A metilao padro de IFNG em granulomas periapicais e cistos radicular

RESUMO

Introduo: Interferon- desempenha um importante papel na patognese das
leses periapicais, e a metilao do IFNG tem sido associada com a inativao
da transcrio.O objetivo do presente estudo foi investigar IFNG promotor
metilao em associao com nveis de transcrio de genes e protenas em
granulomas periapicais e cistos radiculares.
Mtodos:Reao em cadeia da polimerase-metilao especfico foi utilizada
para avaliar o padro de metilao do DNA do gene IFNG em 16 granulomas
periapicais e 13 amostras de cisto radicular. Os nveis de transcrio de RNAm
IFNG foram verificadas em tempo real por reao quantitativa de polimerase
em cadeia, e a expresso da protena foi avaliada por imuno-
histoqumica.Resultados: Todas as amostras de leses periapicais exibiram
metilao parcial ou total do gene IFNG.Alm disso, um aumento do perfil de
metilao foi encontrado em cistos radiculares comparado com granulomas
periapicais. O aumento da expresso de mRNA IFNG foi observado nas
amostras de leses periapicais parcialmente metilados em relao s amostras
que foram completamente metilados.
Concluso:O presente estudo fornece a primeira evidncia do possvel
impacto de IFNG metilao em IFNG transcrio em leses periapicais.

Palavras-chave
Interferon-gama, metilao, granuloma periapical,leso periapical, cisto
radicular


As leses periapicais so um grupo de doenas inflamatrias do sistema
imunolgico que ocorrem como um resultado de necrose de celulose, que pode
ser causada por crie , traumatismo ou procedimentos iatrognicas(1).A
presena de microorganismos viveis no sistema do canal radicular
considerado o principal requisito para o desenvolvimento de leses periapicais
(2). Estas leses podem mostrar reabsoro concomitante dos tecidos duros e
a destruio do perirradicular do ligamento periodontal (3,4).
Vrios estudos sobre leses periapicais humanos indicaram citocinas
como mediadores da reabsoro ssea e desenvolvimento da leso (5,6).
Interferon (IFN) gama codificada pelo gene IFNG e segregada principalmente
por Th- 1 linfcitos , desempenha um central papel na conteno da infeco e
representa uma das citocinas mais eficientes para o desencadeamento da
atividade antimicrobiana em macrfagos (7). Alm disso,o IFN - gama tem sido
associada a aes contraditrias sobre a reabsoro ssea e
osteoclastognese(8).Tem sido relatado que o IFN - gama pode inibir (9,10) ou
acelerar a reabsoro ssea in vivo (11,12). Considerando o papel importante
desta citocina na inflamao,alteraes na expresso de mRNA IFNG atravs
de metilao de DNA pode influenciar o progresso e desenvolvimento de
doenas inflamatrias (13-15) . No entanto,h nenhuma informao sobre
alteraes epigenticas do gene IFNG em leses periapicais .
A metilao do DNA o evento epigentico mais comum, que
caracterizado por a adio nas regies do grupo metilo em citosina dentro
citosina - fosfato - guanina (CpG)(16).Ilhas CpG no metiladas so
relacionados por uma estrutura transcricionalmente ativa,considerando que o
DNA metilado recruta protenas de ligao de metilo, conduzindo a cromatina
compactao e impedindo a ligao de fatores de transcrio (17,18) . Estudos
relataram a importncia de metilao na patognese de alguns doenas
inflamatrias, tais como a gastrite crnica (19) , a inflamao das vias areas
(20),periodontite(21,22), e da asma brnquica (23).Alm disso, um estudo
anterior realizado no nosso laboratrio mostrou que a metilao de DNA pode
ser relevante para a transcrio em IFNG polpa dentria humana (13). Por
causa da importncia do IFN - gama, na patognese das leses periapicais , o
objetivo do presente estudo foi investigar a metilao do gene IFNG ,em
conjunto com a transcrio de genes , nos nveis de RNAm e protena em
periapical granulomas e cistos radiculares .
Materiais e Mtodos
Pacientes e amostras de tecido
Este estudo foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Universidade
Federal de Minas Gerais (CAAE -0462.0.203.000-11), e os pacientes
assinaram informado formulrios de consentimento.Dezesseis granulomas
periapicais e 13 amostras de quisto radicular foram includos no estudo. Os
sujeitos foram pacientes com evidncia radiogrfica de perda do osso alveolar
periapical e com a indicao para a remoo do dente. Os pacientes no
tinham tomado qualquer medicao por 2 meses antes da cirurgia, e eles eram
aparentemente livre de doenas sistmica. Todas as amostras foram obtidas a
partir de dentes sem sensibilidade pulpar e sem tratamento endodntico. As
amostras foram coletadas durante o atendimento cirrgico no Departamento de
Cirurgia Oral e Patologia. Cada amostra foi imediatamente seccionados em 3
partes iguais. A primeira parte da leso foi armazenado em Tissue-Tek (Sakura
Finetek Inc., Torrance,CA) em -80 graus CELSIUS para extrao de DNA. O
segundo fragmento foi armazenado em suporte RNA (BioAgency Biotecnologia,
So Paulo, Brasil), para a extrao de RNA, e a terceira parte foi colocada em
soluo de formaldedo, embebida em parafina, e submetidos anlises
histopatolgica e imuno-histoqumica.
Os diagnsticos foram baseados em critrios de avaliao clnica,
radiogrfica e histolgica.As leses periapicais includos no grupo granuloma
periapical no apresentou epitlio odontognico.As leses foram classificadas
como cistos radiculares quando exibiam uma cavidade cstica alinhado por
epitlio odontognico (24). O grupo granuloma periapical foi composto por sete
homens e nove pacientes do sexo feminino (idades entre 16-75 anos). O grupo
de cisto radicular foi composta por sete homens e seis pacientes do sexo
feminino (faixa etria, 16-75 anos).
O isolamento de ADN e Anlise de metilao do gene IFNG
O DNA genmico foi extrado de amostras de tecido congeladas atravs do kit
de tecido DNeasy da Qiagen ( Qiagen Inc. , Valencia , CA) de acordo com o
protocolo do fabricante . Para avaliar a metilao de CpG IFNG dinucleotdios,
o DNA genmico foi modificado pelo tratamento com bissulfito de sdio,tal
como descrito noutro local (22).As amostras tratadas foram submetidas a
reao em cadeia da polimerase - metilao especfica (PCR) usando
anteriormente os pares de iniciadores descritos que tm como alvo a regio do
promotor do CpG do gene de IFNg (25).Uma amostra foi considerada no -
metilada quando apenas os iniciadores no metilados foram alvo amplificado;
as amostras parcialmente metiladas,as duas reaes de PCR foram
amplificados; e as amostras totalmente metiladas,apenas as reaes de
iniciadores especficos metilados foram positivo (26).O DNA no metilado
tratado com bissulfito de clulas mononucleares do sangue perifrico foi
utilizado como um controlo positivo da reao do no metilado,e o DNA
induzido por metilao das mesmas clulas,tratada com enzima metilase
MSssI ( New England Biolabs , Beverly , MA )e bissulfito , foi utilizado como um
controlo positivo da reao metilado de forma semelhante aos estudos
anteriores (13,22,27) .
Extrao de RNA e PCR quantitativo
Por causa da pequena quantidade de tecido disponvel , a extrao de RNA
no foi possvel em todas as amostras . O RNA total foi extrado a partir de 13
granulomas periapicais e 9 cistos radiculares , utilizando o reagente Trizol(
Invitrogen , Carlsbad , CA) de acordo com o protocolo do fabricante.Integridade
de RNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 1 % .Trasncrio
reversa de 1 micrograma de RNA em cDNA foi realizada usando IIISuper
Roteiro da primeira cadeia ( Invitrogen ) de acordo com as instrues do
fabricante.O PCR em tempo real (PCR quantitativo) foi realizada utilizando Taq
-Ensaios da Expresso Gnica do Homem (Biosistemas Aplicadas, Foster City,
CA) em um passo a uma PCR em tempo real de 48 poos da placa
(Biosistemas Aplicadas , Warrington ,Reino Unido ) . Expresso gnica relativa
foi calculada usando a

,mtodo tal como descrito anteriormente (28).Os

dados foram apresentados como a quantidade relativa de alvo IFNG
normalizados para RPLPO endgena (grande protena ribossomal)
(Biosistemas Aplicadas ) e em relao a um calibrador da amostra . Como o
calibrador foi utilizado um conjunto de amostras de sangue de saudvel
indivduos para garantir que a reao ocorreu corretamente em diferentes
experimentos . Todas as reaes foram realizadas em duplicata.
Avaliao histopatolgica e imuno-histoqumica
Sees hematoxilina-eosina de 5 milmetros foram avaliados
histologicamente.Os cortes histolgicos foram submetidos a clulas
inflamatrias contando em 400 vezes de ampliao . O nmero de campos
considerados variou de 2-6, dependendo do tamanho de cada amostra .
Imunohistoqumica foi realizada em 16 granulomas periapicais e 13 cistos
radiculares usando IFN - gama anti - humana ( ab 9657 ; Abcam , Cambridge ,
Reino Unido) a uma diluio de acordo com os procedimentos padro de
1:200. A desparafinizao,hidratao , e recuperao de antgeno das lminas
realizadas como descritos em outro lugar (29). Diaminobenzidina (Sigma-
Aldrich, St Louis,MO ) foi utilizado como cromgeno , e as seces foram
contrastadas com Hematoxilina de Mayer e montadas em Permount (Fisher
Scientific , Fair Lawn , NJ). Todas as coloraes imunolgicas foram realizadas
manualmente, e leses orais com reatividade conhecida do anticorpo primrio
foram usadas como controles positivos.Os controles negativos foram realizados
com a omisso do anticorpo primrio, resultando em nenhuma colorao
detectvel . A expresso da protena foi avaliada com base na medida de
imunomarcao nuclear em leuccitos em campos de alta potncia (400 X ),
independente da intensidade da colorao. O nmero de campos considerados
variou 2-6 em cada amostra.A porcentagem dos IFN-gama de clulas
imunocoradas foi obtido.
Anlise Estatstica
O exato teste de Fisher foi utilizado para avaliar a associao entre variveis
para dados categricos. O teste de Shapiro-Wilk foi realizado para avaliar a
distribuio de todas as variveis quantitativas. O no parmetro do teste de
Mann-Whitney foi utilizado para comparar dois grupos de casos em uma
varivel. Foi utilizado o teste de correlao no paramtrico de Spearman para
avaliar a associao entre as variveis contnuas. As anlises estatsticas
foram realizadas usando software SPSS 17.0 (SPSS Inc, Chicago, IL) e
valores P <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Resultados
A distribuio das amostras de acordo com estado de metilao do IFNG,os
nveis de mRNA, o nmero de clulas inflamatrias, e a porcentagem de IFN-
gama de clulas imunocoradas so mostrados na Tabela 1. Todas as leses
periapicais exibiram metilao parcial ou total da regio do promotor de do
gene.Alm disso,um aumento do perfil de metilao foi encontrado em cistos
radiculares em comparao com granulomas periapicais ( P = 0,041 ).A
expresso IFNG mRNA em granulomas periapicais no era significativamente
diferente daquela em cistos radiculares . Aumento dos nveis de expresso
mRNA foram observados nas leses periapicais parcialmente metilados(
granuloma periapical + cisto radicular ) em comparao com o amostras
totalmente metilados ( granuloma periapical + cisto radicular )( P = 0,047 ) ( fig.
1 ) . No foi encontrada associao entre o estado de metilao e o nmero de
clulas inflamatrias em ambos os granulomas periapicais ou cistos
radiculares. Alm disso , o nmero de clulas IFN gama imunocoradas no
foi diferente entre amostras parcialmente e totalmente metiladas(dados no
mostrados).Nenhuma correlao foi encontrada entre o nmero de clulas
inflamatrias , o nmero de IFN - gama positiva,e os nveis de mRNA IFNG em
qualquer um dos grupos (dados no leso mostrada ) .
Discusso
O padro de metilao de CpG da regio promotora do IFNG gene foi avaliada
em nosso estudo. Todas as leses apresentadas metilao parcial ou total da
regio promotora do gene sugere que esta alterao epigentica uma
alterao comum em leses inflamatrias periapicais. Alm disso,verificou-se
um aumento do perfil de metilao em cistos radiculares em comparao com
granulomas periapicais.O porqu dos mecanismos imunopatolgicos
envolvidos no desenvolvimento do cisto e sua relao com granulomas
periapicais so controversos (30),o significado biolgico da metilao do gene
IFNG no desenvolvimento de cisto radicular apenas especulativa , e ns no
podemos fazer quaisquer concluses sobre a causa e a conseqncia desta
alterao para a formao destas leses . Outra importante variao entre
granulomas periapicais e cistos radiculares que podem potencialmente
influenciar o estado de metilao a infeco bacteriana. Bobetsis et al (31)
observaram que a infeco bacteriana (Campylobacter rectus) induz a
hipermetilao do promotor de IGF2 placentria em ratinhos . Alm disso , Yin
e Chung ( 32 ) observou-se que a exposio a diferentes bactrias orais resulta
em perfis de metilao diferencial.Por exemplo,quando as clulas epiteliais
gengivais foram expostos a Porphyromonas gingivalis , foram observados
aumentos na metilao nos nveis do gene CD276 , um regulador imunolgico ,
e do gene elastase 2 , uma serina-protease que tem um papel em doenas
inflamatrias ,entre outros . Por outro lado , verificou-se que os nveis de
metilao da elastase 2 e GATA 3 diminuram aps as clulas serem
estimuladas com Fusobacterium nucleatum . Portanto, uma possvel explicao
para os estados de metilaes diferentes entre leses periapicais podem ser a
prevalncia de bactrias diferentes em ambas as leses .
Uma importante descoberta de recente estudo foi a associao inversa que foi
encontrada entre os nveis de mRNA e o estado metilao IFNG das leses
periapicais . Em outras palavras , as leses que mostram metilaes totais
apresentados a diminuio da expresso da citocina . Esta descoberta foi
demonstrada anteriormente na doena inflamatria intestinal( 14 ) , inflamao
da polpa dentria ( 13 ) , e periodontite( 15 ) . A incapacidade de fatores de
transcrio que se ligam ao seu stio de ligao do DNA quando metilado tem
sido proposta como um possvel mecanismo de silenciamento do gene , e pode
fornecer uma explicao para possvel transcrio de baixa regulao desse
gene (31). Portanto, nosso estudo sugere que a regulao epigentica de IFNG
transcrio pode ser envolvido na modulao da secreo de IFN - gama em
leses periapicais .
A presente investigao mostra a evidncia de que a metilao do gene
IFNG um evento frequente em leses periapicais e que a metilao do gene
est associada com nveis de transcrio distintas RNAm do gene. Estes
resultados sugerem que mecanismos epigenticos podem ser importantes para
modulao IFNG em leses periapicais .
Figura 1.Associao entre a quantificao relativa de RNAm e o IFNG
estado de metilao do gene IFNG em granulomas periapicais e cistos
radiculares . ( , Granuloma periapical; *, Cisto radicular). Mann-Whitney U,
estatisticamente diferena significativa, P <0,05.
TABELA 1. Distribuio de amostras de acordo com estado de metilao do
IFNG, os nveis de RNAm, nmero de clulas inflamatrias, e o percentual de
IFN-gama clulas imunomarcadas