Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin
Ttulo del proyecto: Capacidad de biodegradacin y bioconversin por hongos
de podredumbre blanca a partir de desechos de la industria maderera en Colombia 1. Descriptores del Proyecto: 1.1. Planteamiento del problema de investigacin y Justificacin: La gran complejidad estructural en los componentes de los residuos vegetales como los son los residuos obtenidos por la industria maderera generan un gran problema de contaminacin ambiental debido a que estos residuos poseen un largo tiempo de biodegradacin y esto causa la generacin de zonas para el desecho de estos residuos de compleja degradacin. En Colombia se produce millones de toneladas de residuos de madera cada ao (Apro !.!" m # $% y para el tratamiento de estos residuos% se utilizan vertederos% incineracin y el reciclaje. En el caso de los residuos de madera que han sido incinerado reducir&an en gran medida el volumen de residuos y de llenado% ayudando de esta manera a el problema de la escasez de tierras' mas sin embargo la incineracin de los residuos de madera generan emisiones atmos()ricas nocivas tales como los idos de azu(re y nitrgeno (*uisheng et al% "!+,$. Este proyecto de investigacin se llevara a cabo con el (in de disminuir los residuos madereros generados en Colombia a trav)s de la biodegradacin y bioconversin por hongos de podredumbre blanca% ya que estos poseen una actividad enzim-tica que componen una nueva opcin para la degradacin de estos residuos en menor tiempo y de una manera amigable con la naturaleza% desarrollando de este modo aplicaciones que contribuyan al saneamiento ambiental por la eliminacin de estos residuos% y a su vez% evitar otros procesos que suelen generar graves problemas ambientales. 1 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin 1.2 Marco Terico y stado del !rte:
La madera es una opcin valiosa para la industria debido a que es un compuesto org-nico biodegradable con caracter&sticas como la (leibilidad% baja densidad% (acilidad de trabajo% dureza y la mala conductividad para el calor y la electricidad% la dureza de la madera se determina por la composicin de la lignina la cual es un componente estructural de la pared celular de las plantas compuesto por monmeros derivados de tres alcoholes arom-ticos (cumar&lico% coni(eril y sinap&lico$. La madera se clasi(ica en tres grupos los cuales son. maderas blandas las cuales poseen una mayor concentracin de alcohol cumar&lico% maderas duras las cuales contienen alcohol cumar&lico y sinap&lico en cantidades similares y (inalmente las maderas de c)sped las cuales poseen las tres subunidades en cantidades variables. En Colombia la super(icie total re(orestada se estim cerca de las /!!.!!! hect-reas% dentro de las cuales "!!.!!! son re(orestadas con (ines industriales% los departamentos que encabezan la actividad industrial maderera son Antioquia% 0alle% Cundinamarca% Cauca y 1oyac-. Colombia se considera un eportador neto de madera y de muebles de este mismo material para uso de hogar u industrial. (2ontealegre "!!3$. La gran complejidad estructural en los componentes de los residuos vegetales como los son los residuos obtenidos por la industria maderera generan un gran problema de contaminacin ambiental debido a que estos residuos se poseen un largo tiempo de biodegradacin y esto causa la generacin de zonas para el desecho de estos residuos de compleja degradacin% por otro lado la actividad enzim-tica presentada por algunos hongos denominados de podredumbre blanca componen una nueva opcin para la degradacin de estos residuos en una (orma amigable con la naturaleza y de menor tiempo en la cual se generan productos de 2 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin inter)s industrial como lo son alcoholes% -cidos y di(erentes tipos de metabolitos de inter)s. (Aguilar et al "!+#$. 1iodegradacin y bioconversin es un deterioro natural o proceso de degradacin en el que las comunidades microbianas romper o alterar la estructura de los constituyentes de desechos de la industria maderera como sustancias org-nicas e inorg-nicas (2annan et al% "!!/$. En el caso de los hongos degradadores de madera% juegan un papel importante en los ciclos del carbono y del nitrgeno% desarrollando la bioconversin de la materia org-nica. En base a sus patrones de desintegracin% es posible establecer tres tipos principales de hongos. hongos de pudricin blanda% marrn y blanca% los cuales han sido utilizados para aplicaciones industriales (4ses% "!!5$. La degradacin (6ngica se produce etracelularmente debido a la insolubilidad de lignina% celulosa y hemicelulosa. 7oseen dos tipos de sistemas enzim-ticos etracelulares% el sistema hidrol&tico% que genera hidrolasas% responsables de la degradacin de polisac-rido% y un sistema ligninol&tico oidativo etracelular% el cual degrada la lignina y abre anillos de (enilo (8anchez% "!!/$. Actualmente la mayor&a de los procesos para la degradacin de residuos vegetales dentro de los que se incluyen los desechos madereros son evaluados haciendo uso de la actividad enzim-tica de diversos microorganismos.
En cuanto al sustrato% la madera consiste principalmente de tres componentes mayoritarios. lignina% celulosa y hemicelulosa. La celulosa es un pol&mero de anh&drido glucosa con uniones +9,. Las hemicelulosas consisten de pol&meros similares de glucosa con otras uniones o pol&meros de monosac-ridos di(erentes a la glucosa. La lignina es un pol&mero complejo de unidades (enlicas. :e igual manera eisten otros compuestos que no (orman parte de la estructura de la pared vegetal% y la mayor&a son solubles en solventes neutros. (8anchez "!!;' 8midt et al "!!3$ 3 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin Los hongos de podredumbre blanca o lignoceluloliticos pertenecen a los grupos de 1asidiomicetos y Ascomicetos% quienes tienen la propiedad de crecer en la madera y juegan un papel esencial en el ciclo del carbono en la <ierra. Estos hongos en particular poseen un sistema enzim-tico etracelular que se origin en el periodo :evnico superior paralelamente a la evolucin de las plantas vasculares% por lo que se pone en mani(iesto la relacin entre los procesos de degradacin y s&ntesis de la lignina. (=an > Li "!+"$ *especto a estos hongos son los 6nicos con la habilidad de degradar lignina y otros compuestos org-nicos con estructura qu&mica similar% por lo que desde el punto de vista biotecnolgico poseen un gran potencial% pues estas estructuras tan complejas son causantes de contaminacin en ambientes naturales. Estos microorganismos se caracterizan por degradan en primer lugar la lignina y producen ac6mulos de celulosa que dan la apariencia blanquecina a la madera. Esta degradacin produce una despolimerizacin y mineralizacin para producir C4 " y ? " 4. (8anchez "!!;$ El sistema enzim-tico por el cual se lleva a cabo la degradacin de la madera se encuentra constituido por dos sistemas etracelulares% uno sistema hidrol&tico el cual produce hidrolasas para realizar la degradacin de polisac-ridos y otro oidativo que degrada la lignina y rompe los anillos de (enilo. 7or otro lado para que se lleve a cabo esta degradacin se requiere de la presencia de enzimas como la (enol oidasa conocida como lacasa y la accin de peroidasas como la 2anganeso peroidasa (2n7$ y la Lignino peroidasa (Ln7$. (8-nchez "!!;$. La Lignino peroidasa (EC +.++.+.+,$%es una glicoprote&nas de tipo oligomanosa constituida por un peso molecular entre #3 a ,# @:a% este se encuentra constituido por una estructura compleja la cual cuenta con un centro catal&tico que contiene un grupo hemo tipo b constituida por un in Ae BBB el cual se encuentra unido a , anillos pirrlicos. Esta enzima contiene un alto potencial redo% ya que puede oidar compuestos arom-ticos (enlicos y no (enlicos hasta en un ;! C 4 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin del pol&mero% no obstante este realiza la ruptura de enlaces C9C enlaces )ter (C9 49C$ de las cadenas de aril propano% hidroila grupos metileno benc&lico% oida el de alcohol benc&lico para obtener aldeh&dos o cetonas y (inalmente oida (enoles y rompe anillos arom-ticos de los compuestos no (enlicos de la lignina (8-nchez "!!;$. La 2anganeso peroidasa (E.C. +.++.+.+#$% es una hemo peroidasa% la cual requiere de perido de hidrogeno para realizar su actividad y se encuentra constituida por hierro% por otro lado esta tiene un poder redo in(erior a la Ln7 ya que no oida compuestos no (enlicos y genera 2nD# al oidar el 2ED" (8-nchez "!!;$. La lacasa (E.C. +.+!.#."$% es una glicoprote&nas etracelular con un peso molecular aproimado entre /! y +,! F:a% esta enzima monom)rica cuenta en su centro activo con un cl6ster de cobre el cual le permite catalizar la oidacin de un electrn de los (enoles y otros sustratos ricos en electrones para la (ormacin de radicales libres y reducir el o&geno molecular a agua (8-nchez "!!;$. 7or otro lado las celulasas son enzimas responsables de realizar la degradacin de la celulosa% la cual se encuentra constituida por una mezcla compleja de prote&nas las cuales se dividen en endoglucanasas o 9 G +9, glucanasa ( EC #.".+., $ % celobiohidrolasa (CE #.".+.;+ $ y G 9 glucosidasa (EC #.".+."+ $. Las endoglucanasas tambi)n se conocen como carboimetilcelulasas y la Celobiohidrolasa% conocida como eoglucanasa% es el principal componente enzim-tico del sistema de celulasas (6ngicas ya que representa el ,!9H! C de las prote&nas totales de la celulasa% esta adem-s puede hidrolizar celulosa altamente cristalina ya que elimina los monmeros y d&meros de la cadena de glucano. La G9 glucosidasa hidroliza d&meros de glucosa (8-nchez "!!;$. Ainalmente el ultimo sistema enzim-tico empleado para la degradacin de desechos madereros son las hemicelulosas% estas se clasi(ican en endo 9 G +9, 5 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin ilanasa (EC #.".+.3$% la cual genera oligosac-ridos al realizar una escisin de ilano y la G +9, ilosidasa (CE #.".+.#H $ produce ilosa a partir de oligosac-ridos. 7or otro lado para que se lleve a cabo la degradacin de la hemicelulosa se necesita de la presencia de otras enzimas como la ilano esterasa% (er6lico y p I cum-rico esterasas% J 9 + 9 arabino(uranosidasas% y J 9 , glucuronosidases para que se lleve a cabo una degradacin sin)rgica de los ilanos% mananos y dem-s componentes de la madera como el alcohol coni(er&lico% sinap&lico y cumar&lico los cuales son componentes que determinan la dureza de la madera (8-nchez "!!;$. A partir de los antecedes previamente realizados en este trabajos se busca evaluar la capacidad de biodegradacin y bioconversin de los hongos de podredumbre blanca a partir de desechos de la industria maderera en Colombia. 1.3 Objetivos: Keneral. Evaluar la capacidad de biodegradacin y bioconversin de los hongos de podredumbre blanca a partir de desechos de la industria maderera en Colombia. Especi(icos. :eterminar si la biodegradacin y bioconversin a partir de hongos de podredumbre blanca es una buena alternativa que permita el correcto uso de los desechos madereros obtenidos en di(erentes regiones de Colombia y de este modo evitar problemas ambientales. Bdenti(icar las cepas con mayor actividad enzim-tica y que de este modo garantice una e(icaz biodegradacin y bioconversin de los desechos madereros en Colombia. 6 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin Materiales y mtodos AELLB8B8 E8<A:M8<BC4 <B74 :E E8<N:B4. diseo de eperimento totalmente aleatorizado. 8e realizar- un diseo (actorial completo donde se tomaran # variables con # niveles d-ndonos un diseo de 3+ ensayos en los las variables ser-n. los hongos utilizados para el desarrollo del proyecto% los niveles a evaluar ser-n la generacin de las enzimas nombradas previamente en el proceso de la degradacin de los residuos madereros. Cada ensayo ser- realizado por triplicado para generar robustez estad&stica en los resultados obtenidos% generando un total de ",# ensayos. 741LACBOE P 2NE8<*A 741LACBOE. :esechos de la industria maderera 2uestra. 0iruta obtenida del proceso de aserrinaje de la madera. 0A*BA1LE8 Actividad enzim-tica lignol&tica Crecimiento de micelio sobre la madera Caracter&sticas mor(olgicas de los ?ongos de pudricin blanca Concentracin del sustrato a degradar en (uncin del tiempo de (ermentacin. 7eso del sustrato al (inal del tratamiento. p? y temperatura 2E<4:4L4KBA 2icroorganismos y condiciones del cultivo para replicarlos. 7 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin 8e utilizaran las cepas de los hongos 7hanerochaete chrysosporium (A<CC ",H"/$% <rametes versicolor (A<CC 5!;3/$ y 7leurotus ostreatus (A<CC #"H3#$. Los anteriores hongos de podredumbre blanca han sido re(erenciados por la literatura como buenos inductores de enzimas lignocelulol&ticas.
8e replicaran en medio P27K% el cual contiene. etracto de levadura al +C% etracto de malta al +C% peptona bacteriolgica al !."C% glucosa al +C% asparagina al !.+C% @?"74, al !."C% 2g84,Q H ?"4 al !.+C% tiamina clorhidrato + mg y agar al "C. 8e llevara a esterilizacin y se servir- en cajas de 7etri% las cajas sembradas se llevar-n a incubacin a #HRC por / d&as% luego se mantendr-n a ,RC. La preparacin de los inculos se llevara a cabo trans(iriendo / trozos circulares de agar colonizado desde las cajas de 7etri a Aernsbach de +L con +!!! mL de medio de cultivo e incub-ndose por / d&as. Caracter&sticas macro y microscpicas. Bnicialmente se realizara una evaluacin de las caracter&sticas macro y microscpicas de los hongos empleados en estudio% con el objetivo de analizar si hubo un cambio en su mor(olog&a durante el proceso de degradacin% para esto se deber- hacer uso de colorantes de Kram% Azul de lacto(enol y @4?. Cultivos en (ase slida 7ara la evaluacin de la produccin de enzimas lignol&ticas se realizara un sistema de (ermentacin en estado slido% en (rascos de +!! mL. 8e tomara los residuos madereros con las siguientes dimensiones. +%"/ g del material seco est)ril en trozos de !%/ cm de di-metro promedio% con 5%! mL del medio del cultivo P27K y , mL de inoculo homogenizado. 8 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin Esto se incubara a #HRC la cual es una temperatura adecuada para los tres hongos' peridicamente se retirara (rascos para analizar la actividad enzim-tica y la degradacin del sustrato slido' el resto de (rascos se les controlara la humedad de acuerdo con su p)rdida de peso. Etraccin y medicin de la actividad enzim-tica La etraccin de las enzimas se realizara adicionando a cada (rasco de cultivo +! mL de solucin de malonato de sodio (+! m2% p? ,%/$ y agitando vigorosamente en un agitador reciproco a #!! oscSmin durante / minutos. El l&quido sobrenadante se centri(ugara a 5!!! rpm y se (iltrara a trav)s de una membrana de !%,/ micras antes de determinar su actividad enzim-tica. La actividad manganeso peroidasa (2n7$ se determinara a partir de la oidacin del compuesto "%5 dimetoi(enol ("%59:27$ a ,53 nm. La mezcla de reaccin consta de /! m2 de malonato de sodio (p?T,%/$% +m2 de dimetoi(eno% 2n84,% !%, m2 de ?"4"% +!! UL de muestra y agua destilada. Nna unidad de actividad representa + Umol de producto oidado de :27 por minuto. La actividad Ligninoperoidasa (Li7$ se determinara mediante la oidacin de alcohol veratrilico a aldehido veratrilico a #+! nm. La mezcla de reaccin consta de de /! m2 de tartrato de sodio (p? #%!$% " m2 de alcohol veratrilico% !%, m2 de ?"4"% +!! UL de muestra y agua destilada. :egradacin de los materiales lignocelulsicos La degradacin del material en los cultivos de los hongos se determinara retirando el l&quido liiviado de cada matraz por (iltracin al vac&o y determinando el peso seco del solido remanente. La di(erencia de peso respecto al valor inicial representa la cantidad de material degradado. 9 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin Actividad lignol&tica. 7ara poder evaluar la actividad lignol&ticas de los hongos utilizados% se debe hacer uso de un medio de guaiacol% el cual va a ir suplementado con concentraciones di(erentes de la (uente de carbono para poder evaluar y determinar en qu) concentracin la enzima realiza una actividad ptima de degradacin. <A1NLACB4E P AELLB8B8 :E :A<48. 7osteriormente para el an-lisis de los resultados obtenidos en se realizara un an-lisis de varianza AE40A el cual nos determinara las di(erencias estad&sticamente signi(icativas obtenidas en los ensayos. Ainalmente se calculara con la ayuda del programa estad&stico de 8igma7lot en el cual se procesaran los datos y a estos se les determinara la desviacin est-ndar y el coe(iciente de variacin% para establecer que tratamiento presentara una mayor estabilidad de reaccin y este ser- el que podremos emplear para la biodegradacin y bioconversin de los desechos provenientes de industrias madereras. *E8NL<A:48 E87E*A:48 Al (inalizar este proyecto se esperara. 7roduccin de biomasa y actividad de 2anganeso 7eroidasa% Ligninoperoidasa y Lacasa para los hongos evaluados en (uncin del tiempo de (ermentacin. 7roduccin de enzimas ligninol&ticas de los hongos evaluados en los cultivos de (ase slida sobre el material ligninocelulsico. 10 Formato interno para la formulacin de proyectos de investigacin La actividad enzim-tica llevada a cabo por los hongos convierta la madera en otras sustancias de m-s (-cil degradacin% es decir la lignina se convierta en sustancias precursoras de humus como. 0ainillina% Lcido 0ainillinico y -cido (er6lico. Las sustancias precursoras de ?umus son (undamentales en el ciclo del carbono en la tierra% pues constituyen la reserva de carbono en los suelos. 1.8. Bibliografa !guilar !" #avioli $" %erra& !. '()13* +,tracellular activities and -ood component losses during 7inus taeda biodegradation by the bro.n/rot fungus Kloeophyllum trabeum. Bnternational 1iodeterioration > 1iodegradation. 8(: 180/111. 2annan 8% AaFhruVl9*azi A% Alam W% ("!!/$. Nse o( (ungi to improve bioconversion o( activated sludge. =ater *esearch% 0olume #;% Bssue +#% August "!!/% 7ages ";#/9";,# 4ses *% 0alenzuela 8% Areer X% 1aeza X% *odr&guez X% ("!+#$. 7alm leave and plastic Yaste Yood composite (or out9door structures. 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