Blakely & Murray,
2009].

7

La mayora de las MTasas descritas a la fecha son de origen bacteriano. Dentro de
stas, las asociadas a sistemas R-M son las ms abundantes, con 927 MTasas descritas
a la fecha en la base de datos REBASE (http://rebase.neb.com), la cual es una base de
datos de sistemas R-M [Roberts et al., 2010]. Estos sistemas se clasifican en cuatro
tipos (I-IV) [Tock & Dryden, 2005], de los cuales los tipo II son los ms abundantes y
estudiados. Las enzimas de restriccin de tipo II son conocidas por su aplicacin en
biotecnologa y como herramientas en tcnicas de DNA recombinante; as mismo, las
MTasas de tipo II se han empleado cada vez ms para estudiar el efecto de la
metilacin en la expresin gentica [Buryanov & Shevchuk, 2005] y para marcaje
especfico del DNA [Klimasauskas & Weinhold, 2007].

Figura 1. Modificaciones llevadas a cabo por las DNA-metiltransferasas. m6A, N6-
metiladenina; m4C, N4-metilcitosina; m5C, C5-metilcitosina.

1.1. Sistemas R-M
Los sistemas R-M estn formados por pares de actividades enzimticas intracelulares:
una endodesoxirribonucleasa (ENasa) y una MTasa. Estas enzimas interactan con
secuencias especficas de nucletidos en el DNA. Tales secuencias comprenden
generalmente de 4 a 8 nucletidos definidos, que pueden ser continuos o
interrumpidos, nicos o degenerados [Wilson & Murray, 1991]. Las ENasas catalizan
la ruptura de ambas cadenas de DNA, lo cual ocurre una vez por cada secuencia
reconocida no protegida; sto se realiza por la hidrlisis del enlace fosfodister en
ambas cadenas del DNA, resultando terminaciones 3-hidroxilo y 5-fosfato [Wilson &
Murray, 1991; Brooks, 1987]; dependiendo de la posicin de los sitios de corte en el
DNA de doble cadena ste puede quedar con extremos adhesivos o romos. Las MTasas
N
NH
NH
2
O
C H
3

N
N
NH
N
N H
CH
3

N
NH
N H
O
CH
3

m6A m5C m4C

8

catalizan la adicin de un grupo metilo a un nucletido especfico de la secuencia de
reconocimiento, protegindola as de la digestin por parte de su ENasa acompaante
[Blakely & Murray, 2009].

Estos sistemas funcionan en las clulas a manera de sistemas inmunes, los cuales
protegen a la clula de la invasin de DNA extrao, principalmente el que proviene de
fagos. Los sistemas R-M tambin funcionan como reguladores de la adquisicin de
material gentico mediante la restriccin de DNA proveniente de procesos de
conjugacin o transformacin [Jeltsch, 2003].

1.1.2. Nomenclatura de los sistemas R-M
La gran variedad de sistemas R-M descritos a la fecha y su creciente complejidad ha
hecho que la nomenclatura de estos sistemas cambie con el tiempo. El sistema de
nomenclatura vigente nombra a los sistemas R-M de acuerdo a los siguientes criterios
(Tabla 1) [Roberts et al., 2003; Roberts et al., 2010]:

1. Las primeras tres letras estn formadas por el nombre de la especie donde fue
hallado el sistema R-M. La primera letra corresponde al gnero y va en
maysculas; las siguientes dos corresponden a las dos primeras letras de la
especie.
2. Posteriormente se aade la designacin de la cepa.
3. Si el sistema R-M es el primero descrito para una cepa en particular, se aade al
final el nmero romano I; si es el segundo se pone II y as sucesivamente.
4. Cuando se refiere a las protenas, se adiciona el prefijo M. para MTasas, o R.
para ENasas.
5. En el caso de nombrar los genes, todas las letras se ponen en cursivas, y la
designacin de MTasa (M) ENasa (R) se adiciona como sufijo.
6. Las enzimas putativas se nombran de manera similar a las enzimas
caracterizadas experimentalmente, solo que al final se aade el sufijo P; una

9

vez que se demuestra que son genes pertenecientes a sistemas R-M, este sufijo
se elimina.

Tabla 1. Ejemplificacin de la nomenclatura de los sistemas RM.
Organismo Sistema
Protenas Genes
ENasa MTasa ENasa MTasa
Escherichia coli R EcoRI R.EcoRI M.EcoRI ecoRIR ecoRIM
Escherichia coli R
1
EcoRII R.EcoRII M.EcoRII ecoRIIR ecoRIIM
Listeria monocitogenes A
2
LmoAP R.LmoAP M.LmoAP lmoAPR lmoAPM
1. Ejemplo del segundo sistema R-M descrito para E. coli R.
2. Ejemplo de un sistema R-M putativo en L. monocitogenes A.

1.1.3. Clasificacin de los sistemas R-M
De acuerdo al requerimiento de cofactores, manera de actuar y formas activas se
pueden reconocer bsicamente cuatro tipos de sistemas, cuyas caractersticas se
muestran en la Tabla 2. Las enzimas de restriccin de tipo II reconocen secuencias
palindrmicas de 4 a 8 pb; son altamente especficas y cortan al DNA de manera
definida dentro de la secuencia de reconocimiento (4-8 pb). Estas caractersticas,
aunadas al escaso requerimiento de cofactores, han hecho que las enzimas de tipo II
sean las que se utilicen para caracterizar al DNA mediante mapeo de restriccin, y en
la generacin de DNA recombinante [Williams, 2003]. Las MTasas de tipo II se han
empleado para estudiar el efecto de la metilacin en la expresin gentica [Buryanov
& Shevchuk, 2005], y gracias al desarrollo de anlogos de SAM con capacidad de
fluorescencia se han empleado para el marcaje especfico del DNA [Klimasauskas &
Weinhold, 2007].

1.2. Aspectos estructurales de las DNA-MTasas
El impacto que la metilacin del DNA tiene sobre la expresin gentica ha hecho
imprescindible el estudio de los mecanismos de accin de las MTasas para conocer
mejor procesos como el desarrollo del cncer o para establecer estrategias

10

teraputicas en el caso de genes de patogenicidad regulados por metilacin. Gracias a
este inters, se ha dilucidado el mecanismo cataltico que siguen las MTasas, as como
se ha hecho un progreso notable para entender la forma en que estas enzimas
reconocen al DNA con gran especificidad.

Tabla 2. Caractersticas de los sistemas de restriccin-modificacin.
Tipo
Estructura
Cofactores
1

TRD
2

Sitio de
rompimiento
Secuencias de
reconocimiento
ENasa MTasa
I Actividad de
ENasa, MTasa y
reconocimiento
en subunidades
diferentes.
ATP, SAM,
Mg
2+

SAM (Mg
2+
,
ATP)
Subunidad S. Al azar; hasta
1 kb alejado
del blanco
Asimtricas con
un espaciador de
longitud variable
(ej. GAGN7GTCA)
3

II ENasa y MTasa
en diferentes
enzimas.
Mg
2+
SAM Independiente Dentro del
blanco.
Palindrmicas
(ej. GTCGAC)
4

III Complejo
formado por una
subunidad de
modificacin y
una de
restriccin.
ATP,
(SAM),
Mg
2+

SAM (Mg
2+
,
ATP)
Subunidad M Definida, a 25-
27 pb del
extremo 3 del
blanco.
Asimtricas
(ej. AGACC)
5

IV
6
Formados por
una o dos
subunidades.
Mg
2+
, GTP 30 pb de la
secuencia
blanco
Dinucletidos
modificados
(RmC)
7

Basado en [Gingeras, 1991] y [Roberts et al., 2003]
1. Los cofactores en parntesis no son necesarios pero estimulan la actividad.
2. TRD: Dominio de reconocimiento del DNA blanco
3. Secuencia de reconocimiento para el sistema EcoAI.
4. Secuencia de reconocimiento para el sistema SalI.
5. Secuencia de reconocimiento para el sistema EcoP1I.
6. A diferencia de los sistemas anteriores, el tipo IV corta DNA metilado, hidroximetilado, o glucosil-
hidroximetilado.
7. La secuencia de reconocimiento solo se ha definido para el sistema EcoKMcrBC.


11

En las MTasas, las funciones de catlisis y reconocimiento del DNA estn localizadas
en dos dominios diferentes: el dominio cataltico, donde se lleva a cabo la
transferencia del grupo metilo del SAM a la base blanco; y el dominio de
reconocimiento de DNA (TRD, por Target Recognition Domain), el cual determina la
secuencia de reconocimiento. Todas las MTasas caracterizadas estructuralmente
presentan conservacin estructural en el dominio cataltico y elevada heterogeneidad
a nivel del TRD (Fig. 2). El dominio cataltico est formado por una hoja de siete
plegamientos flanqueada por hlices en ambas caras de la hoja, creando una
estructura tipo sndwich (Fig. 2), la cual contiene los sitios de unin a SAM y de la
base a metilar [Cheng & Roberts, 2001; Roberts, 1994].

Figura 2. Estructura de algunas MTasas. El TRD se muestra en gris. Los plegamientos
estn mostrados en verde, mientras que las hlices en azul. Tomado de [Cheng & Roberts,
2001].

A pesar de que el dominio cataltico de las MTasas se encuentra estructuralmente
conservado, no hay una correspondencia con la similitud a nivel de aminocidos
[Cheng & Roberts, 2001]. Sin embargo, se han detectados varios motivos conservados
a nivel de secuencia de aminocidos (9 para MTasas de adenina, y 10 para las de
citosina), lo que facilita su identificacin cuando se cuenta con la secuencia
aminoacdica. Estos motivos son responsables del reconocimiento de SAM (motivos I-


12

III, V, X), en la catlisis de la metilacin (motivos IV y VI), y en el posicionamiento
adecuado de la base blanco dentro del sitio activo de la enzima (motivos IV, VI, VIII)
[Jeltsch, 2002; Malone et al., 1995]. El orden en el que se presentan estos motivos
vara con el tipo de MTasa (Fig. 3). Las m5C-MTasas contienen los diez motivos en
orden consecutivo; el TRD se encuentra insertado entre los motivos VIII y IX. Las
MTasas que modifican adenina o el grupo amino de la citosina carecen del motivo IX, y
tienen la peculiaridad de presentar los motivos de manera permutada. Esta
permutacin ha permitido clasificar a las amino-MTasas en tres clases diferentes: , ,
y [Malone et al., 1995].

De todos estos motivos, las posiciones ms conservadas entre las MTasas son una
glicina en el asa posterior al plegamiento 1 (motivo I), un aminocido cargado
negativamente: Asp/Glu (motivo II) en el extremo carboxilo terminal del plegamiento
2, y un residuo hidrofbico, Val/Ile/Leu (motivo IV) dentro del plegamiento 4. Solo
uno de estos motivos (motivo I) es identificable a partir de la secuencia aminoacdica,
aunque cuando se comparan MTasas dentro de la misma familia (5mC, , , ) el
grado de similitud aumenta considerablemente [Cheng & Roberts, 2001].

Figura 3. Orden lineal de los motivos conservados en las MTasas. Los bloques
representan la secuencia de aminocidos orientada del extremo amino terminal (N) al
carboxilo terminal (C). En azul se muestran el dominio cataltico y en naranja el TRD (dominio
de reconocimiento del DNA).

1.3. Mecanismo de accin de las
Gran parte de la informacin que se tiene acerca del mecanismo d
MTasas proviene de M.HhaI
reconoce la secuencia GCGC y metila la citosina interna en la posicin C5
(http://rebase.neb.com/rebase/enz/M.HhaI.html
determinadas experimentalmente (28 de acuerdo a la REBASE) en presencia y
ausencia de sustratos, ha permitido descifrar el mecanismo de accin de esta enzima
la han colocado como prototipo de las m5C

El paso inicial del proceso de metilacin es el
consolidacin del sitio activo
linealmente a lo largo de la doble cadena; una vez que localiza su secuencia blanco,
dominio cataltico sufre un cambio conformacional
asa del dominio cataltico hacia el
2004; Zhou et al., 2009].

Figura 4. Rearreglo conformacional
M.HhaI se une a DNA especfico, un asa del dominio cataltico (rojo) se inserta en el surco
menor del DNA (verde). Imagen basada en las estructuras de M.HhaI sin DNA (1HMY) y unida
a DNA especfico (3HMT).

13
1.3. Mecanismo de accin de las m5C-MTasas
Gran parte de la informacin que se tiene acerca del mecanismo de accin de las
MTasas proviene de M.HhaI. Esta enzima fue aislada de Hemophilus haemolyticus
http://rebase.neb.com/rebase/enz/M.HhaI.html). La gran cantidad de estructuras
erminadas experimentalmente (28 de acuerdo a la REBASE) en presencia y
ausencia de sustratos, ha permitido descifrar el mecanismo de accin de esta enzima
la han colocado como prototipo de las m5C-MTasas.
El paso inicial del proceso de metilacin es el reconocimiento del sitio blanco
consolidacin del sitio activo. Se ha propuesto que M.HhaI se une al DNA y se mueve
linealmente a lo largo de la doble cadena; una vez que localiza su secuencia blanco,
dominio cataltico sufre un cambio conformacional ocasionado por la migracin de
asa del dominio cataltico hacia el surco menor del DNA (Fig. 4) [Estabrook
conformacional en M.HhaI en respuesta a la unin de DNA
DNA especfico, un asa del dominio cataltico (rojo) se inserta en el surco
Mecanismo de accin de M.HgiDII

e accin de las m5C-
Hemophilus haemolyticus;
. La gran cantidad de estructuras
erminadas experimentalmente (28 de acuerdo a la REBASE) en presencia y
ausencia de sustratos, ha permitido descifrar el mecanismo de accin de esta enzima y
reconocimiento del sitio blanco y
Se ha propuesto que M.HhaI se une al DNA y se mueve
linealmente a lo largo de la doble cadena; una vez que localiza su secuencia blanco, el
ocasionado por la migracin de un
Estabrook et al.,
en M.HhaI en respuesta a la unin de DNA. Cuando
DNA especfico, un asa del dominio cataltico (rojo) se inserta en el surco


14

Este rearreglo se presenta nicamente cuando M.HhaI ha reconocido su sitio blanco
[Klimasauskas et al., 1994]; adicionalmente, el cambio conformacional contribuye al
ensamblaje correcto del sitio activo y est acoplado con la transferencia de la base
hacia el sitio cataltico [Estabrook & Reich, 2006]. Se ha demostrado que la protena
participa activamente en la migracin de la citosina blanco hacia el sitio activo. Los
contactos que M.HhaI establece con el DNA blanco permiten la disminucin de la
barrera de energa libre requerida para el desplazamiento de la base, adems de que
estabiliza este estado mediante el secuestro de la citosina dentro del sitio cataltico
con el asa proveniente del sitio cataltico [Huang et al., 2003].

1.3.1. Catlisis enzimtica de la metilacin
El mecanismo de transferencia del grupo metilo ha sido ampliamente estudiado en
M.HhaI. Los residuos del sitio activo Glu119 y Arg165 se requieren para orientar y
estabilizar la citosina para el ataque nucleoflico mediado por Cys81 (Fig. 5) [Shieh &
Reich, 2007; Shieh et al., 2006]. En el caso de M.HhaI se ha demostrado que Glu119
tiene un papel importante en los primeros pasos de la catlisis. Este residuo protona
la posicin N3 (Fig. 5 y 6a), ocasionando un reacomodo electrnico en el anillo de
citosina que resulta en una carga parcial positiva en la posicin C6. Esto permite el
ataque en C6 por Cys81 (Fig. 6a), lo que posteriormente desencadena un ataque
nucleoflico de C5 al grupo metilo del SAM (Fig. 6b). El paso final de la reaccin incluye
la eliminacin de un tomo de hidrgeno de C5. Anlisis de simulaciones de dinmicas
moleculares en el sitio cataltico de M.HhaI mostraron que un canal de agua en el sitio
activo provee aniones hidrxido requeridos para deprotonar el complejo Cys81-
citosina (Fig. 6c) y liberar la citosina liberada (Fig. 6d) [Zhang & Bruice, 2006; Lau &
Bruice, 1999].

Figura 5. Sitio cataltico de M.HhaI
esqueleto carbonado blanco; los

El papel de Glu119 en la catl
donde se concluy que
contribuyendo nicamente a crear la con
residuo todava resultara esencial para el proc
activamente en la orientacin de la citosina blanco
acuerdo a este mecanismo de accin, las interacciones entre la posicin O2 y los
residuos Arg163 y Arg165 seran los principales mecanismos
mediante una deslocalizacin
por parte de Cys81 [Zhang & Bruice
M.HhaI parece seguir la ruta que utiliza la protonacin en N3, pue
diferentes inhibidores anlogos a citosina han demostrado que Glu119, Arg163, y
Arg165 participan activamente promoviendo y estabilizando la formacin del
intermediario protonado [Kumar, 1997]

Arg
15
Figura 5. Sitio cataltico de M.HhaI. La citosina blanco se muestra como cilindros de
los aminocidos de M.HhaI se muestran en verde.
El papel de Glu119 en la catlisis ha sido debatido por estudios computacionales
donde se concluy que Glu119 tiene un papel secundario en la catlisis,
contribuyendo nicamente a crear la conformacin del estado basal; no obstante
residuo todava resultara esencial para el proceso cataltico debido a que participa
activamente en la orientacin de la citosina blanco [Zhang & Bruice
seran los principales mecanismos que inician la catlisis
deslocalizacin de electrones hacia O2, lo que permitira el ataque en C5
Zhang & Bruice, 2006]. Sin embargo, se ha demostrado que
M.HhaI parece seguir la ruta que utiliza la protonacin en N3, pues estudios con
[Kumar, 1997].

Glu119
Arg165
N3
O2

La citosina blanco se muestra como cilindros de

ha sido debatido por estudios computacionales
Glu119 tiene un papel secundario en la catlisis,
no obstante, este
eso cataltico debido a que participa
Zhang & Bruice, 2006]. De
que inician la catlisis
permitira el ataque en C5
se ha demostrado que
s estudios con

16

Figura 6. Mecanismo de transferencia del grupo metilo en M.HhaI. La numeracin del
anillo se muestra en la estructura de la derecha. (a) Activacin del anillo de citosina por
protonacin en N3 mediada por Glu119 facilita el ataque nucleoflico en C6 por Cys81. (b)
Flujo de electrones hacia el anillo de pirimidina activa el C5, el cual ataca al grupo metilo del
SAM. (c) Un anin hidrxido del agua deprotona la posicin C5, causando el rompimiento del
enlace covalente entre Cys81 y la citosina. (d) Los productos finales de la reaccin: m5C, y S-
adenosil metionina. Basado en [Shieh & Reich, 2007] y [Zhang & Bruice, 2006].

1.3.2. Reconocimiento del DNA blanco
Mientras que el mecanismo de metilacin ha sido bien estudiado y se ha visto que es
conservado entre las MTasas, el reconocimiento especfico del DNA no ha sido bien
estudiado debido a la elevada divergencia de aminocidos del TRD, lo que hace que los
estudios comparativos sean difciles de realizar [Roberts, 1994]. A pesar de esto, se ha
visto que las MTasas que reconocen secuencias similares muestran cierto grado de
conservacin a nivel del TRD [Roberts, 1994; Szegedi & Gumport, 2000].
Adicionalmente, se ha mostrado que varias MTasas de citosina contienen un motivo
conservado (motivo TL), el cual est involucrado en la orientacin e inmovilizacin de
la citosina blanco dentro del sitio cataltico [Vilkaitis et al., 2000]. La conservacin de
aminocidos que rodean el motivo TL en MTasas que reconocen secuencias similares
ha originado la posibilidad de usar esta regin como predictor de especificidad de
secuencia [Neely & Roberts, 2008].

La forma en que algunas MTasas interactan con el DNA ha sido establecida mediante
el empleo de agentes modificadores del DNA. De esta forma se ha encontrado que las
MTasas hacen contactos especficos con las bases a travs del surco principal del DNA
[Finta & Kiss, 1997] as como con el esqueleto de fosfato en el caso de M.TaqI [Mayer
N
N
NH
2
O
DNA
S
-
Cys81
Glu119
OH
O
S
Cys81
N
N H
NH
2
O
DNA
Glu119
O
-
O
Ade
S
+
R
CH
3
S
Cys81
N
N C
NH
2
O
DNA
CH
3
H
Glu119
OH
O
O H
-
N
1
N
3
2
4
5
6
NH
2
O
DNA
CH
3
Glu119
OH
O
S
-
Cys81
Ade
S
R
Ade
S
R
(a) (b) (c) (d)


17

& Barany, 1994]. Mediante mutagnesis dirigida se han encontrado en M.EcoRV dos
residuos (arginina y asparagina) que son importantes para la unin al DNA [Roth et
al., 1998]. El estudio del reconocimiento del DNA en los sistemas RM de tipo I se ha
realizado principalmente mediante anlisis por alineamiento de secuencias,
modelamiento molecular y anlisis mutacionales. Empleando las dos primeras
estrategias, Sturrock & Dryden (1997) hallaron que en general los sistemas de tipo I
presentan una semejanza estructural en su dominio de unin a DNA, y que sta es
parecida a la de M.HhaI, por lo que estas enzimas pueden reconocer su sustrato
especfico de manera similar. Empleando mutagnesis al azar y dirigida se han
encontrado varios residuos crticos en el reconocimiento del DNA por parte de
MTasas de tipo I [Murray, 2000].

1.4. Metiltransferasa M.HgiDII
M.HgiDII es una m5C-MTasa que reconoce la secuencia GTCGAC, y pertenece al
sistema RM HgiDII de Herpetosiphon giganteus D [Krger et al., 1984]. Este sistema ha
sido estudiado en el aspecto de regulacin gentica mediante la generacin de
sistemas R-M hbridos empleando a M.HgiDII y SalI, una ENasa con la misma
especificidad pero que normalmente se encuentra asociada a una amino-MTasa
(M.SalI) [Plaez et al., 1998].

No se han realizado estudios estructurales en esta enzima, y aunque se ha
determinado su especificidad, todava se desconoce cul de las dos citosinas es
metilada. Adicionalmente, varias MTasas identificadas en proyectos de secuenciacin
de genomas son altamente similares a M.HgiDII a nivel de aminocidos, por lo que los
descubrimientos hechos en esta enzima podran ser extrapolados a estas MTasas.


18

2 22 2
2 22 2
. .. .
. .. .
J JJ J
J JJ J
U UU U
U UU U
S SS S
S SS S
T TT T
T TT T
I II I
I II I
F FF F
F FF F
I II I
I II I
C CC C
C CC C
A AA A
A AA A
C CC C
C CC C
I II I
I II I

N NN N
N NN N


19

A pesar de que el mecanismo cataltico de las MTasas ha sido descrito con detalle,
prcticamente toda la informacin proviene principalmente de una sola enzima,
M.HhaI. As, el estudio del mecanismo de accin de M.HgiDII, la cual tiene una
secuencia de reconocimiento diferente a M.HhaI, permitir tener un panorama ms
amplio del mecanismo de accin de estas enzimas. Como el mecanismo de accin de
las MTasas se encuentra conservado, los conocimientos generados podrn aplicarse a
otras MTasas, particularmente aquellas con secuencias de reconocimiento parecidas a
las de M.HgiDII y las que guardan una elevada similitud con sta pero que todava no
han sido caracterizadas.


20

3 33 3
3 33 3
. .. .
. .. .
O OO O
O OO O
B BB B
B BB B
J JJ J
J JJ J
E EE E
E EE E
T TT T
T TT T
I II I
I II I
V VV V
V VV V
O OO O
O OO O
S SS S
S SS S


21

3.1. Objetivo General

Proponer el mecanismo cataltico de M.HgiDII as como la forma en que interacta con
el DNA blanco mediante el anlisis de simulaciones de dinmica molecular.

3.2. Objetivos Particulares

Crear el modelo estructural de M.HgiDII acoplada al cofactor SAM y al DNA
blanco.

Realizar simulaciones de dinmica molecular sobre el complejo ternario.

Determinar las interacciones relevantes para el mecanismo de accin de
M.HgiDII.

Identificar los aminocidos responsables del reconocimiento especfico del
DNA en MTasas que reconocen secuencias idnticas o similares a la de
M.HgiDII.


22

4 44 4
4 44 4
. .. .
. .. .
M MM M
M MM M
A AA A
A AA A
T TT T
T TT T
E EE E
E EE E
R RR R
R RR R
I II I
I II I
A AA A
A AA A
L LL L
L LL L
Y YY Y
Y YY Y
M MM M
M MM M

T TT T
T TT T
O OO O
O OO O
D DD D
D DD D
O OO O
O OO O
S SS S
S SS S


23

4.1. Equipo de cmputo
El modelamiento por homologa y la preparacin del sistema fueron realizados en una
computadora personal Toshiba Satellite E105 (Intel Core Duo CPU P8400; 2.26
GHz). Las simulaciones fueron realizadas en el sistema de alto desempeo Biowulf,
instalado en los Institutos Nacionales Salud de los Estados Unidos (NIH, por sus siglas
en Ingls, National Institutes of Health; http://www.biowulf.nih.gov); se trata de un
sistema de cmputo en racimo con 2130 unidades de procesamiento de datos (nodos).
Para las simulaciones se emplearon 32 nodos, equivalentes a 64 procesadores
Opteron de 2.8 GHz, con conectividad Gigabit Ethernet.

4.2. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA
La estrategia que se sigui para el modelaje por homologa fue un procedimiento
iterativo basado en el perfil energtico de los aminocidos (Fig. 7). Este mtodo
consiste bsicamente en crear variantes estructurales de M.HgiDII mediante la
modificacin del alineamiento usado para el modelaje. Las estructuras generadas son
evaluadas y se selecciona aquella que presenta el mejor perfil energtico.

Los moldes usados para deducir la estructura de M.HgiDII (clave Entrez: P25265)
fueron las MTasas HaeIII unida a DNA, y HhaI unida a DNA y S-adenosil-l-
homocistena (PDB: 1DCT y 3MHT, respectivamente). Las secuencias de aminocidos
fueron alineadas con ClustalX [Larkin et al., 2007]. Para mejorar la calidad del
alineamiento, la estructura secundaria asignada por PSI-PRED [Bryson et al., 2005]
fue usada para aadir restricciones estructurales, eliminando as la introduccin de
huecos en hlices o plegamientos . El alineamiento fue modificado manualmente
para hacer coincidir los motivos catalticos y el motivo TL en todas las MTasas.

Figura 7. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII
modelamiento por homologa
aadiendo variaciones al alineamiento mltiple hasta obtener un perfil energtico en el cual
ningn aminocido tenga una energa

Los modelos fueron generados con Modeller 9.3
restricciones estructurales basadas en la prediccin de estructura secundaria
regin del TRD (aminocidos 207
programa. El perfil de energa libre del modelo inicial fue evaluado con el servidor
ANOLEA [Melo et al., 1997], realizando modificaciones manuales en
hasta que ningn aminocido en el modelo tuviera un puntaje mayor
unidades E/kT. Las coordenadas
la secuencia de DNA fue modificada con Chimera
GTCGAC (C es la citosina blanco
M.HgiDII. Como M.HgiDII tiene un
DNA fue extendida empleando
DNA fue aadido a la estructura de M.HgiDII usando como gua el
24
. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII
modelamiento por homologa. La estructura final es obtenida por modelaje iterativo
ningn aminocido tenga una energa mayor o igual a 10 E/kT.
os fueron generados con Modeller 9.3 [Eswar et al., 2008
basadas en la prediccin de estructura secundaria
regin del TRD (aminocidos 207-352); las asas fueron optimizadas con
energa libre del modelo inicial fue evaluado con el servidor
, realizando modificaciones manuales en la regin del TRD
hasta que ningn aminocido en el modelo tuviera un puntaje mayor
E/kT. Las coordenadas para el DNA fueron obtenidas de la estructura 1DCT
la secuencia de DNA fue modificada con Chimera [Pettersen et al., 2004],
blanco), para adaptarla a la secuencia de reconocimiento de
Como M.HgiDII tiene un TRD ms grande que el de los moldes, l
empleando una estructura de DNA no relacionada (PDB: 1BNA). El
DNA fue aadido a la estructura de M.HgiDII usando como gua el cido nucleico

. Estrategia empleada para obtener la estructura de M.HgiDII mediante
La estructura final es obtenida por modelaje iterativo
2008], aadiendo
basadas en la prediccin de estructura secundaria para la
352); las asas fueron optimizadas con el mismo
energa libre del modelo inicial fue evaluado con el servidor
la regin del TRD
hasta que ningn aminocido en el modelo tuviera un puntaje mayor o igual a 10
para el DNA fueron obtenidas de la estructura 1DCT;
, de GGCCAC a
para adaptarla a la secuencia de reconocimiento de
TRD ms grande que el de los moldes, la cadena de
una estructura de DNA no relacionada (PDB: 1BNA). El
cido nucleico


25

presente en las estructuras de M.HhaI y M.HaeIII. Finalmente, el cofactor SAM fue
reconstruido con el mdulo AutoPSF de VMD [Humphrey et al., 1996] a partir de un
residuo de adenina alineado con la estructura de SAM presente en 3MHT. Para aadir
los tomos restantes de SAM se requiri de los archivos de topologa y parmetros de
las versiones c35b2 y c36a2 de CHARMM [Mackerell et al., 1998; MacKerell &
Banavali, 2000]. El modelo fue refinado con simulaciones de dinmica molecular
(descritas ms adelante). La estructura promedio en un nanosegundo de simulacin
fue minimizada por el mtodo de gradiente conjugado (1000 pasos) para obtener la
estructura final del complejo ternario (M.HgiDII-SAM-DNA).

4.3. Evaluacin de la calidad del modelo
La calidad de los modelos fue evaluada en relacin a su energa y geometra
estereoqumica. Se emple Procheck [Laskowski et al., 1993] para evaluar la
geometra, ProSA-Web [Wiederstein & Sippl, 2007] para evaluar el potencial de
energa, y Verify3D para evaluar la compatibilidad local del modelo en relacin a
estructuras de buena calidad depositadas en el PDB [Eisenberg et al., 1997]. ANOLEA
fue utilizada para calcular la energa para cada aminocido de acuerdo al ambiente
no local de cada tomo pesado en la protena [Melo et al., 1997].

4.4. Definicin del sistema para la simulacin de dinmica molecular
Las simulaciones de dinmica molecular tratan de predecir el comportamiento de
sistemas biolgicos a nivel atmico. Las interacciones atmicas estn definidas por
tres potenciales de energa: Potencial de enlace covalente, potencial de enlace dbil, y
potencial electrosttico (Fig. 8). Adems de estos potenciales, la interaccin atmica
se ve influida por la velocidad y aceleracin de los tomos, las cuales estn definidas
por la temperatura y presin asignadas al sistema. Las funciones que definen estas
interacciones se conocen como campos de fuerza. El clculo de estos potenciales
representa una enorme cantidad de operaciones matemticas, por lo que se requiri
de sistemas de cmputo de alto rendimiento para realizar las simulaciones. Para darse
una idea de la complejidad de los clculos, la simulacin de 5 nanosegundos en un

sistema conformado por aproximadamente 65000 tomos requiri el trabajo
concertado de 64 procesadores durante 24 horas continuas. Adicionalmente
archivos generados durante la simulacin son de un tamao considerable, del orden
de gigabytes, por lo que el anlisis de los resultados tambin requiri una inversin
considerable de tiempo computacional.

Figura 8. Interacciones relev
potencial de enlace covalente;
http://www.stanford.edu/group/pandegroup/folding/education/molmodel.html

Todas las simulaciones fueron realizadas
en el sistema de alto rendimiento
(http://www.biowulf.nih.gov
[Mackerell et al., 1998; MacKerell & Banavali
simulaciones. El complejo ternario fue
de agua. La geometra de estas molculas corresponde al
prefiere para la simulacin de dinmicas moleculares porque e
interacciones requiere menor capacidad de cmputo. El cubo de agua fue construido
de manera tal que hubiera una distancia mnima
del cubo; adems, la carga neta del sistema fue neutralizada mediante la adicin de
26
concertado de 64 procesadores durante 24 horas continuas. Adicionalmente
considerable de tiempo computacional.
relevantes en la simulacin de dinmica molecular.
potencial de enlace covalente; B. Potenciales de interaccin dbil. Imagen modificada de:
Todas las simulaciones fueron realizadas con NAMD v2 [Phillips et al., 2005
de alto rendimiento Biowulf, instalado en el NIH
http://www.biowulf.nih.gov). Los campos de fuerza CHARMM22 y CHARMM27
MacKerell & Banavali, 2000] fueron usados para las
l complejo ternario fue introducido en un cubo formado por
. La geometra de estas molculas corresponde al modelo TIP3P
prefiere para la simulacin de dinmicas moleculares porque el clculo de sus
s requiere menor capacidad de cmputo. El cubo de agua fue construido
una distancia mnima de 12 entre el soluto y las paredes
la carga neta del sistema fue neutralizada mediante la adicin de


concertado de 64 procesadores durante 24 horas continuas. Adicionalmente, los
dinmica molecular. A. El
Potenciales de interaccin dbil. Imagen modificada de:
2005] instalado
instalado en el NIH
). Los campos de fuerza CHARMM22 y CHARMM27
fueron usados para las
formado por molculas
modelo TIP3P, el cual se
clculo de sus
s requiere menor capacidad de cmputo. El cubo de agua fue construido
entre el soluto y las paredes
la carga neta del sistema fue neutralizada mediante la adicin de

27

iones Na
+
y Cl
-
distribuidos al azar dentro del cubo. Al final el sistema qued
conformado por 64300 tomos.

Figura 9. Esquema que representa las condiciones de la simulacin. Los cuadros
representan las condiciones peridicas. rcut fue equivalente a 10 . Imagen tomada de:
http://www.compsoc.man.ac.uk/~lucky/Democritus/Theory/pbc-mi.html

El sistema fue simulado en condiciones peridicas a una temperatura y presin
constantes de 310 K (37
0
C) y 1 atm, respectivamente. Las condiciones peridicas
implican tener un nmero infinito de celdas idnticas a la celda de simulacin, y
permiten un flujo libre de molculas de una celda a otra del sistema, evitando prdida
de molculas o efectos de tensin superficial. Se emple un radio de corte de 10
para las interacciones dbiles (Fig. 9); es decir, se calcularon las interacciones de cada
tomo del sistema nicamente con tomos dentro de un radio de 10 . Con esta
distancia se disminuy el requerimiento de poder de cmputo sin afectar el
comportamiento de las molculas. Los enlaces covalentes que involucran tomos de
hidrgeno fueron restringidos mediante el algoritmo SHAKE, lo que permiti realizar
clculos de interacciones atmicas cada 2 fs (10
-15
segundos). Antes de realizar las
simulaciones es necesario equilibrar el sistema. Este paso consiste en llevar al sistema
a la temperatura y presin requeridas, adems de eliminar efectos estricos mediante
la minimizacin del sistema. El equilibrio del sistema debe realizarse de forma gradual
relajando primero al solvente y despus al soluto, ya que de esta forma se evita la
introduccin de cambios conformacionales drsticos en el soluto. La Tabla 3 resume


28

los pasos que se siguieron para realizar las corridas de equilibrio y de produccin. El
sistema fue equilibrado fijando el soluto y relajando el solvente con 20000 pasos de
minimizacin y 20 ps de simulacin. El soluto fue relajado gradualmente en corridas
de 10 ps con restricciones armnicas decrecientes (100, 10, y 1 kcal mol
-1

-2
),
minimizando por 1000 pasos entre cada periodo de simulacin. Por ltimo, el sistema
fue simulado por 5 ns a 310 K y una presin constante de 1 atm. Las coordenadas
fueron grabadas cada 5 ps (10
-12
segundos) durante el periodo de equilibrio, y cada 10
ps en la corrida de produccin.

Tabla 3. Etapas de la simulacin.
Procedimiento Tiempo
1
/pasos Condiciones Restricciones al soluto
2

Minimizacin 20000 pasos Soluto fijo
DM
3
20 ps 310 K/1 atm Soluto fijo
Minimizacin 1000 pasos 100 mol
-1

-2
DM 10 ps 310 K/1 atm 100 mol
-1

-2

-1

-2
DM 10 ps 310 K/1 atm 10 mol
-1

-2
-1

-2
DM 10 ps 310 K/1 atm 1 mol
-1

-2
Minimizacin 100 pasos Ninguna

DM 5 ns 310 K/1 atm Ninguna

1. Los ciclos de minimizacin/DM tuvieron una duracin en tiempo real de 2 a 3
horas. La simulacin de 5 ns tuvo una duracin en tiempo real de
aproximadamente 24 horas.
2. DM. Dinmica molecular
3. Restricciones armnicas


29

5 55 5
5 55 5
. .. .
. .. .
R RR R
R RR R
E EE E
E EE E
S SS S
S SS S
U UU U
U UU U
L LL L
L LL L
T TT T
T TT T
A AA A
A AA A
D DD D
D DD D
O OO O
O OO O
S SS S
S SS S
Y YY Y
Y YY Y
D DD D
D DD D
I II I
I II I
S SS S
S SS S
C CC C
C CC C
U UU U
U UU U
S SS S
S SS S
I II I
I II I

N NN N
N NN N

Las simulaciones de la dinmica molecular
estructural de protenas. En estas simulaciones
acuerdo a las leyes mecnicas de atraccin y repulsin, as como
ambientales definidas (presencia de solvente, temperatura y
el modelaje de protenas, las simulaciones
nativa debido a que se explora un mayor espectro conformacional (Fig.
al., 2008]. Asimismo, estas simulaciones permiten detectar y
atmicas relevantes en la funcin de las protenas, como la interaccin con los
sustratos. Estas dos aplicaciones de la simulacin de dinmicas moleculares
permitieron describir las interacciones de M.HgiDII con su substrato y cof
inferir a partir de stas el mecanismo cataltico que sigue la enzima
al., 2009].

Figura 10. Espectro conformacional explorado en la simulacin de dinmicas
moleculares. El modelo inicial de una protena podra no tener
Tcnicas como la minimizacin (flecha
no necesariamente representan la estructura nativa. La dinmica molecular explora un mayor
espectro conformacional (flecha azul)
conformacin nativa.

5.1. Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA
De acuerdo a la base de datos del PDB, l
M.HaeIII y M.HhaI (PDB: 1DCT y 3MHT)
moldes para deducir la estructura
30
de la dinmica molecular son de gran utilidad en el anlisis
En estas simulaciones se permite el movimiento atmico de
las leyes mecnicas de atraccin y repulsin, as como
definidas (presencia de solvente, temperatura y presin constantes)
el modelaje de protenas, las simulaciones permiten la adquisicin de la conformacin
debido a que se explora un mayor espectro conformacional (Fig.
. Asimismo, estas simulaciones permiten detectar y cuantificar interacciones
Estas dos aplicaciones de la simulacin de dinmicas moleculares
permitieron describir las interacciones de M.HgiDII con su substrato y cof
stas el mecanismo cataltico que sigue la enzima [Casteln
. Espectro conformacional explorado en la simulacin de dinmicas
El modelo inicial de una protena podra no tener la conformacin nativa.
Tcnicas como la minimizacin (flecha naranja) permiten obtener mnimos locales, los cuales
(flecha azul), con lo que se incrementa la posibilidad de obtener la
Modelamiento de M.HgiDII unida a SAM y DNA
De acuerdo a la base de datos del PDB, las MTasas ms parecidas a M.HgiDII son
1DCT y 3MHT), por lo que stas fueron seleccionadas
deducir la estructura de M.HgiDII. La baja identidad de aminocidos que

en el anlisis
se permite el movimiento atmico de
las leyes mecnicas de atraccin y repulsin, as como condiciones
presin constantes). En
conformacin
debido a que se explora un mayor espectro conformacional (Fig. 10) [Senet et
cuantificar interacciones
Estas dos aplicaciones de la simulacin de dinmicas moleculares
permitieron describir las interacciones de M.HgiDII con su substrato y cofactor, e
[Casteln-Vega et
. Espectro conformacional explorado en la simulacin de dinmicas
la conformacin nativa.
) permiten obtener mnimos locales, los cuales
e se incrementa la posibilidad de obtener la
ms parecidas a M.HgiDII son
seleccionadas como
La baja identidad de aminocidos que

estas MTasas comparten con M.HgiDII (aproximadamente 1
alineamiento de secuencias fuera el paso cr
11).

Figura 11. Validez del modelaje por homologa en relacin con el porcentaje de
identidad en los alineamientos
identidad mnimo requerido para obtener un modelo confiable es ce
de [Bourne & Weissig, 2003].

Basados en el conocimiento de que todas las DNA
contienen varios motivos conservados
los alineamientos para hacer coincidir
y se aadieron restricciones estructurales basad
secundaria. Este procedimiento result en un
cataltico de aproximadamente 27%
apropiado para el modelaje por homologa
correspondiente al TRD fue la que represent mayor dificultad para el alineamiento
debido a la variabilidad intrnseca de esta zona. Como
Mtodos, se realizaron varias modificaciones al alineamiento en la zona del TRD pero
manteniendo fija la posicin del motivo TL. Por cada modificacin al alineamiento se
cre un modelo estructural, el cual fue evaluado por el
con las modificaciones hasta que el perfil ANOLEA del modelo resultante indicara
31
stas MTasas comparten con M.HgiDII (aproximadamente 19%)
alineamiento de secuencias fuera el paso crtico durante el proceso de modelaje
. Validez del modelaje por homologa en relacin con el porcentaje de
identidad en los alineamientos. En el caso de M.HgiDII (354 amnocidos), el porcentaje de
identidad mnimo requerido para obtener un modelo confiable es cercano al 20%.
Basados en el conocimiento de que todas las DNA-MTasas descritas a la fecha
contienen varios motivos conservados [Jeltsch, 2002], se realizaron modificaciones en
los alineamientos para hacer coincidir todos los motivos catalticos en las tres MTasas,
restricciones estructurales basadas en la prediccin de estructura
secundaria. Este procedimiento result en un grado de identidad para
taltico de aproximadamente 27% el cual, como se observa en la Fig. 12
para el modelaje por homologa [Bourne & Weissig, 2003
debido a la variabilidad intrnseca de esta zona. Como se menciona en la seccin de
cre un modelo estructural, el cual fue evaluado por el servidor ANOLEA;

hizo que el
el proceso de modelaje (Fig.
. Validez del modelaje por homologa en relacin con el porcentaje de
En el caso de M.HgiDII (354 amnocidos), el porcentaje de
rcano al 20%. Modificado
MTasas descritas a la fecha
modificaciones en
todos los motivos catalticos en las tres MTasas,
s en la prediccin de estructura
para el dominio
2, result ms
2003]. La regin
se menciona en la seccin de
servidor ANOLEA; se continu


32

energas favorables para todos los aminocidos (<10 E/kT). Procedimientos similares
que involucran modificaciones reiterativas a los alineamientos, basadas en el puntaje
de los modelos resultantes, han sido aplicados con xito en las MTasas M.SssI y
M.BssHII [Koudan et al., 2004; Bujnicki, 2000] debido a la variabilidad intrnseca del
TRD en estas enzimas.

Figura 12. Alineamiento mltiple de M.HgiDII con los moldes M.HaeIII y M.HhaI. La
prediccin de estructura secundaria se muestra arriba de las secuencias de aminociods (H
para hlices , y E para plegamientos ). Los motivos conservados de aminocidos se
muestran bajo las secuencias. El TRD se muestra como una barra con lneas cruzadas bajo las
secuencias. Los alineamientos fueron formateados con BoxShade
(www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html).

El alineamiento final mostr una elevada similitud en el dominio cataltico a nivel de
estructura primaria y secundaria (Fig. 12). La secuencia de M.HgiDII es ms larga que
la de los moldes, y la mayora de los residuos adicionales se localiz en el TRD (Fig. 12,
caja con patrn cruzado). La comparacin estructural del modelo de M.HgiDII y las
estructuras de M.HaeIII y M.HhaI mostr una desviacin media cuadrtica (RMSD,
root mean square deviation) de 2.8 y 4.7 , respectivamente.


33

Aunque la especificidad de M.HgiDII (GTCGAC) ha sido confirmada
experimentalmente [Krger et al., 1984], todava se desconoce cul de las citosinas de
la secuencia de reconocimiento es el blanco de metilacin. Comparando
estructuralmente a M.HgiDII y los moldes, los cuales metilan la citosina interna de la
secuencia de reconocimiento, se hall que el acceso al sitio cataltico de M.HgiDII
coincide con la citosina interna, lo que indica que esta base es el blanco de la
metilacin en esta enzima. De esta forma, creamos una estructura de DNA que
contiene la secuencia de reconocimiento de M.HgiDII con la citosina interna traslocada
al sitio cataltico.

El complejo ternario fue sometido a simulaciones de dinmica molecular, y el sistema
fue monitoreado mediante la evolucin del RMSD del carbono y el radio de giro de
M.HgiDII (Rg) (Fig. 13). El valor de RMSD determina la variacin de la estructura de
M.HgiDII conforme pasa el tiempo de simulacin. El valor Rg tambin mide la
variacin de la estructura de M.HgiDII, pero a diferencia del valor de RMSD, donde se
compara la desviacin estructural en relacin a la estructura inicial del sistema, el Rg
mide la distancia promedio de todos los tomos al centro geomtrico de la molcula
conforme avanza la simulacin. Estos dos valores son tiles para determinar el
equilibrio del sistema, el cual se alcanza cuando dichos valores alcanzan un valor
constante. La Fig. 13 muestra la evolucin de los valores RMSD y Rg durante la
simulacin; puede observarse que el sistema comienza a equilibrarse
aproximadamente durante el primer nanosegundo (1000 ps) de simulacin. El modelo
final del complejo ternario fue obtenido a partir de la estructura minimizada (1000
pasos) promedio en un nanosegundo en la parte final de la simulacin (Fig. 13). Se
eligi esta zona porque present variaciones mnimas en los valores de RMSD y Rg.


34

Figura 13. Monitoreo de RMSD y Rg de M.HgiDII durante la simulacin. La lnea negra
indica la evolucin del RMSD, mientras que la gris muestra la evolucin del Rg. El rectngulo
muestra la seccin empleada para obtener la estructura final del complejo ternario.

5.2. Evaluacin de la calidad del modelo
El modelo final del complejo ternario, despus de la simulacin y una ronda final de
minimizacin, fue evaluado en cuanto a sus caractersticas energticas y
estereoqumicas. El anlisis global de estas caractersticas determina el xito en el
proceso de modelaje. El anlisis energtico global del modelo con ProSA-Web mostr
un puntaje Z de -7.18 (Fig. 14), lo que indica que no hay alteraciones significativas en
relacin con estructuras nativas de tamao similar al de M.HgiII [Wiederstein & Sippl,
2007]. El anlisis de Verify3D indic una concordancia secuencia-estructura
razonablemente buena porque ninguno de los aminocidos tuvo un puntaje negativo
(puntaje promedio = 0.36). El anlisis estereoqumico de Procheck mostr que no
hubo contactos o puntajes inapropiados en cuanto a los parmetros de cadena
principal y grupos funcionales, y la grfica de Ramachandran mostr que el 99.3% de
los aminocidos residi en regiones permitidas (87.8% en las regiones ms
favorables) (Fig. 14). Como regla general una estructura proteica se considera
aceptable si al menos el 90% de sus aminocidos se encuentra dentro de las regiones
permitidas de la grfica de Ramachandran. De esta forma, el procedimiento que
seguimos para modelar a M.HgiDII result en una estructura confiable para
determinar las interacciones relevantes para la catlisis enzimtica y el
reconocimiento de DNA por parte de M.HgiDII.


35

Figura 14. Evaluacin de la calidad de la estructura de M.HgiDII. (A) Resultado obtenido
con ProSA-Web. La energa total de M.HgiDII se encuentra dentro de la regin considerada
como aceptable de acuerdo a resultados experimentales (zona azul). (B) Grfica de
Ramachandran. Las zonas ms favorables se muestran en rojo, y las regiones aceptables se
muestran en amarillo y beige. (C) Perfil energtico por ANOLEA. En verde se muestran los
aminocidos con energas menores a cero y en rojo los que presentan energas mayores a
cero.


36

5.3. Descripcin general de la estructura
El modelo final de M.HgiDII muestra dos dominios estructurales: El dominio cataltico
y el TRD; la unin de estos dos dominios forma un surco donde se llevan a cabo las
interacciones con el DNA (Fig. 15). El cofactor SAM est situado en el sitio cataltico de
la enzima, muy cercano a la citosina blanco de metilacin. El dominio cataltico
contiene un ncleo de plegamientos rodeado por hlices (Fig. 15a). La hoja
contiene siete plegamientos (6 7 5 4 1 2 3 ) arreglados en dos
subdominios. El primer subdominio forma el sitio de unin a SAM, y est formado por
una serie de plegamientos paralelos (1 2 3 ); en la Fig. 15b se muestra que este
subdominio est situado en izquierdo de la hoja . El segundo subdominio forma el
sitio de unin de citosina, y est formado por cuatro plegamientos (6 7 5 4 );
el plegamiento 7 est insertado de manera anti-paralela. Este tipo de arreglo es comn
a todas las MTasas descritas a la fecha [Cheng & Roberts, 2001]. La hoja contiene
una capa de hlices en ambos lados, formando un dominio tipo Rossmann
caracterstico de las MTasas dependientes de SAM [Kozbial & Mushegian, 2005].

El TRD de M.HgiDII se parece al de M.HaeIII [Reinisch, 1995] en que ambas MTasas
muestran una pobre organizacin a nivel de estructura secundaria. Casi todas las
interacciones con el DNA son mediadas por varias asas del TRD, y son las que daran la
especificidad a la enzima. Un asa del dominio cataltico (aminocidos 80-88) contacta
la hlice de DNA a travs del surco menor (Fig. 15). Este contacto hace que la enzima
envuelva totalmente una de las cadenas del DNA, confinando de esta forma a la
citosina blanco dentro del sitio cataltico. En M.HhaI se ha observado que en ausencia
de DNA o en presencia de DNA no especfico, el asa equivalente a la de M.HgiDII se
encuentra dentro del sitio cataltico, pero que en presencia de DNA especfico, esta
regin sufre un cambio conformacional y se inserta en el DNA [Klimasauskas et al.,
1994; Estabrook & Reich, 2006]; adems, se ha visto que este cambio est acoplado a
la traslocacin de la citosina [Estabrook & Reich, 2006]. M.HgiDII podra tener el
mismo mecanismo de ajuste inducido, dada la similitud estructural entre ambas
enzimas.

Figura 15. Modelo de M.HgiDII en complejo con DNA y SAM.
por estructura secundaria (rojo, hlice
color magenta con superficie semi
transparente; la secuencia de reconocimiento es de color verde, y el resto del DNA es azul.
y (b) son imgenes rotadas 90
PyMOL (http://www.pymol.org).

5.4. Interacciones dentro del sitio cataltico
El anlisis de la trayectoria mostr que M.HhiDII
citosina blanco (Fig. 16). Los aminocidos
y Thr269 (TRD) interactuaron con el oxgeno exocclico
Arg162 tambin interactu con el
hidrgeno estable con el nitr
IV) y Glu116 (motivo VI) hicieron contactos con el nitr
Estas interacciones mantuvieron a la citosina en la orientaci
contactos ptimos con Cys79 y SAM.
sido demostrada en M.HhaI, en la cual la sustitucin de Arg165 (equivalente a Arg162
de M.HgiDII) por alanina tuvo un efecto negativo en la actividad de metilacin
et al., 2006]. El papel de Arg160 en la catlisis
37
Figura 15. Modelo de M.HgiDII en complejo con DNA y SAM. La protena est coloreada
ecundaria (rojo, hlice ; amarillo, plegamiento ). SAM est mostrado en
color magenta con superficie semi-transparente. El DNA est mostrado como superficie semi
transparente; la secuencia de reconocimiento es de color verde, y el resto del DNA es azul.
y (b) son imgenes rotadas 90
o
de la misma estructura. Las imgenes fueron generadas con
PyMOL (http://www.pymol.org).
Interacciones dentro del sitio cataltico
l anlisis de la trayectoria mostr que M.HhiDII establece varios contactos
Los aminocidos Arg160 (motivo VIII), Arg162 (motivo VIII),
y Thr269 (TRD) interactuaron con el oxgeno exocclico (O2) de la citosina (
Arg162 tambin interactu con el fosfato de la citosina, y form un puente de
geno estable con el nitrgeno N3 de la citosina. Ala77 (cadena principal; motivo
IV) y Glu116 (motivo VI) hicieron contactos con el nitrgeno exocclico N4 (
Estas interacciones mantuvieron a la citosina en la orientacin apropiada para tener
actos ptimos con Cys79 y SAM. La importancia de este tipo de interacciones
de M.HgiDII) por alanina tuvo un efecto negativo en la actividad de metilacin
. El papel de Arg160 en la catlisis tambin ha sido demostrado en M.SssI,

La protena est coloreada
mostrado en
transparente. El DNA est mostrado como superficie semi-
transparente; la secuencia de reconocimiento es de color verde, y el resto del DNA es azul. (a)
de la misma estructura. Las imgenes fueron generadas con
establece varios contactos con la
Arg160 (motivo VIII), Arg162 (motivo VIII),
de la citosina (Tabla 4);
y form un puente de
Ala77 (cadena principal; motivo
geno exocclico N4 (Tabla 4).
n apropiada para tener
interacciones ha
de M.HgiDII) por alanina tuvo un efecto negativo en la actividad de metilacin [Shieh
ha sido demostrado en M.SssI,

38

otra C5mC MTasa, en la cual la mutacin de Arg230 (equivalente a Arg160 de
M.HgiDII) con alanina afecta la actividad de metilacin [Darii et al., 2009].

Tabla 4. Distancias interatmicas relevantes para la actividad cataltica de M.HgiDII.
Par atmico
1
Distancia promedio
2
()
Arg160 O2 2.8
Arg162 O2 3.1
Thr269 O2 3.1
Arg162 O1P 3.3
Arg162 N3 3.1
Ala77 N4 2.9
Glu116 N4 2.8
Val118 C4 5.9
Cys79 C6 3.5
SAM-CH3 C5 3.5
1. A excepcin de Ala77, todos los aminocidos contactaron a la citosina blanco a travs
de sus grupos funcionales.
2. Distancia promedio en un nanosegundo de simulacin.

Aunque la valina del motivo VI no est involucrada directamente en la catlisis, su
substitucin causa alteraciones en la actividad de metilacin [Estabrook et al., 2004;
Darii et al., 2009]. Anlisis mutacionales y experimentos de unin a DNA en M.HhaI
han sugerido que este residuo podra ser importante para el ensamble correcto del
sitio cataltico, y que tambin podra participar en el mecanismo de traslocacin de la
base. En el caso de M.HgiDII, Val118 (motivo VI) estuvo posicionada a una distancia
promedio de 5.9 de la citosina blanco (carbono C4; Tabla 4), interactuando con la
base a travs de interacciones hidrofbicas.


39

Figura 16. Interacciones en el sitio cataltico de M.HgiDII. El esqueleto de la citosina
blanco y del SAM est mostrado en blanco, y los aminocidos en verde. Los puentes de
hidrgeno estn mostrados en amarillo; las lneas que conectan Cys79 y C6, y C5 y el grupo
metilo del SAM estn mostradas en rojo.

El anlisis de la trayectoria mostr que adems de interactuar con la citosina, Val118
tambin bloque el paso de molculas de agua desde el sitio de unin a DNA hacia el
sitio cataltico. Este bloqueo crea un ambiente libre de agua en la regin donde Cys79
interacta con C6 (Fig. 17). Por lo tanto, se propone que aparte de su contribucin a
orientar la citosina, Val118 podra tambin participar como una barrera que evita el
paso de molculas hacia el sitio cataltico, lo que de otra forma podra interferir con la
catlisis.

Figura 17. Canales de agua en el sitio cataltico de M.HgiDII
presentes en el sitio cataltico de M.HgiDII se muestran con su superficie en forma de malla.
Puede apreciarse que Val118 impide el paso de agua al interior del sitio cataltico.

De acuerdo al mecanismo cataltico mostrado en la Fig.
residuo de cido glutmico (Glu119 en M.HhaI) permite el ataque de la cistena a C6; el
flujo reverso de electrones hacia el anillo de citosina activa C5 para que
grupo metilo de SAM. Sin embargo, la trayectoria de M.HgiDII mostr que au
contact a C6 (Tabla 4), y que el grupo metilo de SAM interactu con
Glu116 no hizo contactos directos con N3; en vez de ello, interactu con N4 y el grupo
amino de SAM. Aparentemente, las interacciones directas con N3 podran no s
para la actividad cataltica de
citosina (Fig. 16) podra compensar la falta de interacciones directas en N3. Se ha
propuesto que las interacciones con O2 pueden desequilibrar la densidad
anillo de citosina y, por tanto,
et al., 1995; Kumar et al., 1997
la presencia de interacciones entre O2, Arg160 y Arg16
proceso cataltico es la interaccin de molculas de agua con N3.
40
. Canales de agua en el sitio cataltico de M.HgiDII. Las molculas de agua
tes en el sitio cataltico de M.HgiDII se muestran con su superficie en forma de malla.
De acuerdo al mecanismo cataltico mostrado en la Fig. 6, la protonacin de N3 por
flujo reverso de electrones hacia el anillo de citosina activa C5 para que
grupo metilo de SAM. Sin embargo, la trayectoria de M.HgiDII mostr que au
), y que el grupo metilo de SAM interactu con
amino de SAM. Aparentemente, las interacciones directas con N3 podran no s
actividad cataltica de M.HgiDII, y la gran cantidad de contactos en O2 de la
) podra compensar la falta de interacciones directas en N3. Se ha
propuesto que las interacciones con O2 pueden desequilibrar la densidad electrnica en el
, permitir el ataque en C6 por el residuo de cistena
1997]. Este mecanismo parece plausible para M.HgiDII debido a
la presencia de interacciones entre O2, Arg160 y Arg162. Otro factor que puede auxiliar
es la interaccin de molculas de agua con N3. Durante la simulacin, N3

Las molculas de agua
tes en el sitio cataltico de M.HgiDII se muestran con su superficie en forma de malla.
, la protonacin de N3 por un
flujo reverso de electrones hacia el anillo de citosina activa C5 para que ste ataque al
grupo metilo de SAM. Sin embargo, la trayectoria de M.HgiDII mostr que aunque Cys79
), y que el grupo metilo de SAM interactu con C5 (Tabla 4),
amino de SAM. Aparentemente, las interacciones directas con N3 podran no ser necesarias
, y la gran cantidad de contactos en O2 de la
) podra compensar la falta de interacciones directas en N3. Se ha
electrnica en el
permitir el ataque en C6 por el residuo de cistena [Gabbara
. Este mecanismo parece plausible para M.HgiDII debido a
2. Otro factor que puede auxiliar al
Durante la simulacin, N3

41

estuvo contactado por molculas de agua provenientes de uno de los canales presentes en el
sitio cataltico (Fig. 17). La participacin de molculas de agua en la activacin de N3 ha
sido propuesta en un estudio de dinmica molecular en M.HhaI [Lau & Bruice, 1999];
tambin se ha demostrado que una molcula de agua es responsable de la activacin en N3
en una mutante parcialmente activa de M.HhaI (Glu119Ala) [Shieh & Reich, 2007].
Tomando en cuenta lo anterior, el mecanismo de accin de M.HgiDII diferira del de
M.HhaI en el paso de activacin de la citosina (Fig. 18). Las interacciones en O2 seran
predominantes para la activacin del anillo de citosina, y la participacin de molculas de
agua en ayudara al proceso de activacin. A pesar de que Glu116 no participa directamente
en el proceso cataltico, aun resulta indispensable para la catlisis debido a que orienta y
estabiliza la citosina blanco y el SAM.

Figura 18. Mecanismo de accin de M.HgiDII. La numeracin atmica se muestra en el
esquema (d). (a) Activacin del anillo de citosina por interacciones entre O2, y Arg160 y
Arg162 facilitan el ataque nucleoflico en C6 por Cys81. (b) Flujo de electrones hacia el anillo
de pirimidina activa el C5, el cual ataca al grupo metilo del SAM. (c) Un anin hidrxido del
agua deprotona la posicin C5, causando el rompimiento del enlace covalente entre Cys81 y la
citosina. (d) Los productos finales de la reaccin: C5mC, y S-adenosil metionina.

El paso final en el proceso de metilacin es la liberacin de la citosina catalizada por
deprotonacin en C5. Simulaciones de dinmica molecular de M.HhaI han mostrado
que un canal de agua en el sitio cataltico provee molculas de hidrxido del solvente
que pueden deprotonar C5 [Zhang & Bruice, 2006; Lau & Bruice, 1999]. Sugerimos
que el mismo mecanismo toma lugar en M.HgiDII, la cual tambin mostr un canal de
agua que alcanz el C5 de la citosina (Fig. 17).

N
N
NH
2
O
DNA
S
-
Cys81
S
Cys81
N
N H
NH
2
O
DNA
Ade
S
+
R
CH
3
S
Cys81
N
N C
NH
2
O
DNA
CH
3
H O H
-
N
1
N
3
2
4
5
6
NH
2
O
DNA
CH
3
S
-
Cys81
Ade
S
R
Ade
S
R
(a) (b) (c) (d)
H
2
O?
H
2
O?
Arg160
Arg162
Arg160
Arg162
Arg160
Arg162
Arg160
Arg162


42

M.HgiDII interactu con SAM orientndolo para que interactuara de manera correcta
con la citosina blanco. La parte de adenina estuvo bordeando el canal de agua en el
sitio cataltico; el nitrgeno N6 de SAM interactu con Ser52 (motivo III), N1 con Ile53
(cadena principal; motivo III), y los hidroxilos de la ribosa con Asp31 (motivo II) (Fig.
16). Adicionalmente, el anillo de purina tuvo interacciones hidrofbicas con Phe9
(motivo I). La parte de metionina estuvo en un rea inaccesible al solvente, y se
mantuvo firmemente unida al sitio cataltico mediante interacciones con sus grupos
amino y carboxilo; el grupo amino de SAM interactu con Glu116, mientras que el
grupo carboxilo interactu con las cadenas principales de aminocidos del motivo I
(Cys10, Gly13, Gly14, Leu15), y del motivo X (Val325).

A pesar de que los anlisis mostrados en este trabajo son de tipo terico, existe una
gran cantidad de evidencia experimental y terica que apoya el mecanismo cataltico
propuesto para M.HgiDII. La existencia del complejo covalente entre M.HhaI y el DNA
(anlogo al intermediario (b) mostrado en la figura 18) ha sido demostrada mediante
anlisis de derivados fluorados en la posicin C5 de la citosina blanco [Klimasauskas
et al., 1994; Reinisch, 1995]. La relevancia de las interacciones entre residuos de
arginina y el O2 de la citosina ha sido demostrada mediante anlisis mutacionales en
M.HhaI [Shieh et al., 2006] y mediante el empleo de inhibidores anlogos de la citosina
[Kumar et al., 1997]. Por ltimo, la participacin de molculas de agua en la activacin
de N3 ha sido propuesta gracias al anlisis estructural de mutantes parcialmente
activas de M.HhaI [Shieh & Reich, 2007].

5.5. Interacciones con la secuencia blanco
M.HgiDII interactu con todas las bases de la secuencia de reconocimiento,
estableciendo contactos tanto con el esqueleto del DNA como con las nucleobases (Fig.
19). Casi todos los contactos con el DNA fueron establecidos a travs del surco
principal, el cual estuvo localizado en la interface protena-DNA (Fig. 15); un asa
(aminocidos 225 246) interactu con el surco menor varias bases ro abajo de la
secuencia blanco (Fig. 15); estas interacciones fuera de la secuencia de

reconocimiento probablemente no contribuyan a la especific
tiles para estabilizar la unin con el DNA. Los aminocidos del asa 80
interactuaron a travs del surco menor, principalmente con el esqueleto del DNA;
Tyr85, sin embargo, estableci contactos directos con la guanina hurfana. E
primer reporte que indica un papel de esta asa en el reconocimiento especfico del
DNA, por lo que se requieren estudios adicionales para esclarecer el papel de Tyr85
en este proceso. En M.HhaI, el asa equivalente
MTasa se une a su DNA espec

Figura 19. Interacciones con la secuencia blanco
diferentes a la citosina blanco. La secuencia de reconocimiento (
con la excepcin de la citosina blanco, que est en negro. Los contactos polares se muestran
como sigue: Interacciones directas mediadas por grupos f
continuas; interacciones directas mediadas por caden
discontinuas; los contactos van der Waals se muestran como flechas continuas grises; los
crculos con W interna representan contactos mediados por agua;
catin-.

43
reconocimiento probablemente no contribuyan a la especificidad, aunque pueden ser
Tyr85, sin embargo, estableci contactos directos con la guanina hurfana. E
En M.HhaI, el asa equivalente se mueve hacia el DNA solo cuand
MTasa se une a su DNA especfico [Estabrook et al., 2009; Zhou et al., 2009
. Interacciones con la secuencia blanco. Solo se muestran interacciones con bases
diferentes a la citosina blanco. La secuencia de reconocimiento (GTCGAC) se muestra en gris,
como sigue: Interacciones directas mediadas por grupos funcionales, flechas negras
continuas; interacciones directas mediadas por cadenas principales, flechas negras
crculos con W interna representan contactos mediados por agua; representa interacciones

idad, aunque pueden ser
Tyr85, sin embargo, estableci contactos directos con la guanina hurfana. Este es el
se mueve hacia el DNA solo cuando la
2009].
Solo se muestran interacciones con bases
GTCGAC) se muestra en gris,
ncionales, flechas negras
as principales, flechas negras
representa interacciones

El motivo TL de M.HgiDII est form
Thr267 interactu con el esqueleto de timina adyacente a la citocina blanco (Fig.
20). De manera similar a la treonina del motivo TL
este aminocido puede ser importan
adecuadamente la citosina blanco dentro del sitio cataltico de M.HgiDII.
20 puede verse que el grupo funcional de Ile268 se encuentra orientado hacia el
interior de la protena, y por lo tanto no
motivo TL, en el que la treonina contacta al DNA y el aminocido hidrofbico se
inserta en la protena tambin se observa en M.HaeIII (Val238) y M.HhaI (Leu251)
grupo hidrofbico podra dar estabilidad estruc
interaccin del residuo de treonina con el DNA.

Figura 20. Motivo TL de M.HgiDII, M. HaeIII y M.HhaI
estructura de M.HgiDII; en medio se muestra la estructura de M.HaeIII; y
muestra la estructura de M.HhaI.
en color verde, los de M.HaeIII en
el DNA en la estructura de M.HgiDII

Los aminocidos localizados
interactuaron con las tres bases de la parte derecha del sitio de reconocimiento (GTC,
o su correspondiente GAC en la cadena complementaria), mientras q
aminocidos localizados en el extremo amino terminal de Thr267 interactuaron con el
resto de las bases (Fig. 19
aminocidos a ambos lados del motivo TL ha sido identificada en varias MTasas de
44
El motivo TL de M.HgiDII est formado por Thr267 e Ile268. Durante la simulacin,
Thr267 interactu con el esqueleto de timina adyacente a la citocina blanco (Fig.
a la treonina del motivo TL en M.HhaI [Vilkaitis
este aminocido puede ser importante para sujetar la cadena de DNA y
la citosina blanco dentro del sitio cataltico de M.HgiDII.
puede verse que el grupo funcional de Ile268 se encuentra orientado hacia el
interior de la protena, y por lo tanto no interacta con el DNA. Esta disposicin del
inserta en la protena tambin se observa en M.HaeIII (Val238) y M.HhaI (Leu251)
grupo hidrofbico podra dar estabilidad estructural a la protena, permitiendo as la
interaccin del residuo de treonina con el DNA.
otivo TL de M.HgiDII, M. HaeIII y M.HhaI. El panel izquierdo muestra la
estructura de M.HgiDII; en medio se muestra la estructura de M.HaeIII; y a la derecha se
ctura de M.HhaI. Los aminocidos del motivo TL de M.HgiDII estn mostrados
en color verde, los de M.HaeIII en gris, y los de M.HhaI en amarillo. El contacto entre Thr267 y
en la estructura de M.HgiDII est representado por una lnea discontinua.
Los aminocidos localizados hacia el extremo carboxilo terminal de Thr267
o su correspondiente GAC en la cadena complementaria), mientras q
19). Esta distribucin de interacciones que involucra

Durante la simulacin,
Thr267 interactu con el esqueleto de timina adyacente a la citocina blanco (Fig. 16 y
Vilkaitis et al., 2000],
sujetar la cadena de DNA y posicionar
la citosina blanco dentro del sitio cataltico de M.HgiDII. En la figura
puede verse que el grupo funcional de Ile268 se encuentra orientado hacia el
. Esta disposicin del
inserta en la protena tambin se observa en M.HaeIII (Val238) y M.HhaI (Leu251). El
tural a la protena, permitiendo as la
El panel izquierdo muestra la
a la derecha se
M.HgiDII estn mostrados
. El contacto entre Thr267 y
o por una lnea discontinua.
carboxilo terminal de Thr267
o su correspondiente GAC en la cadena complementaria), mientras que los
). Esta distribucin de interacciones que involucra


45

citosina [Vilkaitis et al., 2000; Lauster et al., 1989], y como se discute ms adelante, es
una regin importante para definir la especificidad en este grupo de enzimas.

Los aminocidos Arg258 y Arg279 participaron en interacciones catin- con dos
guaninas en la secuencia de reconocimiento (Fig. 19). Las interacciones catin- se
establecen entre un anillo aromtico (nucleobase) y una carga positiva (p. ej. el grupo
guanidinio de la arginina) orientada de forma perpendicular al anillo aromtico.
Aunque los residuos de arginina tambin pueden establecer interacciones catin-
con las otras nucleobases del DNA, tienen preferencia por guaninas [Wintjens et al.,
2000], por lo que este tipo de interacciones pueden ser relevantes para el
reconocimiento especfico del DNA. Se ha demostrado que un residuo de arginina en el
TRD de M.HhaI (Arg240) es esencial para la discriminacin de la secuencia, cambio
conformacional y catlisis [Estabrook et al., 2009], por lo que se requiere de estudios
adicionales para establecer si Arg258 o Arg279 en M.HgiDII tienen funciones similares
como en M.HhaI.

Las molculas de agua jugaron un papel importante en las interacciones con el DNA.
De hecho, varios de los contactos especficos con las nucleobases fueron puentes de
hidrgeno mediados por agua (Fig. 19). Una red de molculas de agua en la interface
DNA-protena contribuye a estabilizar la interaccin DNA-protena mediante la
eliminacin de repulsiones electrostticas entre las dos macromolculas [Reddy et al.,
2001]. Adicionalmente, las molculas de agua pueden actuar como una extensin de
los grupos funcionales de los aminocidos para que estos puedan alcanzar
nucleobases que de otra forma seran inaccesibles debido a restricciones
conformacionales, o permitir interacciones entre dos tomos aceptores o donadores al
eliminar interacciones electrostticas desfavorables [Reddy et al., 2001]. Las
interacciones mediadas por agua han sido descritas en varias protenas de unin a
DNA, y son un mecanismo comn en el reconocimiento especfico del DNA [Reddy et
al., 2001; Rhodes et al., 1996].


46

5.6. Aminocidos conservados en el TRD de MTasas relacionadas a M.HgiDII
Para estudiar la relevancia de los aminocidos que realizaron interacciones
especficas con el DNA, se realizaron alineamientos con del TRD de M.HgiDII con
MTasas similares obtenidas de la base de datos REBASE. Todas las MTasas eran
enzimas putativas, y 20 de ellas tenan una secuencia de reconocimiento asignada por
la REBASE idntica a la de M.HgiDII; la asignacin de especificidad que hace REBASE
est basada en la similitud del TRD con enzimas caracterizadas experimentalmente.

El alineamiento mltiple (Fig. 21) mostr el siguiente motivo altamente conservado:
Cx5Gx6Y(GA)R(MLI)x7T(IML)TTx5-6GxGR(FY)xH, el cual incluye al motivo TL
(subrayado), y todos los aminocidos del TRD que interactuaron con el DNA. Este
resultado refuerza la importancia de esta regin en el reconocimiento especfico del
DNA, y podra ser de utilidad para predecir la especificidad de nuevas MTasas.

Figura 21. Alineamiento multiple del TRD de M.HgiDII y MTasas relacionadas. Las
secuencias asignadas de acuerdo a la REBASE se muestran despus del nombre de la MTasa.
El sombreado representa 100% identidad (fondo negro), o cambios altamente conservativos
(fondo gris). Los aminocidos que interactuaron con el DNA se marcan con tringulos negros.
El motivo TL se muestra sobre el alineamiento.

Motivo TL
M.Sci3XORFEP GTCGAC LLDCYKKPSGATYTSVYGRIKRTDVAPTLTTQF-TRYGTGRYGHYE
M.BloAORF1145P GTCGAC LLECQKKTTGSTFKSFYGRMEWDKPSPTITTQS-YNPGTGRFTHPE
M.LweSORF291P GTCGAC LPNCYKRKSGESYKSVYGRLEWDKPSSTITTQF-VGYGNGRFGHPE
M.LmoAP GTCGAC LPNCYKRKSGESYKSVYGRLEWDKPSSTITTQFVVGYGNGRFGHPE
M.Kpn342ORF3378P GTCGAC RAECHKKDSGMTYKSVYGRMIWDDTSPTITTQC-YGYGNGRFGHPE
M.XfaTORF577P GTCGAC RAACHCKDTGATYPSVYGRMEWDQPAPTITTQC-FGYGNGRFGHPE
M.XfaM23ORF606P GTCGAC RAACHCKDTGATYPSVYGRMEWDQPAPTITTQC-FGYGNGRFGHPE
M.XfaOORFC725P GTCGAC RAACHCKDTGATYPSVYGRMEWDQPAPTITTQC-FGYGNGRFGHPE
M.RpaHORF2193P GTCGAC RVACHKTGSGKTYPSVYGRMSWDKPSPTITTQF-YGFGNGRFGHPE
M.PnaORF4973P GTCGAC VAECHRKASGRHSAGVYGRMEWDKPAPTMTTLC-IGYGNGRFGHPQ
M.HauORF528P GTCGAC IAECHKKESGESYGSVYGRMEWDKVAPTITTQC-NGYGNGRFGHPE
M.VspLGPORF1649P GTCGAC RAKCHTKDSGKGYASVYGRMSWNEPSPTMTTQC-YGFGNGRFGHPS
M.SfuMORF3845P GTCGAC VADCHKKSSGKTYPSVYGRMTWDDPAPTMTTQF-FGFGNGRFGHPE
M.PpuWORF680P GTCGAC RAPCHRKSSGKTYPSVYGRMRHDEPGPTMTTLC-YGFGNGRFGHYD
M.MspELB17ORFEP GTCGAC MAECHRKATGKTYVSVYARMSWDKVSPTITTQS-YGFGNGRFGHPD
M.Nme53442ORF1094P GTCGAC RAACHRKKKGQSYKRIYGRMEWDKPAPTMTTLC-IGFGNGRFGHPE
M.Mca43617ORFAP GTCGAC VAECHKKSSGKTYGSVYGRMSWDKPAPTMTTLC-TGYGNGRFGHPE
M.TerORF4678P GTCGAC IAKCHTKSSGKSYPSVYGRMEWDSPSPTITTQC-FGFGNGRFGHPE
M.EsaSS113P GTCGAC VADCHKSKSGKTYASVYGRMEWDKPAPTMTTQC-FGFGNGRFGHPE
M.KpnMORF4707P VADCHRTDKGKTYSSVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE
M.VeiORF1175P GTCGAC VAECHRAESGRTYPGVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE
M.Bps1106ORF3681P IAECHRAESGRTYPGVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE
M.AspJSORF2196P VADCHRAESGRTYPGVYGRMEWDKPAPTMTTQC-YGFGNGRFGHPE
M.HgiDII GTCGAC 240 IAECHKKESGESYGSVYGRMEWDKVAPTITTQC-NGYGNGRFGHPE 285


47

La utilidad de la regin que rodea al motivo TL para predecir la especificidad ha sido
descrita para MTasas con secuencias de reconocimiento de 4 pb [Neely & Roberts,
2008]. Sin embargo, esto no ha sido posible en el caso de MTasas con secuencias de
reconocimiento ms largas (6 pb) debido a que se han encontrado MTasas con
secuencias de reconocimiento totalmente diferentes pero que presentan alta similitud
en la regin que rodea al motivo TL [Neely & Roberts, 2008]. Nuestro anlisis de
interacciones entre M.HgiDII y los alineamientos con MTasas relacionadas sugiere que
un motivo ms largo podra predecir mejor la especificidad en este tipo de MTasas;
adicionalmente, el hallazgo de que el asa 80 88 podra hacer contactos especficos
con el DNA indica que esta regin tambin podra tomarse en cuenta para predecir la
especificidad en nuevas MTasas.


48

6 66 6
6 66 6
. .. .
. .. .
C CC C
C CC C
O OO O
O OO O
N NN N
N NN N
C CC C
C CC C
L LL L
L LL L
U UU U
U UU U
S SS S
S SS S
I II I
I II I
O OO O
O OO O
N NN N
N NN N
E EE E
E EE E
S SS S
S SS S


49

La estrategia que se sigui en el procedimiento de modelamiento por
homologa permiti obtener un modelo confiable de M.HgiDII en complejo con
SAM y DNA (Fig. 14).
Se determin que M.HgiDII metila la citosina interna de su sitio de
reconocimiento (GTCGAC).
El anlisis de las trayectorias sugiri que las interacciones entre el O2 de la
citosina y las interacciones mediadas por agua en N3 podran ser relevantes
para la catlisis en M.HgiDII.
Se hall un canal de agua en el sitio cataltico de M.HgiDII, lo que apoya la
hiptesis de la participacin de molculas de agua en el mecanismo cataltico
de esta enzima.
Adicionalmente, se describi una nueva funcin para Val118 en la catlisis de
la metilacin como barrera del solvente hacia el sitio cataltico.
Se describi por primera vez que aminocidos del sitio cataltico pueden
participar activamente en el reconocimiento activo del DNA.
El hallazgo de aminocidos del domino cataltico de M.HgiDII que interactan
especficamente con la secuencia blanco, y de la identificacin de regiones del
TRD que son altamente conservadas en las MTasas relacionadas a M.HgiDII,
contribuirn a entender mejor el mecanismo del reconocimiento especfico del
DNA, y permitirn el diseo y refinamiento de algoritmos dirigidos a predecir
especificidades en nuevas MTasas.


50

7 77 7
7 77 7
. .. .
. .. .
G GG G
G GG G
L LL L
L LL L
O OO O
O OO O
S SS S
S SS S
A AA A
A AA A
R RR R
R RR R
I II I
I II I
O OO O
O OO O
D DD D
D DD D
E EE E
E EE E
T TT T
T TT T

R RR R
R RR R
M MM M
M MM M
I II I
I II I
N NN N
N NN N
O OO O
O OO O
S SS S
S SS S


51

Ambiente no local de un aminocido. Todos los tomos diferentes del hidrgeno en
un radio de 7 que pertenecen a aminocidos alejados 11 residuos en la misma
cadena, o que pertenezcan a otra cadena proteica.
En la siguiente direccin electrnica se puede ver un esquema:
http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/anolea/environment.html
Campo de fuerza. Conjunto de funciones y parmetros que describen los potenciales
energticos en un sistema de tomos.
Canal de agua. Tnel o conducto en la estructura de una protena que permite la
entrada de molculas de agua al interior de la protena.
Conformacin nativa. Conformacin en la cual una molcula tiene su actividad
biolgica intacta.
Dominio tipo Rossmann. Dominio estructural caracterstico de protenas que unen
nucletidos. Se compone de dos o tres plegamientos unidos por dos hlices .
Enzima putativa. Protena con supuesta actividad enzimtica pero que no ha sido
comprobada experimentalmente.
Epigentica. Estudio de los factores heredables, independientes de la secuencia
gentica, que afectan la expresin gentica. Algunos factores epigenticos son la
metilacin del DNA o la metilacin de las histonas.
Espectro conformacional. Conjunto de conformaciones de una protena, que van
desde la forma desnaturalizada hasta la conformacin nativa.
Minimizacin por gradiente conjugado. Mtodo de obtencin de la conformacin
con la menor energa local.
Minimizacin. Proceso de obtencin de la conformacin con la menor energa
potencial.
Modelaje por homologa. Procedimiento para la obtencin de la estructura de una
protena a partir de moldes caracterizados estructuralmente mediante el anlisis de
alineamientos de secuencias.
Motivo. Secuencia corta de aminocidos que se encuentra altamente conservada en
algn grupo particular de protenas.
Restriccin armnica. Mtodo para restringir parcialmente el movimiento de los
tomos en un sistema de simulacin de dinmica molecular.

52

Secuencia palindrmica. Segmento de DNA que presenta la misma secuencia en
ambas cadenas cuando se lee del extremo 5al 3. Por ejemplo, la secuencia GTCGAC es
palindrmica porque su secuencia complementaria tambin es GTCGAC.
Simulacin de la dinmica molecular. Prediccin computacional del
comportamiento de los tomos bajo leyes fsicas de atraccin y repulsin en
condiciones especficas de reaccin (temperatura, presin, volumen) por un tiempo
finito.
Sistema de cmputo en racimo. Arreglo de computadoras o procesadores
conectados a travs de redes de alta velocidad que trabajan en conjunto para resolver
operaciones lgicas o matemticas de manera altamente eficiente.
TIP3P. Modelo simplificado de la molcula de agua en el cual se definen tres puntos
de interaccin molecular, los cuales corresponden a los tomos que conforman la
molcula del agua. La simplicidad de este modelo permite su uso en simulaciones de
dinmica molecular.
Trayectoria. Conjunto de coordenadas que definen las posiciones de los tomos
durante la simulacin de la dinmica molecular.


53

8 88 8
8 88 8
. .. .
. .. .
B BB B
B BB B
I II I
I II I
B BB B
B BB B
L LL L
L LL L
I II I
I II I
O OO O
O OO O
G GG G
G GG G
R RR R
R RR R
A AA A
A AA A
F FF F
F FF F

A AA A
A AA A


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