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$%(t +%c #e c%!$a)aci%ne( $le( a)ia?le( !-l I4 Pa)a el an>li(i( #e c%))elacin0 (e -tiliz Pea)(%n $)%#-ct%-!%!ent% #e calc-la) l%( c%eEciente( #e c%))elacin / l%( al%)e( #e $4 Resultados Las concentraciones de lactato y LDH refejan la actividad ictal y la muerte celular ictal En c-lti%( #e +i$%ca!$% %)&an%t*$ic%(0 actii#a#e( inte)ictal / ictal (i&-en -n $e)i%#% #e latencia #e U M le(i%ne( #i(eccin #a@te) AFi&4 1AB4 Se !i#i la c%ncent)acin #e lactat% / #e LD9 en l%( !e#i%( #e c%!-nicacin a $a)ti) #e c-lti%( %)&an%t*$ic%( C-e @-e)%n t)ata#%( c)nica!ente $%) 1:: @enit%*na aM0 3 !M #e >ci#% C-in-)'nic% AK.NAB0 % e+*c-l%4 L%( #at%( #e l%( M0 1:0 160 1M0 210 260 2<0 / 32 DIF (e c%!?ina)%n en c-at)% $-nt%( #e tie!$% $%) !e#ia a)it!'tica0 DIF OVM01:WX0 OV1601MWX0 OV210 26WX0 / OV2<032WX AFi&4 1 B0 ,B4 ,%ncent)aci%ne( #e lactat% / LD9 c%n I en l%( c-lti%( #e c%nt)%l Ae+*c-l%B @-e)%n (i&niEcatia!ente !a/%)e( C-e en l%( c-lti%( t)ata#%( $%) c-alC-ie)a #e @enit%*na % K.NA An Y 12 c-lt-)a( #e t)e( ani!ale(0 ca#a c%n#icinB4 En l%( c-lti%( #e c%nt)%l #e e$ile$(ia0 c-an#% la actii#a# ictal e(ta?a $)e(ente0 la $)%#-ccin #e lactat% @-e #e 10<< Z :03< !M P # AFi&4 LF0 !e#ia Z SD0 n Y < $e)i%#%( ent)e ca!?i%( #e !e#i%0 (iete c-lt-)a(B0 !ient)a( C-e en la a-(encia #e eent%( ictale(0 lactat% @-e $)%#-ci#% a 1012 Z :022 !! P # A$ O:0::10 $)-e?a #e la tJ !e#ia Z SD0 n Y 1N $e)*%#%( ent)e ca!?i%( #e !e#i% en (iete c-lti%( #e c%)te(B4 La $)%#-ccin / la #-)acin #e la actii#a# el'ct)ica #e lactat% @-e)%n @-e)te!ente c%))elaci%na#%( AFi&4 1D0 n Y M c-lt-)a(0 Pea)(%n ) Y :0N220 $ O:0:1B0 al i&-al C-e la( c%ncent)aci%ne( #e LD9 / )ec-ent% #e PI AFi&4 1E0 n Y N c-lt-)a(0 #at%( #e (iete ca!?i%( #e !e#i%0 ) Y :0N3=0 $ O:0::1B4 D-)ante la li?e)acin #e LD9 I cin $e)*%#%( #e tie!$% en C-e %c-))ie)%n l%( ac%nteci!ient%( ictale( @-e (i&niEcatia!ente !a/%) C-e la li?e)acin #e LD9 en l%( $e)*%#%( c%n nin&Dn eent% ictal AFi&4 1G0 $ O:0::10 n Y N c-lti%(B4 Figura 1. Measurementsas ValidationofactateandLDH biomarkersforepilepticactivityand la muerte celular. JFL, curso temporal Representante ofepileptoenesisinan cultura !ipocampo oranot"picos. Los colores corresponden a la frecuencia de ocurrencia de eventos paro#"sticos en $% s contenedores, con e&emplos 'ue se muestran a la derec!a. , La actividad multiunit Deep blue (tra)o superior*+ la lu), la actividad interictal a)ul o amarillo (tra)o medio*+ , convulsiones electroencefalor,-cas ro&os (eventos ictales, tra)a de fondo*. ., /, transcurso de tiempo de lactato (.* y LDH (/* la concentraci0n y la producci0n acumulada en los controles epil1pticos (* y cultivos tratados con fenito"na (2*, y 3452 (D*+ n 6 $7 cada condici0n. Las barras de error indican la 89M. La sini-caci0n estad"stica se muestra para los controles epil1pticos frente a cultivos tratados con 3452, con : p ;%,%<, :: p ;%,%$, y ::: p ;%,%%$. Las diferencias estad"sticamente sini-cativas entre los controles epil1pticos y culturas fenito"na tratados fueron los mismos 'ue en comparaci0n con el control 3452, a e#cepci0n de lactato a D=V ;>7?,@7AB y LDH en D=V ;>7$,7CAB y ;>7?,@7AB , donde Derefound no !ay diferencias estad"sticamente sini-cativas. D, Relaci0n ofactate actividad concentrationand, durante el tiempo de periodsD!en Enica actividad -siol0ica o interictal estaba presente (F* o cuando la actividad ictal estaba presente (G*. Las concentraciones de lactato se representaron frente a la duraci0n de la actividad el1ctrica, con cada punto de datos tot!etime entre mediumc!anes correspondiente. Line 9#ponential-t iss!oDn.9, Relaci0n entre la concentraci0n de LDH en la cultura supernatantand la c1lulas (HlIpositivos* numberofdead. /oncentraciones de LDH y las c1lulas muertas teJidas con Hl numbersof se midieron en los mismos cultivos, con cada punto de tiempo de nuevo tot!etime entre cambios de medio (LDH acumula en el mediumsince cultura Eltima mediumc!ane vsnumberofH= cellsatt!etime ofmediumc!ane* correspondiente. Linear-t l"nea iss!oDn.f, la producci0n de lactato (media K D9, ::: p ;%, %%$* durante periodsDit! momento y sin respiraderos ictales, a partir de datos 'ue se muestran en la D. L, liberaci0n de LDH (media K D9, ::: p ;%, %%$* a partir de cultivos durante per"odos de tiempo con y sin eventos ictales, a partir de datos en 9. Manipulacin de la sealizacin de mTOR: eectos so!re la actividad ictal y la muerte celular ictal 9e!%( $)%?a#% l%( e@ect%( #e la in+i?icin #e C-ina(a( A"a?la 1B (%?)e el #e(a))%ll% #e la e$ile$(ia AFi&4 2A-F0 n Y 3 ca#a c%n#icinB4 En I $)%+i?icin #e 7NK n% t-% e@ect% (i&niEcati%0 !ient)a( C-e la in+i?icin #e MEK n% t-% nin&Dn e@ect% (i&niEcati% (%?)e la $)%#-ccin #e lactat% ante( #e 2: DIF4 Sin e!?a)&%0 la in+i?icin #e PI3K0 Akt0 !"OR0 / la in+i?icin #-al #e PI3K-!"OR #i(!in-/ (i&niEcatia!ente la $)%#-ccin #e lactat% a $a)ti) @)%!NDIF A$ O:0:=B0 la li?e)acin a $a)ti) an#LD9 ;-1: DIF A$ O:0:=B4 9e!%( )e$eti#% l%( e3$e)i!ent%( c%n L. 2;6::2 / )a$a!icina An Y 3B / #e n-e% enc%nt) -na in+i?icin (i&niEcatia #e la $)%#-ccin #e lac I "ate A#e N DIF0 $ O:0:=B / la li?e)acin #e LD9 A#e 1: DIF0 $ O:0:=B )e($ect% a l%( c%nt)%le(4 "a!?i'n $)%?a!%( la #%(i(- )e($-e(ta #e la API-2 / NFP-BEG23= An Y 3 $%) c%n#icinB0 / enc%nt)a!%( la in+i?icin #e$en#iente #e la #%(i( tant% #e lactat% / LD9 AFi&4 3B4 Se calc-l lactat% / c%ncent)aci%ne( #e LD9 en c-lti%( t)ata#%( c%n el @>)!ac% c%!% $%)centa5e #e l%( c%nt)%le( e!$a)e5a#%( en el #*a #e la c%ncent)acin #e lactat% $ic% A!>3i!a actii#a# ictalJ4 Fi&4 2GB4 N% (e enc%nt)a)%n #i@e)encia( (i&niE catia( I ent)e l%( c%nt)%le( / )a$a!icina An Y N0 $ O:0::1B0 :0= [ M API-2 An Y 30 lactat% #e $ O:0:10 LD9 $ O:0::1B0 L. 2;6::2 AN Y N0 $ O:0::1B0 / 6: nM #e NFP-BEG23= An Y 30 $ O:0::1B4 Se )e&i(t) la actii#a# elect)%ence@al%&)>Eca en )a$a!icina0 L. 2;6::20 / l%( c-lti%( #e c%nt)%l ent)e 1: / 1= DIF AFi&4 6A-EB4 Actii#a# ictal e(ta?a $)e(ente enX <=R #e l%( c-lti%( t)ata#%( / #e c%nt)%l4 Sin e!?a)&%0 +-?% )e#-cci%ne( (i&niEcatia( #e N2 / 6=R en el nD!e)% #e eent%( ictale( $%) +%)a en la )a$a!icina An Y 1NB / la( c-lt-)a( L. 2;6::2 t)ata#%( An Y 16B0 )e($ectia!ente0 en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( An Y 130 $ O:0::1B 4 D-)aci%ne( ictale( n% ca!?ia)%n A$ Y :021B ent)e l%( c%nt)%le( A3N0M Z 303 (B0 )a$a!icina A320; Z 30< (B0 c-lt-)a( an#L. 2;6::2 t)ata#a( A2< Z 206 (e&0 $)%!e#i% Z SEMB4 El tie!$% t%tal #e la( c-lt-)a( $a(an en ict-( $%) +%)a a-!ent (i&niEcatia!ente en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( #e la )a$a!icina / L. c-lt-)a( A$ O:0::1B 2;6::2- t)ata#a4 ,a$a( ne-)%nale( $i)a!i#ale( e(ta?an ?ien %)&aniza#%( en l%( c-lti%( #e c%nt)%l ile$tic e$ I a 2< DIF AFi&4 6FBJ Sin e!?a)&%0 el nD!e)% #e ne-)%na( (-$e)iiente( ,A3c a 2< DIF e)aX =:R !a/%) en l%( c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina % L. 2;6::2 @)ente a l%( c%nt)%le( AFi&-)a 6 G0 $ O:0:10 n Y 3B4 El nD!e)% #e ne-)%na( (-$e)iiente( ,A1 en )a$a!icina / c-lt-)a( L. 2;6::2 t)ata#a( @-eX 1::R !>( alt% C-e en l%( c%nt)%le( A$ O:4:10 n Y 3B4 En -n e3$e)i!ent% (e$a)a#%0 (e enc%nt) -n nD!e)% (i!ila) #e ne-)%na( (-$e)iiente( en l%( c-lti%( #e c%nt)%l0 $e)% M:-23:R !>( ne-)%na( C-e (%?)eien en la( c-lt-)a( NFP-BEG23= t)ata#%( en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( en ,A3c A$ O:4:10 n Y 3B / en ,A3? A$ O:0:=0 n Y 3B4 "ecto de la rapamicina lavar#in y de lavado en la actividad epilptica Target name Target abbreviation Drug name Concentrat ion c-Jun N-terminal kinase JNK SP600125 10 /XM !P kinase kinase "K #0126 20 $M ammalian target o% ra&am'cin mT() )a&am'cin 20 nM Protein kinase * !kt !P+-2 0,5 XM P-os&-oinositi.e /-kinase P+/K 01 223002 10 XM Dual in-ibitor P+/K-mT() N4P- *"52/5 30 nM "a?le 14 In+i?it%) na!e(0 c%ncent)ati%n(0 an# ta)&et( Ra$a!/cin t)ata!ient% #el 3 al 2< DIF ten*a el !i(!% e@ect% C-e (e +a #e(c)it% ante)i%)!ente An Y N c-lt-)a( #e #%( e3$e)i!ent%( I !ent%( a#ici%nale(J4 Fi&4 =AB4 Late a$licacin #e la )a$a!icina #el 1: al 2< DIF )e(-lt en c%ncent)aci%ne( #e lactat% (i&niEcatia!ente !>( ?a5%( en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( #el 1M al 2< DIF0 / en la( c%ncent)aci%ne( #e LD9 (i&niEcatia!ente !>( ?a5%( #el 1M al 26 DIF An Y NJ4 Fi&4 =BB4 Nacin te)!i I te!$)ana #el t)ata!ient% )a$a!icina A)a$a!icina a$lica 3-1M DIFJ4 Fi&4 =,B n% a-!ent la el%ci#a# #e -na $%(te)i%) cin I ac-!-lacin #e lactat% A141; Z :4316 !M P # el 1M DIF0 141N Z :466< !M P # el 2< DIF 0 !e#ia Z DE0 n Y N0 $ Y :0;B % ac-!-lacin #e LD9 A:42; Z :42 a- P # el 1M DIF0 :42; Z :41N a- P # el 2< DIF0 !e#ia Z DE0 n Y N0 $ Y :0;MB4 N% lle&a!%( a e) -n ca!?i% (i&niEcati% en el $%#e) #e la actii#a# &)>Eca elect)% I t)a( 1 + #e la )a$a!icina laa) Sali#a #e($-'( #el t)ata!ient% )a$a!icina c)nica A16-26 DIFB en c%!$a)acin c%n elec I actii#a# t)%&)a$+ic en )a$a!icina AFi&4 =D0 E0 n Y 30 $ Y :01220 $)-e?a #e t $a)ea#aB4 A(i!i(!%0 n% e!%( ca!?i%( (i&niEcati%( en el tie!$% inca-tacin A#-)acin #e la actii#a# ictal $%) +%)a #e &)a?acinB en c-l I t-)a( t)ata#%( c%n )a$a!icina #e 3 a 1M DIF / )e&i(t)a#% el 1M #e DIF en c%!$a)acin c%n l%( c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina #e 3 a 1M DIF / &)a?a#% #e($-'( 11 # #e La(+-%-t Ae( #eci)0 la( c%n#ici%ne( #e c%nt)%lB en 2< DIF AFi&4 =FJ !i(!% #i(e% e3$e)i!ental c%!% E&-)a =,J4 n Y 1< 1M DIF c-lt-)a( t)ata#%( c%n )a$a!icina / N Y 1; 2< DIF c-lt-)a( en el C-e (e inte))-!$i el t)ata!ient% )a$a!icina el 1M DIF A11 # #e laa#%B0 $ Y :066M0 Mann-K+itne/ )an&% (-!a #e $)-e?aB4 Rapamycin tratamiento crnico disminuye sur$imiento a%n 9e!%( c-antiEca#% el nD!e)% #e a3%ne( &e)!ina#a( a < DIF AFi&4 NB4 Se c%nE)! C-e la( ne-)ita( C-e c)-zan c%nt%)n%( ;:: [ ! #e #i(tancia #e(#e el ?%)#e #e la c-lt-)a %)&an%t*$ic% (e a3%ne( !e#iante la tincin #e SMI-312 A!a)ca#%) a3nJ4 UlE& et al0 1;;<J4 ,+-n& et al0 2::3B / MAP-2 A!a)ca#%) #en#)*tica(B 4 A!?%( #e e(t%( !a)ca#%)e( a la( !anc+a( %nl/ne- )%nal0 / n% &liale(0 $)%ce(%(4 Se !-e(t)an i!>&ene( )e$)e(entatia( $a)a -n >)ea ce)ca #el ?%)#e #e la )e?ana#a AFi&4 NDB0 / -n >)ea ;:: [ ! #e #i(tancia #e(#e el ?%)#e #e la )e?ana#a AFi&4 NEB4 Un &)an nD!e)% #e $)%ce(%( a3%nale( SMI-312-$%(iti%(0 $e)% (l% -n%( $%c%( MAP-2 I $)%ce(%( #en#)*tica( $%(itia(0 #e5an e(t)at% %)ien( / (e e3tien#en +acia @-e)a I la#% #e la )e?ana#a AFi&4 NDB0 l% C-e c%nE)!a C-e la !a/%)*a #e l%( $)%ce(%( #e &e)!ina#%( @-e)a #e la )e?ana#a (%n a3%ne(4 M>( le5%( #e la )e?ana#a0 t%#%( l%( $)%ce(%( (%n $%(itia( $a)a SMI-3120 / nin&-na e( $%(itia $a)a el MAP-2 AFi&4 NEB0 l% C-e c%nE)!a C-e l%( a3%ne( C-e ?)%tan (l% c)-zan la ;:: [ ! c%nt%)n%4 A3%n ?)%tacin @-e (i&niE I (i&niEcatia!ente )e#-ci#a en l%( c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( AFi&4 NF0 !e#ia Z SEM0 n Y < c-lt-)a(0 $ O:0:=B4 Ra$a!/cin t)ata!ient% n% )e#-5% (i&niEcatia!ente a3n ?)%te I cin #e ,A1 / (-?ic-l-! A$ Y :03<1B0 $e)% )e#-5% (i&niEcatia!ente la ?)%tacin #e ,A3 / DG >)ea( A$ O:0:1 en ,A30 $ O:0:= en la Di)eccin Gene)alJ4 Fi&4 NGB4 La @alta #e e@ect% en a)ea,A1 $-e#e )e\e5a) la !-c+% !a/%) #en(i#a# ne-)%nal en e(ta >)ea en l%( c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina AFi&4 6F0 GB4 "e)!inacin #e la )a$a!icina c%nite I cin #-)ante 11 #*a( n% $)%#-5% n-ea( a3n (i&niEcatia ?)%tacin An Y < c-lt-)a(0 la c%!$a)acin #e la( c-lt-)a( t)ata#%( c%n )a$a!icina a l%( 1M DIF0 / l%( !i(!%( c-lti%( a 2< DIF #e($-'( #e 11 # #e la )a$a!icina laa) I a ca?%0 $ Y :0N<N0 te(t t e!$a)e5a#%J4 Fi&4 N9B4 L& '()**' y rapamicina reducen la osorilacin de la prote+na ri!osmica ,- La @%(@%)ilacin #e SN ASe) 23=P23NB (e inc)e!ent (i&niEcatia!ente en el #*a 1 #e($-'( #e la #i(eccin @)ente in!e#iata!ente #e($-'( #e la #i(eccin AFi&4 MA0 n Y 60 $ O:0:1B4 La )elacin %@$SN a SN a c%ntin-acin0 #i(!in-/ en M DIF0 / (i&niEcatia!ente a-!ent #e n-e% $%) 21 DIF A10:: Z :03: ( .i$ura '4 Hantalla de in!ibidores. 2, 8H M%%$7<, in!ibidor de J53. ., N%$7M, in!ibidor de M93. /, rapamicina, in!ibidor de mOFR. D, 2H=I7, in!ibidores de 2kt. 9, L4 7PC%%7, in!ibidor de H=@3. F, 5VHI.9Q7@<, in!ibidor dual H=@3RmOFR. n 6 @ por punto de datos, para los cultivos con ve!"culo (G* y el tratamiento in!ibidor (F* lactato, y para los cultivos con ve!"culo (F* y el tratamiento in!ibidor (* de LDH. 2cumulativa productionare LDH averaesofactateand tra)a en l"nea ris eac!-ureassolid (culturas tratadas con ve!"culo* ordas!edrayline. L, producci0n (in!ibidorItreatedcultures* 8ummaryoft!edata att!edayofpeak lactato. 5 6 @ para los controles y las rebanadas tratadas para todos los rupos, e#cepto la rapamicina (n 6 M* y L4 7PC%%7 (n 6 M*. Las barras de error indican 8D. 10<< Z :0630 M / 21 DIF0 )e($ectia!ente0 !e#ia Z S"D0 n Y 60 $ O:0:=B4 La @%(@%)ilacin #e SN en la Se) 23=P23N (e )e#-5% (i&niEcatia!ente en la( c'l-la( $i)a!i#ale( en la )a$a!icina / L. c-lti%( a M DIF 2;6::2-t)ata#%( en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( AFi&4 M B0 n Y 3B4 La )elacin #e @%(@%-SN ASe) 23=P23NB e)(-( t%tal #e SN (e )e#-5% en )a$a!icina / c-lt-)a( 2;6::2 t)ata#a(- L. A;6 / <1R0 )e($ec I tia!ente0 $ O:0::10 n Y ;0 E&4 M,B4 La )elacin #e @%(@%- SN ASe) 26:P266B e)(-( t%tal #e SN ta!?i'n (e )e#-5% (i&niEcatia!ente en )a$a-!icina / c-lt-)a( L. 2;6::2 t)ata#a( A;; / ;1R0 )e($ectia!ente0 $ O:0::10 n Y NJ4 Fi&4 MDB D/,01,/23 4rincipales conclusiones 9e!%( enc%nt)a#% C-e el lactat% / LD9 en(a/%( #e !e#i%( #e c-lti% (a! I #ecla)a)%n a l%( ca!?i%( #e !e#i%( #%( ece( $%) (e!ana $)%$%)ci%na)%n e(ti!aci%ne( Dtile( #e actii#a# ictal / la !-e)te cel-la) ictal en %)&an%t*$ic% +i$%ca!$% I c-lt-)a( $al0 /a C-e (e c%ni)ti en el $)i!e) e$il'$tic% 1: DIF4 La in+i?icin #e PI3K / !"OR )e#-ce la @%(@%)ilacin #e SN0 / la in+i?icin #e PI3K0 Akt0 !"OR0 / c%!?ina#% !"ORPPI3K )e#-ce la !-e)te cel-la)0 &e)!inacin a3n0 / la &)ae#a# #e la e$ile$(ia4 Lae I a ca?% e3$e)i!ent%( in#ican C-e la in+i?icin #e !"OR n% ten*a #i I )ect e@ect% antic%n-l(i%0 / C-e l%( e@ect%( anti-e$ile$t%&'nica( / ne-)%$)%tect%)e( #e la in+i?icin #e !"OR $e)(i(tie)%n #-)ante 11 #*a( #e($-'( #e laa#%4 "nsayos de lactato y LDH En el !%#el% #e la c-lt-)a #el +i$%ca!$% %)&an%t*$ic%( #e $e#iat)*a e$ile$(ia $%(t)a-!>tica0 actii#a#e( inte)ictal e ictal a$a)ecen #-)ante la (e&-n#a (e!ana #e($-'( #e la le(in inicial AD/+)@5el#-7%+n(en et al40 2:1:B4 Actii#a# ictal (e ac%!$aa $%) -n a-!ent% (i&niEcati% en la !-e)te cel-la) #e$en#iente #e la actii#a#0 / tant% la actii#a# ictal / la !-e)te cel-la) (e eita $%) K.NA / @enit%*na AP%zz% Mille) et al0 1;;64J Las concentraciones de la Figura 3. Lactato y LDH muestran la dosisIrespuesta a concentraciones variables de in!ibidores. Nna, la dosisIrespuesta para el tratamiento cr0nico de la 2H=I7, n 6 @ por punto R condiciones. ., de dosisI respuesta al tratamiento cr0nico 5VHI.9Q7@<, n 6 @ por punto R condici0n. Las concentraciones se muestran en la -ura. Las barras de error indican 8D. 6 (e!ana( in it)% AE&4 1AB4 El c-)(% te!$%)al #e e$ile$-t%&ene(i( en la( c-lt-)a( #e #i@e)ente( ani!ale( a)i li&e)a!ente0 (i! I ila) a la( a)iaci%ne( enc%nt)a#a( $)eia!ente en e$ile$t%&'ne(i( en ani!ale( in#ii#-ale( / (ie!$)e C-e el !i(!% in(-lt% AKillia!( et al0 2::;J44 Ka#a! et al0 2:1:B4 P%) e(ta )azn0 t%#%( l%( e3$e)i!ent%( @-e)%n c%nt)%la#%( !e#iante la c%!$a)acin-/ e+*c-l%( )e?ana#a( t)ata#a( in+i?i#%)-#el !i(!% ani!al4 Enc%nt)a!%( -na !a/%) $)%#-ccin #e lactat% #e?i#% a la actii#a# ictal0 / a-!ent% #e la li?e)acin #e LD90 #e?i#% a la !-e)te cel-la) #e$en#iente #e la actii#a#4 La ac-!-lacin #e lactat% ictal (e $)%#-ce en l%( (e)e( +-!an%( AD-)ante et al0 1;;6J4 ,a(till% et al0 2::1J44 Me)ci!ek-Ma+!-t%&l- et al0 2:12B / en !%#el%( ani!ale( #e e$ile$(ia A,+a$!an et al0 1;MMJ44 F-5ikaLa / c%l0 1;<< J4 Ka(te)lain et al0 2:1:B4 La li?e)acin #e LD9 e( -n !a)ca#%) a!$lia!ente -tiliza#% #e la !-e)te cel-la) ADecke) / L%+!ann-Matt+e(0 1;<<J4 B%n@%c% et al0 1;;=B4 La( !e#ici%ne( #e lactat% / c%ncent)aci%ne( #e LD9 I en c-lti%( #e +i$%ca!$% %)&an%t*$ic%( (%n !>( )>$i#%( / !en%( !an% #e %?)a C-e la( &)a?aci%ne( elect)%ence@al%&)>Eca( / )ec-ent%( #e c'l-la( !-e)ta(0 l% C-e $e)!ite -n )>$i#% an>li(i( #e #)%&a( c)nic% e@ I #e@ect%( incl-/en#% #%(i(- )e($-e(ta AFi&4 3B4 L%( niele( #e lactat% / #e LD9 (e )e#-5e)%n (i&niEcatia!ente $%) @enit%*na / >ci#% K.NA0 in+i?i#%)e( c%n%ci#%( #e la actii#a# ictal / la !-e)te cel-la) en %)&an%t*$ic%( c-lt-)a( ABe)#ic+e(k/ et al40 2:12B4 En(a/%( #e lactat% / #e LD9 ta!?i'n @-e)%n c%n&)-ente( c%n I !ent%( elect)%ence@al%&)>Eca( / Ni((l !e#i#a #e la )a$a!icina / L. 2;6::2 e@ect%( (%?)e la actii#a# e$ile$ti@%)!e / la (-$e)iencia ne-)%nal4 E(t%( +allaz&%( a$%/an -til I #a# #el lactat% / la( !e#ici%ne( #e LD9 c%!% ?i%!a)ca#%)e( #e la $)%&)e(in #e la e$ile$(ia en e(te !%#el%4 La $)%#-ccin t%tal #e lactat% $%) -n +i$%ca!$% t-)a I calle5n (in %)&an%t*$ic%( #e$en#e #el nD!e)% #e ne-)%na( (-$e)iiente( en el c-lti%4 Se +a #e!%(t)a#% $)eia!ente C-e la( c%n-l(i%ne( e($%nt>nea( en c-lti%( n%t/$ic I %)&a #an c%!% )e(-lta#% la !-e)te ne-)%nal en c-)(% AP%zz% Mille) et al0 1;;6J44 Be)#ic+e(k/ et al0 2:12B0 #e5an#% !en%( ne-)%na( $a)a +ace) lactat%4 E(t% $-e#e )e(-lta) en la #i(!in-cin #e la $)%#-ccin #e lactat%0 tale( c%!% la %?(e)a#a en c-lti%( t)ata#%( c%n e+*c-l% en la( Fi&-)a( 1= / 2A-F ent)e 3 / 6 (e!ana( in it)%4 Pa)a inte)$)eta) (i e(ta #i(!in-cin c%))e($%n#e a -na #i(!in-cin en la actii#a# e$il'$tica % -n $lie&-e #e I en el nD!e)% #e ne-)%na(0 l%( en(a/%( #e LD9 #e la !-e)te cel-la) (%n nece(a)i%(4 El c-)(% te!$%)al #e la $)%#-ccin #e LD9 en c-lti%( e$il'$tic%( t)ata#%( c%n e+*c-l% en la( Fi&-)a( 1, / 2A-F !-e(t)a (i&niEcatia en l%( $lie&-e( #e I en la !-e)te cel-la) #e($-'( #el Enal #el $e)*%#% #e latencia4 La !-e)te cel-la) #e?i#% a c%n-l(i%ne( e(t> en c-)(% / ac-!-latia AFi&4 1,B0 / $%) 2< DIF )e(-lta en -na )e#-ccin #)a!>tica en el nD!e)% #e (%?)eii) )%n( I ne- AFi&4 6F0 GJ4 Be)#ic+e(k/ et al0 2:12B4 En e(ta( c-lt-)a(0 Figura 4. Los reistros el1ctricos y recuentos neuronales con-rme 'ue L4 7PC%%7 (L4* y rapamicina (R2H2* tratamientos reducen el nEmero de eventos ictales y promover la supervivencia neuronal. 2, t"pica inanepilepticcontrolculture evento ictal. ., Representante de control recordinsfrom el1ctrica, la rapamicina y culturas L4 7PC%%7 tratadas. Rapamycinand L4 7PC%%7 tratamientos reducesei)urefre'uency (f*, pero no la duraci0n de las crisis (D*, con el efecto eneral de reducir el tiempo empleado en el estado ictal (S*. :: p ;%,%$, ::: p ;%,%%$. F, =m,enes representativas de las culturas del !ipocampo oranot"picos 5isslImanc!ado en 7? D=V. Las barras de escala, <% T m. L, recuentos neuronales revel0 'ue m,s neuronas sobreviven en /2@c y /2$ de la rapamicina y L4 7PC%%7 culturas tratadosIen comparaci0n con los controles epil1pticos, n 6 @ por condici0n, :: p ;%,%$, ::: p ;%,%%$. Figura 5. 9fectos de diferentes cursos de tiempo de la rapamicina (R2H2* de tratamiento sobre la proresi0n de la epilepsia. 2, rapamicina isapplied @ al 7? D=V, $%I7? D=V (.*, @I$U D=V (/*. Las concentraciones de lactato de control se representan como G, mientras 'ue las concentraciones de lactato en el rupo e#perimental rapamicina se representan como concentraciones F. LDH se representan como para el rupo de control, y % para el rupo de la rapamicina. 5 6 M por condici0n, por punto de datos, : p ;%,%<, :: p ;%,%$, ::: p ;%,%%$. D, reistro el1ctrico Representante de una cultura 'ue fue tratado cr0nicamente con rapamicina, sin ninEn cambio en la actividad a la rapamicina de lavado. 9, resultados de lavado rapamicina en tres culturas, F representa el poder de la actividad el1ctrica en la rapamicina, y G poder de la actividad despu1s de lavarI out. F, /omparaci0n de la actividad convulsiva en cultivos tratados con rapamicina en $U D=V (c"rculo vac"o*, y culturas en los 'ue se suspendi0 el tratamiento rapamicina a partir de las $U D=V durante $$ d"as (c"rculo relleno*. Figura 6. =n!ibici0n de mOFR reduce la brotaci0n a#0n. 2, =)'uierda, microraf"as cosidos muestran la cultura del !ipocampo oranot"picos y alrededores con a#ones erminadas. 9l recuadro muestra la brotaci0n a#ones con marcadores de cuanti-caci0n a diferentes distancias de la cultura. ., /, Rep V sentante im,enes de una cultura de control (.* y la cultura rapamicinaI tratado (/ se muestran a ? D=V, con markscorrespondin a a#onscrossin la /2@ aDayfrom contourP%% T m (a)ul*, DL (verde* o /2$ y . subiculum (amarillo* frontera D, Representante 8M=I@$7 (verde* y M2HI7 (ro&o* tinci0n de los procesos en el borde (l"nea blanca* de una cultura de ? D=V oranot"pico+ imaen de la derec!a se fusion0 8M=I@$7 y M2HI7 (estrato oriens, 8F* tinci0n. e, Representante 8M=I@$7 (verde, leftimae* y M2HI7 (ro&os, middleimae* y fusionadas 8M=I@$7RM2HI7 (imaen derec!a* tinci0n de los procesos de P%% m T aDayfrom la borde de una cultura ? D=V oranot"pico. F, /omparaci0n entre el nEmero de a#ones 'ue cru)an P%% m T contorno de rapamicina o culturas tratadas con ve!"culo (n 6 ?, p ;%,%<*, L, el nEmero de a#ones procedentes de diferentes ,reas del !ipocampo cultura, p ;%,%<. H, /omparaci0n entre el nEmero de a#ones 'ue cru)an P%% m T contorno en cultivos tratados con rapamicina a los $U D=V (c"rculos vac"os* frente a los a#ones en las mismas culturas $$ d despu1s de desco V continuaci0n del tratamiento de la rapamicina (c"rculos rellenos*. la $)%#-ccin #e lactat% (e )e#-ce #e?i#% a la !en%) canti#a# #e ne-)%na(0 $e)% la actii#a# ictal n% +a ce(a#%4 En c%nt)a(te0 l%( c-lti%( t)ata#%( c%n K.NA0 @enit%*na0 % in+i?i#%)e( #e la )-ta #e PI3K-Akt-!"OR +an )e#-ci#% % nin&-na actii#a# ictal0 / c%))e($%n#iente!ente0 n% la !-e)te cel-la) #e$en#iente #e c%n-l(in Ac%!% (e !-e(t)a $%) en(a/%( #e LD9B4 9ance# (-$e)iencia ne-)%nal In I en e(ta( c-lt-)a( AFi&(4 6F0 GB (e t)a#-ce en !a/%)e( ta(a( #e $)%#-ccin #e lactat% E(i%l&ica0 $%)C-e +a/ !>( ne-)%na( $a)a +ace) lactat%4 En l%( $-nt%( #e tie!$% $%(te)i%)e( Ac-a)ta (e!ana in it)%B0 la $)%#-ccin #e lactat% a $a)ti) #e -na )e?ana#a c)nica!ente e$il'$tic% c%n -n !en%) nD!e)% #e ne-)%na( (-$e)iiente( $-e#e (e) la !i(!a C-e la ta(a #e $)%#-ccin #e lactat% l&ica E(i% I en -na )e?ana#a t)ata#a4 P%) l% tant%0 la( #i@e)encia( en la $)%#-ccin #e lactat% #i(!in-/en c%n el tie!$%0 / el an>li(i( #e la !-e)te cel-la) a t)a'( #e en(a/% #e LD9 e( nece(a)i% $a)a la inte)$)etacin #e en(a/% #e lactat% c%!% -n !a)ca#%) #e actii#a# ictal4 mTOR y la epilepsia L%( niele( #e lactat% / LD9 (e )e#-5e)%n #)a!>tica!ente -na ez C-e l%( eent%( ictale( c%!enza)%n a %c-))i) A;-1M DIFB en c-lti%( t)ata#%( c%n it%)( I IN9IB #e PI3K0 Akt / !"OR4 La( )e#-cci%ne( en el lactat% / LD9 #e?i#% a la )a$a!icina A!"ORB0 API-2 AAktB0 / L. 2;6::2 API3KB t)ata!ient%( @-e)%n (i!ila)e( / c%nE)!a#% $%) !e#ici%ne( #i)ecta( #e la actii#a# elect)%ence@al%&)>Eca / la (-$e)iencia cel-la)0 l% C-e (-&ie)e C-e la (ealizacin #e PI3K-Akt @-e )e($%n(a?le $a)a la !a/%) $a)te #e la actiacin #e !"OR c%!% (e !i#e $%) l%( e@ect%( E(i%l&ic%( (%?)e la e$ile$(ia / la !-e)te cel-la)4 El niel #e @%(@%)ilacin #e la $)%te*na )i?%(%!al SN Aa a?a5% I e@ect%) c%))iente #e la *a !"OR @%(@%)ila#a t)a'( SNKB e( -n !a)ca#%) a!$lia!ente -tiliza#% #e la actiacin #e !"OR AG-e)tin / Sa?a I tini0 2::MJ4 B-ck!a(te) et al0 2::;J4 Gen& et al0 2::; B4 F(@%)% I ilacin #e SN +a (i#% in@%)!a#% a a-!enta) #e($-'( #e la le(in ce)e?)al e$ile$t%&'nic% AB-ck!a(te) et al0 2::;J4 Gen& et al0 2::;J4 9-an& et al0 2:1:J4 G+an& / K%n&0 2:12B / c%n-l(i%ne( +i$3ica( A"al%( et al4 0 2:12B4 ,-)i%(a!ente0 la @%(@%)ilacin #e SN e)a ?i@>(ica en n-e(t)%( e3$e)i!ent%(H -n a-!ent% t)an(it%)i% in!e#iata!ente #e($-'( #e la le(in inicial A#i(eccinB (e&-i#% $%) -n (e&-n#% a-!ent% #-)ante el RIOD I PE #e actii#a# ictal / la !-e)te cel-la) ictal4 E(t%( #at%( (-&ie)en C-e la le(in0 /a (ea ca-(a#a $%) -n t)a-!a @*(ic% % $%) la actii#a# ictal0 $-e#e a-!enta) la actiacin #e !"OR4 P%) %t)% la#%0 SN (e !ant-% I !%# #a!ente @%(@%)ila#%( #-)ante t%#% el $e)*%#% #e latencia0 l% C-e (-&ie)e C-e la actiacin #e !"OR $-e#e 5-&a) -n $a$el en la )e%)&anizacin #e ci)c-it% ante( #e la a$a)icin #e c%n-l(i%ne( e($%nt>nea(4 ,)nica t)ata!ient% L. 2;6::2 )e#-ce la @%(@%)ilacin #e SN a M DIF Ace)ca #el Enal #el $e)*%#% #e $)e-ictalB tan eEcaz!ente c%!% I cin t)ata!ient% )a$a!icina c)nica0 #e n-e% l% C-e (-&ie)e C-e la !a/%) $a)te #e la actiacin #e !"OR #-)ante el $e)*%#% $)e-ictal (e $)%#-ce a t)a'( #e PI3K4 P%) Dlti!%0 -n in+i?i#%) #e PI3K-!"OR #-al NFP-BEG23= AMai)a et al40 2::<B )e#-5% lac tate I / la( c%ncent)aci%ne( #e LD9 tant% c%!% PI3K % in+i?i#%)e( #e !"OR (%l%4 La a-(encia #e e@ect%( a#iti%( % (in')&ic%( c%nE)!a C-e l%( e@ect%( anti-e$il'$tic%( #e la in+i?icin #e PI3K (%n #e?i#% a la inactiacin #e la !"OR4 N-e(t)%( )e(-lta#%( #e!-e(t)an C-e la actiacin #e !"OR en e$ile$t%&'ne(i( $%(t)a-!>tic% e( @-e)te!ente #e$en#iente #e PI3K #e I0 l% C-e (-&ie)e C-e la actiacin #e PI3K $%) @act%)e( #e c)eci!ient% $-e#e (e) -n i!$%)tante @act%) C-e c%nt)i?-/e al #e(a))%ll% #e la e$ile$(ia #e($-'( #e -n t)a-!ati(!%4 "enien#% en c-enta la c%!$le5i#a# / eal-aci%ne( $)e(ente en la (ealizacin !"OR AG-e)tin / Sa?atini0 2::MB / la i!$licacin #e PI3K / Akt en la actiacin #e !"OR0 )e( I in+i?i#%)e( #-ale( c%!% NFP-BEG23= - %t)%( @>)!ac%( c%n !ecani(!%( (i!ila)e( !%( I AEn&el!an0 2::;J B%)#e)( et al40 2:1:B $-e#e )e(-lta) $)e@e)i?le a la )a$a!icina en el t)ata!ient% #e la e$ile$(ia4 Los eectos anti#epilepto$nicas de la in5i!icin de mTOR la in+i?icin #e !"OR $%#)*a (e) c-alC-ie)a #e anti-e$il'$tic% A$)eencin #el #e(a))%ll% #e la e$ile$(iaB0 % (i!$le!ente antic%n-l(i%4 L%( #at%( #e la( a$licaci%ne( #e a&-#%( #e la )a$a!icina in it)% n% (-&ie)en -n e@ect% antic%n-l(iante I (ant #i)ecta ADa%-# et al0 2::MJ44 R-e&& et al0 2::MB4 L%( ca!?i%( e(t)-ct-)ale(0 tale( c%!% la )e#-ccin #e la( E?)a( !-(&%(a( ?)%tacin #e($-'( #e la in+i?icin #e !"OR c)nica (-&ie)en -n e@ect% anti I e$ile$t%&'nic% AB-ck!a(te) et al0 2::;J4 Gen& et al0 2::;J4 9-an& et al0 2:1:4B4 En n-e(t)% !%#el%0 la in+i?icin #e !"OR c%n )a$a!icina ta!?i'n c%n#-5% a -na )e#-ccin #e la &e)!inacin a < DIF4 En el !%#el% #e la c-lt-)a #el +i$%ca!$% %)&an%t*$ic%( #e e$ile$t%-&'ne(i(0 < DIF e( el Dlti!% $-nt% #e tie!$% en el C-e e(ta c%!$a)acin $-e#e +ace)(e c%n I a c%n@-(in $%) la a$a)icin #e c%n-l(i%ne( / la !-e)te cel-la) ictal0 l% C-e $-e#e $)%#-ci) la &e)!inacin a#ici%nal4 N-e(t)%( )e(-lta#%( (-&ie)en C-e la in+i?icin #e la (ealizacin #e !"OR #e($-'( #e la le(in0 $e)% ante( #e la a$a)icin #e c%n-l(i%ne(0 RE $)%#-ce I in#-ci#a $%) la le(in a3%nal #e &e)!inacin4 La (-$)e(in #e la( E?)a( !-(&%(a( ?)%tacin )e I C-i)e# t)ata!ient% c%ntin-% c%n cin I )a$a!/ AB-ck!a(te) et al40 2::;B0 l% C-e (-&ie)e C-e la in+i?icin #e !"OR te!$%)al n% +a?e) (-@)i#% anti-e$ile$t%&'nica( e@ect%(4 Sin e!?a)&%0 enc%nt)a!%( C-e #e($-'( #e la te)!inacin antici$a#a #el t)ata!ient% )a$a!icina0 la $)%#-ccin #e lac I tate0 / la li?e)acin #e LD9 )e I $e)!aneci#% )e$)i!i#% #-)ante al !en%( 11 #4 E( i!$%)tante (eala) C-e en l%( $-nt%( #e tie!$% $%(te)i%)e(0 l%( c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina $)%#-cen ?a5%( niele( #e lactat% a $e(a) #e )etene) !-c+a( !>( ne-)%na( C-e l%( c-lti%( #e c%nt)%l Ae$il'$tica(B C-e +an e3$e)i!enta#% (i&niEcatia la !-e)te cel-la) ictal4 La $)%#-ccin #e lactat% e( (i! I ila) en )a$a!/cin t)ata#%( / c-lt-)a( t)ata#%( c%n el e+*c-l% en $-nt%( #e tie!$% $%(te)i%)e( Ac-a)ta (e!anaB in it)% #e?i#% a la !-e)te ne-)%nal (i&niEcatia en la( c-lt-)a( t)ata#a( c%n e+*c-l% #e c%n-l(i%ne(0 / la (-$e)iencia ne-)%nal !e5%)a#a en l%( c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina0 c%!% (e #i(c-te ante)i%)!ente4 Ba5a $)%#-ccin #e lactat% a $a)ti) #e -n &)an nD!e)% #e ne-)%na( e( tien#a I c%n(i(tente c%n -na @-e)te aten-acin #e ictal #a# I actii#a# en c-lti%( t)ata#%( c%n )a$a!icina0 incl-(% #e($-'( #e la )a$a!icina laa)-%-t4 La( )e#-cci%ne( en la &e)!inacin / el a3n z-)e( (ei elect)%&)>Eca I $e)(i(tie)%n #e($-'( #e la )a$a!icina #e laa#% / l%( )e(-lta#%( #e l%( en(a/%( #e lactat% / LD9 c%nE)!a)%n4 E(t%( )e(-lta#%( i!$lican C-e en n-e(t)% !%#el%0 la in+i?icin t)an(it%)ia #e !"OR +a (-@)i#% l%( e@ect%( (%?)e la e$ile$(ia4 P%) Dlti!%0 (e in@%)! #e C-e la )a$a!icina )e#-ce la actii#a# c%n-l(ia0 incl-(% c-an#% (e a#!ini(t)a #e($-'( #el #e(a))%ll% #e c%n-l(i%ne( )ec-))ente( e($%nt>nea( A9-an& et al40 2:1:B4 N-e(t)%( +allaz&%( @-e)%n LAR I Si!iH actii#a# e$ile$ti@%)!e / la !-e)te cel-la) )e(-ltante @-e)%n tant% SIG I (i&niEcatia!ente )e#-ci#a $%) el t)ata!ient% )a$a!icina ta)#e Aa $a)ti) #el 1: DIFB en c%!$a)acin c%n l%( c%nt)%le( e$il'$tic%( AFi&4 =BB0 l% C-e (-&ie)e C-e la )a$a!icina e)a eEcaz incl-(% en e(ta eta$a )elatia!ente ta)#*a #e e$ile$-t%&ene(i(4 A-nC-e e(t%( +allaz&%( $-e#en tene) i!$licaci%ne( cl*nica( $a)a el t)ata!ient% #e la e$ile$(ia a#C-i)i#a0 (-&ie)en C-e e$ile$t%&'ne(i( $-e#e (e) -n $)%ce(% !>( #in>!ic% #e l% i!a&ina#%4 M-e)te Ictal cel-la) ABe)#ic+e(k/ et al40 2:12B $-e#e alte)a) la( )e#e( e$il'$tic%( #e -na !ane)a C-e )eC-ie)e $la(tici#a# ci)c-it% c%ntin-% $a)a !antene) la e$ile$(ia0 / e(t% e$ile$t%&'ne(i( c-)(% $%#)*a (e) ?l%C-ea#a $%) la in+i?icin #e !"OR ta)#e4 Figura 7. Fosforilaci0n de la prote"na ribos0mica 8M se reduce con rapamicina cr0nica o L4 7PC%%7 tratamiento. 2, /ambios en 8M fosforilaci0n con el tiempo in vitro. OopW Las transferencias Xestern representativas de fosfoI8M (8er 7@<R7@M* y el total de 8M, de % a U D=V, y UI7U D=V. 9n pocas palabras, Ratios de fosfoI8M (8er 7@<R7@M* con el total de 8M se representan (n 6 C, la media Y R I 8OD, : p ;%,%<, :: p ;%,%$*. ., microfotoraf"as de inmuno!isto'u"mica de culturas con diferentes tratamientos, 5issl manc!a se muestra en ro&o y f0sforoI8M est, en verde. /, inmunotransferencia de tipo Xestern Representante de p8M (8er7@<R7@M* y el total de 8M y comparaci0n de p8M (8er 7@<R7@M* R 8M relaci0n en cultivos tratados con ve!"culo, rapamicina, o L4 7P@%%7. D, Xestern blot Representante de p8M (8er 7C% R 7CC* y el total de 8M, y la comparaci0n de p8M (8er 7C%R7CC* R relaci0n 8M en cultivos tratados con ve!"culo, rapamicina, o L4 7PC%%7 (::: p ;%,%%$*. 1tilidad y limitaciones de la preparacin de cortes or$anot+picos para la sealizacin de mTOR ,-lti%( #e c%)te( %)&an%t*$ic%( #e +i$%ca!$% $)%$%)ci%nan -n !%#el% e3ce$ci%nal!ente )>$i#% #e e$ile$t%&'ne(i( C-e c%n(e)a la( ca)acte)*(tica( clae #e e(te $)%ce(% AD/+)@5el#-7%+n(en et al0 2:1:J44 Be)#ic+e(k/ et al0 2:12J4 Sa?%lek et al0 2:12B4 De?i#% a C-e la( )e?ana#a( (e c)ean en PM0 e(te e( -n !%#el% #e la e$ile$t%&'ne(i( #e($-'( #e la le(in ce)e?)al $e#i>t)ic%0 / al&-n%( #e n-e(t)%( )e(-lta#%( $-e#e (e) e($ec*Eca $a)a la $%?lacin $e#i>t)ica4 L%( c-lti%( #e c%)te( tienen la !ic)%&lia0 $e)% al&-n%( %t)%( ele!ent%( #el (i(te!a in!-ne / nin&-na ?a))e)a (an&)e-ce)e?)%0 $%) l% C-e l%( e@ect%( anti- in\a!at%)i%( / a(c-la)e( #e la in+i?icin #e !"OR (e $-e#en e3cl-i) en &)an !e#i#a4 La acce(i?ili#a# #e la $)e$a)acin (e $)e(ta a en(a/%( )>$i#%( #e tant% la actii#a# c%n-l(ia / la ne-)%$)%teccin4 El alt% )en#i!ient% #e e(te en@%C-e e( $a)tic-la)!ente i!$%)tante $a)a la e3$l%)acin #e la en I inte)accin #e la le(in ce)e?)al0 la e$ile$(ia0 / el e@ect% #e la !ani$-lacin #e l%( (i(te!a( #e (ealizacin c%!$le5%( tale( c%!% la *a !"OR0 en la C-e n% (l% el $-nt% #e la inte)encin0 (in% ta!?i'n la *a tie!$% )elati% a la( le(i%ne( (%n a)ia?le( i!$%)tante(4