Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA

1
Prctica #5
FOTOSNTESIS Y RESPIRACIN
I. Objetivos
* Diferenciar entre los tipos de respiracin celular.
* Observar la produccin de dixido de carbono durante el proceso de la respiracin.
* Identificar la clorofila y otros pigmentos presentes en las hojas por medio de las tcnicas de
cromatografa.
* Observar la formacin de almidn como una de las etapas finales de la fotosntesis.
* Identificar la absorcin de CO
2
del medio como un indicador del proceso de fotosntesis en diferentes
condiciones de luz.
II. Introduccin
Las clulas llevan a cabo diversos procesos para mantener su funcionamiento normal, muchos de los cuales
requieren energa. La respiracin celular es una serie de reacciones mediante las cuales la clula degrada
molculas orgnicas y produce energa. Todas las clulas vivas llevan a cabo respiracin celular para obtener
la energa necesaria para sus funciones. Usualmente se usa glucosa como materia prima, la cual se
metaboliza a dixido de carbono y agua, producindose energa que se almacena como ATP y se utiliza en la
mayora de las reacciones metablicas

glucosa dixido de agua
carbono
La molcula de ATP est formada por adenina, ribosa y tres grupos fosfatos con enlaces ricos en energa.
Cuando la molcula se hidroliza, el fosfato terminal se separa para formar ADP (difosfato de adenosina) y se
libera energa. El ATP es la fuente de energa que se usa como combustible para llevar a cabo el metabolismo
celular.
La respiracin celular incluye una secuencia
de etapas metablicas definidas como:
gliclisis en el citoplasma y el ciclo de Krebs
y las reacciones de transferencia de
electrones (redox) en la mitocondria. Esta
secuencia de pasos puede seguir una ruta
diferente en presencia o ausencia de oxgeno.
En ausencia de oxgeno, a partir del piruvato
(producto de la gliclisis), ocurre
fermentacin o respiracin anaerbica.
Dependiendo del organismo, existen dos tipos
de respiracin anaerbica: fermentacin
alcohlica y fermentacin lctica.
Por otra parte, el proceso de fotosntesis es
uno de los fenmenos ms extraordinarios de
- O2
+ O2
Acetaldehido
Lactato
Etanol
Acetil-CoA
Piruvato
Ciclo de
Krebs
mitocondria

Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
2
la naturaleza y tiene una gran influencia sobre la mayora de los seres vivos. Las algas y las plantas tienen la
capacidad de sintetizar materia orgnica a partir de compuestos simples de la naturaleza (CO
2
y H
2
O). Tanto
la vida vegetal como la animal dependen de la biomasa vegetal obtenida por la fotosntesis para subsistir, ya
que no existe otra fuente de materia orgnica que pueda servir de alimento a la mayora de los seres vivos. Si
las algas y las plantas desaparecieran, la gran mayora de animales perderan, tarde o temprano, todas sus
fuentes de alimento.
Las algas y las plantas realizan fotosntesis en presencia de luz solar; sta es captada por la clorofila presente
en los cloroplastos. Las clorofilas a y b son pigmentos de color verde azulado. En la captacin y la
transformacin de la energa de la luz intervienen otros pigmentos que conforman un complejo junto con la
clorofila: las xantofilas, de color amarillo, y los carotenos, de color rojo-anaranjado. Las clorofilas estn
formadas por carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y magnesio, siendo los pigmentos ms importantes y
que pueden ser separados con facilidad de los otros compuestos.
El fenmeno de la fotosntesis, que desde el punto de vista bioqumico tiene numerosas etapas complejas,
consiste en tomar agua a travs de las races y dixido de carbono por medio de los estomas, para elaborar a
partir de estos dos compuestos las molculas orgnicas necesarias para la vida del vegetal. Para que el
proceso pueda ocurrir, se requiere de energa que proviene del sol. Los compuestos orgnicos sintetizados
son fundamentalmente carbohidratos. El primero que se forma de modo estable es la glucosa. Este azcar
forma polmeros tales como el almidn, que se acumula como sustancia de reserva en los vegetales y es uno
de los productos finales elaborados a partir de la fotosntesis.
III. Procedimiento
Durante la sesin de laboratorio se realizarn 5 experimentos que le permitirn conocer algunos aspectos de
los procesos de fotosntesis y respiracin. Para lograr ste objetivo, los miembros pares o impares de cada
uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesin de laboratorio, realizarn y analizarn un
experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor.
Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se renen para hacer una discusin de
los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir
sus resultados.
Experimento 1.- Respiracin celular
(a) Respiracin anaerbica
Este mecanismo no es tan eficiente como la respiracin aerbica, ya que slo produce 2 molculas de
ATP, pero permite obtener alguna energa a partir del piruvato que se produjo en la gluclisis. Hay dos
tipos de respiracin celular anaerbica: fermentacin lctica, que ocurre en algunas bacterias y en el
msculo esqueltico humano y fermentacin alcohlica (levaduras, ciertos hongos y algunas bacterias)
que tiene como productos finales alcohol (etanol) y CO
2
. En este ejercicio se estudiar el proceso de
fermentacin alcohlica que llevan a cabo las levaduras (Saccharomyces cerevisiae).
Antes de iniciar, redacte una hiptesis que trate de explicar el efecto del tipo y concentracin de
carbohidratos sobre la tasa de fermentacin en levadura.
1. Se le entregar un frasco que contiene un cultivo de levadura al 2% (preparado antes de iniciar el
laboratorio).
2. Rotule 2 tubos de ensayo y prepare la mezcla siguiente (el instructor asignar un tubo a cada
subgrupo):


Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
3
Tubo 1: 1 ml de glucosa(5%) y 1 ml de levadura
Tubo 2: 1 ml fructosa (5%) y 1 ml de levadura
Tubo 3: 1 ml sacarosa (5%) y 1 ml de levadura
Tubo 4: 1 ml de maltosa (5%) y 1 ml de levadura
Tubo 5: 1 ml de dH
2
O y 1 ml de levadura
3. Utilizando una pipeta Pasteur, llene una jeringa graduada de 1 ml con la
solucin del tubo 1 hasta prcticamente desbordar. Sea cuidadoso de no formar
burbujas a lo largo de la columna de solucin que contiene la jeringa y no tomar
sedimentos del frasco de cultivo.
4. Selle el extremo libre de la jeringa con el tapn. Invierta la jeringa. Debe
asegurarse de tener una columna de solucin sin burbujas y libre de sedimentos
que obstruyan el flujo de solucin y gases en la jeringa.
5. Coloque la jeringa invertida dentro de un tubo de ensayo y anote el tiempo
inicial en la columna correspondiente en el cuadro del reporte.
6. Luego de un perodo de 30 segundos, registre la produccin de CO
2
(volumen de burbujas que se
acumula en la punta de cada jeringa) como la diferencia entre la lectura real cada 30 segundos y la
lectura anterior.
7. Repita el procedimiento (pasos 3-5) con la solucin del tubo 2 u otras soluciones experimentales.
Recuerde registrar el tiempo de inicio.

(b)Respiracin aerbica
En este experimento se determinar en forma cuantitativa la
tasa de respiracin aerbica en plantas y animales, midiendo el
volumen de O
2
consumido. Para ello, se utiliza un respirmetro
(ver figura) el cual consiste de un envase ancho de vidrio (tubo
de ensayo, erlenmeyer, etc) el cual contiene semillas
germinadas o un animal pequeo (invertebrado). Esta cmara
cierra hermticamente con un tapn (cmara de respiracin), al
que se le inserta una pipeta graduada y una entrada de aire
(respirador) conectado a una jeringa. En el extremo libre de la
pipeta se coloca un colorante lquido al inicio del experimento.
En el tiempo, a medida que se reduce (consume) el volumen de
O
2
en la cmara experimental, el colorante se desplazar a lo
largo de la pipeta graduada, permitiendo medir la cantidad de
ml de aire consumido en funcin del tiempo. Es importante
mencionar que con ste diseo, es necesario eliminar los
cambios en el volumen de CO
2
que se produce por la
respiracin. Para ello se coloca en el respirmetro una cantidad
de KOH ( desecante) el cual reacciona con el CO
2
para formar
carbonato de potasio en forma slida
CO
2
+ 2KOH K
2
CO
3
+ H
2
O
Otro parmetro importante de controlar en stos experimentos
jeringa
frijoles germinados
( animal pequeo)
pipeta
graduada
algodn
seco
KOH
( desecante)
Respirmetro

Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
4
es la temperatura ya que produce expansin o contraccin de los gases. Para minimizar fluctuaciones en
la temperatura del ambiente, es importante mantener el respirmetro sumergido en un bao a temperatura
ambiente (ver figura)
Recuerde verificar que no haya fuga de aire
ni entrada de agua en el respirmetro una
vez que coloque los organismos vivos en la
cmara experimental. Finalmente, si realiza
el experimento con un animal, es
importante no generar ruido extremo
durante la toma de datos ya que altera la
calidad de sus resultados.
1. En la mesa de laboratorio encontrar
el respirmetro parcialmente
ensamblado
2. Verifique que las conexiones entre
el tapn/jeringa y tapn/pipeta estn
selladas hermticamente.
3. Verifique que la cmara experimental tiene en el fondo una capa de algodn absorbente impregnado
con una solucin de KOH al 15% (se puede sustituir el algodn de KOH colocando algunos pellets de
desecante). Esta capa de algodn debe estar cubierta con otra capa de algodn seco no absorbente,
para evitar el contacto de la preparacin biolgica con el KOH o desecante
4. Dispense una cantidad de frijoles germinados hasta llenar la mitad del frasco. Cuente el nmero de
semillas que coloc en la cmara experimental
5. Repita los pasos 2 y 3 con un segundo respirmetro, pero sta vez coloque, en lugar de semillas
germinadas, cualquier animal pequeo disponible (anlidos, grillos, cucarachas)
6. Cierre cada una da las cmaras experimentales con el tapn respectivo. Asegrese que en ambos, la
entrada de aire a travs de la jeringa (respiradero) queda abierta, permitiendo el flujo de aire hacia la
cmara experimental.
7. Transfiera ambos respirmetros hacia el contenedor de agua. Verifique que ambos respirmetros no
tienen fuga de aire o agua desde o hacia la cmara experimental.
8. Use un gotero para colocar en ambos respirmetros una gota de colorante en el extremo de la pipeta.
Asegrese de apretar suficientemente el bulbo del gotero de forma que la burbuja del colorante se
ubique en la regin de la pipeta donde pueda leer fcilmente. Esto es muy importante porque usted
necesita medir el desplazamiento de la burbuja a lo largo de la pipeta en funcin del tiempo.
9. Antes de comenzar a tomar sus datos, cierre la entrada de aire con el mbolo de la jeringa. Anote el
tiempo y la posicin de la burbuja. Anote la temperatura.
10. Mida la posicin de la burbuja cada 5 min por espacio de 30 min.
Durante el tiempo de espera, formule una hiptesis que relaciones las diferencias en la tasa respiratoria
entre animales y plantas. Prediga los posibles resultados.
Al finalizar el experimento, remueva los respirmetros del bao, desrmelos cuidadosamente y lave
los restos de colorante
Experimento2.- El papel de la luz en la fotosntesis
La importancia de la luz en el proceso de la fotosntesis puede observarse mediante los siguientes
procesos: (1) absorcin de dixido de carbono de una planta de Elodea en condiciones de luz y sombra (4
masking
tape
termmetro
pipetas
Muestras
experimentales

Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
5
grupos), y (2) diferencias en la formacin de almidn en las plantas de Coleus o Geranio mantenidas en
condiciones de luz y sombra (4 grupos)
(a)Absorcin del dixido de carbono
La absorcin del dixido de carbono por las plantas en presencia de luz es una evidencia indirecta del
proceso de fotosntesis. Uno de los mtodos ms simples para demostrarlo es estimar cambios en los
niveles de CO
2
disuelto en una solucin que contiene una planta acutica bajo condiciones de
iluminacin (Elodea).
En el siguiente experimento se estudiar si Elodea lleva a cabo el proceso de fotosntesis en la oscuridad
y en presencia de luz. El CO
2
en solucin acuosa se convierte en un cido (cido carbnico), cuya
concentracin se medir por medio de una titulacin usando un indicador de pH (fenolftalena). Con este
indicador se observar el punto de cambio en pH, donde se obtiene el equilibrio entre pH cido y bsico.
Este cambio en pH sucede al aadirle una solucin bsica de NaOH a la muestra cida, y se observa por
un cambio en color; de esta forma se podr calcular la produccin de CO2 para cada organismo
Formule una hiptesis de trabajo en el reporte y haga una prediccin de los posibles resultados .
Prepare el siguiente material:
1. Agregue en tres frascos de vidrio etiquetados, 25 ml de dH
2
O. En el frasco nmero 1 no agregue
ninguna planta, mientras a los frascos nmero 2 y 3 agregue en cada uno una rama de Elodea.
2. Sople con una pajilla cada uno de los frascos.
3. Tape hermticamente los frascos, y al frasco 3 cbralo completamente con papel de aluminio.
4. Coloque los frascos1 y 2 cerca de una fuente de iluminacin y espere unos 30 minutos.
5. Al finalizar los 30 minutos, aada 5 gotas de fenolftalena (ste indicador es incoloro en soluciones
cidas y se torna rosado en soluciones alcalinas) y mezcle bien.
6. Llene la bureta de titulacin con la solucin de 0.0025 mM de NaOH.
7. Mueva el frasco en crculos y aada gotas de la solucin de NaOH hasta obtener un color rosado
persistente.
8. Anote en el cuadro de resultados la cantidad de NaOH que utiliz para obtener un cambio en el color
del frasco, mediante la titulacin.
9. Calcule el consumo de CO2 mediante esta ecuacin:

[CO
2
] = ml de NaOH (experimental) ml de NaOH (control) * [NaOH]
Volumen de la Elodea (ml)

10. Repita el proceso con los dems frascos.
Para determinar el volumen de Elodea, siga el siguiente procedimiento:
a.- Coloque la Elodea en un vaso (beaker) pequeo con 50 ml de agua.
b.- Haga una marca donde queda el menisco.
c.- Remueva cuidadosamente el organismo con la precaucin de no derramar agua.
d.- Con una pipeta llena aada agua hasta llegar a la marca.
e.- La diferencia de lectura en la pipeta indicar el volumen del organismo.

Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
6
(b)Formacin de almidn en las plantas (Demostrativo)
Una de las etapas finales de la fotosntesis es la formacin de almidn. Para demostrarlo se toman hojas
nuevas de plantas de Coleus blumei con diferentes patrones de coloracin (o en su defecto hojas nuevas
de Geranio que fueron cultivadas en condiciones de luz u oscuridad).
1. Haga un dibujo del patrn de coloracin.
2. Hierva cada hoja por unos minutos en agua, y observe cules pigmentos desaparecen y cules
permanecen en la hoja, posteriormente, proceda a hervir por varios minutos en alcohol al 90% hasta
que las hojas tomen un color totalmente blanquecino. Posteriormente, y con cuidado de no daar o
doblar la superficie de la hoja, se transfiera a una caja de petri con una solucin yodada.
3. Observe en que rea de la hoja hubo reaccin. Haga un dibujo del patrn de coloracin en presencia
de Lugol y responda las preguntas especificadas en el reporte.
Experimento 3.- Separacin de los pigmentos vegetales
(a) Cromatografa
La cromatografa es una tcnica fsico-qumica que se usa para separar e identificar sustancias en sus
constituyentes individuales. Consiste en una migracin de los componentes de la mezcla entre la fase fija,
que es la fase estacionaria y otra fase mvil. La separacin es posible debido que algunas sustancias se
retienen mejor en la fase estacionaria, mientras que otras se mueven mejor en la fase mvil. Se puede
identificar varios tipos de cromatografa dependiendo del estado fsico de las fases que participan: (1)
cromatografa de adsorcin en la cual, la fase estacionaria es slida y la fase mvil es lquida, y (2)
cromatografa de reparto. En este caso, la fase lquida o gaseosa se desplaza sobre una fase lquida
estacionaria colocada en la superficie de un soporte slido. La cromatografa de papel se fundamenta en
una combinacin entre la cromatografa de adsorcin y cromatografa de reparto. La particin ocurre entre
el agua que hidrata la celulosa y la fase mvil orgnica.
Siga el siguiente procedimiento
1. Marque en una tira de papel a 1,5 cm de distancia del fondo del papel un punto, donde colocar una
gota del extracto de pigmentos, el cual consiste en hojas frescas de espinacas (Spinacia oleracea,
Chenopodiaceae) o gitite (Acnistus arborescens, Solanaceae), cuando esta gota est seca aada 2
gotas ms, esperando que cada una seque antes de poner la siguiente.
2. En el borde superior de la tira de papel marque una raya a 2 cm. del borde superior, sta lnea indica
el frente, y ser el punto final al que debe llegar la solucin reveladora (cuando el frente llegue a este
punto, saque inmediatamente el papel del tubo de ensayo).
3. Suspenda la tira de papel con un gancho dentro de un tubo de ensayo que contenga la solucin
reveladora (acetona al 8% y ter de petrleo del 92%). Cuide que el papel no haga contacto con las
paredes del tubo de ensayo.
4. Regule la superficie de contacto con el lquido sacando o introduciendo el gancho dentro del corcho.
El papel debe tocar la superficie del lquido, pero no debe introducirse en el mismo.
5. Cuando el frente llegue al punto final (2 cm. del borde) saque el papel y pngalo a secar al aire, en un
sitio oscuro.
6. Cada una de las bandas coloreadas del extracto de las plantas es un pigmento diferente. Para cada uno
de los pigmentos que observa aplique la siguiente frmula:



Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual
UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
7
Rf = distancia recorrida por el pigmento
distancia recorrida por el disolvente
El Rf es un indicador de la afinidad de cada pigmento por las fases slida y lquida. Se utiliza para
caracterizar pigmentos; por lo tanto, el pigmento que tenga mayor Rf, ser el ms afn a la fase lquida
y el de menor Rf ser el ms afn a la fase slida.
Haga un esquema en el reporte de sus resultados.

Experimento 4.- Observacin de estomas
La funcin de los estomas es la regulacin de la prdida de vapor de agua y el ingreso de dixido de
carbono. Su estudio se ha centralizado principalmente en el estudio de la transpiracin y fotosntesis.
Tambin, la funcin de los estomas es importante para mantener la homeostasis de la planta, la cual es
indispensable en todo ser vivo para regular el medio interno cuando se relaciona con el ambiente.
Observe al microscopio los estomas de una hoja de zebrina(Tradescantia zebrina) realizando las
siguientes preparaciones:
1. Coloque un pedacito de envs de hoja sobre un portaobjetos.
2. Obsrvela al microscopio.
3. Observe las clulas guardas y pigmentos. De ser necesario, aada un poco de agua carbonatada para
observar los estomas abiertos.
4. Observe corte transversal de una hoja. Haga un esquema de sus observaciones e identifique las
distintas estructuras que la componen.















PARA LA PRXIMA PRCTICA:
Cada subgrupo deber realizar el siguiente
procedimiento: en un pequeo frasco de vidrio,
ponga a enraizar un bulbo de cebolla por
aproximadamente 4 das. Tenga cuidado de no
sumergir la cebolla en el agua.