Recom (PCR) - 04042013A

RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS
QUE REALIZAN LA TCNICA DE REACCIN EN

CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): REAS Y
FLUJOS DE TRABAJO.
DOCUMENTOS TCNICOS PARA EL LABORATORIO CLNICO
Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de Referencia.
Instituto de Salud Pblica de Chile.
14 de enero de 2013
AUTORES
Biol. Jorge Fernndez Ordenes. PhD.
Jefe Subdepto. Gentica Molecular.
TM. Berta Olivares Vicencio.
Encargada de Calidad.
Subdepto. Gentica Molecular.
BQ. Soledad Ulloa Urrutia.
Profesional Subdepartamento de Gentica Molecular.
Subdepto. de Gentica Molecular.
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN
LA TCNICA DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): REAS Y FLUJOS DE TRABAJO.
REVISORES INSTITUTO DE SALUD PBLICA
Winston Andrade Lillo. PhD.
Profesional Seccin Virus Respiratorios y Exantemticos.
Subdepto. de Enfermedades Virales.
BQ. Pamela Araya Rodrguez.
Jefe de Seccin Bacteriologa.
Subdepto. Enfermedades Infecciosas.
TM. Mitzy Celis Morales.
Jefe Seccin Coordinacin de Redes de Laboratorios.
Subdepto. Coordinacin Externa.
BQ. Rodrigo Fasce Pineda.
Jefe Seccin Virus Respiratorios y Exantemticos.
Subdepto. de Enfermedades Virales.
Dr. Juan Carlos Hormazbal Opazo
Jefe Subdepto. Enfermedades Infecciosas
Biol. Daniel Ibaez Cabrera.
Profesional Seccin Bacteriologa.
TM. Mara Isabel Jercic Lara.
Jefe Seccin Parasitologa.
Subdepto Enfermedades Infecciosas.
Dra. Paola Pidal Mndez.
Jefe Departamento Laboratorio Biomdico Nacional y de
Referencia.
Dra. Vernica Ramrez Muoz.
Jefe Subdepto Coordinacin Externa.
T.M. Rodrigo Villarroel Venegas.
Profesional Seccin Parasitologa.
REVISORES EXTERNOS
Dra. Marcela Lagos Lucero.
Jefe de Laboratorio de Biologa Molecular y Citogentica.
Departamento de Laboratorios Clnicos.
Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Catlica de Chile.
Dra. Gabriela Muoz Gmez.
Unidad Biologa Molecular.
Laboratorio Clnico.
Hospital Clnico Universidad de Chile.
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RESUMEN
El siguiente documento entrega recomendaciones
sobre las reas y flujos de trabajo para los laboratorios
que realizan tcnicas de PCR, considerando princi-
palmente dos elementos que se deben tener en cuenta
al disear e implementar un laboratorio de PCR: la se-
paracin de reas de trabajo con sets independientes
de equipamiento, que no se comparten entre reas, y
el flujo unidireccional de trabajo desde el rea ms
limpia hacia la ms sucia. La rigurosa aplicacin de
las medidas presentadas en este documento permitir
un control efectivo de la contaminacin con cidos
nucleicos, asegurando resultados confiables en labo-
ratorios que realizan la tcnica de PCR. Cabe destacar
que, tanto la infraestructura y disposicin de las reas
en el laboratorio como el entrenamiento que reciba el
personal dedicado a realizar esta tcnica, son funda-
mentales para el xito en la aplicacin de estas reco-
mendaciones.
ALCANCE
Estas recomendaciones aplican a los laboratorios
que realizan tcnicas de PCR de punto final y de tiempo
real. No incluye sistemas automatizados de PCR.
INTRODUCCIN
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
fue descrita en el ao 1986 por K. Mullis como una ampli-
ficacin enzimtica especfica de ADN realizada in vitro, es
decir, donde un segmento particular de ADN es copiado y
especficamente amplificado al ser delimitado por un par de
partidores (oligonucletidos) que lo flanquean. El copiado
se logra de forma exponencial a travs de repetidos ciclos
de diferentes etapas y temperaturas de incubacin en pre-
sencia de una enzima ADN-polimerasa termoestable.
RECOMENDACIONES PARA LABORATORIOS QUE REALIZAN LA
TCNICA DE REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
REAS Y FLUJOS DE TRABAJO.
La PCR es una tcnica rpida y verstil, convirtin-
dose hasta la fecha en una tcnica comnmente utilizada
en diversos laboratorios. Tiene ventajas tales como re-
querir una cantidad mnima de templado en la reaccin,
el cual no necesariamente debe estar puro, permitiendo
una fcil y rpida obtencin de resultados. Sin embargo,
la experiencia ha permitido establecer una gran limi-
tante, como es la alta susceptibilidad de contaminacin
en alguna de las etapas de la tcnica: la extraccin del
templado, la preparacin de reactivos, la dispensacin o
carga del templado y la etapa de electroforesis (slo para
el PCR de punto final).
Para minimizar este problema existen ciertas condi-
ciones que deben ser controladas, tales como: separar
reas de trabajo contaminadas con templado de aquellas
reas libres de l con sets independientes de equipa-
miento que no se deben compartir entre reas (micro-
pipetas, gradillas, delantales, guantes, coolers, toalla
absorbente, alcohol, lpices marcadores, microtubos,
minicentrfugas, refrigeradores, etc) y mantener un flujo
unidireccional de trabajo desde las reas ms limpias
hacia las ms sucias.
Este documento est dedicado a describir las reco-
mendaciones de consenso a nivel internacional sobre
cmo establecer un laboratorio de PCR con condiciones
fsicas ptimas para la obtencin de resultados fiables y
libres de contaminacin. No incluye sistemas automati-
zados de PCR.
Muchas veces, algunos de los recursos necesarios
ya estn presentes, por lo que el proceso de conversin
es ms fcil. Sin embargo, es preciso mencionar que
cada laboratorio de PCR tiene sus propios requisitos, los
cuales deben ser cuidadosamente considerados cuando
se evala lo necesario para iniciar y operar este tipo de
laboratorio con xito.
En cuanto al personal encargado de realizar ensayos
de PCR, ste debe estar capacitado en el correcto uso de
los implementos, reactivos, equipos y todo aquello que
est relacionado con la tcnica.
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DEFINICIONES
Amplicn:
Conjunto de molculas de ADN idnticas, resultado de
una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Tambin
se conoce como producto de PCR.
rea limpia:
Espacio fsico libre de amplicones, templados de ADN y
de muestras biolgicas que pudieran contaminar futuras
PCR. Corresponde al rea de preparacin de reactivos,
tambin llamada Pre-PCR.
rea sucia:
Espacio fsico donde existe presencia y manipulacin de
amplicones, ADN/ARN y/o muestras biolgicas. Com-
prende las reas de Extraccin del templado, rea de
Carga dispensacin del templado, rea de Amplifica-
cin (donde estn los termocicladores) y, para el caso de
PCR de punto final, el rea de Electroforesis.
Mezcla de PCR:
Preparacin y mezcla de los componentes necesarios
para que ocurra una reaccin de PCR tales como agua
libre de nucleasas, Mg
+2
, dNTPs, partidores y enzima
polimerasa termoestable (Taq polimerasa).
PCR de punto final:
Tambin conocido como PCR convencional permite vi-
sualizar, mediante una electroforesis, la acumulacin de
amplicones generados al final de un nmero predetermi-
nado de ciclos.
PCR de tiempo real:
Permite detectar la cintica de la acumulacin de ampli-
cones durante cada ciclo inmediatamente, sin necesidad
de una electroforesis posterior.
Templado:
cido nucleico (ADN o ARN) utilizado como molde para
la PCR, es decir, a partir de aquella molcula sern sinte-
tizadas las copias idnticas conocidas como amplicones.
Termociclador:
Equipo que permite realizar de forma automtica los ci-
clos de temperatura necesarios para una PCR. El termo-
ciclador es diferente si se realiza una PCR de punto final
o una PCR de tiempo real.
DESARROLLO
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
Esta tcnica se realiza en un equipo Termociclador y
consta, regularmente, de tres etapas:
1. Denaturacin inicial.
2. Una treintena de ciclos repetitivos.
3. Elongacin final, si es PCR de punto final.
A su vez, cada uno de los ciclos repetitivos de la eta-
pa 2 est conformado por 3 subetapas:
i. Denaturacin a 94C-96C, que provoca la ruptura
de los puentes de hidrgeno y la separacin de la
doble hebra del ADN en simple hebra, quedando
expuestas las bases nitrogenadas del templado.
ii. Hibridacin de los partidores, a una temperatura
que oscila entre 45C-65C (que depende del con-
tenido y proporcin de nucletidos de los partido-
res y/o de los amplicones). En esta etapa ocurre la
hibridacin de los partidores especficos con su
regin complementaria en el templado. La tempe-
ratura de esta etapa es variable, y es dependiente de
la temperatura de fusin (Tm) de los partidores.
iii. Elongacin a 68C-72C, temperatura a la que la
polimerasa va aadiendo los diferentes nucletidos
libres, en el orden que le va dictando la secuencia
de nucletidos de la cadena que acta templado,
desde el extremo 3` de los partidores.
Una vez finalizada la reaccin en el termociclador, se
obtienen millones de copias de amplicones. Si ha ocurri-
do contaminacin durante la preparacin de la PCR, po-
dran obtenerse amplicones inespecficos, es decir, que
no correspondan al ADN diana requerido, o bien falsos
positivos por contaminacin con templado o amplico-
nes, alterndose la confiabilidad de los resultados.
CONTAMINACIN
La contaminacin de las reacciones de PCR es un
problema constante para los laboratorios que realizan
este procedimiento. Sin embargo, hay una serie de me-
didas para controlar esta contaminacin, y el grado de
rigor que se requiere en un laboratorio a menudo se de-
termina segn el ensayo que se va a realizar.
Antes de planificar el diseo del laboratorio es pri-
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mordial conocer las fuentes y las vas comunes de con-
taminacin:
1.- Fuentes de contaminacin:
Corresponden a templados y amplicones.
2.- Vas de contaminacin:
- Aerosoles
La formacin de estas microgotas con cido nu-
cleico puede originarse por la apertura de tubos
que contengan: partidores, sondas (PCR en tiempo
real), templado y amplicones. Los aerosoles son de
fcil dispersin.
- Derrame de soluciones
El contacto de soluciones que contengan cidos
nucleicos (partidores, templado y amplicones) con
la superficie de trabajo es una va comn de conta-
minacin. Esto puede ocurrir ya sea por volcamien-
to de microtubos (y el consecuente derrame de la
solucin) o por la disposicin de tapas de micro-
tubos sobre la superficie, puntas de micropipeta ya
utilizadas, etc que dejan residuos contaminantes.
Las fuentes de contaminacin pueden provenir de
las muestras biolgicas que se manipulan durante la
etapa de extraccin y/o la etapa de carga o dispensacin
durante la preparacin de la reaccin de PCR, y de los
amplicones manipulados en el rea de Post-PCR, prin-
cipalmente.
Ellas pueden ser muy problemticas debido a su gran
estabilidad, contaminando: equipos, superficies, micro-
pipetas, microtubos, soluciones, guantes, delantales,
gradillas, coolers y lpices marcadores.
Para disminuir los riesgos de contaminacin en esta
metodologa, debe realizarse un cuidadoso estudio de
la ubicacin de las diferentes reas del proceso. A su
vez, es fundamental el uso exclusivo de equipamiento,
guantes y material de laboratorio en cada rea. En caso
de disear una nueva infraestructura, es recomendable
considerar los flujos de aire con presiones positiva y ne-
gativa segn el rea, as como el uso de cabinas de PCR
que posean luz ultravioleta.
Recomendaciones para disminuir la
contaminacin:
1.- No deben almacenarse en un mismo refrigerador/
congelador, reactivos libres de templado junto con
cidos nucleicos purificados y/o con muestras bio-
lgicas.
2.- Si se detecta contaminacin en algn reactivo, par-
tidor, sonda, agua, enzima, etc, ste debe ser elimi-
nado. Para evitar prdidas de los stocks de reactivos
por contaminacin, se recomienda preparar alcuo-
tas previo a su uso, de manera de slo eliminar la
alcuota en uso si se detecta contaminacin.
3.- Centrifugar brevemente (spin) los tubos que contengan
cidos nucleicos y luego abrirlos cuidadosamente para
evitar contaminar los guantes y las superficies.
4.- La superficie utilizada para preparar las reacciones
de PCR debe ser descontaminada con radiacin ul-
travioleta antes y despus de la preparacin (15 a
30 min). Si se sospecha contaminacin, adicional-
mente, una vez terminado el trabajo, pueden lim-
piarse las superficies con una solucin de 0,5- 1,0
% de hipoclorito de sodio, que luego debe ser re-
movido con etanol 70%. Tambin es posible utilizar
soluciones comerciales para este fin: DNAZap
(Invitrogen), DNA Away (VWR), DNA Remover
(Minerva Biolabs), entre otras.
5.- Es recomendable incorporar los siguientes contro-
les negativos, para tener un mejor manejo de las
contaminaciones:
a.- Control de extraccin:
Utilizar un reactivo, por ejemplo agua estril libre
de nucleasas, y manipularlo como una muestra
biolgica ms durante el proceso de extraccin
de cidos nucleicos.
b.- Control de reactivos:
Preparar el reactivo en el rea limpia y mante-
ner el tubo cerrado durante el resto del proceso.
Luego incubarlo en el termociclador y realizar la
electroforesis. Permite chequear los reactivos
que se estn utilizando para la preparacin de las
mezclas de PCR.
c.- Control de manipulacin:
Agregar agua en un microtubo en lugar de tem-
plado, cada 3-4 muestras dispensadas, durante
el proceso de carga en la preparacin de la PCR.
Permite chequear la manipulacin, por parte del
operador, de las muestras con templados.
d.- Control de rplica:
Para todo laboratorio que trabaje con PCR en
tiempo real, adems de utilizar los controles
antes mencionados, es necesario trabajar cada
muestra utilizando rplicas (al menos en duplica-
do) para descartar posibles falsos positivos, dada
la alta sensibilidad de la tcnica.
6
6.- Cada vez que un operador ingrese a un rea dife-
rente debe ponerse guantes y delantal nuevos, y
utilizar slo los equipos y materiales disponibles
en esa rea. Los delantales en cada rea son exclu-
sivos y no son intercambiables, es decir, el delantal
utilizado para trabajar en un rea sucia debe ser dis-
tinto al utilizado en un rea limpia (lo mismo ocurre
con los guantes). Para esto, es necesario disponer
de percheros ubicados en las distintas reas:
- rea limpia: una vez que se ha ingresado a esta
rea, el operador debe vestir inmediatamente un
delantal exclusivo. Antes de retirarse, el delantal
utilizado debe ser colgado en un perchero para
que permanezca en esta rea.
- rea sucia: siempre que el operador trabaje en
un rea sucia debe vestir un delantal exclusivo.
- rea de carga o dispensacin de muestras: una
vez que se ha ingresado a esta rea, el operador
debe vestir inmediatamente un delantal exclusi-
vo. Antes de retirarse, el delantal utilizado debe
ser colgado en un perchero para que permanezca
en esta rea y los guantes deben ser eliminados.
Antes de salir del rea limpia, rea de carga o salir
del laboratorio, el delantal utilizado debe ser col-
gado en un perchero para que permanezca en esta
rea y los guantes deben ser eliminados.
Los delantales deben ser renovados permanente-
mente para asegurar la eliminacin de contaminantes
(delantales rea sucia) y mantencin de la limpieza
(delantales rea limpia). Por esta razn, es altamente
recomendable el uso de delantales desechables.
7.- La adicin de Uracil-N-Glicosilasa (UNG) en con-
junto con dUTP (en lugar de dTTP) a la mezcla de
PCR, permite inactivar enzimticamente los ampli-
cones para evitar que sean futuras fuentes de con-
taminacin. Durante la PCR, los amplicones sern
sintetizados utilizando dUTP en vez de dTTP; para
una prxima PCR, en caso de haber contaminacin
por amplicones (contaminacin carry-over), la pre-
via incubacin con enzima UNG degradar los pro-
ductos que contengan dUTP, inactivndolos como
templado.
FLUJO DE TRABAJO UNIDIRECCIONAL
Unidireccional
Preparacin de reactivos (Pre-PCR)
Carga del templado
Amplificacin y deteccin (Post-PCR)
Figura 1:
Esquema de trabajo, en un laboratorio de PCR, con flujo uni-
direccional.
En la Figura 1 se resume el flujo de trabajo unidi-
reccional que debe seguirse al realizar las actividades
propias de un laboratorio de PCR, de manera de trabajar
siempre desde el rea ms limpia hacia las reas ms
sucias: Preparacin de reactivos, Carga o dispensacin
del templado, Amplificacin y Deteccin (tanto para
PCR de punto final como para PCR de Tiempo Real).
El rea de procesamiento de las muestras (Ex-
traccin de templado) debe estar separada del rea
de amplificacin y deteccin. La extraccin de cidos
nucleicos debe realizarse en un gabinete de bio-
seguridad clase II, de forma que el personal que
manipule muestras biolgicas se mantenga protegido
y, al mismo tiempo, se asle el templado de posibles
contaminaciones externas.
Para mantener el flujo unidireccional de trabajo, y
evitar retroceder desde reas sucias hacia reas lim-
pias, cada una de las reas debe contar con recursos
exclusivos tales como: agua libre de nucleasas, centr-
fugas, vrtex, refrigeradores/congeladores, micropipe-
tas, puntas para micropipetas y todo lo que sea necesa-
rio para la realizacin de la tcnica. Se incluye adems,
elementos adicionales como computadores, lpices y
calculadoras que deben ser exclusivos de cada rea
y no intercambiables. Asimismo, debern mantenerse
cantidades suficientes de guantes y delantales en cada
rea, de forma que su uso sea exclusivo en cada una
de ellas y se disminuya al mnimo el riesgo de conta-
minacin.
7
Todos estos elementos deben estar rotulados
segn el rea a la que pertenezcan y no deben ser trasla-
dados a otro espacio del laboratorio.
Cabe destacar que las puntas para micropipetas uti-
lizadas en todas las reas deben tener filtro para evitar
la contaminacin de las mismas por formacin de ae-
rosoles.
El personal, una vez finalizada su tarea en cada rea,
debe sacarse los elementos de proteccin (delantal,
guantes y manguillas desechables) antes de moverse al
rea que el flujo unidireccional le indica.
rea Limpia de Preparacin de Reactivos
El rea de preparacin de reactivos se define como
aquella rea limpia donde se utilizan protocolos y equi-
pamientos para preparar las mezclas de reaccin que
sern utilizadas en la PCR. Todo equipamiento de esta
rea es exclusivo y no se puede utilizar en otra rea del
laboratorio. En este lugar debe haber un congelador de
-20C de uso exclusivo para almacenar los reactivos
utilizados para preparar reacciones de PCR, y nunca
mezclarlos con cualquier tipo de material biolgico (ex-
tractos de ADN o ARN, cultivos, material clonado y am-
plicones). Los stocks de partidores (oligonucletidos) y
los reactivos de PCR nuevos deben almacenarse en una
ubicacin diferente, dentro del mismo congelador, con
respecto a los reactivos de uso diario, para evitar su po-
sible contaminacin.
Como se mencion anteriormente, los delantales y
guantes utilizados en esta rea deben ser exclusivos, ya
que no debe existir contaminacin desde otras reas. Por
lo tanto, el personal que ingrese a esta sala debe sacarse
previamente los elementos de proteccin que est utili-
zando, y vestir elementos de proteccin limpios una vez
dentro de esta rea.
Este espacio debe contar con una cabina de PCR
cerrada que posea luz ultravioleta. Dentro de esta cabi-
na deben manipularse todos los reactivos para preparar
mezclas de PCR. En su interior deben mantenerse la mi-
cropipetas, tubos y gradillas de uso diario.
La cabina cerrada va a permitir:
Irradiar la superficie de trabajo dentro de la cabina
con luz ultravioleta previo a su uso, de forma que
las pirimidinas de cualquier traza de cido nuclei-
co presente en la cabina formen dmeros entre s
(cross-link) bloqueando el paso de la polimerasa
en una futura reaccin de PCR.
rea de Carga o Dispensacin de Templado
En esta rea deben dispensarse los templados a las
mezclas de PCR que han sido preparadas en el rea lim-
pia. El personal debe ingresar y utilizar los elementos de
proteccin exclusivos de esta rea. Adems, debe contar
con cabina de PCR cerrada que posea luz ultravioleta,
micropipetas, gradillas y microcentrfuga de uso exclu-
sivo. Antes de abrir los tubos que contienen el ADN tem-
plado, debe realizarse una breve centrifugacin (spin)
para evitar el escape de aerosoles al abrir el tubo. Una
vez adicionado el cido nucleico templado, cerrar her-
mticamente los tubos y llevar al rea de amplificacin.
Una vez preparadas las mezclas de PCR, el personal
nuevamente debe quitarse guantes y delantal (exclusivos
de esta rea) y dirigirse a los termocicladores para dar
inicio a la reaccin de PCR.
rea de Amplificacin y Deteccin (slo para
PCR de punto final)
Antes de entrar a esta rea sucia, el personal debe
vestir guantes y delantal exclusivos de este sector.
En el caso del PCR de punto final, al finalizar la reac-
cin en el termociclador, los amplicones son manipula-
dos en el sector de electroforesis para la verificacin de
resultados, el cual debe contar con cmaras de electro-
foresis, fuentes de poder y los materiales requeridos para
su funcionamiento.
rea de Extraccin y Purificacin de Templado
En este espacio deben realizarse las extracciones
y/o purificaciones de cidos nucleicos que luego sern
utilizados como templado para las reacciones de PCR.
El almacenamiento de este material debe realizarse en
un congelador exclusivo ubicado dentro de este espa-
cio. La extraccin debe realizarse en un gabinete de
bioseguridad clase II, de forma que el personal que
manipule muestras biolgicas se mantenga protegido y,
al mismo tiempo, se asle el templado de posibles conta-
minaciones externas.
El equipamiento de esta rea es exclusivo y no puede
ser usado en otra rea del laboratorio. El personal, al in-
gresar, debe utilizar delantal y guantes exclusivos de esta
rea y no puede trasladarlos a otra rea del laboratorio.
8
FLUJOS DE AIRE AMBIENTAL
Las diferencias de presin del aire pueden usar-
se para inhibir el pasaje de contaminantes entre reas:
presiones ms altas se utilizan en reas limpias que se
encuentren prximas o contiguas a reas sucias a fin de
minimizar las contaminaciones.
Por esta razn, las reas de Pre y Post-PCR ideal-
mente deben contar con presiones de aire distintas y
controladas individualmente. Mientras el rea limpia
de Preparacin de reactivos debe tener una ligera
presin positiva, entre 5-20 Pa por sobre la presin
existente en el pasillo de conexin entre reas, las otras
reas deben tener una ligera presin negativa
para ingresar aire desde el exterior y, por ende, preve-
nir el escape de contaminantes hacia otros lugares del
laboratorio.
Es necesario, adems, que los controladores de pre-
sin estn conectados a conductos de escape de aire
separados, de forma que cada uno lleve el aire extrado/
ingresado a lugares distintos y no exista contaminacin
por esta va.
CONCLUSIONES
La rigurosa aplicacin de las medidas presentadas
en este documento permitir un control efectivo de la
contaminacin y la obtencin de resultados confiables
en laboratorios que realizan la tcnica de PCR.
Cabe destacar que tanto la infraestructura y dispo-
sicin de las reas en el laboratorio como el entrena-
miento que reciba el personal dedicado a realizar esta
tcnica, en el contexto de un slido sistema de calidad,
son fundamentales para el xito en la aplicacin de estas
recomendaciones.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
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ratory Design and practices. Clinical and Laboratory
Standards Institute. USA. 2006.
13.- MM05-A2. Nucleic Acid Amplification assays for mo-
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edition. Clinical and Laboratory Standards Institute.
USA. 2012.

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