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Cromatografa de lquidos
de alta presin
(HPLC)
High pressure liquid chromatography
High performance liquid chromatography
Bibliografa sugerida:
Captulo 28 - Skoog, D.A., Holler, F.J., y Nieman, T.A. Principios de Anlisis
Instrumental (5 edicin). McGraw-Hill, 2001.
Q.F.Mariela Medina
Asistente Qumica Analtica
Qumica Analtica III - 2014
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HPLC - CLASE 1
Introduccin.
Instrumentacin.
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Cromatografa lquida
Introduccin
Cromatografa en columna.
Fase mvil lquida.
Evolucin instrumental de la
cromatografa clsica en
columnas de vidrio.
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HPLC
Columnas de menor dimetro (mm) y rellenos ms
finos (m).
Presiones muy altas (100 - 400 kg/cm2).
Volmenes de muestra del orden de L.
Introduccin
Distintos tipos de cromatografa basados en distintos
fenmenos que involucran el analito, la fase mvil y la fase
estacionaria.
En HPLC, la fase mvil juega un papel fundamental, a
diferencia de GC, donde la FM slo acta como un portador
de la muestra.
En HPLC es frecuente disponer de pocos tipos de columna
y resolver las separaciones modificando la FM.
HPLC - Conceptos generales
Introduccin
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HPLC - Campo de aplicacin
Aplicable a un amplio rango de molculas.
GC: sustancias voltiles, trmicamente estables (excluye
altos pesos moleculares).
HPLC: todo tipo de sustancias (orgnicas e inorgnicas).
Introduccin
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Requerimientos instrumentales
Separacin en cromatografa
de lquidos de alta presin
Fenmenos que controlan el
proceso separativo en cada caso
Tipos de cromatografa de lquidos
Introduccin
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Modalidades
Introduccin
Cromatografa lquido slido (adsorcin).
Cromatografa lquido- lquido (reparto).
Cromatografa de fase ligada (reparto).
Cromatografa de intercambio inico.
Cromatografa de pares inicos.
Cromatografa de exclusin (permeacin por geles).
Cromatografa de afinidad.
Cromatografa quiral
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Instrumentacin para HPLC
Instrumentacin
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Esquema bsico de HPLC
Bomba
Sistema de
deteccin
Registrador
Columna
Reservorio de
FM
Seal
Puerto de inyeccin
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Bomba(s).
Equipo completo
Instrumentacin
Filtro de lnea.
Horno termostatizado.
Inyector de muestra (manual o automtico).
Precolumna o guarda columna (opcional).
Columna cromatogrfica.
Sistema de deteccin.
Registrador y equipo de procesamiento de datos.
Controlador (dispositivo o PC + software).
Reservorio(s) de fase mvil.
Equipo completo
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Reservorio
Bomba
Medidor
de presin
Filtro
de lnea
Amortiguador
de pulsos
Horno
termostatizado
Inyector
Columna
Sistema de
deteccin
Registrador
Procesador de datos
Sistema de
bombeo
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Instrumentacin
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Reservorio de fase mvil
Botellas. Propsito: contener y
proteger la fase mvil
Material inerte vidrio, acero
inoxidable
Tubo atraviesa la tapa y en la
tapa hay un filtro de aire
En el extremo del tubo hay un
filtro poroso
Filtro
poroso
Filtro
de aire
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Compuesta por uno o ms disolventes.
Compatible con el detector.
Buen disolvente de la muestra.
Seleccionada por sus propiedades
cromatogrficas.
Fase mvil.
Fase mvil
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Todos los disolventes de calidad HPLC
(se puede comprar o purificar uno
mismo)
Pureza qumica
Ausencia de partculas
Se debe desgasear antes de su uso.
Se debe filtrar (0.22 0.45 m) antes
de su uso.
Fase mvil
Fase mvil.
Precaucin: filtrar y desgasear la fase
mvil en el mismo recipiente que se
usar como reservorio.
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Propsito: proveer un suministro continuo y
reproducible de FM a la columna cromatogrfica.
Deben proveer altas presiones.
Habitualmente se requiere caudal constante, no
presin constante.
Sistema de bombeo
Bombeo
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Sistema de bombeo
Bombas reciprocantes de pistn
Uno de los tipos de bomba ms comunes
Reservorio ilimitado
Sistema caro (US$ 5000)
Salida pulsante del solvente (se soluciona)
Compatible con elucin por gradiente
El volumen interno es < 1 mL (p. ej. 100 L)
Son las bombas ms empleadas en la
actualidad
Bombeo
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Bomba reciprocante de pistn
Bombeo
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Vlvula de retencin
(check valve)
Bombeo
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Bomba reciprocante de pistn
Bombeo
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Controladas por microprocesador.
Sensores de presin.
Control de caudal (menos frecuente de
presin).
Capacidad de programacin.
Bombeo
Bombas modernas
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Mantenimiento y cuidado
Son elementos de precisin
Repetibilidad < 1%
Solventes filtrados
No deben funcionar en seco (abrasin)
No usar solventes corrosivos
No dejar sales secas
Disolvente desgaseado
Mantenimiento de sistema de bombeo
Bombeo
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Bombas
Bombeo
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Bombas
Bombeo
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Sistemas de bombeo
Pulsaciones de presin
Bombeo
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Minimizar los pulsos
asociados con las bombas
reciprocantes.
Absorber las fluctuaciones
de presin.
Generalmente emplean un
fluido compresible
integrados a las bombas.
Amortiguadores de pulso.
Bombeo
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Sistema de bombeo
En el diseo de la bomba se busca:
Minimizar el ruido de pulsacin.
Compensar la compresibilidad del solvente.
Bombeo
Es frecuente que un sistema tenga ms de una
bomba:
Para elegir entre fases mviles.
Para mezclar solventes en el equipo
Para generar gradientes de elucin (es una forma
de programacin de fase mvil)
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Bombeo
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Sistema de lavado de pistn
Circulacin de agua entre el pistn y la camisa.
Evita la cristalizacin de slidos disueltos.
Emplea una bomba auxiliar.
A veces emplean un diafragma flexible.
Bombeo
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Preparacin de fase mvil
Manual: composicin fija (cromatografa isocrtica).
Por medio del sistema de bombas.
Gradiente de elucin: variacin programada en el
tiempo. de la composicin de la FM.
Requerimientos: mezcla suave y reproducible.
Fase mvil
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Dispositivo que permite crear el programa de gradiente
Sistema de gradiente a baja presin
Los disolventes se mezclan antes de entrar a la
bomba . La composicin se determina con vlvulas
controladas por microprocesadores.
Sistema de gradiente de alta presin
El gradiente se forma a alta presin. Se necesita
una bomba por cada disolvente usado para el
gradiente.
Fase mvil
Controlador de gradiente.
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Sistemas de mezcla de disolventes en alta
y en baja presin
Fase mvil
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Sistemas de mezcla de disolventes en alta y en
baja presin
Ventajas y desventajas
Baja presin: equipo menos costoso (slo una bomba
de alta presin) , ms susceptible a gases disueltos y
formacin de burbujas
Alta presin: menos susceptible a burbujas, equipo
ms caro (una bomba de alta presin por canal)
Fase mvil
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Sistema modernos de gestin de la fase mvil
Mdulo desgasifica y combina hasta cuatro eluyentes
Desgasificin por vaco usa la tecnologa eficiente de membranas
polimricas de segunda generacin
La mezcla cuaternaria exacta a baja presin proporciona perfiles
de gradiente reproducibles en todo el intervalo de caudal
Los mbolos independientes producen un flujo de eluyentes sin
pulsos sin necesidad de amortiguadores de pulsos.
Amplio intervalo de caudales programable (de 50 L a 5 mL por
minuto).
Mantenimiento de rutina de mbolos, juntas y lavado de juntas sin
herramientas
Lavado automatizado activo de las juntas del mbolo
Fase mvil
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Introduccin de muestra
Inyeccin directa por jeringa
Se debe parar el flujo
Mala precisin (2% en el mejor de los casos)
NO SE USA MS
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Vlvulas de inyeccin
Precisin 0,2%
Presiones hasta 7000 psi
Manuales o elctricas
Contienen un loop (trozo de tubo capilar de
volumen conocido) que es llenado previamente
con la muestra a inyectar.
El volumen inyectado es el volumen del loop (5 a
100 L)
El modelo ms empleado es el de seis puertos
Introduccin de muestra
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Parte fija (estator) con seis orificios de conexin
(puertos)
Parte mvil (rotor) con tres canales de conexin (loop,
sistema de bombeo, columna y descarte)
Dos posiciones: carga e inyeccin
Son dispositivos mecnicos de alta precisin.
Introduccin de muestra
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Vlvula inyectora de 6 puertos:
posicin de carga
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Vlvula inyectora de 6 puertos:
posicin de inyeccin
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Vlvulas inyectoras
manuales
Sello
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Sistema autosampler
Inyecciones son reproducibles de uno a cientos de microlitros.
Compatibles con todas las qumicas de columna de LC.
Inyecciones de volumen variable eliminan la necesidad de cambiar los
bucles.
Un ciclo programable de lavado de agujas y una solucin de lavado de
agujas activa (sin viales de lavado) evitan la contaminacin de las
muestras.
La altura programable de las agujas de inyeccin permite utilizar viales
de distintas formas geomtricas y tiene en cuenta el grosor inferior del
vial.
Velocidad programable de aspiracin de la jeringa para muestras y
eluyentes viscosos
Para facilitar el mantenimiento de rutina, el lavado de las juntas inferiores
y el recambio de la jeringa de inyeccin se llevan a cabo sin herramientas
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Inyector automtico con automuestreador
(autosampler)
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Guardacolumna y precolumna
Guardacolumna - Una pequea columna entre el
inyector y la columna analtica.
Usada para extender la vida til de la columna
analtica
Debe tener la misma FE que la columna analtica.
Precolumna - Una pequea columna entre la bomba y
el inyector
Usada para saturar la FM con la FE (CLL)
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Columnas
Son tubos, generalmente de
acero inoxidable, que contienen el
relleno (packing, empaque)
Presentan conectores roscados
de precisin y tapas internas
porosas para mantener el relleno
dentro
Largo: 3 a 30 cm
Dimetro interno:2 a 5 mm.
4.6 mm el ms comn.
2.1 mm se denomina microbore
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Columnas
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Columnas
Influencia de largo de columna en la resolucin
Influencia de tamao de partcula en la resolucin
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Empaques (rellenos, packings).
El soporte es alguno de los siguientes:
Slidos rgidos - matriz de slice
Soportan presiones 10000 a 15000 psi
Geles duros - partculas porosas de poliestireno
entrecruzado con divinilbenceno
Soportan presiones de 5000 psi
Los geles blandos como agarosa o Sephadex no
soportan altas presiones, no sirven para HPLC
Tendencia moderna: Columnas monolticas
Columnas
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Tamao de partcula
Menor tamao de partcula aumenta la eficiencia y
los requisitos de presin
Dimetros comunes para trabajo analtico
Dimetro partcula N de platos
10 m 5000
5 m 9000
3 m 15000
Columnas de 15 cm x 4.8 mm.
Columnas
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Horno termostatizado
No siempre es necesario.
Dependencia de t
R
con la temperatura poco significativa
en la mayora de los casos.
En algunas modalidades (como cromatografa de
intercambio inico) el control de temperatura mejora la
repetibilidad de t
R
.
A veces es necesario trabajar a t > t
amb.
Nunca t > 80C (estabilidad de la fase estacionaria).
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Sistemas de deteccin para HPLC (detectores)
Existe gran variedad. Algunos:
Absorcin en el UV-vis (uno de los ms usados)
Fluorescencia
Refractomtrico
Absorcin en el infrarrojo
Electroqumicos
Son instrumentos dotados de una celda de flujo
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Sistemas acoplados (hyphenated systems):
acoplamiento con sistemas de deteccin ms complejos
como un espectrmetro de masas (HPLC-MS).
Permiten obtener gran cantidad de informacin.
Suelen requerir interfaces complejas para adaptar la
salida de la columna a la entrada del sistema de
deteccin.
Sistemas de deteccin acoplados
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Sistemas de deteccin para HPLC
Propiedades deseables:
Pequeo volumen interno (para disminuir el
ensanchamiento extracolumna)
Bajo ruido
Buena estabilidad en el tiempo
Alta sensibilidad
Proveer mucha informacin sobre el analito
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Sistemas de deteccin de absorcin en el
UV-visible
Espectrofotmetros optimizados que emplean una celda
de flujo
En el pasado se empleaban detectores a filtros por su
bajo costo, asi como espectrofotmetros de variable
Actualmente: detectores de arreglo de fotodiodos
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Celda de flujo para sistema de deteccin de
absorcin en el UV-visible
Volumen
interno del
orden de 5 a
10 L
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variable
Array de fotodiodos
Sistemas de deteccin de arreglo de fotodiodos
(diode array)
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Sistemas de deteccin de arreglo de fotodiodos
(diode array)
Permiten obtener el espectro del efluente a intervalos
muy pequeos
Se genera una matriz tridimensional de datos
A - - t (gran cantidad de informacin)
Se requiere una computadora potente
La informacin se puede mostrar de diversas formas:
Cromatograma a una y espectro en tiempo real
Espectrocromatograma 3D
Contour plot (proyeccin isomtrica)
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Cromatograma 3-D
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Grficos isomtricos o de contorno
(contour-plots)
Equivalen a una vista "desde arriba" (similar a una
proyeccin topogrfica) del plano - t
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Ventajas de los detectores de arreglo de
fotodiodos
Gran riqueza de informacin.
Clculo de pureza de picos
Se comparan matemticamente los espectros en la
subida, en el pice y en la bajada del pico. Se
generan ndices de pureza numricos. Permite
detectar solapamiento de picos (mala separacin).
Correccin de absorcin inespecfica o efectos de
refraccin.
Manipulacin matemtica avanzada de espectros y
cromatogramas
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Sistemas de deteccin de fluorescencia
Son filtrofluormetros o espectrofluormetros provistos
de una celda de flujo.
Son menos empleados que los de absorcin, pero
proveen mayor selectividad (pocas sustancias
fluorescentes) y elevada sensibilidad.
Se emplean por ejemplo para vitaminas en baja
concentracin.
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Sistema de deteccin refractomtrico
Se basa en la variacin del ndice de refraccin del lquido
con la concentracin del analito.
Es un detector universal (no selectivo).
Se emplea p. ej. cuando el analito no absorbe en el UV-
visible (caso de azcares).
Requiere un control muy estricto de la temperatura.
Su operacin es delicada (picos positivos o negativos).
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Sistemas de procesamiento
de datos
Similares a los empleados en GC.
Mnimo: registro grfico del cromatograma, deteccin de
picos, t
R,
rea de picos.
Configuracin de parmetros de deteccin e integracin
de picos.
Prestaciones avanzadas.
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Sistemas de procesamiento
de datos
Antiguamente:
integrador - registrador
(tira de papel) - caen
en desuso
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Actualmente: sistemas informatizados avanzados
(chemstations).
Control total del instrumento.
Tiempo de retencin, rea, altura de pico, ancho medio,
estadsticas.
Identificacin automtica.
Informacin especfica dependiente del detector: espectros,
reconocimiento analitos por bibliotecas de espectros.
Generacin de informes con formatos complejos (GLP, etc.)
Sistemas de procesamiento
de datos
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Sistemas informatizados
modernos
Un ejemplo: Chemstation
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Control del instrumento
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Informacin cromatogrfica
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Informacin espectral
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Informacin espectral
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Reportes
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Diagnsticos