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o
ln k = ln
Donde, k es la velocidad de reaccin; A {(ufc/ml, g o cm
2
)/tiempo} es un factor pre-exponencial
parmetro a ser determinado (intercepto de y en una grfica de Lnk vs 1/T) , R es la
constante de los gases (8.314 J mol
-1
K
-1
), T es la temperatura absoluta (K), y E
a
es
denominada como la energa de activacin de la reaccin lmite de velocidad-crecimiento (Ross
y McMeekin, 1994). Si en la ecuacin anterior los valores de k son calculados a diferentes
temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse una lnea recta en la cual la
pendiente (m) es igual E
a
/R (Dominic, 2004; McDonald y Sun, 1999; Labuza et al., 1992;
Labuza y Riboh, 1982). As el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la clasificacin de
Whiting y Buchanan (1993) como un modelo secundario.
Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el
crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento especfico
(Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi et al., 1998), y la ecuacin de Arrhenius puede escribirse
como:
= Ac
Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las grficas
pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuacin anterior no puede encajar muy bien por
debajo de los datos ptimos o por encima de las temperaturas de crecimiento. Entonces, las
grficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de
temperatura (McDonald y Sun, 1999; Labuza y Fu, 1993). As la ecuacin que ha sido utilizada
mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es
el modelo de la raz cuadrara propuesto por Ratkowsky et al., en 1982 (Giannuzzi et al., 1998;
Neumeyer et al., 1997; Willocx et al., 1993; Adair et al., 1989).
= g (
0
)
Cabeza-Herrera, E.A. Aplicacin de la Microbiologa Predictiva en la determinacin de la vida til de los alimentos 9
6. Ejercicio de estimacin de la vida til empleando modelos predictivos y test
acelerados de tiempo.
En el proceso de pasteurizacin de la leche a 72C por 15 segundos se busca reducir la carga
total microbiana un 99,99%. El producto est pensado para ser mantenido en condiciones de
refrigeracin (4C 0,5C). La variable microbiolgica a controlar es el recuento total de
viables, cuyo lmite mximo de crecimiento permitido es 4x10
4
ufc/ml. Si la carga inicial es de
10x10
6
bacterias por ml, al final del proceso se detecta que la poblacin final remanente es de
1000 ufc/ml.
Determine la vida til a 4C empleando los datos del test acelerado de tiempo durante 12 horas
mostrados a continuacin:
Tiempo (min)
10C 20C 30C
ufc/ml
0 1000 1000 1000
58 1047 1479 3162
115 1096 2188 9772
173 1148 3236 30903
230 1202 4786 95499
288 1259 7079 295121
346 1318 10471 912011
403 1380 15488 2818383
461 1445 23442 8128305
518 1514 34674 21379621
576 1585 51286 45708819
634 1660 75858 75857758
691 1738 112202 100000000
749 1820 165959 112201845
Para el clculo de la vida til pueden emplearse varios modelos predictivos, pero vamos a
comenzar con la aproximacin de Arrhenius.
1. El primer paso una vez obtenida la poblacin en unidades logartmicas (ln ufc ml
-1
) es
calcular la velocidad de crecimiento especfica () para cada temperatura. Esta puede
obtenerse de diversas maneras, una es graficando en las ordenadas el ln ufc ml
-1
en fase
exponencial y en las abscisas el tiempo (min), y a partir de esta grfica obtener la
ecuacin de la recta en cuyo caso la pendiente es igual a la velocidad de crecimiento
especfica (ufc ml
-1
min
-1
). Otra forma es calculando a partir de la siguiente expresin:
=
(ln
ln
0
)
(t
t
0
)
Tambin puede emplearse el uso de software especficos como el DMFit, MicroFit, etc.
Cabeza-Herrera, E.A. Aplicacin de la Microbiologa Predictiva en la determinacin de la vida til de los alimentos 10
10C (283K) 20C (293K) 30C (303K)
(ln ufc/ml*min)
0,000799 0,006838 0,019400
1/T (1/K)
0,003534 0,003413 0,003300
2. Con los resultados de para cada temperatura procedemos a calcular las constantes del
modelo de Arrhenius: energa de activacin (Ea) y el Factor pre-exponencial A. Para este
caso graficaremos en las ordenadas el ln a cada temperatura y en las abscisas el inverso
de cada temperatura absoluta (1/T). Recordemos que cuando se grafica de esta forma, la
pendiente de la recta (m) que se obtiene es igual a: Ea/R (y que por tanto Ea = m*R,
que en todos los casos ser positiva); y el intercepto en el eje y cuando X=0 es el factor
pre-exponencial en logaritmo (LnA).
Figura 1. Relacin entre la velocidad de crecimiento vs temperatura mediante la
cintica de Arrhenius
De la grfica podemos inferir que:
Ea = (m*R)
R = 8,314472 J mol
-1
K
-1
Ea = (13679 Ln ufcK/ml*min * 8,314472 J/molK)
Ea = 113733,662 Ln ufc*J/ml*min*mol.
LnA = 41,371 Ln ufc/ml*min
3. Una vez obtenidos los parmetros procedemos a calcular a 4C (277K) reemplazando
en la ecuacin de Arrhenius.
Ln = Ln
Ln = 41,371(
Lnufc
ml min
)
113733,662 (
Ln ufc J
ml min mol
)
8,314472 (
J
mol K
) 277K
Ln = 43,27(
Ln ufc
ml min
) 47,13 (
Ln ufc
ml min
)
y = -13679x + 41,371
R = 0,9688
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0,00325 0,0033 0,00335 0,0034 0,00345 0,0035 0,00355
L
n
(
L
n
u
f
c
/
m
l
*
m
i
n
)
1/T (1/K)
Cabeza-Herrera, E.A. Aplicacin de la Microbiologa Predictiva en la determinacin de la vida til de los alimentos 11
ln = 8,01167
Ln ufc
ml min
= 0,0003316
Ln ufc
ml min
Por tanto, la velocidad de crecimiento especfico a 4C es de 0,0003316 Ln ufc/ml*min.
4. Procedemos a estimar entonces la vida til a 4C. Si nuestro valor lmite es 4,0x10
4
ufc/ml
(10,5966 Ln ufc/ml). Si tenemos que por cada minuto se incrementa 0,0003316 Ln ufc/ml
{recordemos que se obtiene del Ln ufc/ml vs tiempo (min)}, en cuanto tiempo se
alcanzarn las 10,5966 Ln ufc/ml que es nuestro valor lmite?
5. Podemos usar una sencilla regla de tres:
1 min 0,0003316 ln ufc/ml
X? 10,5966 ln ufc/ml
=
1mn 10,5966 n uc/ml
0,0003316 n uc/ml
X = 31955,97 minutos, aproximadamente 31956 minutos, o el equivalente a 22
das.
Con el empleo de la cintica de Arrhenius, obtendramos un producto con una vida til
media de 20 a 22 das si se conserva a temperatura de 4C.
Si usamos la aproximacin de Monod-Hinshelwood, debemos conocer el tiempo de generacin
a la temperatura problema, en este caso a 4C.
1. El primer paso y para este caso, debemos calcular k para cada temperatura, aunque
tenemos varias opciones, emplearemos en este caso la frmula:
g
=
ln2
Donde T
g
equivale al tiempo de generacin.
10C (283K) 20C (293K) 30C (303K)
0,000799 0,006838 0,019400
Tg = (0,693/)
867,33 min 101,35 min 35,72 min
2. El segundo paso es graficar el Log
10
Tg para cada temperatura experimental en las
ordenadas y la Temperatura en las abscisas.
Cabeza-Herrera, E.A. Aplicacin de la Microbiologa Predictiva en la determinacin de la vida til de los alimentos 12
Figura 2. Relacin entre el tiempo de generacin (expresado en unidades Log
10
) vs
temperatura de crecimiento.
3. A partir de la ecuacin de la recta calculamos el Log
10
T
g
a 4C.
Si y = 1,27ln(x) + 5,8484, entonces a 4C (x).
Log
10
T
g
= 1,27*ln(4) + 5,8484
Log
10
T
g
= 1,27*1,386 + 5,8484
Log
10
T
g
= 1,761 + 5,8484
Log
10
T
g
= 4,0878
T
g
= 10
4,0878
T
g
= 12240,7 min a 4C
4. Con los datos anteriores de T
g
a 4C, procedemos a establecer la vida til mediante la
ecuacin:
t
s
=
Log
s
og
0
og2
g
t
s
=
4,602 3
0,301
12240,7 mn
t
s
= 65148,16 mn
t
s
= 45,2 Js
Con el empleo del modelo de Monod-Hinshelwood, obtendramos un producto con una
vida til media de 45 das si se conserva a temperatura de 4C.
y = -1,27ln(x) + 5,8484
R = 0,9978
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
0 5 10 15 20 25 30 35
L
o
g
1
0
T
g
(
m
i
n
)
Temperatura (C)
Cabeza-Herrera, E.A. Aplicacin de la Microbiologa Predictiva en la determinacin de la vida til de los alimentos 13
7. Conclusin.
Si la vida til estimada para este producto a 4C es de 22 das con el modelo de Arrhenius,
como margen de seguridad puede establecerse una vida til de 18 a 20 das a 4C. Sin
embargo, con la aproximacin de Monod-Hinshelwood la vida til se ve prolongada a 45 das.
En este caso como margen de seguridad podramos establecer una vida til de 40 das.
Tal y como explica Labuza y Fu (1993) o McDonald y Sun (1999), cuando se emplea el modelo
de Arrhenius para el crecimiento bacteriano, las extrapolaciones de las grficas pueden no
mostrar linealidad, y por lo tanto, el modelo anterior no puede encajar muy bien por debajo o
por encima de las temperaturas evaluadas para el crecimiento, lo anterior puede evidenciarse
al comparar las Figuras 1 y 2, donde se observa que la relacin tanto de la velocidad de
crecimiento como del tiempo de generacin frente a la temperatura no es lineal, sino de tipo
exponencial o logartmico, es decir, se asemeja ms al proceso de crecimiento bacteriano, que
por regla general es fisin binaria, la cual es de tipo exponencial. Claro que debemos recordar
que no todas las bacterias siguen este proceso de crecimiento tal y como ocurre con
Streptomyces spp. (Formacin de hifas y esporulacin); Mixobacterias (Formacin de cuerpos
fructferos y esporulacin); Hyphomicrobium spp. (Gemacin); Nocardia spp. y Micoplasmas
(Formacin de filamentos y septacin).
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Anexo 1. Diversos valores de R (Constante de los gases ideales).
Valor de R Unidades (VPT
-1
n
-1
)
8.314472 JK
-1
mol
-1
0.0820574587 LatmK
-1
mol
-1
83.14472 cm
3
barmol
-1
K
-1
8.20574587 10
-5
m
3
atmK
-1
mol
-1
8.314472 cm
3
MPaK
-1
mol
-1
8.314472 LkPaK
-1
mol
-1
8.314472 m
3
PaK
-1
mol
-1
62.36367 LmmHgK
-1
mol
-1
62.36367 LTorrK
-1
mol
-1
83.14472 LmbarK
-1
mol
-1
0.08314472 LbarK
-1
mol
-1
1.987 calK
-1
mol
-1
6.132440 lbfftK
-1
g-mol
-1
10.73159 ft
3
psiR
-1
lb-mol
-1
0.7302413 ft
3
atmR
-1
lb-mol
-1
998.9701 ft
3
mmHgK
-1
lb-mol
-1
8.314472 10
7
ergK
-1
mol
-1