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Culture des cellules animales

Plan du
cours
1. Dfinitions
- Primoculture et culture secondaire
- Ligne cellulaire
- Adhrence
- Culture en monocouche
- Passage
- Transformation cellulaire
2. Composition des milieux de culture
2.1. Milieu synthtique de base
ature des constituants
!"les des constituants
2.2. #rum de $eau f%tal
Constituants et r"les
A$antages et incon$nients du #&'
2.(. Milieu dfini )ou milieu synthtique*
ature des constituants a+outs , un milieu de base riche
A$antages et incon$nients des milieu- dfinis
3. Environnement physico-chimique
(.1. Les diffrents facteurs , considrer . o-yg/ne0 tem1rature0 12 et osmolarit
(.2. La rgulation du 12
Les deu- syst/mes utiliss . le cou1le )a2C3(
-
0 C32* et l425P5#
L4indicateur color
. !e repiqua"e ou passa"e des cellules adhrentes
#. !a culture $ "rande chelle des cellules animales
%. !es applications de la culture in vitro des cellules animales
1. Dfinitions
Primoculture ou culture primaire & culture drivant de cellules directement prleves sur
un or"anisme.
6ne 1rimoculture 1eut 7tre considre comme telle +usqu4, son 1remier re1iquage. Les cellules
1eu$ent dans certains cas se di$iser0 mais 1our de nombreu- ty1es cellulaires0 il s4agira seulement
d4un maintien en sur$ie.
Culture secondaire 8 culture obtenue 1ar re1iquage , 1artir d4une culture 1rimaire )ou d4une
autre culture secondaire*.
!i"ne cellulaire & 6ne ligne cellulaire est une population homo"'ne de cellules0 sta(les
apr's des mitoses successives0 et ayant en thorie une capacit illimite de division )entretien
in $itro 1ar re1iquages successifs*. 9l s:agit en "nral de cellules cancreuses) cellules 1rle$es
sur une tumeur au d1art0 ou cellules rendues immortelles )transformation 8 cancrisation* 1ar
traitement mutag/ne chimique ou 1hysique ou 1ar utilisation de $irus oncog/nes.
- prleves chez un patient (comme les cellules HeLa),
- transformes artificiellement par un virus oncogne (c..d. un gne immortalisant tel que T de !"#)
- mutes pour des gnes impliqus dans la rgulation du c$cle cellulaire (comme par e%emple la protine
p&').
6ne ligne 1eut 7tre .
$ dure de vie limite . on obser$e une dgnrescence des cellules au bout d4un certain
nombre de re1iquages.
$ dure de vie illimite0 elle est alors a11ele li"ne continue.
*dhrence +
L4adhrence , un su11ort est indis1ensable , la 1rolifration de la 1lu1art des ty1es cellulaires
issus des mammif/res0 e-ce1tion faite des cellules circulantes et de certaines cellules
transformes.
;ans les tissus la nature des molcules im1liques dans l4adhrence sont .
;es protines mem(ranaires a11eles intgrines qui font le relais entre la matrice
e-tracellulaire et le cytosquelette )formation de 1oints focau- d4adhrence*.
Les composants de la matrice extracellulaire0 glycosaminoglycanes )acide hyaluronique*0
2
1rotoglycanes )aggrgan0 1erlcan0 syndcan <* et des 1rotines )collag/ne0 fibronectine0
laminine0 tnascine0 $itronectine <*.
(n vitro l4ancra"e des cellules est indispensa(le $ leur prolifration. Cet ancrage d1end des
facteurs d,attachement cits ci-dessus qui seront synthtiss 1ar les cellules et a11orts dans le
milieu de culture. 9l d1end galement de la nature du support utilis0 ils sont en gnral en
1lastique0 polystyr'ne) trait 1hysiquement 1our e-1oser des char"es n"atives.
Culture en monocouche
La culture en monocouche est la technique de base 1our la culture de cellules adhrentes. 5lle est
ralise sur 1lastique0 en rcipients prsentant une surface plane )flacon0 boite0 micro1laque ,
fond 1lat* et consiste en une culture statique )sans agitation*.
Les cellules se di$isent +usqu4, former un ta1is qui recou$re l4ensemble de la surface dis1onible0
ce stade est a11el confluence.
= . L4arri$e , confluence s,accompa"ne souvent d,un arr-t de la prolifration0 soit , cause de
signau- transmis 1ar les +onctions cellule-cellule qui 1roduisent une inhi(ition de contact0 soit 1arce que
la quantit de milieu prsente ne peut plus su(venir aux (esoins de la population cellulaire en
augmentation. ;ans un flacon 1lat offrant une surface de 2# cm
2
les cellules sont recou$ertes de # m! de
milieu de culture.
Passa"e & repiqua"e & su(culture
Lorsque le ta1is de culture )ou monocouche* arri$e , confluence il faut dcoller les cellules du
su11ort0 les dis1erser et les rensemencer , une densit 1lus faible dans un nou$eau rci1ient de
culture. Cette o1ration est a11ele re1iquage. La dis1ersion des cellules 1eut 7tre ralise 1ar
grattage du ta1is0 ou 1lus classiquement 1ar utilisation d4un mlange de try1sine et d45;TA )dans
ce dernier cas on 1arle de try1sination*.
.ransformation cellulaire
Acquisition de l4immortalit )tr/s diffrent de la transformation en gnie gntique*. 5lle 1eut 7tre
s1ontane )a11arition de $ariants immortels suite , des mutations* ou 1ro$oque 1ar l4em1loi de
mutag/nes chimiques ou 1hysiques )radiations* ou de $irus oncog/nes. Les cellules cancreuses
sont des cellules transformes.
2. Composition des milieux de culture
Les milieu- de culture doivent reproduire aussi fid'lement que 1ossible les conditions de
l4en$ironnement que les cellules trou$aient in vivo.
9ls doi$ent donc 7tre , la fois .
- $ecteur d4lments nutritifs0
- contribuer au maintien des conditions 1hysico-chimiques telles que 12 et osmolarit
- et 1ermettre la 1rolifration des cellules )di$isions cellulaires*.
6n milieu de culture 1eut consister .
- en l4association d4un milieu synthtique de base > srum )le 1lus 1erformant tant le srum de
$eau f%tal* ?
- ou un milieu de culture 1eut-7tre un milieu dfini 8 milieu synthtique sans srum.
2.1. /ilieux synthtiques de (ase
Les milieux de (ase sont tous synthtiques0 de composition plus ou moins complexe0 ils 1ortent
gnralement le nom du chercheur qui les a mis au 1oint . Ea"le) Par0er) 1am) Dul(ecco) 2race) 3
3n les dsigne galement 1ar l4a11ellation M5M 8 /ilieu Essentiel /inimum
Ces milieu- sont dits de (ase car ils assurent seulement la survie des cellules in vitro.
La prolifration et l4expression des diffrentes fonctions cellulaires en culture ncessitent
l,addition d,une certaine concentration de srum au milieu synthtique de base.
(
Milieu synthtique de base . nature des constituants
4els minraux + @ ions sont indis1ensables a
>
0 A
>
0 P3
B
-
0 Mg
2>
0 Ca
2>
0 Cl
-
0 C3
(
2-
(car)onate).
Certains milieu- contiennent aussi des mtau- , l4tat de traces comme le fer0 le cui$re0 le cobalt0
le slnium.
*cides amins +
a.a. essentiels . C cheD l4homme )9leu0 Leu0 Lys0 Meth0 Ph0 Thro0 Tr10 &al*.
autres a.a. dont la capacit de synth'se a t perdue lors du passa"e in vitro . au moins
cinq autres Eln0Tyr0 Cys0 Arg et 2is.
= . Cas 1articulier de la "lutamine )Eln* qui est indis1ensable 1our quasiment toutes les
cellules de mammif/res en culture . cet acide amin n4est 1as stable en solution m7me , BFC0 il
faut donc le ra+outer au milieu lors d4une longue conser$ation du stocG )il e-iste formule milieu
sans Eln note HIo Eln0 il faudra donc a+outer la Eln , chaque utilisation*. La Eln sert de
prcurseur pour la synth'se des purines) des pyrimidines0 des sucres amins et de quelques
acides amins. 6ne carence en glutamine 1eut conduire , un arr7t de la croissance cellulaire dJ ,
une inhibition de la synth/se de l4A;
5itamines + Les besoins sont $ariables sui$ant les ty1es cellulaires. #elon 5agle0 C $itamines
sont indis1ensables . choline) acide folique) thiamine) pyridoxal) ri(oflavine) acide
nicotinique) inositol) acide panthotnique.
2lucose + la substance nergtique fondamentale est gnralement le glucose , la concentration
de 1 gIL0 concentration semblable , celle du srum humain*. Le glucose est quelquefois
substitu 1ar d4autres oses tels que le "alactose) le mannose ou le fructose. ;ans les milieu-
riches on 1eut trou$er des acides ctoniques tels que l: cto"lutarate ou le pyruvate.
6ou"e de phnol + indicateur color dont la Done de $irage est situe au- 12 de @02-@0K.
4yst'me tampon) on a deux possi(ilits +
utilisation du couple 7(icar(onate de sodium) dioxyde de car(one80 a2C3
(
a11ort
dans le milieu et C3
2
), L M* dans l4atmos1h/re de l4tu$e.
utilisation d4une molcule or"anique tampon dans le milieu0 l41EPE4.
Milieu synthtique de base . r"les des constituants
4els minraux
#er$ent de cofacteurs d4enDymes0 +ouent un r"le dans la 1ression osmotique0 le 1otentiel de
membrane0 les communications )second messager Ca
>>
*0 les trans1orts )ion cotrans1ort a
>
1ar
e-em1le*0 la rgulation du 120 attachement des cellules )notamment le Ca
>>
*0 entrent dans la
constitution de certaines molcules )grou1ement 1rosthtique0 1hos1hate ou autres*0 <
*cides amins
#ous-units constituti$es des 1rotines.
5itamines
Cofacteurs d4enDymes ou 1rcurseurs 1our la synth/se de molcules.
2lucose
#ource d4nergie )catabolisme nergtique* et source de carbone )anabolisme*.
6ou"e de phnol
Permet de $isualiser les $ariations du 120 ada1t car Done de $irage situe , la $aleur du 12 ,
rguler.
4yst'me tampon
Permet la rgulation du 12 . rgulation obligatoire 1our les cellules de mammif/res notamment
qui sont issues d4un organisme oN r/gne l4homostasie.
*+ , L-homostasie est la capacit que peut avoir un s$stme quelconque conserver son quili)re de
fonctionnement en dpit des contraintes qui lui sont e%trieures.
B
2.2. 4rum
Mises en culture en 1rsence d:un milieu synthtique de base tel que nous $enons de le dcrire0 la 1lu1art
des cellules ne sont gnralement a1tes qu:, la sur$ie. !e dclenchement de la division cellulaire n9est
possi(le qu9en prsence d9un certain nom(re de facteurs mito"'nes) le plus souvent fournis par le
srum.
Le 1ourcentage de srum additionn au milieu de base $arie) selon le ty1e cellulaire0 de 2 $ 2: ;) le plus
souvent de l,ordre de # $ 1: ;.
3n 1eut utiliser des srums d:origine humaine ou animale0 d:indi$idus +eunes0 sachant que l:effet
cytostimulant "lo(al du srum est inversement proportionnel $ l9<"e du donneur.
Les 1lus frquemment retrou$s sont . le srum de $eau0 le srum de $eau nou$eau-n0 le srum de $eau
f%tal )#&'*0 ce dernier ayant les meilleures 1erformances. 9l e-iste actuellement des mlanges 1ermettant
de rem1lacer le #&'0 on 1eut citer aussi le liquide amniotique enrichi en certains constituants.
Le srum est un mlan"e de composition extr-mement complexe qui contient0 entre autres0 un grand
nombre de substances libres 1ar toutes sortes de ty1es cellulaires de l:organisme donneur.
#rum de $eau f%tal . constituants et r"les
La nature de certains de ses constituants sera $oque ultrieurement dans le 1aragra1he sur les milieu-
dfinis.
=acteurs de croissance et des hormones +
- 'acteurs de croissance 8 1e1tides im1liqus dans le contr"le du cycle cellulaire )messagers
chimiques*0 ils ont un effet mitog/ne et 1ermettent la 1rolifration cellulaire.
- 2ormones 8 messagers ncessaires , la mise en 1lace de certaines fonctions cellulaires
=acteurs d9attachement +
glyco1rotines qui fa$orisent l:adhrence des cellules )c:est im1ortant surtout en dbut de culture
car les cellules sont 1eu nombreuses et conditionnent mal le milieu de culture*.
Elments qui assurent une protection des cellules +
ils augmentent la $iabilit.
Proprit nutritive +
!iche en nombreu- oligolments.
A$antages et incon$nient de l4utilisation du srum de $eau f%tal
La 1rsence de srum 1eut 7tre0 toutefois0 un facteur limitant. 5n effet .
>.?!?4*.?@A D> 4E6>/ DE 5E*> =@E.*!
*vanta"es ?nconvnients
O A11ort facteurs de croissance 1ermettant la
1rolifration cellulaire
O A11ort d4hormones
O A11ort de facteurs d4attachement contribuant , la
bonne adhrence indis1ensable , la di$ision cellulaire
O !"le 1rotecteur . augmente la $iabilit cellulaire et la
stabilit des 1roduits cellulaires
O Pro1rits nutriti$es )nombreu- mtabolites0 ions0
oligolments et li1ides en solution*
O Pou$oir tam1on
OA11ort de 1rotines de trans1ort )trans1ortent des
substances de faible 1oids molculaire0 fer et acides
gras 1ar e-em1le*
O Pou$oir dto-ifiant . absorbe et neutralise les to-ines
O Com1osition non dfinie
O &ariabilit de lot , lot
O Probl/mes d4innocuit . il s4agit d4un 1roduit
biologique qui m7me 1rle$ strilement et strilis 1ar
filtration 1eut renfermer des $irus0 des to-ines0 des
1rions0 des myco1lasmes
O Teneur le$e en 1rotines donc 1robl/me
d4interfrences lors de la 1urification des 1rotines
d4intr7t synthtises 1ar les cellules )e- . 1rotines
recombinantes0 1rotines a$ec a11lication
thra1eutique*
O A11ro$isionnement $ariable donc $ariabilit des 1ri-
O 'a$orise 1rfrentiellement la croissance des
fibroblastes dans des cultures 1rimaires )1ar ra11ort au-
autres ty1es de cellules*
*+ , Le srum sem)le .ouer un r/le dans la ddiffrenciation cellulaire, lors de la culture long terme.
L
*+ , Le srum prsente lavantage d'apporter des inhibiteurs de protases, l-01macroglo)uline et
l-21antitr$psine, qui inactivent la trypsine que l'on utilise en routine pour le repiquage des cultures.
2.3. /ilieux dfinis ou milieux synthtiques sans srum
;e$ant la faible re1roductibilit de certains rsultats0 les chercheurs ont $olu $ers la mise au 1oint de
milieu- d1our$us de srum0 enrichis en facteurs rigoureusement contr"ls. Ces milieu- sont a11els
milieu- dfinis.
;iffrents constituants dfinis sont additionns $ des concentrations dfinies $ un milieu
synthtique de (ase riche )ty1e 2AM '12 ou MC;= 1PB*. L:addition de ces substances $arie en
fonction des e-igences du ty1e cellulaire culti$.
ature des constituants a+outs , un milieu de base riche
O 1ormones .
- 9nsuline .
)6tilise , la concentration de L , 1P QgImL*. C4est une substance im1ortante 1our certaines lignes
cellulaires. Ce1endant elle n4est pas tr's sta(le dans les milieux sans srum0 c4est 1ourquoi on 1eut
admettre que 1our beaucou1 de cellules elle ne Boue un rCle important qu,en d(ut de culture.
5lle serait inutile lorsque les cellules sont en pleine croissance. L4insuline peut -tre remplace par
l,?2= )(nsuline1li3e 4ro5th 6actor*.
- 2ydrocortisone
- Progestrone
- 3estradiol
- 2ormone de croissance
- #omatomdine
- 2ormone 1arathyroRde
O =acteurs de croissance .
Les facteurs de croissance se classent 1lut"t comme tant des substances 1aracrines ou autocrines0
a11els de faSon 1lus gnrale0 mdiateurs chimiques locau-. Leur action sur les cellules est
dclenche 1ar la formation d:un com1le-e s1cifique a$ec un rce1teur et il en rsulte alors soit une
augmentation de la taille de la cellule0 soit une augmentation de la 1o1ulation cellulaire0 soit une
induction ou un blocage d:une ta1e de diffrenciation.
Les facteurs de croissance sont des polypeptides dont la ma+orit d:entre eu- sont actuellement
produits par recom(inaison et donc dis1onibles en quantit suffisante. Toutefois0 un milieu sans
srum et contenant ces facteurs devient tr's onreux. 6n te milieu n4est utilisa(le que 1our la
recherche0 mais rarement pour la production.
- 5E' (7pidermal 4ro5th 6actor)
- 'E' (6i)ro)last 4ro5th 6actor)
- E' (*erve 4ro5th 6actor)
- P;E' (8lateled19erivated 4ro5th 6actor : facteurs de croissance des cellules endothliales
d;origine plaquettaire)
- TE' (Transforming 4ro5th 6actor)
- ;iffrents interfrons
- ;iffrentes interleuGines

O =acteurs d9attachement .
Les su11orts ta1isss )T coats U* a$ec un substrat 1rotique constituent des surfaces de choi-
1our la culture des cellules dont l4adhsion est difficile. 9ls fa$orisent aussi la diffrenciation des
cellules culti$es. Certains facteurs d4attachement 1eu$ent aussi 7tre introduits en solution dans le
milieu de culture.
K
- Poly-L-lysine . c4est une molcule synthtique 1rsentant de nombreuses charges 1ositi$es. La
1oly-lysine am1lifie l:interaction lectrostatique entre les ions ngatifs de la membrane cellulaire et
les ions 1ositifs de la surface cellulaire 1rsents dans les facteurs de fi-ation de la surface de la
culture. 6ne fois adsor(e en surface des cellules) elle au"mente le nom(re de sites char"s
positivement disponi(les pour la fixation des cellules au support plastique char"
n"ativement.
- Collag/ne . glyco1rotine fibreuse dont le r"le 1eut 7tre com1ar , une armature. C4est une 1rotine
structurale0 les molcules de collag/ne +ouent le r"le de cVble entre les cellules de notre cor1s et c4est
la 1rotine la 1lus abondante de l4organisme )notion de T colle U*. 9l est secrt 1ar les cellules des
tissus con+onctifs.
- 'ibronectine . glyco1rotine qui contribue , l4organisation de la matrice e-tracellulaire et ,
l4adhsion cellulaire. 9n $i$o c4est une molcule-cl 1our l4adhrence des cellules , la matrice
e-tracellulaire )les rce1teurs de la fibronectine sont notamment les intgrines*. La fi)ronectine est
galement un facteur limitant la prolifration tumorale. Les cellules mtastatiques n;ont pas de
fi)ronectine qui se lient leur mem)rane.
- Laminines . famille de glyco1rotines qui forment le constituant ma+eur de la lame basale0 en
dehors du collag/ne. La lame )asale est un assem)lage de protines et gl$coprotines
e%tracellulaires sur lequel reposent les cellules pithliales. 7lle permet l-adhrence de la cellule
pithliale au tissu con.onctif sous1.acent. Les molcules constitutives de la lame )asale sont
scrtes par les cellules pithliales.
- Elatine . 5lle est obtenue 1ar l:bullition 1rolonge de la 1eau animale0 des os et des tissus
con+onctifs. 5lle est constitue , en$iron WC-WW M )en 1oids , sec* de 1rotines. 5lle est utilise
comme agent collant.
O Protines de transport .
- Albumine srique bo$ine )=#A ou <+ en anglais*
L4albumine 1eut 7tre utilise , une concentration ma-imale de LgIL )sou$ent P01-1 gIL*. 5lle rem1lit
diffrentes fonctions dont celle d47tre le transporteur de su(stances lipophiles )acides gras0
lments de trace0 hormones et $itamines li1osolubles*0 mais aussi de 1ermettre la dtoxification du
milieu )trans1ort de 2
2
3
2
0 fi-ation de to-ines*.
!,al(umine peut -tre remplace par le PE2-2PPPP0 la Pluronic 'KC ou le .DEEA CL0 qui
1eu$ent aussi prot"er les cellules contre les effets du cisaillement. Le de-trane et les
cyclode-trines 1eu$ent rem1lacer l4albumine 1our leur 1otentiel d4absor1tion des li1ides0 ce qui
1ermet d4a11ro$isionner les cellules en ces substances.
- Transferrine
5lle est utilise en concentration de 1 , 1PP mgIL. #on premier rCle est de transporter le fer )d4oN
son nom*0 mais elle permet "alement de dtoxifier d,autres mtaux. La transferrine peut -tre
remplace par du fer )'e
>>
ou 'e
>>>
*0 complex par le citrate0 la glycylglycine ou d4autres acides
organiques.
O *ntioxydants .
Le r"le des antio-ydants est tr/s important lors de cultures menes en milieu sans srum. 9ls
doivent inactiver les peroxydes "nrs au cours de la croissance) une fonction normalement
assure par le srum.
3n utilise du -mercaptothanol )en$iron 1PQM*0 du Aa
2
4e@
3
)1P-KP nM ? le e est essentiel pour
l;activit de la glutathion pero%$dase*0 du "lutathion0 les vitamines E et C0 du pyruvate0 etc.
O 4u(stances lipidiques .
Les substances li1idiques sont essentielles 1our les cellules car elles contiennent les prcurseurs de
la synth'se des prosta"landines0 ncessaires 1our certaines cellules 1articuli/res0 et sont
incorpores apr's d,ventuelles modifications dans les mem(ranes cellulaires.
L4thanolamine )1P-2P QM* est requise dans la formulation de la 1lu1art des milieu-0 l;inositol ne
l;tant que dans quelques cas seulement.
9l e-iste une lon"ue liste d,acides "ras) plus ou moins saturs0 qui sont essentiels 1our certaines
lignes cellulaires0 1ar e-em1le0 acide lipoEque) acide linolique.
@
;e 1lus0 selon les cellules0 il est ncessaire d4a+outer des hormones) comme les drivs du
cholestrol) l,hydrocortisone ou des analo"ues plus sta(les 7la dexamthasone8) etc. Par
dfinition ces substances sont li1o1hiles0 sauf l4thanolamine et l4inositol.
Classiquement0 elles sont a+outes a1r/s formation de com1le-es a$ec la =#A0 mais 1lus rcemment
aussi a$ec la de-trane ou les dri$s de de-trine.
O =acteurs divers .
- Mtau- , l4tat de trace . L:im1ortance de ces minrau- ne cesse de grandir0 en 1articulier dans la
culture en milieu dfini. Citons 1ar e-em1le le slnium0 com1osant de l:enDyme glutathion-
1ero-ydase ? cette enDyme inter$ient dans la dgradation des 1ero-ydes to-iques mtaboliss 1ar la
cellule au cours de la culture.
- Putrescine . La 1utrescine )10B-diaminobutane* est le 1roduit de la dcarbo-ylation de l:ornithine
1ar l:ornithine dcarbo-ylase. C:est une diamine. Les 1olyamines a+outes au- cellules en culture
induisent la synth/se d4une 1rotine qui inhibe l4ornithine dcarbo-ylase. L:ornithine )acide 20L-
diamino1entanoRque* est un acide amin. Cet acide amin n:est 1as cod 1ar le code gntique. X ce
titre0 il n:entre 1as dans la com1osition des 1rotines. C:est l:un des 1roduits de l:action de l:arginase
dihydrolase sur la L-arginine 1our former l:ure.
- Acide ascorbique )8 $itamine C* . la $itamine C +oue un r"le im1ortant dans le maintien du
1otentiel d4o-ydo-rduction0 mais ses diffrentes fonctions sont difficiles , $aluer car elle s4o-yde
ra1idement dans les milieu- de culture et sa demi-$ie est tr/s br/$e. La vitamine +20 et la vitamine 7
(tocophrol) sont rarement prsentes.
- Prcurseurs des acides nucliques comme la thymine0 l4uridine0 adnosine. Les a$is sont 1artags
quant , la relle utilit de ces molcules car les cellules semblent ca1ables de synthtiser ces
1rcurseurs d4acides nucliques , 1artir de $itamines comme l4acide folique.
O 4u(stances non dfinies .
Les substances non dfinies0 comme les peptones0 la Primatone !L0 etc.0 sont utilises sous forme
dialyse ou non dyalise pour amliorer les milieux avec ou sans srum. 5lles apportent des acides
amins) des acides "ras) des sels) des oli"opeptides) etc. L4a$antage est qu4un milieu sans srum
contenant ces substances 1eut 7tre 1lus facilement utilis qu4un milieu sans ces a+outs. L4incon$nient
est qu4un milieu amlior par ces su(stances n,est plus dfini.
A$antages et incon$nients des milieu- dfinis
Les a$antages du milieu dfini sont $idents .
- la croissance cellulaire et la 1roducti$it sont o1timises0
- la re1roductibilit est garantie0
- 1arfois0 le 1ri- du milieu 1eut m7me 7tre rduit )si 1as tro1 d4addition de facteurs de
croissance*.
La "rande difficult rside dans la ncessit de dvelopper et d,optimiser les milieux sans srum)
pour les diffrents types de cellules utiliss) en effet leur emploi est ddi.
;e 1lus0 ces milieu- doi$ent 7tre o1timiss non seulement 1our la ligne cellulaire0 mais aussi pour les
conditions de culture. 5n effet0 les cellules sont gnralement moins e-igeantes dans les syst/mes de
culture , haute densit cellulaire0 un 1hnom/ne qui refl/te la 1roduction autocrine de facteurs de
croissance0 alors qu4, basse densit0 ces facteurs sont tro1 dilus.
>.?!?4*.?@A DE4 /?!?E>F 4*A4 4E6>/ & /?!?E>F DE=?A?4
*vanta"es ?nconvnients
O Yualit constante
O 5n$ironnement cellulaire dfini
O #atisfaction o1timale des crit/res d4innocuit
O #im1lification des ta1es de 1urification de
1rotines 1roduites 1ar la culture cellulaire
O A11ro$isionnement constant
O 5m1loi 1ou$ant ncessiter une ada1tation des cellules
O 5m1loi sou$ent limit quant au- ty1es cellulaires et au-
a11lications
O Moins bonne $iabilit cellulaire , densit le$e
O Moins bonne 1rotection des cellules et des 1roduits
O Pas ncessairement moins chers que les milieu-
su11lments en srum de $eau f%tal
C
3. Environnement physico-chimique
3.1. !es diffrents facteurs $ considrer + oxy"'ne) temprature) p1 et osmolarit
@xy"'ne . Les cellules animales sont aro(ies strictes0 l4a11ort d4o-yg/ne est donc indis1ensable.
9l est 1rsent dans l4air atmos1hrique 1our les cultures statiques 1laces en tu$e ou a11ort 1ar in+ection
d4air 1our les cultures conduites en bioracteur.
= . 5n culture monocouche en flacon 1lat0 culture statique0 a11ort o-yg/ne 1ar air ambiant et on doit .
- d$isser le bouchon des flacons
- la hauteur de milieu au dessus du ta1is ne doit 1as 7tre le$e 1our que le transfert de
l4o-yg/ne au- cellules se fasse correctement en effet 3
2
se dissout 1eu dans l4eau )cette faible
hauteur conditionne le $olume de milieu utilisable dans un flacon de culture*.
.emprature . Les cellules doi$ent 7tre 1laces , la tem1rature qui corres1ond , celle de l4organisme
dont elles sont issues. La r"ulation de la temprature est o(li"atoire )enceinte thermostate ou
bioracteur qui1 d4un syst/me de rgulation de la tem1rature*.
p1 . Les cellules doi$ent 7tre 1laces au 12 qui corres1ond , celle de l4organisme dont elles sont issues.
La r"ulation du p1 est o(li"atoire 1our les cellules de mammif/res. 5lle 1eut 7tre assure 1ar deu-
syst/mes .
soit a11ort d4une molcule tam1on dans le milieu de culture ?
soit a11ort de bicarbonate de sodium dans le milieu et a11ort de C3
2
gaDeu- dans
l4atmos1h/re de l4tu$e ou 1ar in+ection dans un bioracteur.
@smolarit . Afin de 1r$enir l4au"mentation de l,osmolarit du milieu due $ l,vaporation0
l4atmos1h/re de l4incubateur doit 7tre sature en $a1eur d4eau0 1our cela on T inonde U le 1lancher de
l4tu$e. 5n effet en culture monocouche0 l41aisseur du milieu est faible et l4$a1oration , (@FC n4est 1as
ngligeable.
3.2. !a r"ulation du p1
!es deux syst'mes utiliss + le couple 7Aa1C@
3
-
) C@
2
8 et l,1EPE4
9nter$ention du cou1le )2C3
(
-
IC3
2
* dans la rgulation du 12
;ans le syst/me tam1on )2C3
(
-
IC3
2
* le (icar(onate de sodium est en solution dans le milieu de culture et il est
en quilibre a$ec un pourcenta"e de # ; en C@
2
dans l9atmosph're am(iante de culture. #on utilisation
im1lique de dis1oser d4une tuve $ C@
2
.
Le pGa de ce syst/me tam1on est de %)3.
Le fonctionnement de ce syst/me tam1on est illustr ci-dessous .
Au- 12 situs au- alentours de @ 1endant la culture0 l4quilibre chimique entre les formes acide et basique du
cou1le rgulateur du 12 est le sui$ant . C3
2
> 22
2
3
2
C
3
> 2
2
3 2C3
(
-
> 2
(
3
>

L4acide carbonique
2
C
3
est un 1roduit tr/s instable donc on 1eut 1ro1oser l4quation sim1lifie sui$ante .
C@
2
H 1
2
@ 1C@
3
-
H 1
H
.
- Le mtabolisme cellulaire )res1iration donc dgagement de C3
2
* entraZne une acidification du milieu selon
cette quation0
- si on su11lmente le milieu en bicarbonate de sodium a2C3
(
)c:est-,-dire 2C3
(
[
* on d1lace l:quilibre
et on limite l:acidification0
- il faut aussi $oquer le fait qu4, (@FC l:ion 2C3
(
-
est $olatil et que sa dsor1tion entraZne une basification
du milieu selon la m7me quation0
- ;ans cette situation0 le bicarbonate s41uiserait dans le milieu0 il faut donc le rgnrer et c4est le r"le de
l4a11ort du C3
2
. Tou+ours selon la m7me quation chimique0 le C3
2
a11ort 1eut 7tre con$erti en ion
bicarbonate 2C3
(
-
. L4enrichissement en C3
2
, L M dans l4atmos1h/re de l4tu$e 1ermet donc de
maintenir le tam1on carbonate.
9nter$ention de l425P5# dans la rgulation du 12
W
9l s4agit d4une molcule organique tam1on 1ossdant un grou1ement fonctionnel ca1able de ca1ter ou de
librer un 1roton.
acide\)hydro-ythyl-2*-B-1i1raDinyl-1*-2-thane
sulfonique
C
C
2
1C

2
3
B
#0 free acid ? MM 8 2(C0(
C
C
2
1C

2
3
B
#a sodium salt
Le pGa de l425P5# est de I)##.
Com1araison des deu- syst/mes tam1on utilisables
!e couple Aa1C@3 J C@2
)bicarbonate dans le milieu et gaD carbonique atmos1hrique , L
M*
!a molcule or"anique tampon 1EPE4
)en solution dans le milieu de culture*
Equipement cessite un qui1ement 1articulier 8 tu$e , C32 Pas d4qui1ement 1articulier
Efficacit 1Aa 8 K0(
il est loign de la $aleur du 12 , rguler )12 ]@*
moins bon 1ou$oir tam1on
1Aa 8 @0(
il est 1roche de la $aleur du 12 , rguler )12 ]@*
bon 1ou$oir tam1on
6isque de toxicit Pas de to-icit cellulaire To-icit $entuelle , l4gard de certaines cellules
!,indicateur color + rou"e de phnol
O L4indicateur color r$/le , tout moment l:ordre de la $aleur du 12 de la sus1ension et 1ar l, m7me0
grossi/rement0 l:tat de la culture.
O Le rouge de 1hnol est un (on indicateur color 1our sui$re l:$olution du 12 au cours de la culture
car0 a$ec un 1Aa de @02-@0K0 sa Kone de vira"e se situe Buste $ la valeur du p1 que l9on veut maintenir.
Le rouge de 1hnol0 qui vire du violet au Baune des p1 alcalins aux p1 acides0 , 12 @ il conf/re une
coloration rou"e oran" aux milieux de culture.
O 6n milieu correctement r"ul de$ra 1rsenter une coloration rou"e-oran"e.
6ne coloration rou"e violace est le signe d:un 12 tro1 basique. C4est le signe d4une mortalit
cellulaire0 les cellules lyses lib/rent des 1rotines qui alcalinisent le milieu.
6ne coloration Baune celui d:une acidification im1ortante. Cette acidification s:obser$e lorsque
le nom(re de cellules devient trop important0 elle est due , la dissolution du gaD carbonique
1roduit lors de la res1iration des cellules.
6n milieu +aunissant im1lique un repiqua"e o(li"atoire des cellules.
#i l9acidification du milieu s9accompa"ne d9une opacification c:est alors le signe d:une
contamination (actrienne.
. !e repiqua"e ou passa"e
.1. Passa"e par trypsination
La trypsine est une protase )5C (.B.21.B* qui catalyse le cli$age de la liaison 1e1tidique entre
un acide amin basique )lysine ou arginine* et un acide amin de radical indiffrent. 5lle est
gnralement isole du 1ancras )bo$in ou 1orcin*. La try1sine ne requiert 1as la 1rsence d:ions
s1cifiques ou de cofacteurs. 5lle sera donc utilisable en solution saline.
5lle 1ermet d4hydrolyser les 1rotines im1liques dans l4adhrence cellulaire et 1ro$oque ainsi le
dtachement des cellules du su11ort. #on tem1s d4action doit 7tre limit 1our ne 1as risquer
d4altrer les membranes cellulaires.
La try1sine est prpare dans une solution d,ED.* qui est un chlateur d4ions di$alents. 5n
effet0 les ions Ca
>>
et Mg
>>
sont im1liqus dans l4adhrence. Leur chlation contribue donc aussi
au dtachement des cellules.
1P
Le dtachement des cellules est suivi au microscope invers et se traduit 1ar un changement de
mor1hologie des cellules qui de$iennent s1hriques. Les cellules ne sont 1lus immobilises et cela
se traduit 1ar un 1assage en sus1ension transitoire des cellules.
L4action de la trypsine est arr-te 1ar dilution avec du milieu neuf et 1ar l,intervention
d,inhi(iteurs contenus dans le srum de veau fLtal )2macroglobuline et 1antitry1sine*0
l-inhi)iteur isol du germe de so.a est aussi trs utilis.
6epiqua"e par trypsination + ?l existe deux protocoles d,utilisation de la trypsine
1. 5limination du milieu

2. La$age $entuel du ta1is a$ec une solution saline

)a+out de la solution 1uis limination*

(. Addition de la try1sine

B. 3n laisse la try1sine . B. 3n enl/$e l4e-c/s de try1sine .
Les cellules 1assent en sus1ension dans la try1sine. le ta1is est +uste imbib de try1sine.
(agitation lgre du flacon sur la platine du microscope , (on tapote le flacon ,
les cellules = nagent >) les cellules = glissent > sur le support)

L. Addition de milieu neuf . L. Addition de milieu neuf .
dilution de la sus1ension et homognisation. mise en sus1ension des cellules et
homognisation.
.2. >tilisation de racloir
Les racloirs sont conditionns indi$iduellement sous emballage strile.
Leur utilisation est simple et rapide.
Toutefois0 la via(ilit cellulaire est moins (ien prserve qu4a$ec la try1sine bien gre.
La formation d4amas cellulaires 1eut 7tre res1onsable d4une htro"nit des cultures su(squentes.
L4utilisation du racloir est 1lut"t rser$e , la rcu1ration de cellules qui $ont 7tre lyses 1our des tudes
ultrieures et donc non remises en culture.
#. !a culture $ "rande chelle des cellules animales
? !oir images .ointes
M Scaling-up solutions N
'lacon 1lat , tages
cellules adhrentes
=outeille (= roller U*
'lacon cylindrique a$ec
agitation magntique
(=spinner>)
cellules en sus1ension
=ioracteur
fibres creuses
cellules adhrentes
microsu11orts
classique cellules en sus1ension
%. *pplications de la culture des cellules animales
11
@(tention de matriel (iolo"ique cellulaire pour des tudes en recherche fondamentale

6emplacement des or"anismes animaux pour limiter l,exprimentation animale
5tudes 1hysiologiques )recherche fondamentale ou a11lique*
Test de cytoto-icit en 1harmacologie ou cosmtologie 1ar e-em1le
Production de mta(olites divers
)hormones0 interfrons0 interleuGines0 facteurs de croissance0 anticor1s monoclonau- <*
Culture de tissus ou d,or"anes
5tudes 1hysiologiques )recherche fondamentale ou a11lique*
Chirurgie r1aratrice )1eau0 muscle0 foie0 $aisseau- sanguins0 <. et 1eut-7tre un +our
neurones*
Production de vaccins viraux
6?4O>E P?@!@2?O>E +
!es mesures qui doivent -tre mises en Luvre pour le niveau de confinement 2
Conception du la(oratoire
- 1ictogramme
- laboratoire s1ar 1ar une 1orte
- acc/s rglement
*mna"ements internes
- P.#.M. )99* ?
- $7tement de 1rotection restant au laboratoire
- la$abos , commande non manuelle
- rsistance des surfaces , l4eau 1our les sols
- surfaces 1aillasse rsistante au- acides0 alcalis0 sol$ants et dsinfectants
- 1rsence d4un autocla$e , 1ro-imit
- centrifugeuse si tubes tanches
Pratiques opratoires
- utilisation de gants 1our tous les gestes , risque
- minimiser les arosols
- 1i1etage mcanique
- dcontamination quotidienne des 1aillasses
- inacti$ation du matriel contamin0 des dchets a$ant sortie
- stocGage des agents biologiques en lieu sJr
- utilisation de conteneurs s1cifiques 1our aiguilles0 ob+ets tranchants ou cou1ants souills