PRACTICA N09

NUMERACIN E IDENTIFICACIN DE Staphylococcus aureus

I. INTRODUCCIN
Los integrantes del gnero Staphylococcus, son cocos GRAM positivos, de 0.5-1.5 m de
dimetro, catalasa positivos, que se encuentran microscpicamente aislados, en pares,
ttradas o formando racimos irregulares. Son inmviles, facultativamente anaerobios,
no formadores de esporas, generalmente no capsulados o con limitada formacin de
cpsula.
El gnero Staphylococcus est ubicado junto a los gneros Micrococcus, Planococcus y
Stomatococcus en la Flia. Micrococcaceae.
Staphylococcus aureus, especie coagulasa positiva, es un reconocido patgeno
humano, siendo agente etiolgico de un amplio espectro de infecciones de origen
comunitario y nosocomial. S. aureus, tiene una amplia gama de determinantes de
virulencia, que abarca componentes de pared celular y una gran variedad de
exoprotenas que contribuyen en su habilidad para colonizar y causar enfermedad en
mamferos.
Casi todas las cepas producen un grupo de enzimas y citotoxinas que incluyen 4
hemolisinas (alfa, beta, gamma y delta) nucleasas, proteasas, lipasas, hialuronidasas y
colagenasa. La principal funcin de estas protenas sera convertir tejidos del husped
en nutrientes requeridos para el desarrollo bacteriano.
Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a la
neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de microorganismos
competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es
competitivo en presencia de otros microorganismos.
Staphylococcus se puede encontrar en:
a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan
alimentos, agua, agua residual.

b) En alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como
puede ser la leche y derivados lcteos, tambin se desarrolla en aquellos
alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sera el
jamn; otro factor importante en los alimentos es el pH, as tenemos en el caso
de la mayonesa, sta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el
desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada
por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de
este microorganismo enterotoxignico y finalmente.

c) Tambin se puede localizar en personas y animales. Estos ltimos, los animales y
las personas son los principales reservorios de estos microorganismos.
Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una
contaminacin postproceso con tipos enterotoxignicos de Staphylococcus aureus, por
ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de
conservacin inapropiadas; este problema se acenta por la ausencia de flora
competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo
El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por
tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al
ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencion con anterioridad
son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la A la ms nociva.
La contaminacin de alimentos por S. aureus, est asociada con una forma de
gastroenteritis que se manifiesta clnicamente por un cuadro caracterizado por vmitos
(76% de casos) y diarrea (77% de casos). El corto perodo de incubacin de 1-6 horas
orienta a la sospecha de enfermedad producida por ingestin de una o ms
enterotoxinas preformadas en el alimento que ha sido contaminado con cepas de S.
aureus productor de la misma.
El trmino Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas
que secretan una enzima que provoca coagulacin del fibringeno sanguneo,
utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos
de defensa del husped. Esta reaccin se utiliza in vitro para la identificacin de cepas
de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma.
Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son:
Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de
intoxicaciones.
Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de
este microorganismo enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin postproceso, la cual es usualmente debida a
contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

II. OBJETIVOS

Determinar la presencia de Staphylococcus aureus en alimentos de
consumo humano (empleando muestra de queso fresco).

Conocer el mtodo y los medios de cultivo empleados para la deteccin
de Staphylococcus aureus.


III. MATERIALES:

Material Biolgico: Queso
Material no biolgico:
Agar Baird Parker
Frascos estriles
Tubos de dilucin
Pipetas de 1 y 10 mL
Asas bacteriolgicas
Esptulas de Drigalsky
Huevos criollos
Diluyente: agua peptonada con 2% de citrato de sodio.
Plasma sanguneo (para prueba de coagulasa)
Gradillas
Mechero Bunsen
Placas de Petri


IV. PROCEDIMIENTO:
Tcnica: Siembra en placa por el mtodo de superficie

1. Preparacin de la muestra: Pesamos 3 g de queso. Luego agregamos 27 ml del
diluyente (agua peptonada + 2% de citrato de sodio), teniendo en cuenta que
sta ser la primera dilucin (10
-1
).







2. Luego procedemos a homogeneizar la muestra agitndola hasta que se
desmenuce por si sola.






3. Preparamos resto de diluciones (10
-2
, 10
-3
) y posteriormente sembramos por
duplicado cada una de las diluciones en una placa por el mtodo de siembra en
superficie con Agar Baird Parker, esto se realiza con ayuda de la esptula
Drigalsky.








4. Incubar a 35 37C por 24 48 horas

5. T
r
a
n
s
c
u
r
r
i
d
o
el tiempo de incubacin, leemos las placas y observamos los resultados.
Colonias caractersticas: colonias negras, medianas, brillantes y con un halo
blanco.
6. Se procede a hacer el conteo de las colonias caractersticas.
7. Confirmar la presencia de S. aureus realizando prueba de coagulasa y de
termonucleasa.
o Prueba de coagulasa: se incuba en un tubo con caldo nutritivo una asada con
muestra de la colonia caracterstica o sospechosa. Luego de 18 horas de
incubacin colocar 0.5mL de cultivo en 0.5ml de plasma sanguneo. Lectura:
cada 30 minutos durante 24 horas. La positividad se indica por la coagulacin
del medio lo que indica que el microorganismo produce la enzima coagulasa.
o Prueba de termonucleasa: se ha comprobado que existe una estrecha relacin
entre produccin de termonucleasa y enterotoxina estafiloccicas. Calentar la
cepa del supuesto S. aureus a 98C durante 10 minutos. Enfriar.la muestra asi
tratada se centrifuga a 27 000 rpm durante 20 minutos o a 7 500 rpm durante
45 minutos. El sobrenadante se utiliza para la prueba de termonucleasa.
En placas de Petri, se vierten, aspticamente, 5ml de agar DNasa-azul de
toluidina. Una vez solidificado el medio, se hacen pocillos de 3mm de
dimetro. Con pipeta Pasteur, se llenan los pocillos con el sobrenadante del
centrifugado de la muestra. Incubar, sin invertir las placas a 45C durante 2-4
horas. Pasado este tiempo, se vierte sobre la superficie del medio solucin de
azul de toluidina. En caso positivo, aparecen zonas rosadas alrededor de los
pocillos.
o Se hacen tinciones
Lectura: colonias negras, borde blanco, halo transparente, medianas
Confirmar: pruebas de coagulasa y termonucleasa.

V. RESULTADOS

Despus de la incubacin de 24 48 horas se tuvo los siguientes resultados:




















Se realiza el clculo de la siguiente manera:
1. Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o ml,
multiplicando el nmero de colonias en la placa por el factor de dilucin.
Cuando la prueba es negativa se expresa como <10 UFC/g ml.
Cuando la prueba es positiva se multiplica el nmero de colonias por el factor de
dilucin.

Computo del recuento estndar en placa

Dilucin Crecimiento Recuento por duplicado
(48horas)
Gram / Morfologa
10
-1
Colonias negras con halo / Cocos gram (+)
agrupados en racimos
10-
2
Colonias negras con halo / Cocos gram (+)
agrupados en racimos
10-
3
Colonias negras con halo / ---------------------


Computo del estimado del recuento estndar en placa.
Para el mtodo en superficie solo se sembr una placa por cada dilucin. Realizamos
el clculo con la placa que obtuvo el nmero de colonias ms aceptable,
correspondiente a la dilucin 10
-1
. Se debe tomar en cuenta que el inculo es de 0.1ml.

Siembra en
Superficie
48 h

36 + 32 = 68/2 = 34


(

)



(

Con la tincin de Gram se pudo observar los cocos en racimos que caracteriza a
Staphylococcus aureus.











Prueba de coagulasa: se realiza esta prueba a una colonia caracterstica.







Prueba de DNasa: se procede a esta prueba despus de haber confirmado que el
microorganismo es coagulasa positiva.



VI. CONCLUSIONES

Logramos identificar Staphylococcus aureus a travs de la prueba de la coagulasa.
Se determin el nmero de Staphylococcus aureus viables a travs del mtodo de
siembra en superficie y utilizando el mtodo de recuento en placa
La prueba positiva (+), se
confirma S. aureus
No se realiz la prueba de DNasa
100x
En este anlisis se lleg a la conclusin de que la muestra de queso colectada del
Mercado de Lambayeque se obtuvo por el mtodo de siembra en superficie

, con lo que se determina que la muestra si es apta para el

consumo humano.

VII. CUESTIONARIO

1. Fundamentar prueba de coagulasa:
Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies
de Staphylococcus (coagulasas negativos). La tcnica en tubo detecta coagulasa libre
y ligada. Mecanismo de accin de la coagulasa libre: procoagulasa (enzima
extracelular bacteriana) reacciona con un factor activador presente en el plasma
sanguneo similar a la protrombina, dando lugar a un complejo anlogoa la trombina
(coagulasa propiamente dicha) que reacciona con fibringeno formando un cogulo
de fibrinaen ausencia de Ca2+. La coagulasa ligada o factor de agregacin acta
directamente sobre el fibringeno y lo convierte en fibrina. No requiere la presencia
de activadores plasmticos.

2. Fundamentar la Prueba de Termonucleasa.
La deteccin de la desoxirribonucleasa termoestable estafiloccica (termonucleasa)
en los alimentos, se utiliza como una prueba indirecta de la presencia de grandes
cantidades de Staphylococcus aureus en los alimentos, as como de la posible
formacin de enterotoxina estafiloccica.
Esta prueba se fundamenta en la reaccin que se produce por una enzima nucleasa
sintetizada por cepas patgenas de Staphylococcus aureus en un medio de DNA azul
de toluidina. Entonces lo que ocurre es que la termonucleasa ataca al DNA presente
en el medio degradndolo. El producto resultante genera un cambio de pH el cual
hace reaccionar al azul de toluidina presente en el medio, generando un halo rosado
alrededor del pozo de siembra en el medio azulado.
La produccin de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia
de oxgeno, requiere iones calcio para su actividad enzimtica, posee un pH ptimo de
8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad
(resiste temperatura de 130 C por 16,6 min) es la nica asociacin con el crecimiento
de S. aureus. Esta relacin ha motivado el desarrollo de diferentes mtodos para
detectar esta enzima en el alimento y utilizarla como pesquisaje en los alimentos
susceptibles a la contaminacin de S. aureus.

3. Valores aceptables de Staphylococcus aureus en alimentos.






4. F
u
n
d
a
m
e
n
t
a
r

e
l

c
o
l
o
r

n
e
g
r
o de la colonia y la formacin de halo alrededor de la colonia.
Los estafilococos coagulasa positivos (Staphylococcus aureus) producen colonias
brillantes, convexas, de color gris oscuro a negro, con o sin una zona opaca alrededor
de las colonias. Los estafilococos producen colonias de color de gris oscuro a negro
debido a la reduccin del telurito.
El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsin de yema de
huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de
huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se
forma tambin una zona opaca como consecuencia de la formacin de un precipitado
de sales de calcio y magnesio, insoluble en cidos grasos. Esta zona opaca se hace ms
visible a partir de las 24 horas de incubacin.

El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de
las mismas, son las caracteristicas tpicas ms visibles de las colonias tpicas.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
BIBLIOGRAFIA
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analtica para alimentos y bebidas. Editorial Daz de Santos. Segunda edicin.
Madrid-Espaa.
James M. Jay. 2002. Microbiologa moderna de los alimentos. Editorial Acribia
S.A. Cuarta edicin. Zaragoza-Espaa.
Direccin general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de Anlisis
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Jay J. M.; 2000; Microbiologa Moderna de los Alimentos; 4ta edicin;
Editorial Acribia; Zaragoza; Espaa.

LINKOGRAFA

http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/sociedad-y-
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http://www.bvsops.org.uy/pdf/aureus.pdf
http://www.digesa.sld.pe/norma_consulta/Proy_RM615-2003.pdf
http://www.nutricion.pro/27-04-2010/sentirse-bien/staphylococcus-aureus-
enfermedad-transmitida-por-alimentos
http://alimentoseguro.wordpress.com/2009/08/22/etas-envenenamiento-por-
staphylococcus-aureus/
http://virus.usal.es/web/demo_microali/Saureus/SaureusPlaca.html
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/bairdparker.htm