Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Cincias Exatas e da Natureza

Departamento de Qumica Fundamental

Qumica Analtica 12 Prof. Madalena Areias

















Tcnicas de Separao:
Cromatografia Lquida, Cromatografia Gasosa e Eletroforese Capilar















Aluna: Daniele Cristina Gomes da Cunha Kunze









Recife, 29 de julho de 2014
Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)
A cromatografia uma tcnica de separao na qual os componentes a serem
separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase mvel e a outra
estacionria.
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilizao
atribuda a um botnico russo ao descrever suas experincias na separao dos
componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de ter de petrleo (fase
mvel) atravs de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de clcio (fase
estacionria), qual se adicionou o extrato, levou separao dos componentes em
faixas coloridas. Este provavelmente o motivo pelo qual a tcnica conhecida como
cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar errnea idia de que o
processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam ser
considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi praticamente
ignorada at a dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir da, diversos trabalhos na
rea possibilitaram seu aperfeioamento e, em conjunto com os avanos tecnolgicos,
levaram-na a um elevado grau de sofisticao, que resultou no seu grande potencial de
aplicao em muitas reas. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de
compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de
compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos
componentes de uma mistura.
O processo cromatogrfico consiste na migrao dos componentes de uma
mistura entre a fase mvel e a fase estacionria. No caso da cromatografia lquida, a
fase mvel um solvente e a estacionria constituda de partculas slidas
empacotadas em uma coluna, e sobre essa coluna que a fase mvel atravessada.

So as foras fsicas e qumicas que atuam entre os solutos e as duas fases so
responsveis pela reteno dos solutos sobre a coluna cromatogrfica. A diferena na
magnitude dessas foras que determina a resoluo e portanto a separao dos solutos
individuais. As foras elementares que agem sobre as molculas so de cinco tipos:
1. Foras de disperso de London ou foras de Van der Waals;
2. Interaes de dipolo induzido;
3. Ligaes de hidrognio;
4. Interaes dieltricas;
5. Interaes eletrostticas e coulombianas.
As variveis que afetarem essas foras intermoleculares iro influenciar o grau
de separao obtido pela passagem dos solutos atravs da coluna cromatogrfica.
H cinco tipos de fases estacionrias com diferentes mecanismos que regem as
separaes cromatogrficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase mvel
possvel utilizar um deles:
1. Cromatografia lquido-slido (ou por adsoro)
O mecanismo desse tipo de separao se baseia na competio que existe entre
molculas da amostra e as da fase mvel em ocupar os stios ativos na superfcie de um
slido (fase estacionria).
O equilbrio estabelecido : para que a molcula do soluto possa ser adsorvida na
fase estacionria, primeiro uma molcula da fase mvel deve ser deslocada da
superfcie. Se assumir que o adsorvente possui uma superfcie polar (por exemplo: slica
ou alumina), grupos apolares (por exemplo, hidrocarbonetos) tero pouca afinidade por
essa superfcie e no iro deslocar a molcula da fase mvel, por isso, no sero retidos.
Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrognio tero fortes
afinidades pela superfcie e sero fortemente retidos. Molculas polarizveis (por
exemplo, molculas aromticas) iro apresentar interao dipolo induzido-dipolo com a
superfcie do adsorvente e, portanto, tambm sero retidas.
O grau de reteno depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional.
importante que as partculas da fase estacionria apresentem uma grande rea de
superfcie, isto , um grande nmero de stios ativos.

2. Cromatografia lquido-lquido (ou por partio)
O mecanismo de separao neste tipo de cromatografia, ou mecanismo de
distribuio como tambm chamado, baseia-se nas diferentes solubilidades que
apresentam os componentes da amostra na fase mvel e na fase estacionria. Ento, os
componentes mais solveis na fase estacionria so seletivamente retidos por ela,
enquanto os menos solveis so transportados mais rapidamente pela fase mvel.
O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase estacionria na fase
mvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a no reprodutibilidade nas
separaes repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras: saturando a fase mvel
com a fase estacionria por meio de uma pr-coluna, colocada antes do injetor, que
contenha uma alta percentagem de fase estacionaria; ou utilizando materiais que
contenham a fase estacionria, quimicamente ligada a um suporte slido.
3. Cromatografia lquida com fase ligada
A fase estacionria para a cromatografia lquida com fase ligada (CLFL) surgiu
como resposta aos problemas com a CLL. Como a fase estacionria quimicamente
ligada superfcie do suporte, no h mais solubilidade da fase estacionria na fase
mvel.
O mecanismo principal desta tcnica baseia-se na partio. Por outro lado, como
esta fase estacionria tambm apresenta influncia de grupos ativos (polares) da
superfcie (isto , tambm ocorre o mecanismo de adsoro), a maioria dos
pesquisadores considera esta tcnica um mtodo separado.
Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionria possvel obter
diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares, como o grupo amino
(-NH
2
) e o grupo nitrilo (-CN), que funcionam similarmente s fases polares da CLS,
sendo chamados de fase normal. E h os de natureza apolar, como os grupos octil
(-C8H17), octadecil (-C18H37) e fenil (-C6H5), que so chamados de fase reversa.
Este tipo de cromatografia muito til e se aplica a molculas de baixa ou mdia
polaridade, no inicas, de massa molecular inferior a 2000 e solveis em solvente
orgnico.


4. Cromatografia lquida por troca inica
Na cromatografia por troca inica (CTI), a fase estacionria possui grupamentos
inicos quimicamente ligados que podem ser trocadores de ctions ou de nions. Esses
grupamentos apresentam contra-ons que so deslocados pelos ons da amostra.
5. Cromatografia lquida por excluso
Esta tcnica baseada no tamanho efetivo das molculas dos componentes da
amostra em soluo. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que
um material til. O primeiro o inferior, chamado de limite de permeao, abaixo do
qual todas as molculas de menor tamanho so igualmente difundidas dentro dos poros
do material e o segundo o superior, chamado limite de excluso, acima do qual todas
as molculas so muito grandes para penetrar nos poros. Molculas de tamanho
intermedirio entre ambos os limites sero separadas totalmente ou parcialmente de
acordo com a seletividade caracterstica de cada material. Ento, sero eludas sem
resoluo as molculas menores que o limite de permeao e as maiores do que o limite
de excluso, separando somente as que se encontram dentro destes limites.

Instrumentao
Um equipamento bsico de cromatografia lquida contm basicamente cinco
componentes, como pode ser visto no esquema abaixo:

1. Reservatrio da fase mvel: A fase mvel da CLAE deve ser um solvente que
respeite algumas caractersticas impostas por esse mtodo analtico. A principal
caracterstica que a fase mvel dissolva a amostra sem qualquer interao qumica
entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fcil purificao, para
que se possam fazer anlises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem
interferir na deteco do analito por ultravioleta (UV).
A fase mvel deve ser compatvel com o detector empregado e, tambm possuir
polaridade adequada para permitir uma separao conveniente dos componentes da
amostra. Embora existam vrios solventes, trs deles so mais utilizados: gua,
metanol e acetonitrila. As fases mveis polares tm tendncia a dissolver oxignio e
outros gases. Se esses gases so liberados dentro do equipamento, formam bolhas e
podem afetar o funcionamento do detector e a eficincia da coluna. Por esse motivo
necessrio remover os gases dissolvidos na fase mvel. Em muitos equipamentos,
o prprio reservatrio est condicionado a efetuar a remoo, por exemplo, pela
aplicao de vcuo no reservatrio e agitao da fase mvel sob ao de ultrassom
e/ou aquecimento. O problema da formao de bolhas tem sido reduzido pela
adio de um filtro na sada do detector, o que restringe um pouco a vazo e produz
uma pequena presso na cela do detector, impedindo a formao de bolhas.


2. Bombas de alta presso: O grande avano na cromatografia em coluna foi o
desenvolvimento e a utilizao de suportes com partculas diminutas responsveis
pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso
para a eluio da fase mvel, devido a sua baixa permeabilidade.
A bomba de alta presso o dispositivo que bombeia e
controla o fluxo e a presso da fase mvel (solvente).
composta de um ou mais pistes acoplados a um
sistema de vlvulas e fornece uma alta presso. A
bomba tem que proporcionar uma vazo razovel
atravs da coluna, para que a anlise no seja lenta, e
uma vazo constante, para no atrapalhar o sistema de
deteco. Podem ser considerados basicamente dois
tipos de bombas, as mecnicas e as pneumticas.



3. Vlvulas para amostragem: Anteriormente, a introduo da amostra era efetuada
de forma similar realizada na cromatografia gasosa, ou seja, mediante micro-
seringa que injeta a amostra dentro de uma pequena cmara, de onde eluda pela
fase mvel.

Os equipamentos modernos empregam vlvulas para amostragem, como a ilustrada
abaixo:

A amostra, introduzida na vlvula mediante seringa, deve encher o espao interno
da poro do tubo capilar de ao, a ala de amostragem (carga). Normalmente o
volume contido na ala de 1 a 100 L. A amostra injetada na coluna, ao girar a
vlvula para que a posio de entrada e sada mude (injeo na coluna). Desta
forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de
amostra, dependendo do tubo capilar (ala de amostragem) utilizado, com um alto
grau de reprodutibilidade. As vlvulas para amostragem so fabricadas somente de
material inerte, como teflon e ao inoxidvel, e seu desenho tal que resistem a
presses muito elevadas.
4. Coluna cromatogrfica: feita de um material inerte que resiste a todas as
presses em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna determinada pelo
comprimento, dimetro e pelo material de recheio. Geralmente, utilizada tambm
uma pr-coluna, que uma pequena coluna instalada a montante da coluna analtica
e tem como objetivo reter slidos e, em muitos casos, reter materiais que por
reaes qumicas podem precipitar sobre a fase estacionria.

As colunas geralmente utilizadas so: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8),
CN (cianopropil) e NH
2
(amina). A fase estacionria mais utilizada composta de
partculas microporosas de slica. So permeveis ao solvente e possuem uma rea
superficial de vrias centenas de metros por gramas.
5. Detectores: Uma instrumentao melhor requerida para a CLAE, em relao
sensibilidade dos detectores, para monitorizao do efluente que sai da coluna.
Infelizmente as propriedades fsicas ou fsico-qumicas da amostra e fase mvel
so, muitas vezes, similares. Algumas solues para o problema de deteco tm
sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: medidas diferenciadas de
propriedades gerais de ambas: amostras e fase mvel; medidas de uma propriedade
da amostra que no apresentada pela fase mvel; e deteco aps a eliminao da
fase mvel.
Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em
uma destas solues. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes
caractersticas:
Alta sensibilidade e baixo limite de deteco;
Resposta rpida a todos os solutos;
Insensibilidade a mudanas nas temperaturas e na vazo da fase mvel;
Resposta independente da fase mvel;
Pequena contribuio ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do
detector;
Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto;
No destruio do soluto;
Segurana e convenincia de uso;
Informao qualitativa do pico desejado.
Infelizmente, no existe um detector que apresente todas estas propriedades, a
no ser que ele seja desenvolvido. A tabela abaixo resume algumas das
propriedades dos detectores:








Cromatografia Gasosa
Assim como a cromatografia lquida, a cromatografia gasosa um mtodo fsico
de separao, no qual os componentes a serem separados so distribudos entre duas
fases: a fase estacionria, e a fase mvel. Neste caso, a fase mvel um gs inerte,
normalmente nitrognio, hlio ou hidrognio. A amostra transportada por uma
corrente de gs atravs de uma coluna empacotada com um slido recoberta com uma
pelcula de um lquido.

Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar os
componentes de misturas, a cromatografia de gs uma das ferramentas mais
importantes em qumica. amplamente usada para anlises quantitativos e qualitativos
de espcies qumicas e para a determinar constantes termoqumicas tais como calores de
soluo e vaporizao, presso de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de
gs tambm usada para monitorar os processos industriais de forma automtica:
analisam-se as correntes de gs periodicamente e realizam-se reaes de forma manual
ou automtica para compensar variaes no desejadas.
O mtodo consiste primeiramente na introduo da mistura de prova ou amostra
em uma corrente de gs inerte, normalmente hidrognio, hlio, nitrognio ou argnio,
que atuaro como gs de arraste. As amostras lquidas vaporizam-se antes da injeo no
gs de arrastre. O fluxo de gs passa pela coluna empacotada atravs da qual os
componentes da amostra se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de interao
de cada componente com a fase estacionria no voltil. As substncias que tm a maior
interao com a fase estacionria so retidas por mais tempo e, por tanto, separadas
daquelas de menor interao. medida que as substncias eluem da coluna, passam por
um detector, que gera um sinal eltrico proporcional quantidade de material eluido. O
registro deste sinal em funo do tempo o cromatograma, sendo que as substncias
aparecem nele como picos com rea proporcional sua massa, o que possibilita a
anlise.
Existem dois tipos de cromatografia de gs: cromatografia gs-slido (CGS) e
cromatografia gs-lquido (CGL). A cromatografia gs-slido se baseia na base slida
estacionria, na qual a reteno das substncias analisveis a consequncia da
absoro fsica. A cromatografia gs-lquido til para separar ons ou molculas
dissolvidas em um solvente. Se a soluo de amostra estiver em contato com um
segundo slido ou fase lquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em
diferentes graus, devido a diferenas de adsoro, intercmbio de ons, partio, ou
tamanho. Estas diferenas permitem que os componentes da mistura se separem usando
estas diferenas para determinar o tempo de reteno dos solutos atravs da coluna.

Instrumentao
Os constituintes bsicos de um sistema cromatogrfico gasoso so bastante
semelhantes ao lquido:

1. Reservatrio de Gs de Arraste
O gs de arraste fica contido em cilindros sob presso. Assim, a escolha do gs
de arraste independe da amostra a ser separada. O parmetro mais importante a sua
compatibilidade com o detector (alguns detectores trabalham melhor quando se usam
determinados gases). Os gases mais empregados so H
2
, He e N
2
e a vazo do gs de
arraste, que deve ser controlada, constante durante a anlise.
2. Sistema de Introduo de Amostra
Na CG, a seo do cromatgrafo gasoso onde feita a introduo da amostra o
injetor (ou vaporizador). Na verso mais simples, trata-se de um bloco de metal
conectado coluna cromatogrfica e alimentao de gs de arraste. Este bloco contm
um orifcio com um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras
lquidas ou gasosas podem ser injetadas com micro seringas hipodrmicas. Amostras
slidas podem ser dissolvidas em um solvente adequado. O injetor deve estar aquecido
a uma temperatura acima do ponto de ebulio dos componentes da amostra, para que a
amostra se volatilize completa e instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a
temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposio da amostra. A amostra
deve entrar na coluna na forma de um segmento estreito, para evitar alargamento dos
picos.
3. Coluna Cromatogrfica
Depois de injetada e vaporizada, a amostra introduzida na coluna
cromatogrfica, onde efetuada a separao. Na CG a "afinidade" de um soluto pela
fase mvel determinada pela volatilidade do soluto, sua presso de vapor, que
funo da estrutura do composto e da temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se
tambm a presso de vapor e, por conseguinte, a "afinidade" de uma substncia pela
fase mvel.
4. Detector
Quantifica e indica o que sai da coluna. Os dois tipos mais utilizados so o
detector por ionizao de chama (FID) e o detector fotomtrico de chama (FPD).
Um detector de ionizao de chama (FID ou DIC) consiste em
uma chama de hidrognio (H
2
)/ar e um prato coletor. O efluente passa
da coluna do CG atravs da chama, a qual divide em molculas
orgnicas e produz ons. Os ons so recolhidos em um eletrodo
negativo e produzem um sinal eltrico. O FID extremamente
sensvel com uma faixa dinmica grande. Sua nica desvantagem
que destri a amostra. Sua maior utilizao na deteco de
hidrocarbonetos. O FID oferece uma leitura rpida, precisa e contnua
da concentrao total de HC para nveis to baixos
como ppb.
J o detector fotomtrico de chama (FPD)
permite medies sensveis e seletivas de enxofre
voltil e compostos de fsforo. O princpio de deteco
a formao de espcies de enxofre excitado (S
2
*) e
HOP* em uma chama. Um tubo fotomultiplicador
mede a emisso de quimiluminescncia caracterstica dessas espcies. O filtro ptico
pode ser trocado para permitir ao fotomultiplicador visualizar luz de 394 nm (para a
medio de enxofre) ou 526 nm (para fsforo). A resposta do detector ao fsforo
linear, ao passo que a resposta ao enxofre depende da concentrao. Normalmente
utiliza-se (N
2
) como gs de arrastre.

5. Eletrnica de tratamentos: Purifica os rudos para melhor anlise;
6. Registro de sinal: Analisa e avalia os dados obtidos no processo.















Eletroforese Capilar
Este mtodo de separao pode ser definido como sendo a migrao de espcies
carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas so dissolvidas ou suspensas
em um eletrlito, atravs do qual uma corrente eltrica aplicada.
Para uma separao eletrofortica ocorrer, uma pequena quantidade de amostra
injetada numa soluo tampo aquosa contida em um tubo estreito ou em um suporte
poroso e plano, como papel ou gel semisslido. Aplica-se ento, um alto potencial de
corrente contnua ao longo do comprimento do tampo atravs de um par de eletrodos
localizados nas extremidades. A aplicao desse potencial faz com que os ons da
amostra migrem em direo a um ou a outro eletrodo. As separaes so baseadas nas
diferenas das relaes carga/tamanho dos analitos da amostra. Se um potencial alto for
aplicado atravs de um tubo capilar contendo soluo tampo, ocorre um fluxo eletro
osmtico, onde o solvente migra em direo ao ctodo ou ao nodo.
O princpio da separao em eletroforese se baseia na diferena nas velocidades
de migrao de compostos diferentes quando aplicado uma ddp entre as extremidades
do capilar.

onde:
e
= mobilidade eletrofortica
E = fora do campo eltrico

Altos potenciais levam a uma velocidade de migrao elevada, isto uma
separao rpida.
A eletroforese capilar (EC) uma tcnica aplicvel na determinao de uma
grande variedade de amostras. Uma caracterstica que difere a EC das outras tcnicas
a sua capacidade nica para separar macromolculas carregadas eletricamente de
interesse tanto em indstrias de biotecnologia quanto em pesquisas biolgicas.
Na eletroforese capilar possvel empregar diversos modos de separao, cada
qual com seu mecanismo e seletividade caractersticos. A seguir so apresentadas, de
forma simplificada, as caractersticas de cada tipo de separao.


1) Eletroforese capilar de zona (CZE)
A eletroforese de zona em soluo livre a tcnica mais utilizada e tem esta
denominao devido ao fato de que o capilar e os reservatrios contendo os eletrodos
so cheios com um tampo (denominado eletrlito carreador), o qual conduz a corrente
eltrica e fornece a capacidade tamponante. A amostra, contendo uma mistura inica,
introduzida no capilar como uma banda de pequena espessura. Sob a influncia do
campo eltrico, as espcies inicas da amostra e do tampo migram para o eletrodo
correspondente, isto , ctions em direo ao catodo e nions em direo ao anodo,
como mostrado na figura abaixo:

2) Cromatografia eletrocintica micelar (MEKC)
Na eletroforese de zona em soluo livre no possvel separao de
diferentes compostos neutros, pois estes migram na mesma velocidade, j que no esto
sob a influncia do campo eltrico. Desta forma, para separ-los necessrio utilizar
outra tcnica de separao, como por exemplo, a cromatografia eletrocintica. Neste
tipo de eletroforese, a separao do soluto dependente da distribuio entre as fases
aquosa e micelar, como representado abaixo:

3) Isotacoforese Capilar (CITP)
Na isotacoforese, a amostra introduzida na interface de um sistema tampo,
consistindo de um eletrlito lder e um eletrlito terminal. Para efetuar a separao,
utilizam-se as diferenas nas mobilidades eletroforticas de ctions e nions, em relao
aos ons dos eletrlitos lder e terminal.
Na separao de uma amostra de ctions, por exemplo, o eletrlito lder deve
possuir ctions cuja mobilidade seja maior que a dos ons a serem separados e o
eletrlito terminal deve possuir ctions com mobilidades inferiores aos ctions da
amostra. Desta forma, estabelecem-se zonas de amostras, entre os dois tipos de
eletrlitos, que vo sendo continuamente separadas, at que cada zona contenha um
nico tipo de on. Todas as zonas migram, na mesma velocidade do on do eletrlito
lder, em direo ao eletrodo correspondente.

4) Focalizao Isoeltrica Capilar (CIEF)
Na focalizao isoeltrica, os analitos so separados de acordo com seus pontos
isoeltricos (pI) isto , o valor do pH no qual o anflito tem carga residual nula. No pI
no ocorre migrao sob a ao de um campo eltrico. A amostra misturada com uma
srie de reagentes, denominados anflitos carreadores, que possuem boa capacidade
tamponante em seus valores individuais de pI. Um gradiente de pH obtido quando se
aplica o campo eltrico, fazendo com que ocorra uma movimentao do soluto, de
acordo com o valor do pH. Desta forma, em valores de pH mais baixos que o pI dos
analitos, estes migram para o catodo, pois esto positivamente carregados. Em pH mais
alto, eles migram para o anodo, pois esto carregados negativamente. Este tipo de
eletroforese utilizado, quase exclusivamente, para a separao de espcies anfteras,
como protenas e polipeptdios.

5) Eletroforese Capilar em Gel (CGE)
Este tipo de eletroforese utilizado quando a razo carga/raio dos analitos to
prxima, que no possvel separ-los com o uso da eletroforese de zona tradicional.
A separao realizada com base na diferena entre o tamanho das molculas
dos analitos; sendo assim, a maior ou menor facilidade com que os analitos de diversos
tamanhos migram atravs da matriz de gel que produz a separao, como mostra a
figura abaixo:

6) Eletrocromatografia Capilar (CEC)
A eletrocromatografia capilar uma tcnica de separao que mistura
caractersticas da eletroforese capilar e de HPLC. Este tipo de eletroforese emprega
como fase estacionria micro partculas de slica fundida, usualmente contendo um
ligante hidrofbico que retm os solutos. Da mesma forma que em HPLC, na CEC
existe uma fase mvel que , normalmente, uma mistura de tampes aquosos. A
superfcie de slica possui uma alta densidade de grupos silanis ionizados, gerando,
desta forma, um elevado fluxo eletroosmtico quando a voltagem aplicada. O
mecanismo de separao dependente da natureza da amostra.
Instrumentao
Geralmente o funcionamento de um equipamento de eletroforese capilar (EC)
envolve a aplicao de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de dimetro
reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. O uso do capilar apresenta vrias
vantagens, particularmente com respeito ao aquecimento Joule.

A alta resistncia eltrica deste permite a aplicao de campos eltricos altos
pois gera um aquecimento mnimo, alm disso o formato de capilar propicia uma
dissipao eficiente do calor gerado. O uso de campos eltricos altos resulta em tempo
de anlise curto, alta eficincia e resoluo.
Na eletroforese capilar, o capilar preenchido com uma soluo tampo e suas
extremidades so mergulhadas em recipientes que a contm e onde aplicado um
campo eltrico, que gera uma corrente no interior do capilar. Os eletrodos so feitos de
um material inerte, tal como, platina, e so tambm mergulhados na soluo para fechar
o circuito. O capilar passa atravs de um detector, usualmente um detector
espectrofotomtrico de absoro no UV/Vis.
Uma pequena quantidade de amostra introduzida em uma das extremidades do
capilar. A aplicao do campo eltrico provoca o movimento dos analitos em direo
aos eletrodos. As separaes em EC so baseadas na presena de um fluxo
eletricamente induzido, denominado fluxo eletroosmtico (FEO), um fenmeno
eletrofortico que gera o fluxo da soluo dentro do capilar, que faz com que os solutos
se movimentem em direo ao detector. Este fluxo pode reduzir significativamente o
tempo de anlise ou forar um on a reverter a sua tendncia de migrao em direo a
um eletrodo, pelo qual est sendo atrado, devido ao sinal de sua carga.
O grfico, gerado pelo detector, tempo em funo de resposta do detector
denominado eletroferograma:


Capilares
Os capilares podem ser de vidro (para l > 280 nm), teflon (flexvel, transparente
no UV, porm no pode ser usado com alta voltagem), ou slica fundida, normalmente
recoberta externamente com uma camada de proteo de poliamida, que produz uma
melhora na resistncia mecnica, uma vez que extremamente frgil e se quebra com
facilidade. Uma pequena poro deste recobrimento removida a fim de se formar uma
janela para a deteco. A janela ento alinhada ao centro ptico do detector.
Os capilares so, tipicamente, de 25 a 100 cm de comprimento com 15 a 100 m
de dimetro interno. Nos instrumentos disponveis comercialmente, os capilares so
mantidos dentro de um dispositivo, denominado cassete, que facilita a insero no
instrumento e protege a janela delicada de deteco. A superfcie interna do capilar pode
ser quimicamente modificada por meio de ligao covalente com diferentes substncias.
Estes recobrimentos so utilizados para uma grande variedade de propsitos, tais como,
reduzir a adsoro da amostra ou mudar a carga inica da parede do capilar.
O controle de temperatura ao redor do capilar muito importante para assegurar
separaes reprodutveis. O controle feito geralmente por ar ou lquido refrigerante, os
quais so forados a passar atravs do cassete, onde se encontra o capilar.
Introduo da Amostra
Na EC, diferentemente das tcnicas cromatogrficas (Cromatografia Gasosa -
CG e Cromatografia Lquida de Alta Eficincia - CLAE), a amostra no injetada e sim
introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector.
O modo de injeo mais empregado em EC o denominado hidrodinmico,
onde o capilar mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual em seguida
pressurizado, submetido ao vcuo ou erguido (efeito sifo) provocando a entrada de um
certo volume de amostra no capilar. Uma outra alternativa obtida atravs da insero
do capilar e do eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicao de uma voltagem,
sendo que solutos neutros so arrastados pelo FEO, ao passo que solutos carregados iro
migrar para dentro do capilar, por causa do FEO e tambm da migrao eletrofortica.
Este tipo de injeo denominado de injeo eletrocintica. A figura abaixo mostra os
esquemas para introduo de amostras:

Detectores
O detector mais frequentemente utilizado em EC o espectrofotomtrico de
absoro no UV/Vis devido sua natureza quase universal, ou seja, pode ser aplicado
na deteco de vrias classes de substncias. A maioria dos instrumentos tem tambm
detectores com arranjo de diodos disponveis, o qual fornece um espectro de UV/Vis
para cada substncia detectada.
Alguns detectores alternativos so os de fluorescncia, de fluorescncia indireta,
de fluorescncia induzida por laser, o espectrmetro de massa, o amperomtrico e o de
condutividade. O acoplamento de EC com espectrmetro de massas usualmente
empregado para dar informaes estruturais dos analitos.

Bibliografia
1) Anlise Instrumental: Cromatografia Lquida de Alta Resoluo. CEFET - RJ.
(Disponvel em: http://www.ifrj.edu.br/webfm_send/546. Acessado em 20 de julho
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2) Cromatografia: um Breve Ensaio. DEGANI, A. L. G., CASS, Q. B., VIEIRA, P.
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3. Acessado em 20 de julho de 2014).
3) Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. (Disponvel em:
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farmaceutico-industrial/130-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia.html.
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10) Eletroforese Capilar. QUEIROZ, S. C. N., JARDIM, I. C. S. F. UNICAMP.
(Disponvel em: http://chemkeys.com/br/wp-content/themes/chemkeysbr/articleI.p
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