Universidad Nacional de Asuncin

Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud

IICS - UNA

Virologa Ambiental
Mara Eugenia Galeano Dinatale, M.Sc.
Universidad Nacional de Asuncin
Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud
Dpto. de Biologa Molecular y Gentica

e-mail: maruphd@hotmail.com

Recordemos.....Virus. Caractersticas generales:

DNA

18 nm

Diferentes
Parvovirus
Mimivirus
Tamaos/Formas
Diferente Estructura / Propiedades de superficie
Genoma: RNA DNA
Envueltos (Hidrofbico)- No envueltos (Hidroflico)
Influenza virus

Bacteriofago

Son tan pequeos por lo que pueden actuar como partculas coloidales
en el ambiente,
pueden interactuar
con vrios medios y matrices (ej:
Parsitos
intercelulares
obligados
aire, agua, desechos, superficies).

Biolgicamente activos slo en el husped

(animal, humano, vegetal o bacteriano)
Submicroscpicos

Ambiente

Vrios procesos de
transporte, dilucin, secuestro, degradacin e
inactivacin...

Transmisin
Respiratoria

Agua

Directa
Indirecta

Vector

Gotas
(dia >20 m)

Vehculos

Fecal - Oral

Alimentos

Fomites/Superfcies

Aerosoles
(dia <5 m)

CONTAMINACIN MICRIOBIOLGICA DE
LOS ALIMENTOS y AGUAS DE CONSUMO
BACTERIAS

13%
7%

VIRUS

PROTOZOARIOS

80%

*Bacterias: Campylobacter spp, Clostridium perfringens, Salmonella spp.,

Shigella spp., Staphylococcus spp. Escherichia coli.
*Protozoarios: Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, Toxoplasma gondii.
*Virus: Norovirus, Hepatitis A, Rotavirus, Hepatitis E.
Modificado de: Mead et al. 1999. Emerg Infect Dis. 5(5):607-25.

Virologa Ambiental
Aspecto aplicado de la Virologa.

Estudia a los virus en ambientes acuticos, suelo,

alimentos, superfcies o aerosoles.

Virus: Cuales?

Virus entricos de transmisin fecal-oral

Virus respiratorios

-Parmetros de calidad de agua/alimentos: Coliformes

Fecales y Totales. E coli
-Facilidad de transporte y persistencia en el ambiente.
- Potencial / Riesgo de transmisin.
- Importancia clnica: capacidad de exposicin del
hospedador, de infectar y causar enfermedad.

Virus de importancia agroganadera

Factores que afectan a los virus en el

ambiente

Fsicos

Qumicos

Humedad Relativa (HR).

Temperatura.
Luz Solar / UV.
Secuestro retencin.
Qumicos antivirales especficos. ej: Amonio.
Niveles de pH (>8,5).
Asociacin con slidos. ej: biopelculas, flculos.
Material orgnico: tipo y volmen.
Composicin del medio de suspensin.
Calidad del aire. Polucin.

Biolgicos

Tipo de virus. ej: envuelto / no-envuelto.

Propiedades de la superfcie del vrus.
Formacin de bioaerosoles
Antagonismo microbiolgico

Ecolgicos

Condiciones climticas. ej: Lluvia.

Actividad del medio. ej. flujo, caudal, etc.
Ciclo de transmisin del virus.
Comportamiento Humano
Degradacin del ambiente

Sistemas de Recuperacin, Deteccin y

Cuantificacin de partculas virales

Objetivo
principal
y Tipo de
En
heces,
vsceras
demedio
animales,

desechos
tratados, alimentos y muestras ambientales con alta
concentracin de virus. Extraccin simple con solventes y
elucin.
Microscopia
electrnica
y
cultivo
celular.
(Deng
and
Caractersticas del medio vs. Concentracin viral
Cliver, 1992; Turner et al., 1999)
En muchos medios los virus se encuentran tan diluidos que
necesitan ser concentrados,
separados
purficados de los
Concentracin
viral vs. Volumen
dey muestra
constituyentes del medio que puedan interferir con su
deteccin. (Bosch, 1998) Cultivo celular y mtodos
moleculares.

Volumen de muestra vs. Maniobrabilidad y

Factibilidad costo/espacio/tiempo

Virus en sistemas acuticos

Mtodos de recuperacin

Vrus entricos ms frecuentes:

Rotavirus
Astrovirus
Calicivirus
HepatitisA
Enterovirus
Poliovirus
Aichivirus
Coxsackie virus
Reovirus
Torqueteno virus

Adenovirus 40/41
Hepatitis E
Bocavirus
Echovirus

Mtodo de concentracin IDEAL: tcnicamente simple, rpido y

accesible, capaz de procesar grandes volmenes de gua, de
obtener volumen pequeo de concentrado, de promover una gran
recuperacin y de detectar una mplia variedad de virus, adems
de ser repetitivo y reproducible (Bosch, 1998; Li et al., 1998; WynJones & Sellwood, 2001).

NO EXISTE!!!

Virus en sistemas acuticos

Concentracin de partculas virales
Muestra
el virus
es puesta
enMasa
una MATRIZ
Los virus en la muestra son retenidos
en con
un Filtro
en virtud
de su
que lode
absorve
bajo
condiciones
Molecular, independientemente
su carga
elctrica
total. especficas de
pH y fuerza inica. El agua resultante es
Hidroextracin.
(Wellings
et al.
1976)
Ultrafiltracin.
Presin/Flujo
tangencial.
desechada
y las partculas
virales
eluidas de la
matriz
en unKatayama
volumen menor
yal.
concentradas
en
(Poynter et al.
1975;
et
2002)
PEG 6000 o
Retencin en Slido
el eluato
por
precipitacin
cida
y centrifugado.
Sacarosa
Higroscpico
et al. 1976)
Masa (Katzenelson
Molecular Por DILISIS

Adsorcin-Elucin

Trampas

Por PRESIN

Varias Horas a 4C

7 um

pHRetencin de
Fuerza inica
partculas

MUESTRA DE
MUESTRA DE AGUA
AGUA

MATRIZ

Bolsa de
membrana de
Dilisis
0,45 um
MATRIZ
FILTROS
y
MUESTRA
DE
MEMBRANAS
AGUA
de diferente
Porosidad

Pads de Gasa
Ultracentrifugacin
Membranas o Cartuchos
Elucin de la
membrana

cargados: Electropositivos o
Electronegativos

Otras tcnicas

Vidrio: Polvo o Lana

Virus
concentrado

Virus
Retencin
de
mayores
concentrado
partculas virales
Precipitacin
cida y
Agua
Centrifugacin
resultante

Agua Agua
resultante
resultante
Elucin de la
membrana

Virus
concentrado

Virus en sistemas acuticos

Concentracin de partculas virales

Ultracentrifugacin

Centrifugacin, capaz de concentrar todos

los virus aplicando suficiente fuerza de
gravedad y tiempo.

Otros mtodos
Agua
resultante

Floculacin. (Calgua et al. 2008)

CENTRIFUGACIN

MUESTRA DE
AGUA

FUERZA G
TIEMPO

Pellet
Resuspensin
Virus
concentrado

HCl [1N]
pH 3,5

LECHE
DESCREMADA
pH 3,5

SALES MARINAS
Conductividad
>1,5 mS

Agua
resultante
CENTRIFUGACIN

MUESTRA DE
AGUA
Agitador Magntico
Reposo
8-10 HORAS
8-10 HORAS

Pellet

RESUSPENSIN

Virus
concentrado

Virus en Sistemas Slidos

Mtodos de recuperacin

ALIMENTOS
En Lodos -> Biopelculas: Los
grnulos consistentes en
BIVALVOS:
ALIMENTACION POR
FILTRACIN y hongos
bacterias, polmeros
extracelulares,
protozoarios

Grnulo maduro esfrico de lodo

activado formado por bacterias y
polmeros extracelulares. Colonizado
SISTEMAPeritrichia).
DIGESTIVO
por ciliados (subclasse
Image: SEM scanning electron
microscopy.
Weber et al. (2007).

Victoria et al. 2004

Virus en Sistemas Slidos

Mtodos de recuperacin

Determinacin del Volumen de muestra:

secado 50mL a 103C-105C

Homogenizacin

Degradacin / Elucin de los virus de las

partculas slidas

Purificacin

Concentracin
ELUYENTES

Maceracin
Competenicia
(Stomacher)

Agitacin
activo.
Ej: Casena,
magntica

por el sitio
Aminocidos (Lisina, Glisina, Ac. Asprtico)

Ultra-sonicacin

Extracto de carne,

Disminucin de interaccin electroesttica/hidrofbica. Ej: Detergentes

Deteccin
(SDS, EDTA), agentes caotrpicos/anticaotrpicos.

Mtodos de Deteccin

Extraccin de cidos nuclicos: Isotiocianato de

Guanidina y slica (Boom et al. 2002) Kit de
extraccin. Compuestos fenlicos (ej.Trizol)
Tcnicas de Biologa Celular y Molecular:
Cultivo Celular
Electroforesis en gel de acrilamida (PAGE)
Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
Real time PCR (PCR cuantitativo)

CONCENTRACIN Y
DETECCIN

CARACTERIZACIN Y
TIPIFICACIN

MUESTRA DE
AGUA

CUANTIFICACIN

Norovirus

Genogrupo GII
Genotipo GII.4
En c/ 10 uL existen 4000 (4 x 103) copias
de genoma (partculas virales?)

En 1 Litro de muestra????
Cuntas copias de genoma (partculas virales)????
PARA LA INFECCIN.UNA SOLA PARTCULA VIRAL VIABLE BASTA!

Importancia

Brotes y Epidemias. Contencin y paliacin de

daos. Humanas, animales. Agroganadera.
Manejo de sistemas hdricos. Plantas de
tratamientos afluentes y efluentes.
Control de calidad de aguas de consumo,
alimentos y en la Industria.
Zonas tursticas y recreacionales.
Advertir a las autoridades nacionales e
internacionales. Legislacin.

GRACIAS POR SU ATENCIN!!!