Armendariz Biologia Molecular 1a Banco Imagen c14 VECTORES CLONACION

PARTE II
METODOLOGA DEL
ADN RECOMBINANTE
CAPTULO 14
VECTORES DE CLONACIN
Y EXPRESIN
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CAPTULO 14. VECTORES DE CLONACIN Y EXPRESIN
PARTE II. METODOLOGA DEL ADN RECOMBINANTE
Figura 14-1. Vector de clonacin y expresin. Un vector de clonacin contiene
elementos como el origen de replicacin, un sitio mltiple de clonacin (SMC),
que es una secuencia especfica reconocida por diversas enzimas de
restriccin para poder insertar el ADNc del gen de inters y un marcador de
seleccin. Un vector de expresin se utiliza para producir una protena
recombinante y contiene, adems de los elementos mencionados, un
promotor y un sitio IRES (sitio de entrada interna al ribosoma), as como
una secuencia de poliadenilacin.
Figura 14-2. Marcadores de
seleccin. A) El gen LacZ es un
marcador de seleccin que codifica
para la enzima -galactosidasa.
Cuando la clula que contiene el
plsmido se pone en contacto con
el reactivo x-gal, las colonias de
clulas transformadas se tien de
color azul. B) Otro marcador de
seleccin es el gen GFP, que
expresa la protena verde
fluorescente que
proporciona fluorescencia a la
colonia celular cuando es expuesta
a la luz ultravioleta.
Figura 14-3. Vectores de clonacin. Los
vectores de clonacin se han creado
con la finalidad de contener y permitir
la amplificacin de fragmentos de
cidos nucleicos. A) Un plsmido consta
de componentes bsicos como el sitio
de clonacin mltiple, un gene de
resistencia y un sitio ORI. B) Los fagos
provienen de la modificacin del
genoma ADNds lineal de virus
bacterianos.
A B
Figura 14-3. (Continuacin) C) Los
csmidos, como su nombre indica,
combinan propiedades de los plsmidos
con la presencia de los sitios COS del
fago.
C
Figura 14-3. (Continuacin) D) Un
BAC, o cromosoma bacteriano,
permite la ligacin de fragmentos
grandes de ADN que contienen
secuencias de resistencia a
antibiticos, y sitio de clonacin
mltiple.
D
Figura 14-3. (Continuacin)
E) Los YAC se construyen a
partir de la ligacin de
fragmentos de ADN de gran
tamao con genomas de
levadura modificados que
contienen genes de
resistencia a antibiticos,
secuencias telomricas y de
codificacin para
centrmeros.
E
Figura 14-4. Estrategia general de
clonacin. El procedimiento
esquematizado consta de los
siguientes pasos: preparacin del
vector para clonacin, preparacin
del inserto de ADN a clonar, ligacin
del inserto de ADN con el vector, la
transformacin de bacterias y la
identificacin de las colonias que
contienen el vector recombinante.
Una vez que se obtiene el vector
recombinante, puede utilizarse para
producir protenas recombinantes o
para almacenar el ADN.
Figura 14-5. Estrategias de clonacin. Segn el tipo de extremos que se generan con
el corte por las enzimas de restriccin del vector e inserto que se va a clonar, se
pueden tener las siguientes opciones: clonacin de extremos romos con romos A),
cohesivos con cohesivos B), o cohesivos con romos C).
Figura 14-5. (Continuacin) Estrategias de clonacin.
Figura 14-6. Purificacin del inserto a clonar. Despus de la digestin
enzimtica con que es escindido el inserto del ADN de origen, el inserto se
purifica del resto de la molcula de ADN de donde proviene, mediante
una electroforesis en gel. En la imagen, un inserto es liberado
empleando las enzimas Hind III y Xho I, y en la electroforesis se
visualiza el fragmento digerido.
Figura 14-6. Purificacin del inserto a clonar. (Continuacin) Un corte de la
agarosa a la altura de la banda del inserto digerido lo asla del resto de la
molcula de origen que no haya liberado el inserto. Para extraer el inserto de
la agarosa, se purifica el cido nucleico empleando tcnicas comerciales de
extraccin y purificacin de ADN por columnas inicas.
Figura 14-7. Transformacin de bacterias. A) Transformacin qumica. Para la
transformacin qumica se aade el plsmido deseado a las clulas qumicamente
competentes que se encuentran en una solucin con CaCl2, que junto con el vector forma
un complejo insoluble. Un choque trmico a 42 C facilita la entrada del complejo
ADN-CaCl2 a la clula. Se aade medio LB para que las clulas crezcan y se
reproduzcan con el plsmido insertado. Posteriormente, se siembran en agar
con antibitico del gen de resistencia que contiene el plsmido y se
seleccionan las colonias resistentes que contienen el vector recombinante.
Figura 14-7. Transformacin de bacterias. B) Transformacin por electroporacin.
En la transformacin por electroporacin la diferencia estriba en que en lugar de
un choque trmico se aplican pulsos elctricos que desestabilizan la membrana
celular y permiten la entrada del vector.
Figura 14-8. Produccin de una
genoteca de ADN complementario. Las
genotecas de ADNc se construyen a
partir de la secuencia de ARNm, de los
cuales se sintetiza el ADNc por
retrotranscripcin. El ARNm remanente
es degradado, y la cadena
complementaria del ADN de cadena
sencilla para formar un ADN de doble
cadena se sintetiza con ayuda de una
ADN polimerasa. Los fragmentos de
ADNc de doble cadena se clonan en el
vector de eleccin.

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