Francisco Javier Guzmn Bernardo

ESTUDIO ANALTICO DE SULFAMIDAS,

COMPUESTOS ASOCIADOS Y PRODUCTOS DE
DEGRADACIN MEDIANTE NUEVOS
MTODOS DE SEPARACIN




I.S.B.N. Ediciones de la UCLM
84-8427-396-2










Cuenca, 2005

UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA
Facultad de Ciencias Qumicas
Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos





ESTUDIO ANALTICO DE SULFAMIDAS,
COMPUESTOS ASOCIADOS Y PRODUCTOS DE DEGRADACIN
MEDIANTE NUEVOS MTODOS DE SEPARACIN


FRANCISCO JAVIER GUZMN BERNARDO


TESIS DOCTORAL
Ciudad Real, 2001



Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de Alimentos
Facultad de Ciencias Qumicas

ESTUDIO ANALTICO DE SULFAMIDAS,
COMPUESTOS ASOCIADOS Y PRODUCTOS DE
DEGRADACIN MEDIANTE NUEVOS
MTODOS DE SEPARACIN

por
Francisco Javier Guzmn Bernardo

Visado en Ciudad Real, 7 de mayo de 2001




Fdo. Juan Jos Berzas Nevado
Catedrtico de Universidad del
Departamento de Qumica
Analtica y Tecnologa de
Alimentos de la Universidad
de Castilla-La Mancha

Trabajo presentado para optar al Grado de
Doctor en Ciencias Qumicas





Fdo. Francisco Javier Guzmn Bernardo
Licenciado en Ciencias Qumicas


Fdo. Gregorio Castaeda Pealvo
Profesor Titular del
Departamento de Qumica
Analtica y Tecnologa de
Alimentos de la Universidad
de Castilla-La Mancha

DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA
Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS

JOS MARA LEMUS GALLEGO, Profesor Titular de Universidad y
Secretario del Departamento de Qumica Analtica y Tecnologa de
Alimentos de la Universidad de Castilla-La Mancha,

CERTIFICA:

Que el presente trabajo de investigacin titulado
Estudio analtico de sulfamidas, compuestos asociados y productos
de degradacin mediante nuevos mtodos de separacin
constituye la Tesis Doctoral que presenta D. Francisco Javier
Guzmn Bernardo para aspirar al Grado de Doctor en Ciencias
Qumicas, y ha sido realizado en los laboratorios de este
Departamento bajo la direccin de los profesores Dr. D. Juan Jos
Berzas Nevado y Dr. D. Gregorio Castaeda Pealvo.


Y para que conste, expido y firmo el presente certificado en
Ciudad Real a siete de mayo de dos mil uno.




V B






Fdo. Mara Dolores Cabezudo Ibez
Directora del Departamento
Fdo. Jos Mara Lemus Gallego
Secretario del Departamento


En este momento, en el que est por concluir este trabajo de investigacin, quiero
dar las gracias a todos aquellos que me han ayudado a llegar a este momento.

Al Dr. D. Juan Jos Berzas Nevado por depositar su confianza en m para formar
parte de su equipo investigador y por darme apoyo de una manera decidida y constante
durante todo este perodo.

Al Dr. D. Gregorio Castaeda Pealvo por haberse dedicado con una paciencia y
una entrega encomiables a mi formacin en el mbito cientfico y por haberme ofrecido su
amistad sincera desde el primer momento.

A mi familia y a Mari Luz, que siempre han estado muy prximos a m y han hecho
suyos mis anhelos, ilusiones y contrariedades, brindndome su calor y ayudndome a
superar los momentos ms difciles.

A mis amigos, Agustn, Justo y ngel, con quienes he vivido unos aos plagados de
gratsimas experiencias que, por supuesto, siempre quedarn entre nosotros cuatro.

A mis compaeros del rea de Qumica Analtica por haberme ofrecido un
compaerismo y afecto que tanto he disfrutado, y tambin a mis compaeros de la
Facultad de Ciencias del Medio Ambiente, con quienes tantas veces he arreglado el mundo
mientras tombamos una taza de caf.

A todos aquellos que, de alguna u otra manera, han contribuido a que esta tesis
llegara a buen puerto.

A todos ellos, muchas gracias.









OBJETO DE LA TESIS

El objeto de esta Tesis Doctoral ha sido el de continuar incidiendo en el
conocimiento analtico de algunas sulfamidas y compuestos asociados, as como sus
productos de degradacin y metabolitos, con la finalidad de optimizar nuevos
procedimientos de separacin y determinacin de los compuestos citados, en productos
comerciales de uso clnico y veterinario as como en fluidos biolgicos, por
cromatografa lquida y por electroforesis capilar.
Parte importante del objeto de esta Tesis fue tambin el anlisis de aquellos
parmetros que pueden incrementar la sensibilidad del detector UV-Visible de diodos
en lnea en electroforesis capilar.














Introduccin 5
ANTECEDENTES HISTRICOS DE LAS SULFAMIDAS

La primera sulfamida que se sintetiz fue la sulfanilamida. Ya en 1908, Gelmo la
prepar como parte de un programa de investigacin de colorantes azoicos. Durante
muchos aos se utiliz slo como producto intermedio en la industria de los colorantes. Su
actividad antibacteriana se descubri un cuarto de siglo ms tarde, despus de una larga
serie de circunstancias interesantes. En 1932, Domagk (1) indic que el prontosil rubrum,
sintetizado por Mietzsch y Klarer, era activo en infecciones producidas por estreptococos
-hemolticos, aunque hasta 1935 no fueron introducidas en la teraputica (Prontosil). Por
este descubrimiento Domagk recibi el premio Nobel en 1938.
En 1935 un grupo de investigadores formado por Trfoul, Nitti y Bovet bajo la
direccin de Fourneau, en el Instituto Pasteur de Pars, demostr, tal como se acepta en la
actualidad, que la agrupacin azo del prontosil rubrum se reduce in vivo por la accin de
la azo reductasa, formando sulfanilamida, que es el producto activo (2).
H
2
N N
NH
2
N SO
2
NH
2
H
2
N NH
2
NH
2
NH
2
SO
2
NH
2
+
Prontosil Rubrum
Sulfanilamida

Figura 1. Reduccin del Prontosil Rubrum



6 Introduccin
Las sulfamidas o sulfonamidas, adems de constituir el primer tratamiento eficaz
de las infecciones bacterianas, provocaron una revolucin en quimioterapia al introducir y
comprobar el concepto de antagonismo metablico que ha sido de gran utilidad en qumica
farmacutica para explicar el mecanismo de accin de muchos frmacos y para disear
racionalmente nuevos agentes teraputicos.
Con objeto de obtener nuevas sulfamidas, se han sintetizado, hasta el momento,
alrededor de 15.000 derivados anlogos, relacionados con la sulfanilamida, en especial
relacionados con el cido p-aminobenzoico, dentro del ms intensivo y extenso programa
de modificacin molecular. La posterior modificacin de estos compuestos con nuevas
propiedades farmacolgicas ha conducido a muchos frmacos nuevos: antibacterianos
(sulfanilamidas), leprostticos (sulfonas), diurticos (sulfonamidas heterocclicas,
bencenodisulfonamidas, tiacidas), hipoglucemiantes (sulfonilureas), antimalricos
(cloroguanida, cicloguanilo), frmacos antitiridicos (propiltiuracilo, metimazol) y un
frmaco de utilidad en el tratamiento de la gota (probenecida).
Se designan con el nombre general de SULFAMIDA a todos aquellos compuestos,
con accin antibacteriana, que contienen la funcin sulfonamida R-SO
2
NH
2
, pero que, de
hecho, derivan del grupo para-amino-benceno-sulfonamida, en el que el radical R est
constituido por la anilina, y cuya frmula es:

H
2
N S NH
2
O
O
Figura 2. Frmula de la para-amino-benceno-sulfonamida


Introduccin 7
Este ncleo es la base de numerosos derivados, obtenidos por sustitucin de los
grupos amino, tanto de la anilina como de la sulfonamida, por radicales. Como principio
general, para el mantenimiento de la accin antibacteriana no puede modificarse la
estructura fundamental de las sulfonamidas. Esto se explica por el hecho de que las
sulfonamidas son antagonistas competitivos del cido p-aminobenzoico, por lo que su
estructura debe mantenerse muy similar a la de este metabolito esencial; es decir, debe
incluir las siguientes caractersticas: un anillo bencnico con slo dos sustituyentes en
posicin para, un grupo amino en la posicin 4 ( o un grupo tal como azo, nitro, o amino
sustituido que in vivo puede dar lugar al grupo 4-amino) y un grupo 1-sulfonamido
monosustituido (excepto en las sulfonas y algunos derivados especiales). Los frmacos
relacionados con las sulfonamidas, pero que no poseen esta estructura fundamental pueden
ejercer accin antibacteriana por un mecanismo distinto.
El descubrimiento de las sulfamidas dio lugar a la quimioterapia microbiana puesto
que se trata de sustancias que se interponen en el metabolismo del microbio paralizando
todo anabolismo y no de simples bactericidas. Si bien han perdido algo de inters por la
aparicin de los antibiticos, ya que estos ltimos poseen un espectro antimicrobiano ms
extendido y son de ms fcil manejo, las sulfamidas conservan un elevado inters en
veterinaria, con la condicin de utilizarlas correctamente, en especial si se tiene presente
que algunas tienen indicaciones precisas y no son reemplazables por antibiticos. Por ello
su uso sigue siendo muy amplio y variado.
La propiedad bacteriosttica es debida a un fenmeno antivitamnico. Los
microbios, para su reproduccin, necesitan de una vitamina, la vitamina H o cido para-
amino-benzoico. Las sulfamidas son las antivitaminas y, por lo tanto, existe antagonismo
entre ambos cuerpos, que resulta de la identidad morfolgica de sus molculas. La
sulfamida ocupa el lugar del cido p-aminobenzoico en los compuestos intermediarios del
8 Introduccin
metabolismo microbiano, lo que origina su bloqueo. Este bloqueo es el que impide el
crecimiento y la divisin celular de las bacterias. Existe, pues, solamente bacteriostasis,
que se ejerce sobre las formas jvenes, pero el organismo debe poner en juego sus defensas
para destruir los microbios. La accin bacteriosttica de la sulfamida debe completarse por
la accin bacterioltica de los leucocitos.
Si la concentracin de sulfamidas es insuficiente, ya sea por el hecho de que la
dosis no haya sido bastante elevada, ya porque debido a su eliminacin renal no se alcance
la tasa necesaria de medicamento, los microbios reemprenden su reproduccin, siendo
necesaria entonces una mayor concentracin. Si tal fenmeno se repitiera dara lugar a la
creacin de una cepa sulfamidorresistente del germen considerado.
Las sulfamidas suelen suministrarse asociadas con otros compuestos que
intensifican su accin antibacteriana. ste es el caso del trimetoprim (TMP), aislado en
1962, y de la pirimetamina (PMT), cuya asociacin con determinadas sulfamidas fue
desarrollada originariamente como medicamento antipaldico.
N
N H
2
N NH
2
OCH
3
OCH
3
OCH
3
Cl
N
N
NH
2
NH
2
Trimetoprim Pirimetamina

Figura 3. Frmulas de Trimetoprim y Pirimetamina


El mecanismo de accin es la interferencia con la produccin de cido flico. En
combinacin con una sulfamida y debido a la existencia de distintos puntos de ataque
sobre el metabolismo de las bacterias, se produce un bloqueo secuencial, dando lugar a un
Introduccin 9
efecto bacteriano sinrgico debido a que, como las sulfonamidas, bloquean la misma ruta
metablica. La combinacin de la sulfamida con estos potenciadores produce, as, una
respuesta supra aditiva; es ms eficaz contra un gran nmero de microorganismos y es
menos probable que permita la formacin de resistencia bacteriana. El trimetoprim se
suele asociar, en proporcin 1:5 (TMP:sulfamida), con sulfametoxazol, sulfadoxina y
sulfadiacina, mientras que la pirimetamina se suele asociar con sulfaquinoxalina (SQX) en
proporciones 1:3 (PMT:SQX).
Conviene destacar las sulfamidas de accin general que, cuando se administran por
idas se eliminan por la orina, en su mayor parte, libres o combinadas.
a elim
na en forma de derivados acetilados (la
la boca, se absorben por el intestino, pasan a la circulacin y se reparten por todos los
tejidos y lquidos del organismo. Asimismo, pueden franquear ciertas placentas. Pero,
segn la naturaleza de la sulfamida, se observa que algunas se concentran ms
particularmente en la bilis y la orina. En la sangre, la sulfamida se combina con las
protenas del plasma, pero esta combinacin es lbil y la sulfamida activa se libera
progresivamente.
Estas sulfam
L inacin es, por lo tanto, menos rpida cuando el porcentaje de la asociacin de tipo
sulfamida-protena es ms elevado en la sangre.
Las sulfamidas pasan en parte a la ori
acetilacin tiene lugar en el hgado), los cuales son inactivos y, adems, sobre todo para
ciertas sulfamidas, cristalizan dentro de los canales urinarios, provocando as grandes
problemas. Se puede contrarrestar este inconveniente bebiendo abundante agua y
administrando al mismo tiempo que la sulfamida, la vitamina PP (amida o cido
nicotnico) o tambin administrando mezclas de tres o cuatro sulfamidas. As, la
solubilidad respectiva de cada derivado acetilado no cambia mientras que las actividades
10 Introduccin
de los productos se suman, con lo cual, para un efecto global idntico, se disminuyen los
riesgos de bloqueo renal.

CLASIFICACIN DE SULFAMIDAS

Para clasificar las sulfamidas se han utilizado varios criterios: aplicacin
teraputica, estructura qumica y espectro de accin antibacteriana.
Segn su principal aplicacin teraputica, aunque algunas de ellas poseen ms de
una, se pueden clasificar en: sulfamidas sistmicas, sulfamidas intestinales, sulfamidas
urinarias, sulfamidas oftlmicas y sulfamidas para usos especiales.
Las sulfamidas sistmicas se usan en infecciones sistemticas y, segn la duracin
de la accin, se pueden dividir en sulfamidas de accin rpida y de accin prolongada. Las
de accin rpida se absorben y se eliminan rpidamente, su vida media oscila entre 5 y 15
horas y las ms utilizadas son: sulfacloropiridacina, sulfadiacina, sulfametacina,
sulfametizol, sulfafurazol, sulfameracina, sulfametizol, sulfametoxazol y las
trisulfapiridinas. Las de accin prolongada se absorben rpidamente y se eliminan
lentamente. Su vida media es de 35 a 40 horas, debido a lo cual deben usarse con sumo
cuidado pues pueden alcanzar una concentracin peligrosa en la sangre. Las ms utilizadas
son: sulfadimetoxina, sulfadoxina, sulfaleno, sulfameter, sulfametoxidiacina,
sulfametoxipiridacina, sulfametomidina, sulfamoxol, sulfaperin, sulfafenazol, sulfasomizol
y sulfasimacina.
Las sulfamidas intestinales se obtuvieron uniendo agrupaciones hidrfilas al grupo
amino libre con el fin de obtener formas muy solubles en agua. Debido a las agrupaciones
fuertemente hidrfilas, son mal absorbidas en el tracto gastrointestinal y por ello alcanzan
elevadas concentraciones en la luz del colon, donde la hidrlisis bacteriana libera la
Introduccin 11
agrupacin sulfanilamida. Las ms utilizadas son la ftalilsulfacetemida, ftalilsulfatiazol,
sulfaguanol y el cido sulfalxico.
Las sulfamidas urinarias se absorben rpidamente y se eliminan lentamente por los
riones, alcanzando as elevadas concentraciones en los mismos. Las principales son la
sulfacetamida, sulfacloropiridacina, sulfacitina, sulfadimetoxina, sulfaetidol, sulfafurazol,
sulfameter, sulfametizol, sulfametoxazol, sulfametoxipiridacina, sulfafenazol, sulfaurea y
la sulfisomidina. Las sulfamidas oftlmicas se aplican tpicamente y las principales son la
sulfacetamida sdica y la sulfisoxazol diolamina.
Otra forma de agrupar las sulfamidas viene determinada por su estructura qumica.
Las sulfamidas, denominadas tambin sulfanilamidas o sulfafrmacos, poseen la estructura
general siguiente:
S
O
O
RHN N
H
R' (1) (4)
1
2 3
4
5 6
Figura 4. Estructura general de las sulfamidas

Este ncleo es la base de numerosos derivados, obtenidos por sustitucin de los
hidrgenos aminados por radicales. As, podremos efectuar la siguiente clasificacin:
1.- Para-amino-benceno-sulfonamida o sulfanilamida.
H
2
N-C
6
H
4
-SO
2
-NH
2

2.- Derivados obtenidos por la sustitucin del hidrgeno del nitrgeno sulfamdico:
H
2
N-C
6
H
4
-SO
2
-NHR
3.- Derivados obtenidos por la sustitucin de tomos de hidrgeno en el nitrgeno
anilnico y sulfamdico, conjuntamente.
RHN-C
6
H
4
-SO
2
-NHR
12 Introduccin
4.- Derivados de tipo azoico, obtenidos por la formacin de la sal de diazonio y la
posterior copulacin con diversos reactivos.
R-N=N-C
6
H
4
-SO
2
-NH
2
A continuacin se presenta una tabla con las sulfamidas ms utilizadas en la
industria farmacutica y veterinaria.
Tabla 1. Sulfamidas
Nombre oficial Siglas Nombre
registrado
Nombre qumico
Sulfacetamida SCM Cetamide
Sulamyd
N-sulfanilacetamida
Sulfapiridina SPR Dagenan N
1
-2-piridilsulfanilamida
Sulfadiacina SDC Coco-Diazine
Microsulfon
Pyrimal
N
1
-2-pirimidinilsulfanilamida
Sulfameracina SMR N
1
-(4-metil-2-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfametacina
(sulfadimidina)
SMT N
1
-(4,6-dimetil-2-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfacloropiridacina SCP Sonilyn N
1
-(6-cloro-3-piridacinil)-sulfanilamida
Sulfametizol SMTZ Thiosulfil
Ultrasul
N
1
-(5-metil-1,3,4-tiadiazol-2-il)-sulfanilamida
Sulfametoxazol SMX Gantanol N
1
-(5-metil-3-isoxazolil)-sulfanilamida
Sulfaetidol SED Sul-Spansion
Sul-Spantab
N
1
-(5-etil-1,3,4- tiadiazol-2-il)-sulfanilamida
Sulfisoxazol
(diolamina)
SSX Gantrisin
SK-Soxazol
Sodizole
Sosol
Soxomide
Sulfisocon
N
1
-(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-sulfanilamida, con
2,2-imino-bis(etanol)
Sulfametoxipiridacina SMP Kynex
Midicel
N
1
-(6-metoxi-3-piridacinil)-sulfanilamida
Sulfaleno SFL Kelficinz N
1
-(3-metoxi-2-piracinil)-sulfanilamida
Sulfameter SME Sulfa N
1
-(5-metoxi-2-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfadoxina SDX Fanasil
Fanasulf
N
1
-(5,6-dimetoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfadimetoxina SDM Madribon N
1
-(2,6-dimetoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfamonometoxina SMM N
1
-(6-metoxi-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfaclomida SCL N
1
-(5-cloro-2,6-dimetil-4-pirimidinil)-sulfanilamida
Sulfacitina SCT Renoquid N
1
-(1-etil-1,2-dihidro-2-oxo-4-pirimidinil)-
sulfanilamida
Sulfasimacina SSM N
1
-(4,6-dietil-s-triacin-2-il)-sulfanilamida
Acetilsulfisoxazol Gantrisin
Acetyl
N-(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-N-sulfanilacetamida
Sulfasalacina
(Salazosulfapiridina)
SSC Azulfidina cido 5-[p-(2-piridilsulfamoil)-fenilazo]-saliclico
Ftalilsulfacetamida N
1
-acetil-N
4
-ftalilsulfanilamida
Ftalilsulfatiazol Sulfatalidina cido 4-(2-tiazolilsulfamoil)-ftalanlico
Succinilsulfatiazol Sulfasuxidina cido 4-(2-tiazolilsulfamoil)-succinanlico
Mafenida MAF Sulfamylon -amino-p-toluensulfonamida

Introduccin 13
ANLISIS DE SULFAMIDAS

El elevado numero de sulfamidas diferentes utilizadas en la industria
farmacutica y su amplio uso tanto en la prctica mdica como veterinaria hace que
sean muy numerosos los trabajos encontrados en bibliografa que determinan
sulfamidas, sus potenciadores y algunos productos de su degradacin y metabolitos,
bien de forma individual o conjuntamente. Estas drogas se pueden determinar
cuantitativamente en todo tipo de matriz, mediante un gran nmero de mtodos, siendo
los instrumentales, sin lugar a dudas, los ms utilizados y los que mayor inters
presentan.
Dentro de los mtodos instrumentales, los mtodos espectroscpicos de
absorcin en el ultravioleta visible, junto con los cromatogrficos, han sido los que
han permitido analizar la mayora de las sulfamidas, aunque tambin se han empleado,
con el fin de determinar estas drogas, tcnicas de espectrofluorimetra molecular, as
como tcnicas electroqumicas.
Los mtodos cromatogrficos han sido los ms utilizados para el anlisis de
sulfamidas, destacando por su importancia, dentro de ellos, la cromatografa lquida de
alta resolucin (HPLC o LC), aunque tambin se han encontrado en bibliografa
mtodos que utilizan la cromatografa de gases (CG) y la cromatografa en capa fina
(CCF).
La asociacin sulfametoxazol-trimetoprim (SMX-TMP) es muy frecuente en
productos farmacuticos y veterinarios por lo que se han propuesto diversos mtodos para
la determinacin conjunta de los dos componentes por HPLC en fluidos biolgicos (3-6) y
en productos comerciales (7-9). Con bastante frecuencia se ha llevado a cabo la
determinacin simultnea de TMP y SMX, bien en presencia de los productos de
14 Introduccin
degradacin de SMX en fluidos biolgicos (10-14), bien en presencia de otras sulfamidas
como la sulfameracina (15) o sulfadiacina en compuestos farmacuticos (16), o como la
sulfadimetoxina, en plasma de origen animal (17), o bien en presencia de otros compuestos
a los que suelen ir asociados en las formulaciones farmacuticas como la epidrina y la
codeina (18). En todos los casos se utilizaron detectores UV.
Otro de los potenciadores que suele asociarse con las sulfamidas es la
pirimetamina. El gran uso que se hace, en la prctica mdica y veterinaria de estas
asociaciones, ha propiciado que se propongan mtodos por HPLC para la determinacin
conjunta de PMT, sulfamidas, derivados acetilados de estas y de otros componentes que
suelen asociarse en las formulaciones farmacuticas.
G.R. Rao y col. (19), en 1989, propusieron un mtodo para la determinacin
conjunta de sulfametoxipiridacina y TMP o PMT en formulaciones farmacuticas,
utilizando una columna de acero rellena de fenil Bandapak, cido metanico-acetato
sdico (pH=4) como fase mvil y deteccin a 354 nm. Bajo estas condiciones los
excipientes de las muestras no presentaron interferencias y se obtuvieron recuperaciones
cuantitativas.
En nuestros laboratorios se ha venido trabajando en la determinacin de sulfamidas
y sus potenciadores durante los ltimos aos, desarrollando nuevos mtodos analticos,
espectrofotomtricos en la mayora de las ocasiones, para su posterior aplicacin en
productos comerciales farmacuticos y/o zoosanitarios. Con este fin, se utiliz el mtodo
de los espectros cocientes derivados (20), el mtodo de las reas de los espectros cocientes
y la espectrofotometra derivada por medidas en el punto de corte o zero-crossing.
Concretamente, se ha trabajado con las mezclas binarias de tipo sulfamida-
potenciador ms comunmente utilizadas para la elaboracin de productos farmacuticos
y/o zoosanitarios, tales como SMX-TMP (21), SQX-PMT (22), SDC-TMP (23) y la
Introduccin 15
mezcla ternaria formada por SQX-SMT-PMT (24). En todos los casos citados se
resolvieron las diferentes mezclas de sulfamidas y potenciadores utilizando los tres
mtodos. Se obtuvieron mejores resultados en trminos de reproducibilidad y
recuperaciones cuando se utilizaron espectros cocientes que cuando se realizaron las
determinaciones por espectrofotometra derivada con medida en el punto de corte.
En bibliografa se recogen numerosos trabajos de HPLC en los que se lleva a cabo
la separacin e identificacin de varias sulfamidas a la vez, en presencia o no de sus
productos de degradacin, partiendo de distintos tipos de matrices como son: mezclas
sintticas, productos farmacuticos, fluidos biolgicos, carnes, pescados etc.
R. Cross (25) y J. Wieling y col. (26) han propuesto mtodos para la separacin y
determinacin conjunta de un gran nmero de sulfamidas en muestras sintticas. El
primero de ellos consigue separar e identificar una mezcla de 22 sulfamidas utilizando una
columna C
18
y deteccin a 270 nm, mientras que el segundo consigue separar e identificar
doce sulfamidas utilizando HPLC de fase reversa con una columna C
18
.
M. De Smet y col. (27), A.R. Long y col. (28) y F.M. El Anwar y col. (29),
propusieron diferentes mtodos para la separacin y determinacin de 4, 7 y 3 sulfamidas,
respectivamente, en productos de uso farmacutico y veterinario, usando en todos los casos
deteccin UV.

Sin embargo, recientemente se ha desarrollado enormemente la electroforesis
capilar (EC) y sus variantes, prcticamente inditas hasta principios de los aos noventa
en cuanto a anlisis de sulfamidas se refiere. En la ltima dcada del pasado siglo, las
tcnicas de electroforesis capilar fueron perfeccionndose paulatinamente hasta
conseguir poderes de separacin comparables a los ofrecidos por HPLC. Este hecho,
junto con el bajo coste de mantenimiento, en los planos econmico y medioambiental,
de los equipos de electroforesis capilar con respecto a los cromatgrafos de lquidos
16 Introduccin
facilit que estas tcnicas se abriesen camino rpidamente dentro de los mtodos de
separacin.
Como inconveniente, hay que decir que las separaciones por electroforesis
capilar son menos sensibles que las de HPLC, debido a que los capilares tienen un paso
ptico muy reducido (entre 50 y 75 m de dimetro interno), por lo que es necesario
modificarlos. Los capilares de burbuja y las clulas de flujo son los ejemplos ms
comunes.
Tambin, en la actualidad se vienen desarrollando nuevas tcnicas
electroforticas, como es la de amplificacin de campo, que utiliza capilares
convencionales en las separaciones. En esta modalidad se practica una inyeccin de
larga duracin y una posterior concentracin de la muestra dentro del mismo capilar
antes de efectuar la separacin.
El uso de la electroforesis capilar en zona (CZE) para la separacin de
sulfamidas y/o sus potenciadores ha sido extenso desde la implantacin de esta tcnica a
nivel mundial. En lo que concierne a los sistemas de deteccin, la bibliografa recoge
una amplsima mayora de trabajos donde se utiliza la espectrofotometra ultravioleta-
visible con una gran variedad de finalidades, desde la investigacin bsica, es decir, el
estudio de la naturaleza de la separacin electrofortica y los factores que le afectan,
hasta la determinacin de estos compuestos en productos farmacuticos y en medio
biolgico.
Los primeros trabajos en separacin de sulfamidas y compuestos asociados por
CZE datan de 1993. Ricci y Cross (30) compararon en trminos operacionales la nueva
tcnica con la celebrrima HPLC. Este trabajo, aunque meramente descriptivo, aporta
como ejemplo la separacin de un grupo de sulfamidas y sus compuestos asociados por
las dos tcnicas. La separacin electrofortica result ser claramente mejor que la
Introduccin 17
cromatogrfica y tambin ms rpida. En cuanto a los anchos de pico, medidos a la
mitad de la altura, eran 6 veces menores en EC que en cromatografa lquida.
Los mismos autores (31) trabajaron en la separacin de 22 sulfamidas y 3
inhibidores de la dihidrofolatoreductasa (DHFRI). Dos de stos eran los tpicos
potenciadores de las sulfamidas, pirimetamina y trimetoprim. Los datos experimentales
obtenidos en las separaciones en trminos de movilidad con respecto al flujo
electroosmtico (FEO) se justifican con las estructuras qumicas de las molculas y
sobre todo, con sus pK
a
. Por lo tanto, el comportamiento tanto de las sulfamidas como
de los DHFRI se relaciona directamente con la diferente ionizacin que experimentan a
diferentes pH. Igualmente, se estudi y discuti la variacin de los tiempos de
migracin con la fuerza inica del tampn y con el voltaje aplicado. Consiguieron
separar 18 de estas drogas, en 22 minutos, utilizando tampn fosfato de pH 7.5 y
aplicando un voltaje de 15 kV. El inters de este trabajo reside en que pone de
manifiesto la estrecha relacin existente entre movilidad y pK
a
, pues no se estudian
aspectos cuantitativos, tales como reproducibilidad, linealidad de respuesta o
sensibilidad. Otra de las conclusiones de este trabajo fue que la puesta a punto de un
mtodo en CZE es ms rpido que en cromatografa lquida, aunque tambin se
menciona el hecho de que cuando existen compuestos neutros entre los analitos, stos
no se pueden separar por CZE.
La aplicacin de la electroforesis capilar en zona tiene una de sus limitaciones en
la magnitud del flujo electrosmtico. Esta limitacin fue comprobada
experimentalmente utilizando una mezcla de sulfamidas (32). En este estudio se han
encontrado varias limitaciones en el pH para muchas sulfamidas cargadas
negativamente en presencia de analitos cargados positivamente, como los DHFRI. Las
limitaciones que se manifiestan a bajos pH se deben, bien a que el flujo electroosmtico
18 Introduccin
es bajo, una situacin que lleva a tiempos de anlisis largos, o bien a que la ionizacin
no es suficiente para la separacin entre las sulfamidas y las molculas neutras. Las
limitaciones que se manifiestan a pH altos se deben, bien a que el flujo electroosmtico
es muy elevado y, por lo tanto, no hay suficiente tiempo para la separacin, o bien a que
los grados de ionizacin de los diferentes analitos son muy similares, lo que hace que se
pierda selectividad por razn de la carga.
En 1994, Yao y Li (33) se fijaron como objetivo evaluar y comparar tres
mtodos para determinar coeficientes de difusin por CZE, utilizando como modelo una
mezcla de cinco sulfamidas. La conveniencia de utilizar uno cualquiera de los tres
mtodos frente a los otros dos se evalu en funcin de la precisin, expresada en
trminos de desviacin estndar relativa y de la sencillez del procedimiento
experimental.
Un ao ms tarde, Jing y Cross (34) establecieron la correlacin entre la
movilidad electrofortica y la relacin cargaradio inico (Z/r), utilizando una mezcla
de 8 DHFRI, entre los cuales se encontraban PMT y TMP. La separacin se realiz
aplicando un voltaje de 13 kV y utilizando tampn fosfato de concentracin 250 mM
ajustado a pH 2.1. As demostraron la naturaleza electrosttica de la separacin
electrofortica. Adems, a partir de los datos obtenidos, calcularon los pK
a
de los
compuestos en estudio, lo cual es indicativo de la gran influencia que ejerce el pH sobre
la carga de los analitos.
Los mismos autores (35) utilizaron la separacin de nueve sulfamidas para
proponer, terica y empricamente, una ecuacin que relacionaba la movilidad
electrofortica (
ef
) con la inversa del cuadrado del radio hidrodinmico, cuando,
frecuentemente, la movilidad electrofortica aparece como funcin de la inversa de ste
y no de la inversa de su cuadrado.
Introduccin 19
Tambin se comprueba la dependencia de
ef
con la inversa de la raz cuadrada
de la fuerza inica.
Lin y col. (36) introdujeron en 1997 como novedad la separacin de 16
sulfamidas en sus formas catinicas. Para ello, utilizaron tampn citrato de
concentracin 500 mM ajustado a pH 2.1, aplicando un voltaje de 30 kV. Los resultados
de este estudio indicaron que el pH y la concentracin de tampn eran dos importantes
parmetros de separacin. Sin embargo, se reconoce que el pH tiene un efecto mayor en
la selectividad y la resolucin que la concentracin de tampn. A partir del tiempo de
migracin observado, se calcularon las movilidades electroforticas.
Debido a que a un pH tan cido, el flujo electroosmtico es muy pequeo y a la
gran concentracin de tampn antes mencionada, el tiempo de anlisis llega a ser de 50
minutos.
En esta lnea se enmarcan una serie de trabajos de Cross y Cao dedicados al
estudio del efecto de la fuerza inica y del efecto Joule sobre las separaciones
electroforticas. Una vez ms, se utiliz un grupo de sulfamidas como compuestos a
separar. En uno de ellos (37) se utilizaron 5 sulfamidas con diferentes grados de
ionizacin como tests para el estudio de la modificacin en la movilidad electrofortica
causada por concentraciones crecientes de tampn fosfato de pH 7 (de 5 a 210 mM). Se
hicieron experimentos para evaluar por separado los efectos que ejercen la fuerza inica
y la temperatura generada por efecto Joule sobre la ionizacin.
El efecto de altas concentraciones de tampn fosfato sdico (65 210 mM) en la
separacin de 23 sulfamidas por electroforesis capilar en zona se examin a pH 7 y 18
kV (38). En fosfato 65 mM, todos los analitos ionizados (21 de 23 sulfamidas) se
resuelven suficientemente para su monitorizacin. A altas concentraciones de tampn,
la resolucin general mejora claramente dado el efecto salino que, sistemticamente,
20 Introduccin
hace que mejore el espacio de separacin. Este efecto es superado progresivamente por
el efecto Joule incrementando las movilidades electroforticas de los analitos que
migran lejos del detector.
En 1999 (39) clasificaron las sulfamidas en tres grupos, segn sus equilibrios de
ionizacin: el grupo cuya ionizacin es como la del cido sulfanlico, el grupo que
forma aniones con doble carga y el resto de las sulfamidas, que siguen la ionizacin de
la manera habitual (figura 5)
Un mtodo basado en diseo de experiencias para la determinacin de
sulfadiacina y pirimetamina, entre otras drogas antimalricas, fue propuesto por Ng y
Toh (40). El planteamiento del esquema, denominado por sus autores overlapping
resolution mapping (ORM), obedeca a que se asuma que las variables qumicas que
influan en la separacin eran tan solo dos: pH y concentracin de bromuro de tetrabutil-
amonio (TBA), que se utiliza para evitar la adsorcin de los analitos cargados
positivamente por formacin de pares inicos con las cargas negativas de las paredes
del capilar. Las experiencias se llevaron a cabo aplicando un potencial de 15 kV y
utilizando mezcla de tampones fosfato y borato de concentraciones 0.05 M y 0.025 M
respectivamente. As, se prepar un diseo factorial de 9 experiencias conforme con el
esquema citado variando simultneamente el pH y la concentracin de tampn. Estas
experiencias determinaron que las condiciones ptimas para la separacin eran pH 7.50
y 9 mM de TBA. Posteriormente se comprob la validez de la prediccin realizando la
separacin bajo las condiciones seleccionadas como ptimas.




Introduccin 21

igura 5. Equilibrios de disociacin de las sulfamidas tipo a) cido sulfanlico;
N
S
O
O O
H
H H
H
-
+
N
S O O
H
H H
O
+
N
S
O
O O
H H
-
K
a,1
K
a,2
a)

N
S
N
O O
ROOH H
R H
K
a,1
K
a,2
b)
N
S
N
O O
ROO H
R H
N
S
N
O O
ROO H
R
-
-
-
N
S
N
O O
R H
H
H H
K
a,1
K
a,2
c)
N
S
N
O O
H H
R H
N
S
N
O O
H H
R
-
+


F
b) formadoras de especies doblemente ionizadas; c) resto de sulfamidas.
22 Introduccin
En 1998, Wright y Dorsey (41) propusieron un mtodo basado en la formacin
de complejos por transferencia de carga de sulfamidas con Ag (I). Se trabaj en medio
no acuoso, disolviendo AgI en acetonitrilo al 100 %, y utilizando disolucin de Ag (I)
35 mM. El voltaje aplicado y la temperatura de separacin eran 10 kV y 30 C,
respectivamente. La formacin de los complejos con Ag (I) mejor la separacin de las
sulfamidas, siendo sta rpida y con excelentes resoluciones. Tambin se observ que
los datos referentes a migracin as como los referidos a selectividad resultaron ser
diferentes a los que se obtuvieron utilizando la misma reaccin en medio acuoso.
Aunque no todos los compuestos estn resueltos por la lnea base en estas condiciones,
se demuestra cualitativamente la viabilidad de las separaciones aprovechando esta
forma de equilibrio qumico.
Hows y Perret (42) utilizaron un grupo de 17 sulfamidas para comprobar la
eficacia de un ctodo, diseado para minimizar el deterioro que se produce en el
electrolito a medida que se van realizando separaciones. El potencial aplicado era 15 kV
utilizando como fase mvil una mezcla de tampones dihidrogenofosfato 30 mM y
borato 10 mM, ajustando el pH a 6.75 con HCl.
Sin embargo, el uso de la CZE aplicado a la determinacin de sulfamidas tanto
en productos farmacuticos como en medio biolgico ha sido hasta el momento menos
prolfica que en investigacin bsica, debido, tal vez, a la incapacidad de la tcnica para
separar compuestos neutros, que, no teniendo por qu ser estrictamente sulfamidas, s
que podran ser sus potenciadores o sus compuestos asociados (vitaminas,
expectorantes...), los cuales se combinan con ellas habitualmente, segn se explic con
anterioridad.
No obstante, Wainright (43) utiliz capilares sin recubrimiento para la
separacin tanto de sulfamidas como de otros antibiticos como penicilinas y
Introduccin 23
cefalosporinas. La mezcla de sulfamidas, nueve en total, se consigui separar en un
electrolito de separacin que contena tampn fosfato 30 mM y borato 10 mM,
ajustando el pH a7.0 y aplicando una rampa de voltaje de 240 V/cm en un capilar de 60
cm de longitud efectiva. Las condiciones optimizadas para la separacin de las
penicilinas y de las cefalosporinas se utiliz para su determinacin en frmacos,
obtenindose coeficientes de variacin de 1 % en tiempos de migracin y 3 % en reas
de pico. Sin embargo no se presentan aplicaciones para la separacin de sulfamidas. Se
lleg a la conclusin de que era viable la utilizacin de esta tcnica para el anlisis en
productos farmacuticos, habida cuenta de las reproducibilidades obtenidas.
En medio biolgico, se conocen trabajos en diferentes matrices.
Ackermans y col. (44) determinaron 15 sulfamidas y TMP a pH 7.0 (tampn
fosfato:borato, 0.02 M:0.02 M) en extractos de carne de cerdo mediante un sencillo
pretratamiento consistente en practicar una extraccin con acetonitrilo y posterior
centrifugacin. A este pH, la matriz no interfiere en la posterior separacin. Las
muestras fueron inyectadas hidrodinmicamente durante 10 segundos en un capilar de
50 m de dimetro interno y 109.75 cm de longitud efectiva. Los lmites de deteccin
estaban comprendidos entre 2 y 9 ppm, asumiendo que en el tratamiento de la muestra
se recuperaba el 100 % de la cantidad existente en ella.
En 1993, Jumppanen (45) y col. utilizaron un capilar de 50 m de dimetro
interno y 60 cm de longitud efectiva para la monitorizacin de diurticos en suero y
orina. Aquellos diurticos que contienen grupos carboxlicos o sulfamdicos se
separaron a pH 10.6 con cido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfnico de
concentracin 0.06 M. A este pH, estos diurticos son aninicos. El potencial aplicado
fue 25 kV y la temperatura fue de 20 C. Los resultados fueron validados frente a un
mtodo de CG-MS. Este trabajo no se refiere a separacin de sulfamidas como tales,
24 Introduccin
pero s a compuestos con agrupaciones qumicas semejantes, por lo que podra
aprovecharse en la monitorizacin de estas drogas en muestras biolgicas, como suero y
orina.
En esta misma lnea, Veraart y col. (46) determinaron sulfamidas en suero y
orina utilizando preconcentracin. En este trabajo, se utiliz la misma preparacin para
determinar compuestos anfteros, como las sulfamidas, en suero y orina, poniendo el
nfasis en la preparacin, completamente automatizada, de la muestra, lo cual no haba
sido descrito con anterioridad. La muestra (8 mL de orina o 1 mL de suero) se hizo
pasar por un cartucho de 50 mg de estireno y divinil-benceno. Se hizo un lavado con 1
mL de agua y 5 mL de acetonitrilo-fosfato 10 mM de pH 3 (20:80, v:v). Posteriormente
se eluy con 0.7 mL de acetonitrilo. Estas fracciones se introdujeron en el sistema de
separacin, constituido por un capilar de slice fundida de 50 m de dimetro interno y
de 40 cm de longitud efectiva. Como en otros casos, se utiliz tampn fosfato 20 mM
de pH 7.0 como electrolito de separacin, siendo el voltaje aplicado 30 kV. Los lmites
de deteccin fueron 10 30 g/mL en orina y 500 g/mL en suero. Tanto la
sensibilidad como la reproducibilidad son adecuadas para utilizar este mtodo en
anlisis clnico y en estudios metablicos.
El principal inconveniente que presenta la deteccin ultravioleta-visible en
electroforesis capilar es que la pequea longitud de paso ptico limita la sensibilidad,
como ya se ha explicado con anterioridad. Para obviar este problema, se pueden acoplar
equipos de EC a otro tipo de detectores. En algunos casos se ha recurrido a deteccin
por espectrometra de masas (MS) y en otros casos, a deteccin electroqumica.
Johansson y col. (47) utilizaron un equipo de EC comercial acoplado a un
espectrmetro de masas con una interfase de ionizacin a presin atmosfrica (API)
para determinar benzodiacepinas y sus metabolitos en orina humana y para caracterizar
Introduccin 25
sulfamidas. En el caso de las sulfamidas se utiliz un electrolito de separacin
compuesto por acetato amnico 20 mM de pH 6.8 que contena un 20 % (v/v) de
metanol. La separacin se realiz a 26 kV. Se muestran los electroferogramas con
deteccin ptica y por espectrometra de masas de una muestra de 2 pmol (380 680
pg) de cada sulfamida. Se sugiere que el anlisis de estas drogas en orina de caballos de
carreras es interesante para el control antidopaje en estos animales, pero no se aporta
ninguna aplicacin en este sentido. Adems, se utiliza la informacin estructural que
produca un acoplamiento EC-UV-MS-MS para la caracterizacin de la sulfametacina.
En este caso, todos los fragmentos esperados para la sulfametacina por MS-MS estaban
presentes comparados con los anlisis previos por LC-MS-MS.
En 1992, Perkins y col. (48) compararon la cromatografa lquida capilar a
nanoescala (nCLC) con la CZE, utilizando un espectrmetro de masas de cuadrupolo
como detector, con una interfase de ionizacin por electroespray (ESI). Estas dos
metodologas se aplicaron a la separacin y determinacin de un grupo de sulfamidas,
siendo el acoplamiento CZE-ESI-MS ms rpido y sensible. En este mismo trabajo se
dice que ambas tcnicas proporcionan mtodos de anlisis complementarios. Los lmites
de deteccin de estas tcnicas estn alrededor del orden de magnitud de 10
-12
moles.
Pleasance y Thibault (49) acoplaron un equipo de electroforesis capilar a un
detector de MS para determinar antibiticos utilizados en la industria de la piscicultura,
entre los que se encontraban sulfamidas y potenciadores (en este caso, TMP). El hecho
de utilizar deteccin de masas se debe a que los niveles tolerables establecidos por los
organismos reguladores, alrededor de 0.1 ppm, demandaban el desarrollo de mtodos de
alta sensibilidad y elevada selectividad. El acoplamiento coaxial de EC con API-MS
proporcion una interfase ms robusta y reproducible que la de unin lquida. En este
26 Introduccin
trabajo no se dan lmites de cuantificacin, pero se dice que se puede confirmar la
presencia de sulfamidas en los niveles requeridos utilizando el acoplamiento EC-MS.
Tomando como base el trabajo anterior, Bateman y Locke (50) utilizaron el
mismo acoplamiento pero con una interfase diferente, de nano-electroespray (51). Para
comparar los resultados de este trabajo con los del anterior, se aplic la monitorizacin
del in caracterstico, en este caso MH
+
156. Los autores dan un ejemplo de una
muestra de leche a la que se haba adicionado 6 sulfamidas en una concentracin de 5
ppb. Los lmites de deteccin para todas las sulfamidas estuvieron en el orden de
magnitud de las ppt.
Recientemente, en 1999, se ha propuesto un mtodo para la separacin y
determinacin de sulfamidas en tabletas por electroforesis capilar en zona con deteccin
amperomtrica (52). En este trabajo se determinan sulfadiacina, sulfametacina y
trimetoprim en preparados farmacuticos. Se utiliz un capilar de slice fundida de 75
cm de longitud y 25 m de dimetro interno donde se inyect la muestra en modo
electrocintico a 28 kV durante 10 segundos y posteriormente se llev a cabo la
separacin aplicando un potencial de 28 kV. El detector amperomtrico consista en un
disco de carbn de 500 m de dimetro, que funcionaba como electrodo de trabajo,
polarizado a +1275 mV frente a un electrodo de Ag/AgCl/KCl 3M y un electrodo
auxiliar de platino. El electrolito de separacin contena tampn fosfato 20 mM ajustado
a pH 6.2. Los tres analitos se separaron en menos de 16 minutos y se consiguieron
lmites de deteccin cercanos a 1 M. Las recuperaciones en los frmacos fueron
cercanas al 100 % en todos los casos.

La introduccin de la tcnica de cromatografa capilar elecrocintica micelar
(MEKC o MECC) se debe a Terabe y colaboradores (53-55) y tuvo lugar en 1984.
Introduccin 27
Supuso un gran avance en EC y actualmente es una de las modalidades ms utilizadas
para la separacin de molculas neutras, aunque su aplicacin a la separacin a los
compuestos cargados tambin ha demostrado ser de gran eficiencia, especialmente en la
separacin de molculas pequeas. Este mtodo combina el mecanismo de separacin
de la cromatografa con el movimiento electrofortico y electroosmtico de los analitos
y de la disolucin, segn se explica en el apartado dedicado a esta modalidad de la
presente Memoria (pg. 82).
En el anlisis de sulfamidas por MEKC se vuelve a constatar que la deteccin
ultravioletavisible es la ms ampliamente empleada.
En 1992, Fu y col. (56) utilizaron esta tcnica para separar un grupo de
vitaminas hidrosolubles, sulfamidas, cefalosporinas y analgsicos antipirticos. La
separacin tena lugar en un capilar de slice fundida de 45 cm de longitud y 50 m de
dimetro interno, utilizando como electrolito de separacin tampn fosfatoborato y
dodecilsulfato sdico como agente micelar. Los autores proclaman como conclusin el
gran futuro que tiene esta tcnica en el rea del anlisis de medicamentos.
En este sentido, ese mismo ao, Dang y col. (57) propusieron la separacin de
siete sulfamidas y trimetoprim en un capilar de 50 cm de longitud y su determinacin en
tabletas que los contenan. Las separaciones se realizaron a 12 kV. Se utiliz tampn
fosfato-borato 25 mM ajustado a pH 8.5, SDS 100 mM como agente micelar y TBA 10
mM como modificador. Se analizaron medicamentos que contenan bien la mezcla
binaria SMX-TMP o bien la mezcla ternaria SMX-SMT-TMP. Las recuperaciones
fueron, en todos los casos, cercanas al 100 %.
En nuestros laboratorios se ha estudiado la determinacin de sulfamidas y sus
compuestos asociados por MEKC en productos veterinarios (58). Se puso a punto un
mtodo para la determinacin de sulfaquinoxalina, sulfametacina, pirimetamina y
28 Introduccin
menadiona utilizando un capilar de slice fundida de 57 cm de longitud y 75 m de
dimetro interno. El electrolito de separacin estaba compuesto por tampn borato 30
mM ajustado a pH 9.2, SDS 40 mM como agente micelar y acetonitrilo al 6% como
modificador orgnico. Los lmites de cuantificacin se estimaron alrededor de 1 mg/L
para todos los componentes. Lo ms llamativo de este estudio fue que los resultados
encontrados en las aplicaciones a productos veterinarios no se correspondan con los
valores etiquetados en la mayora de ellos, tanto en el aspecto cualitativo como en el
cuantitativo.
Tambin se ha aplicado esta tcnica al anlisis de sulfamidas en comestibles,
pero ms recientemente. As, en 1997 se optimiz un mtodo para la separacin
simultnea de sulfamidas, DHFRI y antibiticos beta-lactmicos (59). La separacin
tiene lugar en un capilar de slice fundida de 60 cm de longitud y 50 m de dimetro
interno. El electrolito de separacin estaba compuesto por tetraborato sdico 20 mM
ajustado a pH 8.5 y SDS 100 mM. Estas condiciones se obtuvieron por medio de un
determinado diseo de optimizacin, que permite una considerable reduccin de las
separaciones requeridas, del tiempo que se emplea y de la generacin de datos que
pueden ser analizados estadsticamente para proporcionar informacin de las
interacciones entre parmetros experimentales, que se pueden utilizar en posteriores
separaciones.
En 1995, Ozaki et al. (60) pusieron a punto un mtodo en el que se acoplaba la
MEKC con MS, utilizando un surfactante de alto peso molecular e ionizacin por
electroespray como interfase. La separacin se llev a cabo utilizando tampn formiato
amnico 10 mM de pH 7, que contena 10 % de metanol y 1 % de surfactante (v:v).
Este sistema se aplic a la separacin de una mezcla de 5 sulfamidas. Se compar la
Introduccin 29
separacin con un detector UV frente a la del sistema MEKC-ESI-MS, siendo la
primera mejor que la segunda en trminos de resolucin.
Un grupo de drogas antimalricas y sus metabolitos fueron determinados junto
con pirimetamina, por CZE a pH bajos y por MEKC a pH altos (61). En este trabajo se
utiliz la tcnica de amplificacin de campo en CZE con buenos resultados. Tambin se
examin el efecto que tena la inyeccin de la muestra en un disolvente orgnico, como
el metanol. Este tipo de disolventes favorecen el stacking de los analitos, resultando
de ello una disminucin en los lmites de deteccin. El mtodo fue aplicado a la
determinacin de algunas de estas drogas en orina, entre las que se encuentra la
pirimetamina.
En 1996, Wrigth y col. (62) aprovecharon que las sulfamidas son capaces de
formar complejos lbiles con Ag (I) para establecer dos mtodos, uno por CZE y otro
por MEKC para la separacin de 5 y 9 sulfamidas respectivamente. En ambos mtodos
se utiliz un capilar de slice fundida de 47 cm de longitud y 50 m de dimetro interno.
La separacin por CZE se llev a cabo aplicando un potencial de 20 kV y utilizando
como electrolito una disolucin tampn de acetato de pH 4, que contena 80 mM de
AgNO
3
y un 15% de acetonitrilo. Para la separacin por MEKC se seleccion como
ptimo un electrolito compuesto por una disolucin tampn de cido 4-(2-hidroxietil)-
1-piperacinetanosulfnico (HEPES) ajustada a pH 7, que contena 25 mM de AgNO
3
y
25 mM de SDS como agente micelar.
Por otra parte, Lin y col. (63) estudiaron la separacin de un grupo de 13
sulfamidas por CZE y MEKC. En este trabajo, meramente cualitativo, se concluye que
el orden de migracin de las sulfamidas en CZE depende de la relacin carga/masa y de
los valores de pK
a
. En MEKC, se demostr que el orden de migracin vena
30 Introduccin
determinado por el pK
a
y por las constantes de formacin de las asociaciones sulfamida-
micela.
Tambin se han utilizado ciclodextrinas en el anlisis de sulfamidas con la
misma finalidad que se utiliza el SDS en MEKC. Las ciclodextrinas (64) son unas
dextrinas obtenidas a partir del almidn mediante la accin de un enzima procedente de
microorganismos del gnero Bacillus. Estos enzimas son las
ciclodextrinaglucosiltransferasas, que son capaces de romper la estructura de la amilosa
y ocasionar su ciclacin. Hay ciclodextrinas , y , segn sean 6, 7 u 8 las molculas
de glucosa que formen el ciclo. Anlogamente, se han obtenido derivados de ellas. Las
glucosas que forman parte de las ciclodextrinas disponen hacia el interior los grupos
alcohlicos secundarios provocando la existencia de una cavidad con carcter
hidrfobo. Los grupos alcohlicos primarios quedan dispuestos hacia el exterior y, en
ese caso, tienen carcter hidrfilo. Debido a estas caractersticas las ciclodextrinas
permitirn la solubilizacin de sustancias con carcter hidrfobo en medios acuosos
consiguiendo su estabilizacin.
Las ciclodextrinas se pueden emplear como selectores quirales en EC
(65). Cuando los enantimeros entran en la ciclodextrina interaccionando con ella puede
suceder que uno de ellos presente menor movilidad electrofortica que otro porque haya
formado un complejo ms estable con la ciclodextrina. La conclusin que se extrae es
que el tamao de la cavidad de la ciclodextrina es crucial para la separacin.
Para el caso del anlisis de sulfamidas, se ha utilizado nicamente -
ciclodextrina (-CD) con el fin de eluir los compuestos neutros. Se han publicado
trabajos aplicados tanto a investigacin bsica como a productos farmacuticos y a
muestras biolgicas utilizando mayoritariamente la deteccin ultravioleta-visible.

Introduccin 31

Figura 6. Estructura de las ciclodextrinas

Un mtodo basado en diseo de experiencias para la determinacin de ocho
sulfamidas, fue propuesto por Ng y col. (66, 67). El planteamiento del esquema fue del
tipo overlapping resolution mapping (ORM), que estos mismos autores ya haban
empleado en trabajos anteriores (40). En este caso, se asuma que las variables que
influan en la separacin eran tan solo dos: pH y concentracin de -CD. As, se prepar
un diseo factorial conforme con el esquema citado y se hicieron nueve experiencias
preliminares, variando simultneamente el pH y la concentracin de -CD. Estas
experiencias determinaron que las condiciones ptimas para la separacin eran pH 6.5 y
2 mM de -CD. Posteriormente se comprob la validez de este mtodo realizando la
separacin.
En 1999 se propuso un mtodo para la separacin de sulfanilamida,
sulfametacina, sulfameracina, sulfadiacina, sulfametizol y sulfafurazol por EC (68). Las
muestras se inyectaban en un capilar recubierto de 50 cm de longitud y 50 m de
dimetro interno y se separaban a 15 kV con un electrolito compuesto por una mezcla
equimolar de tampones fosfato y borato 50 mM de pH 6.4, que contena 2 mM de -
32 Introduccin
CD. Se obtuvo un lmite de deteccin de 1 ppm para la sulfameracina y una respuesta
lineal a la concentracin entre 1 y 50 ppm.
En cuanto a aplicaciones en productos farmacuticos podemos citar el trabajo de
Ng y col. que, en 1993, separaron una mezcla de siete sulfamidas utilizando EC con -
CD como modificador (69). Se discute la influencia de la concentracin de -CD y del
pH sobre la migracin de las sulfamidas. Las condiciones ptimas de separacin fueron
la utilizacin de tampn fosfato:borato (0.05 M ambos) de pH 7 y 10 mM de -CD,
aplicando un voltaje de 15 kV.
En este trabajo se utiliza la -CD para formar complejos de inclusin con las
sulfamidas que no estn cargadas al pH de la separacin, pero no para separar ismeros.
Se aplic este mtodo para la determinacin de sulfadiacina y trimetoprim en frmacos
diferentes. Las recuperaciones estuvieron entre el 95 y 100 % y las desviaciones
estndar relativas alrededor del 1.2 %.
Por lo que se refiere a aplicaciones en medio biolgico, Lin y col. (70)
propusieron un mtodo para separar 13 sulfamidas en leche. Utilizaron la tcnica de
CZE en capilares de slice fundida de 44 cm de longitud y 50 m de dimetro interno.
La separacin se llevaba a cabo a 20 kV y 25 C utilizando fosfato:borato (50mM
ambos) de pH 6.85. En este trabajo se demuestra que la adicin de ciertos
modificadores, entre los que est la -CD en concentracin 0.5 mM, permite la
resolucin de los picos de sulfatiazol y sulfametoxipiridacina en el seno de una rpida
separacin de las trece sulfamidas. Tambin se calculan las constantes de formacin de
los complejos de inclusin formados por las sulfamidas con las ciclodextrinas.
Por comparacin de un electroferograma obtenido de una muestra de leche
desproteinizada y otra muestra, tambin de leche desproteinizada pero dopada con
sulfamidas, se puede ver que los picos de las sulfamidas no estn afectados por la
Introduccin 33
matriz, por lo que se indica que se podra aplicar este mtodo para el anlisis de estas
sulfamidas en leche. Sin embargo, no se dan datos cuantitativos al respecto.

Determinacin de sulfamidas y metabolitos.

Otro aspecto fundamental en el problema de la determinacin de sulfamidas y
potenciadores en medio biolgico es que stas pueden sufrir reacciones en el interior de
los organismos vivos para dar lugar a otros compuestos similares denominados
metabolitos.
Las reacciones metablicas ms frecuentes en el campo que nos ocupa son las de
acetilacin y las de hidroxilacin de estos compuestos. As, para el anlisis en medio
biolgico hay que tener en cuenta que podemos encontrar el principio activo sin
modificar coexistiendo con su correspondiente metabolito o metabolitos.
La dificultad de trabajar en medio biolgico debido a las interferencias de la
matriz hace que, en muchas ocasiones haya que recurrir a tratamientos de la muestra
previos a la separacin propiamente dicha, con el objeto, bien de eliminar interferentes
o bien de concentrar los analitos.
Otra dificultad aadida es la obtencin de los metabolitos. Estos productos no
suelen constar en los catlogos comerciales de los principales fabricantes y es necesario
solicitarlos a empresas que trabajan directamente con ellos en investigacin. Cuando
esto no es posible, hay que recurrir a la sntesis en el laboratorio, lo cual no garantiza la
pureza del producto.
Tal vez por estas razones, los trabajos circunscritos a este rea sean menos
numerosos que los concernientes a sulfamidas y compuestos asociados en general.
34 Introduccin
En este sentido, aunque las tcnicas de separacin constituyen una poderosa
herramienta para los fines propuestos, la bibliografa recoge pocos trabajos referentes a
la determinacin de estos metabolitos por estas tcnicas. Se da la circunstancia de que
en ninguno de estos trabajos citados ha sido utilizada la electroforesis capilar, sino que
la tcnica separativa ms ampliamente utilizada ha sido la cromatografa lquida de alta
resolucin.
L. Nordholm y L. Dalgaard (71) propusieron un mtodo para determinar TMP en
presencia de sus productos de degradacin, en orina, utilizando una columna LiChrosorb
RP-18, una fase mvil compuesta por hidrgenosulfato de tributilamonio en acetonitrilo-
dihidrgeno fosfato de pH 7.5 (17:3) y deteccin UV a 254 nm, que fue comparada con
deteccin electroqumica a 700 mV, usando un electrodo de referencia de Ag/AgCl. En
ambos casos los lmites de deteccin alcanzados fueron de 0.1 mg/L.
B. Conway (72) describi un procedimiento para la extraccin y posterior
determinacin de sulfametacina en alimentos para animales, utilizando una columna de
tipo C
18
, una mezcla de acetato amnico (con un 3% de cido actico):acetonitrilo:agua
(6:9:25) como fase mvil y con deteccin a 272 nm. Poco despus J. Houglum y col. (73)
propusieron un nuevo mtodo para la extraccin y separacin de SMT en alimentos de
animales. Este autor propone, previamente, una extraccin con metanol, una posterior
separacin utilizando una columna C
18
y fase mvil compuesta por metanol-cido actico
con 0.1% de cloruro de tetrabutilamonio (1:4). La deteccin se lleva a cabo midiendo la
absorbancia a 280 nm. En 1987, N. Haagasma y col. (74) propusieron un nuevo mtodo
para la determinacin de SMT y sus N-acetil y amino metabolitos en tejidos animales. Este
mtodo implicaba la extraccin de los compuestos de inters. Concretamente, se hizo una
extraccin con dicloruro de metilo y una posterior preconcentracin sobre una columna de
Introduccin 35
slice (para SMT y el N-acetil derivado) y en un cartucho de fluorisil (para el amino
derivado).
E. Ishikuro, en 1989 (75) propuso un mtodo para la determinacin de SQX en
alimentos utilizando, tras extraccin con dimetilformamida, una columna C
18
, un detector
UV que meda la absorbancia a 252 nm y una fase mvil compuesta por metanol-tampn
fosfato de pH 7 en proporciones (7:13). Anteriormente, en 1984, J.C. Eppel y col. (76)
haban determinado sulfaquinoxalina y su N-acetil derivado en muestras de plasma y de
orina utilizando las mismas condiciones.
L. Pou Clave y col. (77) y N.E. Basci y col. (78) propusieron en 1990 sendos
mtodos para la determinacin, en sangre, de sulfametoxazol y de sulfametoxazol en
presencia de sus metabolitos, respectivamente. Ambos autores procedieron, primeramente,
a una desproteinizacin de la muestra con cido perclrico, el primero, y con cido tricloro
actico, el segundo, utilizando posteriormente una columna C
18
y deteccin UV para llevar
a cabo la determinacin. Los intervalos de respuesta lineal estaban comprendidos entre 3 y
500 mg/L y entre 3 y 200 mg/L, respectivamente. Por su parte, Basci compar los
resultados obtenidos por el mtodo propuesto con los obtenidos utilizando el mtodo de
Bratton-Marshall, encontrndose altos coeficientes de variacin en el mtodo
colorimtrico, con respecto a los encontrados por HPLC, para pequeas concentraciones
de metabolito.
Malish y col. (79) propusieron un mtodo por HPLC con deteccin por barra de
diodos en lnea para la determinacin de sulfamidas, entre las que estaban SMT y su N
4
-
acetilmetabolito, nitrofuranos y algunos antiparasitarios.
Se utilizaron dos mtodos cromatogrficos diferentes. En uno de ellos se
utilizaba una columna RP-18, con un tamao de partcula de 5 m que tena 250 mm de
longitud y 4.6 mm de dimetro. La fase mvil estaba compuesta por tampn de pH 4.8 y
36 Introduccin
acetonitrilo:agua y se aplicaba un gradiente que viene detallado en el trabajo. El caudal
de fase mvil era 1.5 mL/min y la temperatura del horno, 40 C. En el otro caso, se
utiliz una columna capilar RP-18 con un tamao de partcula de 3 m que tena una
longitud de 120 mm y 2 mm de dimetro. Se utiliz la misma fase mvil que en el caso
anterior, pero con un gradiente diferente. El caudal de fase mvil era 0.5 mL/min y la
temperatura del horno, 45 C. Se obtuvo como resultado que el uso de la cromatografa
capilar produce tiempos considerablemente ms cortos, ahorro de disolventes, picos
ms estrechos y posiblemente una mejor separacin de las interferencias.
Excepto para la sulfanilamida, todos los lmites de deteccin y determinacin
fueron encontrados por debajo de 100 g/kg, que es el nivel de tolerancia que la Unin
Europea fij para drogas de origen sulfamdico en todos los tejidos y en leche (80).
De todas las sulfamidas de polaridad intermedia estudiadas, sulfatiazol tenda a
tener recuperaciones del 80 %, cuando las del resto eran prximas al 100 %. Esto se
debe a que el sulfatiazol puede asociarse con azcares reductores, formando bases de
Schiff en un primer paso (81). De todas maneras, los datos que se presentan estn dentro
de los requerimientos de la Unin Europea en trminos de recuperaciones y precisin.
Ya en 1990, Rychener y col. (82) determinaron residuos de sulfamidas y sus N
4
-
metabolitos en carne, hgado y riones por HPLC. Lgicamente, hubo de optimizarse un
procedimiento de extraccin de los compuestos antes de su separacin. En este caso, se
someti a extraccin una muestra de 10 g con 40 mL de acetona. El sobrenadante se
filtr y el residuo slido se volvi a someter a extraccin con otros 40 mL de acetona.
Los dos extractos se juntaron y se les adicion 60 mL de HCl 0.125 M. Para eliminar las
grasas, se extrajo con hexano (2 50 mL). A la fase acuosa se le adicion una alcuota
de 10 mL de tampn acetato de pH 5.2 y se extrajo con acetato de etilo dos veces, una
con 40 mL y otra con 60 mL, sucesivamente. Los extractos se juntaron nuevamente y se
Introduccin 37
evaporaron a 45 C y 180 mbar hasta obtener 2 mL de extracto. Seguidamente se
evaporaron con 15 mL de etanol a 50 C y 40 mbar hasta sequedad y el residuo
resultante se disolvi en diclorometano. Esta disolucin se hizo pasar por una columna
de silica gel desactivada por elucin con 40 mL de acetona-diclorometano (3:2) y el
eluido, tras adicin de 100 L de una disolucin de una sulfamida al 0.002 % como
patrn interno, se evapor a 45 C y 300 mbar. El residuo se disolvi en 0.3 mL de
disolucin hidroalcohlica al 50 % para la separacin cromatogrfica. La columna
utilizada fue una Superspher 100 RP-18 de 12.5 cm de longitud y 4 mm de dimetro,
adaptada a una precolumna Lchrospher 10 RP-18 de 4 mm de longitud y 4 mm de
dimetro. Ambas columnas estaban rellenas con partculas de 5 m de dimetro. La fase
mvil empleada estaba compuesta por tampn acetato de pH 4.0 y acetonitrilo en
proporcin 81:19, siendo el caudal de fase mvil 2 mL/min. Asimismo, tambin se
utiliz como columna cromatogrfica una Nucleosil 5SA de 20 cm de longitud y 4 mm
de dimetro con partculas de 5 m de tamao en su interior. En este caso, se utiliz un
caudal de 1.5 mL/min de una fase mvil compuesta por una mezcla 1:1 de acetonitrilo
al 18 % en agua y una disolucin que contena tampn fosfato y acetonitrilo en
proporcin 21:4, y ajustada a pH 2.0. En ambos casos, la deteccin se llev a cabo con
barra de diodos en lnea a 270 nm. Las recuperaciones obtenidas iban del 50 al 80 %,
mientras que los lmites de deteccin estuvieron entre 50 y 100 ppb.
En 1992, T. Okamura y col. (83) determinaron sulfametoxazol y su N-acetil
derivado en orina utilizando una extraccin de fase slida. As, los compuestos de inters
fueron extrados de la orina utilizando dos cartuchos Sep-pak C
18
conectados en serie y el
extracto fue analizado por HPLC con deteccin UV.
R. Van der Hoeven (84), en 1982, propuso un mtodo para la determinacin de
sulfametoxazol, sulfametacina y de sus metabolitos N-acetilados en suero. Para ello
38 Introduccin
procedi a la desproteinizacin de la muestra con HClO
4
y utiliz una columna
Bondapak RP C
18
para llevar a cabo la separacin de los analitos. K. Rona y col. (85) en
1988, determinaron conjuntamente sulfasalacina, sulfapiridina y sus metabolitos acetilados
e hidroxilados en fluidos biolgicos utilizando una extraccin con posterior elucin en un
cartucho de Sep-Pak C
18
, una columna C
18
y deteccin a 254 nm.
Endoh, Takahashi y Nishikawa realizaron la determinacin de sulfamidas, sus
N
4
-acetil metabolitos y cocidiostticos diaminopirimidnicos en tejidos de pollo (86).
Concretamente, los compuestos estudiados eran sulfamonometoxina, sulfadimetoxina,
sulfaquinoxalina, sulfadiacina y sulfametoxazol, sus N
4
-acetil metabolitos y los
coccidiostticos diaverdina, ormetoprim y trimetoprim. Se determinaron por HPLC en
una columna de acero inoxidable de 25 cm de longitud y 4.6 mm de dimetro de
Nucleosil 5 C
18
con una fase mvil que contena tampn fosfato 10 mM y acetonitrilo
en una proporcin 41:9 cuando se ajustaba a pH 5 o 17:3 cuando se ajustaba a pH 5.9,
siendo el caudal 1 mL/min. El esquema de preparacin de la muestra involucra
extraccin de los tejidos con acetonitrilo, lavado del extracto con hexano, lavado en una
columna de almina de 30 cm de longitud y 15 mm de dimetro y elucin con
H
2
O:MeCN (85:15) o H
2
O:MeOH (50:50). El extracto de acetonitrilo se analiz con
cloranfenicol como patrn interno, con una fase mvil de pH 5 y deteccin a 240 nm. El
extracto de metanol se analiz con acetanilida como patrn interno con una fase mvil
de pH 5.9 y deteccin a 270 nm. Los trece analitos dieron respuesta lineal a la
concenteracin entre 0.1 y 50 g/mL, lo que equivale a 0.02 10 g/g en tejido. Los
lmites de deteccin iban de 0.02 a 0.05 g/mL.
Furusawa y Mukai propusieron en 1994 un mtodo para la determinacin
simultnea de residuos de sulfamonometoxina, sulfadimetoxina y sus N
4
-acetil
metabolitos en alimentos de origen animal (87). Se estudi en carnes de vacuno, cerdo,
Introduccin 39
pollo y en huevos. Se realiz un tratamiento de la muestra basado en la extraccin con
25 mL de acetonitrilo al 90 % y 20 mL de hexano y posterior centrifugacin a 2100 g
durante 10 minutos. Tras la correspondiente filtracin, se repeta la extraccin dos veces
ms y se juntaban los sobrenadantes. Esta fase lquida se secaba sobre sulfato sdico
anhidro y se volva a filtrar. El filtrado resultante era el que se haca pasar por una
columna de almina de 30 cm de longitud y 15 mm de dimetro interno. As, las
sulfamidas y sus metabolitos se eluan con 20 mL de acetonitrilo al 90 %. Tras llevar a
sequedad, el residuo se disolvi en 1 mL de fase mvil y se inyectaron 20 L en la
columna cromatogrfica del tipo RP-18. La fase mvil estaba formada por tampn
fosfato 0.5 M de pH 5 y acetonitrilo en proporcin 3:1 y el caudal era 1 mL/min. La
deteccin se realiz a 270 nm. En estas condiciones, los compuestos objeto de este
estudio se separaron en 12.4 minutos. Aplicando este procedimiento se obtuvieron unos
lmites de deteccin de 0.01 ppm para todos los compuestos. Las recuperaciones de
todas las muestras fueron superiores al 80 % con desviaciones estndar relativas que
oscilaban entre 0.4 y 5 %.
Tambin se han utilizado otro tipo de detectores diferentes al ultravioleta-visible
para aumentar la sensibilidad. Von Baer y col. (88) determinaron sulfamidas y sus N
4
-
acetilmetabolitos en suero y orina por cromatografa lquida utilizando deteccin
amperomtrica. Los N
4
-acetilderivados fueron sintetizados basndose en el
procedimiento descrito por Vree y col. (89). La pureza de los productos se comprob
por espectroscopia infrarroja y resonancia magntica nuclear y tambin por HPLC y
deteccin visible-ultravioleta. En este caso, el pretratamiento de la muestra es ms
sencillo que en los casos anteriores, aunque igualmente necesario. Las muestras de
suero u orina se mezclaban con tampn fosfato 0.2 M de pH 3.0, y se hacan pasar por
una columna Extrelut 1, eluyendo con diclorometano. El extracto se evapor hasta
40 Introduccin
sequedad y el residuo se disolvi en la fase mvil. Porciones de la solucin se
analizaron por HPLC en una columna RP18 Superspher de 12.5 cm de longitud y 4 mm
de dimetro con un relleno cuyo tamao de partcula era 4 m. La fase mvil que se
utiliz fue metanol:fosfato 67 mM ajustado a pH 6.7 en proporcin 1:3 (v:v). El caudal
de la fase mvil era 1 mL/min. Se utiliz deteccin amperomtrica a 1.00 y 1.25 V
frente a un electrodo de Ag/AgCl. Las rectas de calibrado resultaron ser lineales entre
0.15 y 8 mM y los lmites de deteccin fueron de 10 a 30 nM, es decir, alrededor de 2.5
ppb.
En 1994, Balizs y Benesch (90) compararon la determinacin de cuatro
sulfamidas y sus N
4
-acetil metabolitos en tejido muscular utilizando cromatografa
lquida con deteccin ultravioleta y espectrometra de masas. Desarrollaron un mtodo
por LC-MS que validaron para el anlisis de sulfatiazol, sulfadiacina, sulfameracina y
sulfametacina y sus N
4
-acetilmetabolitos en msculo de cerdo tratado previamente con
un complejo polisulfamdico, que contena las cuatro drogas. El proceso de
pretratamiento requera extraccin con cloroformo-acetona, seguido de extraccin en
fase slida con cartuchos de slice Sep-Pak. Paralelamente, se valid un mtodo de
cromatografa lquida y deteccin ultravioleta-visible utilizando el mismo
procedimiento para el pretratamiento. A los tejidos se les adicionaron concentraciones
de estas drogas en un intervalo comprendido entre 20 and 100 g/kg. Como patrn
interno se utiliz sulfametacina marcada con
13
C. Las muestras se analizaron mediante
LC-MS con termoespray. Los lmites de deteccin llegaron a ser inferiores a 25 g/kg y
los lmites de cuantificacin para la mayora de las sulfamidas se estimaron en torno a
100 g/kg. Las muestras reales se analizaron por los dos mtodos de cromatografa
lquida y se encontr que las concentraciones de las sulfamidas eran similares. Sin
Introduccin 41
embargo el mtodo de LC-MS result ms conveniente para anlisis confirmatorios
debido a su especificidad.
Recientemente, en 1999, Roenn y col. (91) han propuesto un mtodo por HPLC
para la determinacin de cotrimoxazol (TMP:SMX, 1:5) en nios tratados de malaria.
El mtodo arroja unos lmites de deteccin de 0.1, 1 y 1 g/mL para trimetoprim,
sulfametoxazol y su acetilsulfametoxazol, respectivamente.
Habida cuenta de la gran variedad de procedimientos analticos para la
determinacin de sulfamidas y sus metabolitos por HPLC, en la siguiente tabla se
enumeran, a modo de resumen, los diferentes mtodos comentados.

Tabla 2. Determinacin de sulfamidas y sus metabolitos por HPLC
Ref. Compuestos Muestra Columna Deteccin
71 TMP y productos de degradacin Orina RP-18 UV-Vis
72, 73 SMT Alimentos para animales C
18
UV-Vis
74 SMT y N-Acetil y aminometabolito Tejidos animales C
18
UV-Vis
75 SQX Alimentos C
18
UV-Vis
76 SQX y N-Acetilmetabolito Plasma y orina C
18
UV-Vis
77 SMX Sangre C
18
UV-Vis
78 SMX y metabolitos Sangre C
18
UV-Vis
79 SMT y N
4
-acetilmetabolito RP-18 y
RP-18
capilar
UV-Vis
82 Sulfamidas y N
4
-Acetilmetabolitos Carne, hgado y riones RP-18 y
Nucleosil
5SA
UV-Vis
83 SMX y N-Acetilmetabolito Orina C
18
UV-Vis
84 SMX, SMT y N-Acetilmetabolitos Suero RP C
18
UV-Vis
85 SSC, SPR e hidroxi y acetil metabolitos Fluidos biolgicos C
18
UV-Vis
86 SMM, SDM, SQX, SDC, SMX y
N
4
-Acetilmetabolitos
Tejidos de pollo C
18
UV-Vis
87 SMM, SDM y N
4
-Acetilmetabolitos Carne de vacuno, cerdo,
pollo y huevos
RP-18 UV-Vis
88 Sulfamidas y N
4
-Acetilmetabolitos Suero y orina C
18
Amperom.
90 STZ, SDC, SMR, SMT y
N
4
-Acetilmetabolitos
Msculo de cerdo C18 UV-Vis y
Masas
91 TMP, SMX y Acetil-SMX Nios con la malaria

La otra tcnica de separacin empleada para la determinacin de sulfamidas y
sus metabolitos ha sido la cromatografa de gases.
42 Introduccin
La determinacin de sulfamidas por cromatografa de gases acoplada a deteccin
por emisin atmica fue realizada por Chiavarino y col. (92) en 1998. Este trabajo
describe el uso de la deteccin por emisin atmica (AED) (93) para la determinacin
simultanea de nueve sulfamidas, separadas por cromatografa de gases concvencional,
una vez convertidas en sus N
1
-metilderivados. El detector de emisin atmica se basa en
un plasma de helio inducido por microondas donde los analitos se transforman en
tomos, iones y radicales en diferentes estados de excitacin. Cuando se desactivan,
emiten fotones que se detectan por medio de un espectrmetro, produciendo un espectro
de emisin elemental. La intensidad de varias lneas puede registrarse simultneamente
para generar una serie de varios cromatogramas especficos. En bibliografa se estn
encontrando cada vez ms aplicaciones de CG-AED (94,95). Se tomaron nueve
sulfamidas y se convirtieron en sus respectivos N
1
-metil derivados por tratamiento con
diazometano. Estos derivados fueron determinados por CG en una columna de slice
fundida de 12.5 m de longitud y 0.22 mm de dimetro interno. Se utiliz He como gas
portador (1.5 mL/min) y un programa de temperatura desde 75 C hasta 290 C a 20
C/min. La identificacin y cuantificacin simultnea se logr con el uso de un detector
de emisin atmica. Las rectas de calibrado fueron lineales entre 3 y 80 mg/L de
sulfamida. La determinacin de sulfamidas fue posible con el uso de 2-amino-
benzotiazol como patrn interno. La capacidad del detector de emisin atmica se
compar con las detecciones por FID y MS. Se menciona el hecho de que el detector
FID no da ms informacin de la identidad qumica del analito que la basada en el
tiempo de retencin. CG-MS ofrece como principal ventaja la identificacin cualitativa
de los analitos gracias a su espectro de masas. Sin embargo, la determinacin
cuantitativa de sulfamidas est limitada por falta de linealidad en la respuesta, con
desviaciones que dependen del compuesto especficamente. El mtodo podra aplicarse
Introduccin 43
a la determinacin de sulfamidas y sus metabolitos en muestras biolgicas, sin embargo,
no se muestra ninguna aplicacin en este sentido.
Utilizando esta tcnica, Matusik y col. (96) determinaron
desaminosulfametacina, sulfametacina y N
4
-acetilsulfametacina con detector de captura
electrnica y posterior confirmacin con deteccin por espectrometra de masas. En este
caso, las sulfamidas se extrajeron de muestas procedentes de carne de ternera y tejidos
de ganado porcino con cloroformo:acetona. Tras el proceso de extraccin al que se
somete a la muestra y previo a la separacin, se propone una derivatizacin de los
analitos, metilndolos con diazometano como reactivo. Una vez realizada la
derivatizacin, se inyectaron las muestras en una columna de vidrio de 6 pies de
longitud y 2 mm de dimetro. La separacin se llev a cabo operando a 280 C 288
C, cuando se utilizaban N
2
o Ar-CH
4
, respectivamente, como gases portadores, en el
caso de la deteccin por captura electrnica. Los intervalos de linealidad para la
desaminosulfametacina, N
4
-acetilsulfametacina y sulfametacina derivatizadas fueron de
0.08 a 3.0 ppm, de 0.02 a 3.0 ppm y de 0.05 a 0.5 ppm, respectivamente. La
identificacin fue realizada por medio de la deteccin por ionizacin qumica y
espectrometra de masas.

Determinacin de sulfamidas, potenciadores y sus productos de degradacin.

Los productos de degradacin son aquellos que se forman a partir de los
productos principales debido a reacciones qumicas. Las causas de la aparicin de
productos de degradacin pueden ser mltiples.
1. Envejecimiento de los productos principales
2. Conservacin en ambientes hmedos o no protegidos de la luz
44 Introduccin
3. Hidrlisis de los productos principales
4. Reacciones qumicas entre varios de estos productos principales.
5. Alteracin de las condiciones de conservacin, especialmente temperatura y
pH
6. Accin bacteriana

La accin de alguno de estos factores o de la combinacin de varios de ellos
hace que aparezcan estos subproductos. En el caso de las sulfamidas, al ser stas
altamente estables en un amplio intervalo de pH, es difcil que a partir de cualquiera de
ellas se pueda generar un producto de degradacin extremando las condiciones de
acidez o basicidad. As, es necesaria la accin de varios factores de los anteriormente
citados para que se produzca la degradacin de este tipo de compuestos. Sin embargo,
no por ello hay que dejar de considerar la importancia que la aparicin de estos
productos puede tener, de cara al control de la calidad en la industria farmacutica,
donde las sulfamidas continan utilizndose como agente teraputico.
En esta memoria se ha abordado, concretamente, el problema de la
determinacin de los productos de degradacin que podran generarse en frmacos que
contienen una de las combinaciones ms ampliamente utilizadas de sulfamida y
potenciador, como es la combinacin entre sulfametoxazol y trimetoprim.
En bibliografa se han encontrado pocas referencias que estudien este problema
analtico. Sin embargo merece la pena destacar alguna de ellas. As en 1986, Deshpande
y col. (97) utilizaron la cromatografa en capa fina para proponer un mtodo de
separacin para varias drogas y antibiticos, entre los que se encontraban
sulfametoxazol, trimetoprim y 3,4,5-trimetoxibenzaldehdo, que es uno de los productos
de degradacin de trimetoprim. Se utiliz un analizador Iatrosan TH-10 equipado con
Introduccin 45
Chromarods S II como fase estacionaria y deteccin por ionizacin en llama. Las fases
mviles utilizadas fueron cido actico al 1%-metanol (4:1) para la separacin de
trimetoprim y sulfametoxazol y diclorometano-metanol-amonaco (80:19:1) para la
separacin de sulfametoxazol y 3,4,5-trimetoxibenzaldehdo. Se dan los valores de RF.
Por otra parte, Cho y Gemperline (98) utilizaron un mtodo de reconocimiento
por espectroscopia en el infrarrojo cercano, que aplicaron a sulfametoxazol y a mezclas
de ste con sus principales productos de degradacin.
Moore y Brouwer (99) monitorizaron por HPLC la estabilidad de
sulfametoxazol y trimetoprim en suero analizando la influencia de la temperatura en un
amplio intervalo, de 20 a 37 C.
Bergh y Breytenbach centraron su estudio en la degradacin de trimetoprim
(100). As, idearon un mtodo por HPLC y deteccin ultravioleta-visible para la
separacin de ste y cinco de sus principales productos de degradacin en tabletas, con
el fin de monitorizar la estabilidad del trimetoprim. La degradacin del trimetoprim se
consigui calentando la materia prima a reflujo en medio cido o exponiendo
suspensiones de trimetoprim en varias disoluciones reguladoras a la luz directa del sol.
Estas tabletas se disolvieron en etanol al 95 %, se filtr la disolucin y se diluy. La
disolucin resultante se inyect en el sistema cromatogrfico. Se utiliz como fase
mvil una mezcla de agua-tetrahidrofurano-propanol-metanol-acetonitrilo-cido actico
(31:25:20:15:5:1) y la deteccin se realiz a 271 nm. Con este procedimiento se separ
el TMP de cinco de sus principales productos de degradacin, sin que otros compuestos
habitualmente presentes en estas tabletas interfirieran, como por ejemplo
sulfametoxazol, metil 4-hidroxibenzoato y propil 4-hidroxibenzoato. El mtodo es
indicador de la estabilidad del trimetoprim porque ninguno de los productos de
degradacin interfirieron en el pico de ste. En este trabajo se da la recta de calibrado
46 Introduccin
para el trimetoprim en presencia de sus productos de degradacin, sin embargo no se
dan datos acerca del intervalo de linealidad ni de la sensibilidad del mtodo.
En esta lnea, estos mismos autores mejoraron su mtodo para determinar el
trimetoprim en presencia de los cinco productos de degradacin (101). La mejora
consisti en que se utiliz una columna de acero inoxidable de 25 cm de longitud y 4.6
mm de dimetro de Partisil ODS-3 (10 m de dimetro) porque, mientras que el mtodo
anterior estaba libre de interferencias por los productos de degradacin, cuando se
utilizaba una columna para estudios cinticos en muestras que contenan trimetoprim en
varias disoluciones reguladoras, se observaba una clara distorsin del pico. La fase
mvil contena disolucin de acetato amnico de pH 6.9 y acetonitrilo al 25 % en
proporcin 3:1. La deteccin se realiz a 254 nm para que no se produjeran
interferencias en la determinacin de trimetoprim en tabletas o suspensiones. El
intervalo de linealidad fue de 1 a 500 ppm y las recuperaciones obtenidas fueron
superiores al 99 %.
En el ao 1993, Smyth y Chabala (102) se enfrentaron al serio problema de la
estabilidad de estas drogas, ya sean como materias primas o como formulaciones,
debido a que se almacenan a temperaturas ms altas y durante ms tiempo de lo que
sera conveniente. Adems, pueden comprarse bastante ms baratas e importarse con
una pureza menor que la deseada. Este trabajo investiga acerca de problemas que se
pueden encontrar en el anlisis orgnico relacionados con estabilidad de las drogas,
como es el caso de trimetoprim y sulfamidas que se asocian con l para potenciar su
actividad. Se comparan mtodos para la resolucin de los problemas analticos que se
plantean. Por polarogarfa diferencial de pulso (DPP), se encontr que, adems del pico
del trimetoprim, se observaban tres picos ms, que se asignaron a diferentes productos
de degradacin. En este caso, se encontr que el mtodo por DPP era suficientemente
Introduccin 47
selectivo para la deteccin de impurezas y productos de degradacin del trimetoprim.
Por otro lado, se propuso un mtodo por HPLC, utilizando una columna Supercosil
LC18 de 25 cm de longitud y 4.6 mm de dimetro, rellena con partculas de 5 m de
dimetro. La fase mvil era metanol:agua (70:30, v:v) y la deteccin se realizaba a 254
nm. Aplicando este mtodo se logr determinar la sulfamida que acompaa al
trimetoprim, generalmente sulfametoxazol, pero no los productos de degradacin de
ste. Desgraciadamente no se dan resultados cuantitativos.

Como ya se ha comentado, la reduccin de la primera sulfamida, el prontosil
rubrum, que produce su escisin, puede darse en otras sulfamidas cualesquiera puesto
que sus estructuras qumicas son muy similares entre s y estn sujetas a reactividades
parecidas, de tal manera que, si esta reduccin se produce antes de que la azorreductasa
acte sobre la sulfamida, la sulfanilamida aparecer como un producto secundario de la
sulfamida, es decir, un producto de degradacin.
El hecho de que todas las sulfamidas puedan reducirse o degradarse para generar
sulfanilamida hizo que fijsemos nuestra atencin en aquellos procesos degradativos no
enzimticos que pudieran producir esa reaccin. Como se ha explicado anteriormente,
son varios los factores que pueden afectar a la estabilidad de un analito en el seno de
una disolucin y cuando algunos de ellos se combinan, pueden dar lugar a que parte de
nuestro analito sufra un proceso degradativo que hay que conocer y evaluar.
Por lo tanto, el problema que se plantea es la determinacin de sulfamidas y sus
productos de degradacin, orientada al anlisis rutinario del control de calidad de
preparados farmacuticos. Segn lo expuesto anteriormente, sea cual sea la sulfamida
que se incluya como principio activo en el frmaco, siempre va a existir la posibilidad
de encontrar sulfanilamida como producto de degradacin.
48 Introduccin
Concretamente, hemos centrado nuestra investigacin en una de las
combinaciones ms utilizadas en la prctica farmacutica, como es la combinacin
sulfametoxazol-trimetoprim y hemos prestado especial atencin a los trabajos que
aparecen en bibliografa relativos a la determinacin de sulfametoxazol en presencia de
sulfanilamida, ya como una sulfamida ms, ya como producto de degradacin.
Uno de ellos es el de Robinson y col. (103), que, sobre la base de un trabajo
anterior de Cobb y Hill (104), elaboraron un mtodo por HPLC en fase normal para el
estudio del sulfametoxazol y su determinacin en frmacos. Prepararon dos tipos de
tabletas de 500 y 1000 mg de sulfametoxazol y adems adicionaron excipientes muy
comunes en la industria farmacutica, como lactosa, cido esterico y lauril sulfato de
sodio. El estudio se hizo en colaboracin entre ocho laboratorios diferentes que
analizaron las mismas tabletas por el mismo mtodo. El procedimiento utilizado
consisti en extraer el sulfametoxazol de las tabletas con metanol y adicionar
sulfameracina como patrn interno. La columna analtica era de acero inoxidable de
250 mm de longitud y 4.6 mm de dimetro, rellena con partculas de 5 m de dimetro.
La fase mvil estaba compuesta por isooctano:diclorometano:2-
propanol:acetonitrilo:cido actico en proporciones 70:25:5:5:0.5. El caudal de fase
mvil era 2 mL/min y la deteccin se realizaba a 254 nm. En conjunto, los resultados
obtenidos muestran que la exactitud y la precisin del mtodo propuesto son
satisfactorias aparte de las variaciones registradas en el equipo cromatogrfico
comercial empleado en cada laboratorio. La respuesta del detector fue lineal hasta 3.0
g de sulfametoxazol inyectado. Las recuperaciones estuvieron entre 98 y 102 %.
En lo que se refiere a determinacin de impurezas, nicamente se cita la
posibilidad que tiene este mtodo para resolver una mezcla de sulfametoxazol en
presencia de sus productos de degradacin, sulfanilamida y cido sulfanlico, generados
Introduccin 49
por hidrlisis en medio cido. Segn se indica, esto se conseguira incrementando las
proporciones de 2-propanol y de acetonitrilo de la fase mvil en un 50 %, por ejemplo,
un incremento desde 5 partes hasta 7.5 u 8 partes de cada uno. Bajo estas condiciones,
el tiempo de retencin de la sulfanilamida es de 20 minutos, aunque con ligera prdida
de resolucin para la separacin del compuesto principal y del estndar interno.
En el trabajo de Li (105) se propone un mtodo para la determinacin de
sulfametoxazol, sulfadiacina y trimetoprim por HPLC en fase inversa, utilizando
sulfanilamida como patrn interno. El mtodo se aplic en preparados farmacuticos de
amplio uso. Se utiliz una fase mvil compuesta por tampn fosfato de pH 7 y
concentracin 50 mM y metanol en proporcin 102:33 (v:v). el caudal de fase mvil era
1 mL/min y la deteccin se realizaba a 240 nm. Las recuperaciones estuvieron en todos
los casos cercanas al 100 %.
Una de las reacciones ms caractersticas de las sulfamidas que, adems, se ha
utilizado para su determinacin es la reaccin de diazotacin y posterior acoplamiento
con el reactivo de Bratton-Marshall, es decir, el dihidrocloruro de N-(1-
naftil)etilendiamia (NED). Esta reaccin, combinada con deteccin espectrofotomtrica
ha sido uno de los procedimientos ms populares (figura 7)

NH
2
SO
2
NH
R
NaNO
2
pH = 1
SO
2
NH
R
N N
+
NED
SO
2
NH R N N
NH CH
2
CH
2
NH
2

Figura 7. Diazotacin de sulfamidas y acoplamiento con dihidrocloruro de
N-(1-naftil)etilendiamia.
50 Introduccin
En el trabajo de Garca lvarez y col. (106) se pone a punto un mtodo
cromatogrfico en fase inversa para la determinacin de sulfamidas en preparados
farmacuticos previa derivatizacion pre-columna para formar el colorante azoico con
NED, donde se utiliza dodecil sulfato sdico y pentanol como eluyente micelar. La
derivatizacin pre-columna mejor la resolucin en los cromatogramas e increment la
selectividad en la determinacin de mezclas de sulfamidas en presencia de otras drogas.
La reaccin de derivatizacin se realizaba en un medio micelar de SDS a pH 1 y ello
llevaba a un procedimiento simple y rpido para el control de este tipo de compuestos
en preparados farmacuticos. Aunque se estudiaron ocho sulfamidas, comentaremos
solamente los datos obtenidos para sulfametoxazol y sulfanilamida. Se estudi la
repetibilidad para disoluciones de dos concentraciones diferentes, 1 y 20 ppm. Se
encontr que la precisin de la respuesta de la sulfanilamida era peor que la del
sulfametoxazol en ambos casos (2.6 y 1.4 % frente a 6.3 y 4.3 % para 1 y 20 ppm de
sulfametoxazol y sulfanilamida, respectivamente). Por otra parte, se hizo un estudio de
las recuperaciones en mezclas sintticas binarias y ternarias de distintas sulfamidas as
como en productos farmacuticos. En el caso de la mezcla binaria de sulfametoxazol y
sulfanilamida, as como en los medicamentos que las contienen, las recuperaciones
fueron prximas al 100 % y las reas de pico presentaron desviaciones estndar
relativas nunca superiores al 2.6 %.
La determinacin de compuestos en medio biolgico suele implicar un
tratamiento de la muestra antes de su anlisis. Este tratamiento puede constar de varias
etapas y se puede llegar a perder parte del analito de nuestro inters por fenmenos
como la coprecipitacin, entre otros.
Long y colaboradores (107-110) demostraron que, mezclando material biolgico
con material de empaquetamiento de las columnas C
18
, se puede preparar una columna
Introduccin 51
de la cual eluir los analitos de inters de una manera selectiva. Basndose en este
principio, propusieron la primera aplicacin de la metodologa de dispersin en fase
slida de la matriz (MSPD) para la extraccin rpida de un grupo de sulfamidas en
muestras de leche, su posterior separacin por HPLC y su cuantificacin con detector de
barra de diodos en lnea (111). Entre esas sulfamidas se encontraban sulfametoxazol y
sulfanilamida. En este trabajo, las muestras de leche se ponan en contacto con el
material C
18
en un simple mortero, donde se agitaba todo hasta su completa
homogeneizacin y se adicionaba sulfameracina como patrn interno. La matriz
resultante se meta en una jeringa y se comprima hasta alcanzar un volumen de 4.5 mL.
Esta columna resultante se lav primero con 8 mL de hexano. Seguidamente, las
sulfamidas se eluyeron con 8 mL de diclorometano. Este extracto se llev a sequedad y
posteriormente se volvi a disolver en metanol:cido fosfrico 17 mM (1:4, v:v). Tras 5
minutos en ultrasonidos, la disolucin se centrifug a 13600 g durante 5 minutos y se
filtr el sobrenadante para su inyeccin en el sistema cromatogrfico. Se utiliz una
columna derivatizada con octadecilsilano y una fase mvil compuesta por cido
fosfrico 17 mM y acetonitrilo en una proporcin 90:10 (v:v). El caudal de fase mvil
cambi de 1 a 2 mL/min a partir de t = 5 min. Los lmites de deteccin estuvieron entre
31.25 y 62.5 ng/mL, segn la sulfamida. Sin embargo, las recuperaciones obtenidas
fueron algo bajas, 73.1 y 89.4 % para sulfanilamida y sulfametoxazol, respectivamente.

Es evidente que la cromatografa lquida es ideal para la separacin de
sulfamidas por el gran poder de separacin que proporciona esta tcnica. Sin embargo,
cuando el objetivo es la determinacin de bajas concentraciones de las mismas, la
deteccin ultravioleta-visible no es suficiente. Una manera de mejorar la sensibilidad
sera utilizar reacciones de derivatizacin para hacer que las sulfamidas presenten
52 Introduccin
fluorescencia. Concretamente, para la determinacin de sulfametoxazol, se ha descrito
una reaccin con o-ftalildialdehdo (OPA) en combinacin con -mercaptoetanol (ME)
utilizando anlisis por inyeccin en flujo (112). Sobre esta base, los mismos autores
propusieron en 1996 (113) la separacin de un grupo de sulfamidas, entre las cuales se
encontraban sulfametoxazol y sulfanilamida, utilizando cromatografa lquida en fase
inversa. La separacin se llev a cabo utilizando un gradiente de fase mvil, compuesta
por acetonitrilo:agua. La columna analtica era de acero inoxidable y tena 15 cm de
longitud y 0.46 de dimetro interno y estaba rellena de partculas con un tamao de 5
m. Tambin se utiliz una precolumna empaquetada con la misma fase estacionaria.
En cuanto al detector, las longitudes de onda de excitacin y de emisin fueron 302 y
412 nm, respectivamente. La derivatizacin post-columna utilizando OPA y ME se
realiz con una bomba peristltica, un clula de flujo, tubos de politetrafluoroetileno de
0.8 mm de dimetro y varias conexiones.


Figura 8. Esquema del montaje para la determinacin de sulfamidas utilizando
derivatizacin post-columna. P = bomba de HPLC; V = vlvula de inyeccin; PC =
pre-columna; CA = columna analtica; BP = bomba peristltica; R = reactor; T =
termostato electrnico; D = fluormetro; O = ordenador; W = desecho.

El procedimiento se aplic a diferentes tipos de alimentos, como tejidos, huevos
y leche. Este mtodo presenta la ventaja de que el tratamiento de la muestra previo a la
Introduccin 53
separacin no necesita muchos pasos, simplemente dos extracciones sucesivas con
cido tricloractico y posterior inyeccin de la muestra en el cromatgrafo. Por su parte,
la linealidad, precisin y recuperacin fueron satisfactorios.
Los lmites de deteccin para sulfanilamida y sulfametoxazol estuvieron en
torno a 50 g/kg para tejido, leche y huevos, cuando, como ya se ha comentado, la
Unin Europea ha adoptado para las sulfamidas un nivel residual mximo de 100 g/kg
en comestibles de origen animal (114).
Sin embargo, Stoev y Michailova (115) obtuvieron unos lmites de deteccin por
debajo de 1 g/kg utilizando un mtodo por HPLC con derivatizacin precolumna por
reaccin con fluorescamina.
El tratamiento propuesto para la muestra era sencillo, como en el caso anterior.
Las sulfamidas se aislaron de la carne o del rin, primero con acetato de etilo y
despus con acetona. Se juntaron las fases orgnicas y se evaporaron a vaco a 50 C. El
residuo se disolvi en agua y, tras 1 minuto de ultrasonidos, se someti a tres
extracciones sucesivas con cloruro de metileno. Las fases orgnicas se mezclaron y se
llevaron nuevamente a sequedad. El residuo se disolvi en 0.25 mL de fluorescamina al
0.1 % en acetona y 0.25 mL de K
2
HPO
4
1 M para su posterior inyeccin en el sistema
cromatogrfico. Se utiliz una columna analtica de 25 cm de longitud y 4 mm de
dimetro, rellena con partculas de 5 m de dimetro. Se utiliz una fase mvil,
compuesta por acetonitrilo:agua (35:65, v:v), de pH 3.0, que contena 0.01 M de
K
2
HPO
4
y cuyo caudal era 1.5 mL/min. Las longitudes de onda de excitacin y de
emisin se fijaron a 405 y 490 nm, respectivamente. Aunque las recuperaciones no
fueron buenas (5487 %), el lmite de deteccin, estimado como concentracin
resultante de una relacin seal-ruido de 5, fue 0.05 g/kg. Anlogamente, se estim
que el lmite de cuantificacin para las sulfamidas en carne era 0.2 g/kg. nicamente
54 Introduccin
para sulfaquinoxalina era 1 g/kg. Estos lmites de cuantificacin mejoraron bastante
los que se haban descrito hasta el momento (116, 117) y desde luego, son mucho
menores que el nivel residual mnimo que tiene adoptado la Unin Europea.
Agbaba y col. (118) describieron un mtodo densitomtrico simple, exacto y
rpido para la determinacin simultnea de cotrimoxazol (SMX:TMP, 5:1) y trazas de
sus impurezas en frmacos por cromatografa en capa fina (CCF). La separacin
cromatogrfica se llev a cabo en placas de 20 10 mm recubiertos con una capa de
250 m de slica gel 60, en las cuales se aplic 1 L tanto de muestras como de
patrones. El desarrollo de las placas se haca con cloroformo-n-heptano-etanol (9:9:9,
v:v:v) a una distancia de 90 mm. Cada placa albergaba 14 muestras y 5 patrones. El
detector densitomtrico se fij a 260 nm. Los calibrados fueron ajustados a un
polinomio de segundo grado y cubran unos intervalos de 500-2500 ng y 100-500 ng
por inyeccin para sulfametoxazol y trimetoprim, respectivamente. Los lmites de
deteccin para sulfanilamida y cido sulfanlico fueron 4.5 y 4.1 ng/L,
respectivamente, lo que equivale a nivel de impurezas del 0.01 %, y los lmites de
cuantificacin fueron 13.5 y 12.4 ng/L, respectivamente, lo que equivale a nivel de
impurezas del 0.03 %. Los lmites de cuantificacin para sulfametoxazol y trimetoprim
fueron estimados en 19 y 16 ng/L, respectivamente.
Anteriormente, en 1985, Tammiletho (119) utiliz la cromatografa en capa fina
de alta resolucin para la determinacin de sulfametoxazol y trimetorprim en
preparados farmacuticos, utilizando sulfanilamida como patrn interno. Tambin se
utiliz deteccin densitomtrica, pero en este caso no se dieron lmites de deteccin y de
cuantificacin, sino recuperaciones para estas drogas en los respectivos medicamentos,
siendo stas cercanas al 100 %.

Introduccin 55
Adems de las tcnicas de separacin se han utilizado otras tcnicas
instrumentales para la determinacin de sulfametoxazol en el seno de un grupo de
sulfamidas en presencia de sulfanilamida, ya sea sta como analito o como producto de
degradacin.
Se han descrito algunos mtodos espectrofotomtricos para tal propsito. En uno
de ellos, se utiliza la espectrofotometra diferencial, basada en la utilizacin de
diferentes espectros de absorcin correspondientes al mismo compuesto, obtenidos a
dos pH diferentes (120). Este mtodo se aplic en la determinacin de las mezclas
binarias de sulfamidas sulfametoxazol-sulfaquinoxalina y sulfatiazol-sulfametoxazol.
Adems, se realiz la determinacin de sulfametoxazol, sulfaquinoxalina y sulfatiazol
en presencia de sulfanilamida adicionando una cantidad constante de sta (6.6 g/mL) a
muestras que contenan diferentes cantidades de sulfamidas. Las recuperaciones fueron
en la mayora de los casos cercanas al 100 %.
Punta Cordero y col. (121) llevaron a cabo la determinacin extracto-
espectrofotomtrica de cido sulfanlico y un grupo de sulfamidas en productos
farmacuticos con 1,2-naftoquinona-4-sulfonato de potasio.
Narita y col. (122) determinaron sulfametoxazol utilizando una reaccin de
diazotacin de aminas seguida de acoplamiento, a pH 4.4, con 2,4,6-triaminopirimidina
al 0.1 % y oxidacin del resultante derivado azoico a un triazol fluorescente mediante el
uso de N-bromosuccinimida al 2 % en NaOH como oxidante. As, obtuvieron un lmite
de deteccin de 40 ng/mL y un intervalo de linealidad de 0.04 a 1 g/mL. Se sugiere
que el mtodo podra ser empleado en la determinacin de sulfanilamida y
sulfaguanidina, pero debido a que esta reaccin de derivatizacin no es selectiva, no se
podra realizar la determinacin de uno de estos compuestos en presencia de otro
aplicando este mtodo.
56 Introduccin
Yao y col. (123) aprovecharon la buena respuesta que dan las sulfamidas en su
forma de sal cuaternaria como especies electroactivas frente a los electrodos de
membrana para la determinacin de algunas de ellas. En lo que concierne al
sulfametoxazol, el lmite de deteccin se estim en 10 M.
Mann y col. (124) emplearon la espectroscopia Raman para la determinacin de
componentes minoritarios en slidos incoloros de alta pureza. Muestras de
sulfametoxazol que contenan cido sulfanlico y sulfanilamida como impurezas se
utilizaron como tests. Los lmites de deteccin encontrados fueron estimados en torno a
1 g/kg.
Por ltimo, en 1992, Nie y col. (125) realizaron la determinacin de
sulfanilamida, sulfacetamida, sulfadiacina y sulfametoxazol mediante un sensor
piezoelctrico. El mtodo se aplic en tabletas y en soluciones oftlmicas, estando los
resultados de acuerdo con los proporcionados por los mtodos de la farmacopea.












Introduccin 57
INTRODUCCIN A LA ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis capilar (EC) es una tcnica relativamente nueva para la
separacin y anlisis de compuestos qumicos que est siendo utilizada cada vez ms
por analistas de los campos de la qumica analtica y bioqumica. Una revisin de los
artculos publicados en los ltimos aos sobre la misma, muestra un crecimiento
exponencial en el nmero de artculos existentes, lo que refleja la expansin y
aceptacin de la tcnica.
La EC complementa otras tcnicas de separacin, como son la cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC o LC), la cromatografa de gases (CG) y la
electroforesis en gel (EG). Algunos de los mtodos usados en HPLC y EG podran
adaptarse a EC debido a sus ventajas, entre las que se incluyen la alta eficiencia y las
rpidas separaciones, las columnas baratas y la larga vida, la pequea cantidad de
muestra requerida y el bajo consumo de reactivos.
Adems, la EC puede ser aplicada para la separacin de una gran variedad de
muestras como son compuestos polares inicos, polares no inicos, as como
compuestos apolares y no inicos. Tambin se puede aplicar al anlisis de biomolculas
de altos pesos moleculares.
La mayora de los artculos iniciales trataron los aspectos tericos de los
principios de la EC. En la actualidad la EC es considerada como una tcnica exacta,
precisa y un mtodo independiente de anlisis y es utilizada de forma rutinaria en la
industria, en la Universidad y en laboratorios gubernamentales.
Sin embargo, al ser una tcnica de reciente implantacin, no existen demasiados
libros publicados sobre ella si la comparamos con los escritos en HPLC.

58 Introduccin
Definicin de electroforesis y principios generales de la tcnica

La electroforesis ha sido definida como el movimiento diferencial de especies
cargadas elctricamente en un medio lquido conductivo, normalmente acuoso, bajo la
influencia de un campo elctrico. La descripcin de los principios de la electroforesis se
remontan al siglo antepasado, cuando Kohlrausch (126) obtuvo las ecuaciones bsicas
de la migracin de un ion en disolucin de electrolito en 1897.
Fue introducida como tcnica de separacin por Tiselius en 1937 (127), cuando
situ una muestra de protenas entre dos disoluciones tampn en un tubo y, aplicando
posteriormente un campo elctrico, encontr que los componentes de la muestra
migraban en una direccin a una velocidad que dependa de la magnitud y del signo de
sus cargas y de sus respectivas movilidades. Gracias a este trabajo, Tiselius recibi el
premio Nobel. Este autor llev a cabo su experimento en una disolucin libre, lo cual
limitaba mucho la eficiencia de la separacin, debido fundamentalmente a la difusin
trmica y a la conveccin. Con el fin de suprimir la conveccin producida por efecto
Joule, la electroforesis se empez a realizar en medios anticonvectivos, como papeles y
geles de poliacrilamida y agarosa. Desde entonces la EG ha sido una tcnica
ampliamente utilizada para la separacin de macromolculas biolgicas, tales como
protenas y cidos nucleicos. Sin embargo, la EG generalmente presenta problemas
derivados de bajas eficiencias, altos tiempos de anlisis, dificultades en la
automatizacin y deteccin. Adems de ser muy laboriosa, el consumo de reactivos y
de tiempo es elevado e incluso pueden darse interacciones entre la muestra y la matriz
del gel que pueden afectar a la separacin.
Debido a estos problemas, se hicieron algunos intentos para llevar a cabo la
electroforesis en disolucin libre sin la necesidad de un medio estabilizante que
Introduccin 59
eliminara la conveccin. Una alternativa fue la utilizacin de tubos finos o capilares.
As Hjerten, en 1967, llev a cabo la primera separacin electrofortica utilizando un
tubo abierto de cristal de cuarzo de un dimetro interno de 1-3 mm y recubierto
internamente con metilcelulosa para prevenir la electrosmosis (128). La conveccin
fue reducida haciendo rotar el tubo alrededor de su eje longitudinal. La deteccin fue
realizada con un detector UV que registraba a lo largo del tubo. Esta tcnica de
electroforesis en zonas libres fue aplicada a una gran variedad de muestras entre las que
se incluyen protenas, cidos nucleicos o incluso virus.
Posteriormente, a mediados de 1970, Everaerts y colaboradores (129)
desarrollaron la isotacoforesis capilar en tubos abiertos de dimetro submilimtrico
basndose en lo que se ha venido a llamar efecto anticonvectivo de la pared que se
ocasiona como consecuencia de la alta capacidad de disipacin de calor que se obtiene
en los tubos de pequeo dimetro interno debido a la alta proporcin entre la superficie
de disipacin y el dimetro interno del capilar. Adems, estos autores usaron tubos de
tefln en lugar de tubos de vidrio, lo cual tena como ventaja la eliminacin del
fenmeno de electrosmosis, que poda perturbar la separacin por isotacoforesis
capilar. A partir de aquel momento se han venido fabricando equipos instrumentales
para esta tcnica, sin embargo el inters por la misma ha sido escaso en comparacin
con otras.
En 1974, Virtanen (130) llev a cabo experiencias por electroforesis en zona
utilizando tubos de vidrio de 200-500 m de dimetro interno utilizando deteccin
potenciomtrica. Algunos aos despus, Milkers, Everaerts y Verhgeen (131) realizaron
separaciones por electroforesis capilar en zona utilizando tubos de tefln de un dimetro
interno de 200 m de dimetro interno y un detector conductimtrico. Con este montaje,
consiguieron separar y detectar 16 pequeos iones en 10 minutos.
60 Introduccin
Los estudios anteriores demuestran que los principios generales de la
electroforesis capilar en zona son conocidos hace mucho tiempo. Pero hasta la dcada
de los 80 los dos principales problemas quedaban sin resolver; por un lado, la baja
sensibilidad de los sistemas de deteccin y por otro, el fenmeno de electrosmosis.
En el ao 1981, Jorgenson y Luckacs describieron separaciones utilizando por
primera vez un tubo capilar de dimetro menor que 100 m como celda electrofortica
(132). Esto les permiti realizar separaciones usando los mismos principios que en la
electroforesis convencional, pero con mayor rapidez y eficiencia (133). En lugar de
intentar suprimir el fenmeno de la electrosmosis usando capilares elctricamente
inertes, aprovecharon este fenmeno que se genera en capilares de pequeo dimetro
interno para mover los analitos a lo largo del capilar con mucha menor dispersin de la
que se observa en cromatografa lquida. Adems, describieron las relaciones existentes
entre los parmetros operacionales y la calidad de la separacin demostrando el
potencial de la tcnica. Desde ese momento tan solo transcurrieron ocho aos hasta la
aparicin del primer instrumento comercial de electroforesis capilar y, de entonces ac,
se ha desarrollado exponencialmente el uso de esta tcnica. Este hecho queda reflejado
en la gran cantidad de monografas sobre EC (134-138) y en el nmero de publicaciones
en revistas cientficas que utilizan esta tcnica como principio de separacin (139-142),
que supera los 6000 (Analytical Abstracts, 1980-2000). En los siguientes aos se
llevaron a cabo algunas innovaciones en cuanto a los sistemas de deteccin y al
desarrollo de algunas subtcnicas de la electroforesis capilar en zona que la han
conducido a ser una poderosa tcnica de separacin, especialmente para compuestos
biolgicos y farmacolgicos.


Introduccin 61
TEORA DE LA ELECTROFORESIS

Aspectos tericos de la electroforesis capilar

La separacin por EC se basa en la diferencia de velocidad de los solutos en el
seno de un campo elctrico. Para comenzar vamos a considerar la migracin de un
compuesto cargado en el seno de una disolucin de electrolito a dilucin infinita, donde
no tengan lugar interacciones inicas.
Si aplicamos un campo elctrico homogneo, el compuesto cargado i es
acelerado por una fuerza (F
e
) proporcional al campo elctrico aplicado (E)
F
e
= q
i
E

Debido a que el ion se encuentra en un medio acuoso, que tiene una viscosidad
(), la fuerza de rozamiento (F
r
) que se opone a su movimiento depender de una
constante (k), de la viscosidad del medio () y de la velocidad de migracin del ion en
el medio (v
i
).
F
r
= k v
i


De acuerdo con la ley de Stokes la constante k puede ser sustituida por 6r para
una partcula esfrica. Para partculas no esfricas y pequeos iones, el valor numrico
es inferior a 6.
F
r
= 6r
i
v
i

donde r
i
es el radio del ion solvatado o, en este caso, hidratado.
62 Introduccin
Si la aceleracin causada por la fuerza elctrica (F
e
) es compensada por la fuerza
de rozamiento se alcanzar un estado de equilibrio en el que las fuerzas sern iguales y
de sentido contrario y el ion se mover con una velocidad constante v
i
.
F
r
= F
e


E
r
q
v
i
6
=

De acuerdo a la ecuacin anterior, la velocidad de migracin del ion es
directamente proporcional al campo elctrico aplicado. A este factor de
proporcionalidad se le denomina movilidad electrofortica absoluta del ion (
e
) que se
puede expresar como:
r
q
E
r
qE
E
v

i
e
6
6
= = =

Es decir, que para un determinado ion, la movilidad electrofortica absoluta slo
depende de la viscosidad del medio. Hemos de destacar que tanto la velocidad como la
movilidad electroforticas pueden ser positivas o negativas dependiendo del signo de la
carga del ion. De esta ecuacin se deduce que pequeas partculas altamente cargadas,
tienen altas movilidades electroforticas y viceversa.
En la prctica se trabaja en presencia de otras especies en la disolucin de
electrolito. Las interacciones electrostticas a las que se ve sometido un ion en la
disolucin de electrolito afectan a la movilidad electrofortica de dicho ion. Estos iones
en disolucin se rodean de contraiones de carga opuesta, que crean una atmsfera
inica. Para considerar estos efectos sobre la movilidad, se cambia la carga terica del
ion por una carga efectiva (menor) del ion y el radio hidrodinmico del ion por el radio
efectivo del mismo, incluyendo su atmsfera de contraiones. As, obtenemos una
Introduccin 63
movilidad efectiva que depende no slo de la viscosidad del medio sino tambin de las
interacciones inicas que ocurren en disolucin.
Como consecuencia, la movilidad efectiva ser siempre inferior a la movilidad
absoluta calculada anteriormente.
Para determinar la movilidad electrofortica es necesario conocer el tiempo que
tarda la molcula desde que es introducida en el capilar hasta su llegada al detector. A
este tiempo se le llama tiempo de migracin y depende directamente de la longitud del
capilar e inversamente de la movilidad electrofortica y del campo elctrico aplicado.
Si slo se considerase la movilidad electrofortica, no se explicara
completamente el comportamiento migratorio dentro del capilar, ya que dicho
comportamiento depende tambin del flujo electroosmtico (143-145).

El fenmeno de electroforesis y el flujo electroosmtico.

El flujo electroosmtico (FEO) o electrosmosis es un fenmeno bsico en todas
las separaciones y se produce al aplicar un voltaje a un sistema lquido que est en
contacto con una superficie cargada. Generalmente, los capilares se fabrican de slice
fundida, si bien, materiales no inicos, como el tefln, tambin exhiben flujo
electroosmtico, que resulta probablemente de la adsorcin de aniones sobre la
superficie.
Cuando la slice est en contacto con una disolucin acuosa, su superficie se
hidroliza para dar lugar a grupos silanol. Estos grupos pueden estar cargados
positivamente como SiOH
2
+
, neutros SiOH o tener carga negativa como SiO
-

dependiendo del pH de la disolucin acuosa. Los contraiones, cationes en la mayora de
los casos, tienden a ser adsorbidos en la pared por atracciones de tipo electrosttico para
64 Introduccin
compensar el defecto de cargas. Se forma as, segn el modelo de Stern, una doble capa
rgida de iones adsorbidos y a la que se superpone una doble capa difusa de iones.
Este sistema de doble capa origina un potencial elctrico en la interfase entre la
pared y la disolucin de electrolito. El potencial de la doble capa rgida decrece
linealmente con la distancia, mientras que el potencial de la doble capa difusa, conocido
como potencial zeta, lo hace exponencialmente.
Cuando se aplica una diferencia de potencial a lo largo del capilar, los cationes
que forman parte de la doble capa difusa son atrados hacia el ctodo y como stos estn
solvatados, arrastran en su movimiento al resto de la disolucin que hay en el capilar
hacia el ctodo. Si bien el punto exacto de la ionizacin de la slice fundida es difcil de
determinar, se ha observado que el flujo electroosmtico comienza a tener un valor
significativo a partir de pH 4.

Los beneficios del flujo electroosmtico

El principal efecto beneficioso del FEO es el hecho de que se consigue un perfil
de velocidades plano, lo cual se traduce en picos estrechos.
La magnitud del flujo electroosmtico puede ser expresada en trminos de
movilidad o velocidad.
E v E;

v
FEO FEO FEO
= =
4


: constante dielctrica del electrolito : potencial zeta
: viscosidad de la disolucin E: campo elctrico aplicado

Introduccin 65
a) Perfil plano b) Perfil laminar




Figura 9. Perfil de velocidades del FEO segn el rgimen del flujo.

Mientras que el FEO normalmente es beneficioso para la separacin, ste
necesita ser controlado, puesto que valores elevados pueden producir la elucin de los
compuestos antes de que se produzca la separacin o bien valores muy bajos pueden
conducir a tiempos de anlisis elevados o incluso que no eluyan determinados
compuestos. As, los parmetros que nos van a permitir el control del flujo
electroosmtico son:
1. Campo elctrico. Al aumentar ste, aumenta la velocidad del FEO como se
describe en las ecuaciones.
2. El pH del tampn de separacin. Ajustando el pH se puede actuar sobre la
carga de la pared del capilar. Cuanto ms altos sea el pH, habr mayor desprotonacin
de los grupos silano y mayor densidad de carga por lo que el potencial zeta ser mayor
y como consecuencia aumenta la
FEO
y la v
FEO
. A pH neutro, el FEO ya es capaz de
arrastrar todas las especies al ctodo.
3. Fuerza inica o concentracin del tampn. sta afecta al espesor de la doble
capa ya que al aumentar la concentracin de iones disminuye el espesor de la doble capa
difusa. Como consecuencia el potencial zeta tambin disminuye y en definitiva el FEO
es menor (146).
66 Introduccin
4. Adicin de disolventes orgnicos. Influyen sobre la viscosidad de la
disolucin y sobre el potencial zeta. Metanol, etanol e isopropanol, en concentraciones
de 10 a 20 % reducen el FEO, sin embargo, el acetonitrilo ha demostrado producir el
efecto contrario (146).
5. Temperatura. Provoca cambios en la viscosidad del electrolito (de un 2 a 3%
por

grado centgrado) haciendo que aumente la velocidad del FEO al aumentar la
temperatura.
6. Adicin de polmeros neutros hidroflicos. Se adsorben sobre la pared del
capilar disminuyendo la FEO y tambin aumentan la viscosidad por lo que su accin se
ve intensificada.
7. Recubrimiento interno del capilar. Se realiza con compuestos que se enlazan
de forma covalente a su superficie y el resultado es la supresin del FEO.

Una vez estudiados los principios tericos de la electroforesis, as como los del
FEO y los factores de que depende, vamos a suponer un sistema constituido por dos
electrodos y un capilar de slice fundida relleno de electrolito de pH bsico (9.2) y en el
cual se ha introducido, en el extremo en contacto con el nodo, una muestra constituida
por cationes, aniones y especies neutras.
Si se aplica una diferencia de potencial entre nodo y ctodo, los iones migrarn
a lo largo del capilar con una determinada velocidad electrofortica que depender de la
relacin q/r de cada ion, obtenindose finalmente un electroferograma como el que se
muestra en la figura 10.



Introduccin 67





+
Tiempo de migracin
FEO
Se
a
-
-
+


Figura 10. Electroferograma tipo para una disolucin que contiene aniones,
cationes y especies neutras

Los aniones de menor tamao tienen mayor velocidad electrofortica que los de
mayor tamao, por eso oponen mayor resistencia al FEO y tardan ms tiempo en eluir.
Los compuestos neutros avanzan todos juntos a igual velocidad electrofortica que es la
velocidad del FEO. Los cationes se ven impulsados por el FEO y como los ms
pequeos son los que tienen mayor velocidad electrofortica sern los primeros en salir
y los mayores los ltimos en salir. As, el tiempo necesario para ser eluido un ion viene
determinado por su movilidad y por la del FEO.
La movilidad aparente de un ion se define como

FEO i A
+ =
y puede ser obtenida a partir de su tiempo de migracin y otros parmetros
experimentales.
V t
lL
E t
l
E
V
m m
A
A
= = =

l: longitud del capilar desde el extremo de la inyeccin hasta el detector.
L: longitud total del capilar t
m
: tiempo de migracin V: voltaje aplicado
68 Introduccin
Puesto que la movilidad del FEO es fcilmente calculable usando un marcador
neutro (DMSO, acetona, fenol, metanol) a partir del electroferograma se puede extraer
rpidamente la movilidad efectiva de un determinado ion:
FEO A i
=
Tambin se puede poner en funcin de los tiempos de migracin como:
V
L
t t
mm m
li
|
|
.
|

\
|
=
1 1

donde t
mm
es el tiempo de migracin del marcador.
Hay que destacar que los aniones tendrn movilidades negativas ya que se
oponen al FEO y los cationes, positivas pues van en el mismo sentido.

El tampn de separacin

La seleccin del tampn de separacin es extremadamente importante para la
separacin. Existen numerosas publicaciones donde se hace referencia a la influencia de
la concentracin de tampn y el FEO (147, 148). El pH del tampn de separacin es un
parmetro crtico a la hora de la separacin. Puede estar comprendido entre 2 y 12
debido a la alta estabilidad de los capilares de slice fundida.
La eleccin del pH depender del tipo de soluto a separar, ya que ste puede
afectar a la carga de los solutos y, por tanto, a su movilidad electrofortica as como a la
movilidad del FEO, alterando as la separacin de los compuestos.
Despus del pH, la fuerza inica del tampn es una herramienta poderosa para
mejorar la eficiencia, resolucin y selectividad de la separacin ya que influye sobre la
movilidad de los analitos y sobre la movilidad del FEO por afectar al espesor de la
doble capa difusa y por tanto al potencial zeta (). Adems influye en la intensidad de
Introduccin 69
corriente que atraviesa el capilar y, por lo tanto, en el calor generado por efecto Joule.
Por ello hay que seleccionar tampones cuyos iones presenten baja conductividad, como
Tris, borato, histidina, cido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfnico (CAPS), cuyos
iones son voluminosos y como consecuencia pueden ser usados en altas concentraciones
sin generar corrientes demasiado altas aunque presentan la desventaja de que estos
tampones suelen presentar fuerte absorcin en el UV.
Para aumentar la selectividad del sistema, se puede aadir al tampn una serie de
aditivos tales como disolventes orgnicos, que aadidos al electrolito alteran la
polaridad y la viscosidad de la fase mvil. Como consecuencia, se modifica la
movilidad electroosmtica de los iones y la movilidad del FEO. La adicin al tampn de
surfactantes, selectores quirales o agentes formadores de complejos puede alterar
tambin la selectividad y el tiempo de anlisis.

Parmetros determinantes de la separacin

Una separacin analtica se lleva a cabo para obtener, en un tiempo razonable,
informacin cualitativa y cuantitativa acerca de la muestra.As, los parmetros ms
relevantes que dan idea del correcto funcionamiento de una separacin electrofortica
son el tiempo de migracin, la eficiencia, la selectividad y la resolucin.

El tiempo de migracin (t
m
) de un analito es el tiempo que ste tarda en
recorrer la longitud efectiva del capilar (l) y se obtiene directamente del
electroferograma. ste puede ser descrito en funcin de los parmetros experimentales
como:

( )V
lL
t
FEO l
m
+
=
70 Introduccin

La eficiencia de un sistema electrofortico se mide por el nmero de platos
tericos (N) alcanzados por el capilar y se puede calcular a partir de la siguiente
expresin:
DL
V l
N
w
t
N
FEO e m
2
) (
; 54 . 5
2
2 / 1
+
=
|
|
.
|

\
|
=
donde w
1/2
es el ancho del pico a la mitad de su altura y D es el coeficiente de difusin
del soluto

La selectividad es la capacidad del sistema para separa solutos que estn
prximos entre s y se mide a travs de la distancia entre dos mximos consecutivos. La
selectividad viene dada por la siguiente expresin:
mFEO m
mFEO m
t t
t t

=
1
2

La forma ms eficiente para influir sobre ella es cambiar el pH de la disolucin.

La resolucin (R) es el parmetro ms importante a la hora de la separacin.
Nos indica lo bien separados que estn dos compuestos. Se puede calcular a partir del
electroferograma usando la ecuacin:


2 1
1 2
) ( 2
w w
t t
R
m m
+

=
Pero tambin se puede expresar como:


( )
2
1
2
1
EOF
L
l
D
V
177 . 0 R |
.
|

\
|
|
|
.
|

\
|
+
=

Introduccin 71
De esta ecuacin podemos deducir que la resolucin aumenta con el voltaje pero
no aumenta tanto como lo hace la eficiencia que es directamente proporcional al voltaje.
As, hemos de usar voltajes lo ms altos posibles para llevar a cabo la separacin ya que
produce separaciones ms rpidas, con altas eficiencias.
En cuanto a la movilidad del FEO, hemos de destacar que altas movilidades que
antes producan altas eficiencias, ahora producen bajas resoluciones. La mayor
resolucin se obtendr cuando la movilidad del FEO sea igual y en sentido contrario a la
movilidad electrofortica media de los iones pero si tenemos en cuenta el t
m
(medio):

FEO
m
lL
) medio ( t
+
=

Si
FEO
=

entonces el t
m
tendera a infinito, lo cual no es prctico. Por lo tanto, se debe mantener
un
FEO
que d tiempos de anlisis lo ms pequeos posible siempre que exista una
resolucin entre los picos.
La resolucin depende tambin de las movilidades electroforticas de los
analitos y ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia entre ellas. Esta diferencia se
puede aumentar al optimizar el pH del electrolito de separacin o bien mediante la
adicin de modificadores orgnicos al electrolito de separacin, lo cual puede causar
diferencias en las movilidades y, por lo tanto, aumentar la resolucin y la selectividad
del sistema.






72 Introduccin
Factores que afectan al desarrollo de la separacin

El alto poder de resolucin de la EC se debe fundamentalmente a que los efectos
dispersivos pueden ser controlados con la nueva instrumentacin, por lo que es
importante comprender estos efectos dispersivos para estimar su influencia sobre la
separacin y conseguir disminuirlos al mximo.
El ensanchamiento de los picos en EC es la suma de una serie de efectos que
contribuyen a ste. Suponiendo un pico gaussiano, el ensanchamiento puede ser
expresado en trminos de la variante espacial
2
. As, la varianza total ser la suma total
de una serie de varianzas debidas a determinadas fuentes de dispersin.

2
O
2
W
2
I
2
E
2
J
2
A
2
D
2
t
+ + + + + + =

D: difusin I: inyeccin
A: adsorcin W: cambio de la zona de deteccin
J: efecto Joule O: otros.
E: electrodispersin

Difusin. En EC la muestra se introduce en un capilar. La zona donde est
contenida la muestra se va ensanchando por ambos lados debido a una diferencia de
concentracin entre la zona de muestra y el electrolito de separacin. Se obtiene as un
perfil de concentracin semejante a una curva gaussiana.

Adsorcin. La principal causa de adsorcin sobre las paredes de slice fundida
son las interacciones inicas entre compuestos catinicos y las propias paredes, que
presentan cargas negativas. Dependiendo de la intensidad de esta interaccin, se pueden
Introduccin 73
obtener picos asimtricos, o bien, puede ser que exista una total adsorcin del analito en
las paredes, en cuyo caso no se obtendran picos.

Efecto Joule. Cuando una corriente pasa a lo largo del capilar, parte de la energa
elctrica es convertida en calor. Como consecuencia de este calor, aumenta la
temperatura dentro del capilar, crendose un gradiente de temperatura desde el centro
hacia la pared del capilar y que es eliminada a travs de las paredes de ste.
Matemticamente, puede ser descrito por la siguiente ecuacin:

(

|
.
|

\
|
+
|
|
.
|

\
|
+
|
|
.
|

\
|
=
h
1
r
1
r
r
ln
K
1
r
r
ln
K
1
2
Qr
T
3 2
3
2 1
2
1
2
1
T


Q: calor generado por efecto Joule. r
1
: radio interno del capilar
r
2
: radio externo del capilar. r
3
: radio externo de la poliamida
k
1
y k
2
: conductividades trmicas de la slice y de la poliamida, respectivamente (k
1
>
k
2
)
h: velocidad de transferencia trmica desde el capilar.

Como consecuencia de la corriente elctrica, el calor se genera homogneamente
a lo largo del interior del capilar. Mientras que el perfil de temperatura dentro del
capilar es parablico, el perfil de temperatura a lo largo de las paredes del capilar y de
un medio envolvente es logartmico.

Para obviar este fenmeno, se puede eliminar el calor de la superficie del capilar
a travs de un sistema de refrigeracin que puede ser por una corriente forzada de aire o
mediante el uso de un lquido refrigerante. Este control de temperatura es necesario no
slo para eliminar el calor sino para mantener el capilar a una temperatura constante
74 Introduccin
durante la separacin, incluso en ausencia de efecto Joule, para asegurarnos la
reproducibilidad de las medidas.

Longitud de la muestra inyectada. Es importante que la longitud de la muestra
inyectada sea lo ms pequea posible. Si sta es mayor que la dispersin causada por la
muestra, la eficiencia (149) y la resolucin se vern sacrificadas. Una regla prctica
consiste en inyectar una longitud de muestra inferior al 1-2 % de la longitud total del
capilar.

Electrodispersin. Ocasiona la dispersin de los picos electroforticos debido a
la diferente composicin del tampn y la muestra inyectada, lo cual da origen a dos
zonas de diferente conductividad y, por lo tanto, de campo elctrico. Cuando la zona de
muestra presenta una mayor movilidad que la del electrolito (11a), el borde anterior de
la zona de la muestra ser difuso y el borde posterior ser picudo. Anlogamente,
cuando la zona de la muestra presenta una menor movilidad que la del electrolito (11c),
el borde anterior de la zona de la muestra ser picudo y el posterior ser difuso. Caso de
que tanto la muestra como el electrolito tengan la misma conductividad (11b), no
existir ninguna deformacin del pico debido a la electrodispersin.

Figura 11. Electrodispersin derivada de la diferencia de conductividad entre la
disolucin de la muestra (verde) y el electrolito (amarillo)

Introduccin 75
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES DE LA
ELECTROFORESIS CAPILAR.

En la figura 12 se muestra el diseo bsico de un equipo de electroforesis
capilar.

Figura 12. Diseo bsico de un equipo de electroforesis capilar.

Para comenzar una separacin, el capilar se rellena con el tampn o electrolito
de separacin, despus se inyecta la muestra en el lado opuesto al detector y
seguidamente el capilar se sumerge en dos viales que contienen el electrolito de
separacin a la vez que los electrodos. Finalmente se aplica una diferencia de potencial
entre ambos electrodos y comienza la separacin.

Inyeccin de la muestra

La inyeccin de la muestra en el capilar se puede hacer mediante una gran
variedad de mtodos, pero los dos ms importantes son la inyeccin hidrodinmica y la
inyeccin electrocintica.
La inyeccin hidrodinmica se puede llevar a cabo mediante la aplicacin de una
presin al vial, en el que se introduce en el extremo inicial del capilar, o bien, haciendo
76 Introduccin
vaco sobre el extremo final del capilar, o bien, por gravedad elevando el vial que
contiene la muestra unos centmetros por encima del vial de salida.




Figura 13. Modos de inyeccin hidrodinmica.

La inyeccin electrocintica supone un modo alternativo a la introduccin de la
muestra en electroforesis capilar. Se basa en el hecho de que al aplicar una diferencia de
potencial aparece un movimiento electrofortico y electroosmtico en el capilar.

Introduccin 77

Figura 14. Inyeccin electrocintica.

El nivel de concentracin detectable en EC es del orden de mg/L. Para las
determinaciones en frmacos, estos lmites pueden ser suficientes pero cuando se trabaja
con fluidos biolgicos interesa detectar cantidades inferiores.
En la prctica actual, se ha intentado suplir esta limitacin mediante el empleo
de tcnicas de preconcentracin previas a las separaciones elecroforticas o bien
mediante preconcentraciones en columna durante o antes de la separacin
propiamente dicha (150). Estas tcnicas, de amplificacin de campo, son el Stacking
(FASS) (131) y la inyeccin de grandes volmenes de muestra (LVSS) (151).

Fuente de alto voltaje

Se utilizan fuentes de corriente continua, capaces de aplicar un voltaje entre 1 y
30 KV con una regulacin de voltaje de 0.1% para mantener una alta reproducibilidad
del tiempo de migracin. Debe tener la capacidad de cambiar la polaridad y es
preferible que este cambio se haga directamente desde el correspondiente programa
informtico.


78 Introduccin
Capilar

Los capilares que se utilizan en una separacin electrofortica han de ser
qumica y elctricamente inertes, transparentes a la radiacin UV-Visible, robustos a la
vez que flexibles y baratos. La mayor parte de estos requerimientos los rene la slice
fundida, por lo que gran mayora de los capilares que se utilizan en EC estn hechos de
slice. Uno de los mayores problemas que presenta la slice fundida es su baja
flexibilidad, por ello los capilares van recubiertos de una capa de poliamida que protege
al capilar y le confiere una gran flexibilidad. La ventana de deteccin se consigue hacer
fcilmente quitando unos milmetros de la poliamida utilizando una llama o una
resistencia elctrica.
Otro material que se suele utilizar es el tefln, que es transparente a la radiacin
UV, no requiere ventanas especiales y, aunque no presenta carga, exhibe FEO. Sin
embargo, es difcil obtener capilares de tefln con un dimetro interno homogneo.
Adems, presenta problemas de adsorcin similares a los de slice y bajos coeficientes
de transferencia trmica, inconvenientes que han hecho que su uso sea ms limitado.
Los capilares de slice que se utilizan en EC suelen tener un dimetro interno
entre 25 y 100 m y un dimetro externo entre 350 y 400 m. La longitud efectiva suele
oscilar entre los 10 cm, para capilares rellenos de gel y los 100 cm de los capilares que
se utilizan para la resolucin de muestras muy complejas. No suelen utilizarse capilares
ms largos porque hacen que aumente considerablemente el tiempo de anlisis sin una
mejora apreciable de la eficiencia.



Introduccin 79
Sistemas de termostatizacin del capilar

Existen sistemas de flujo de aire (a una velocidad de unos 10 m/s) o de lquido.
Aunque el sistema por lquido suele ser algo mejor tambin supone una instrumentacin
ms complicada y de mayor coste, por lo que en muchas ocasiones se prefiere la
termostatizacin por flujo de aire, que se muestra igual de eficiente, siempre y cuando
no se superen valores de 5 (W/m) durante la separacin.

Sistemas de deteccin

La electroforesis es bastante parecida a la cromatografa lquida en el hecho de
que los solutos se eluyen del sistema por un tubo en forma lquida. As, no es
sorprendente que la mayor parte de los detectores utilizados en HPLC lo sean tambin
en EC.
El detector UV es uno de los ms utilizados en EC. Como sabemos, las
absorbancias dependen de la posibilidad de la existencia de grupos cromforos en la
molcula a la longitud de onda de trabajo, del pH del tampn de separacin, de la
concentracin y de la longitud de paso ptico.
El hecho de que la longitud del paso ptico de la celda en EC es
aproximadamente el dimetro interno del capilar limita mucho la sensibilidad de la
tcnica. Para aumentar la longitud de paso ptico se pueden utilizar ventanas de
deteccin en forma de Z, de burbuja (152, 153) o bien celdas de multirreflexin, donde
el incremento de paso ptico es proporcional al nmero de reflexiones, con las que se
pueden conseguir longitudes de paso ptico de hasta 1 cm. Tambin se pueden utilizar
capilares rectangulares, donde la absorbancia puede ser multiplicada por 20.
80 Introduccin
Los sistemas ms utilizados son los que se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Mtodos de deteccin.
Mtodo LOD* (M) Ventajas e inconvenientes
Absorcin UV-Vis 10
-5
10
-8

-Universal
-La batera de diodos en lnea ofrece
informacin espectral
Fluorescencia 10
-7
10
-9

-Sensibilidad
-Requiere, en general, derivatizacin
Fluorescencia inducida por LASER 10
-14
10
-16

-Muy sensible
-Caro
-Requiere, en general, derivatizacin
Amperometra 10
-10
10
-11

-Sensible
-Selectivo, pero suele usarse con analitos
electroactivos
-Requiere modificaciones electrnicas y en
el capilar
Conductividad 10
-7
10
-8

-Universal
-Requiere modificaciones electrnicas y en
el capilar
Espectrometra de masas 10
-8
10
-9

-Alta sensibilidad e informacin estructural
-Acoplamiento EC-MS complicado
Mtodos indirectos 10 100 veces
menos que un
mtodo directo
-Universal
-Menor sensibilidad que los directos
Otros
Radiactividad, ndice de refraccin, dicrosmo circular, Raman...
* LOD: Lmite de deteccin



Figura 15. Celdas de deteccin que aumentan el paso ptico.



Introduccin 81
MODALIDADES DE ELECTROFORESIS CAPILAR

Las principales modalidades descritas dentro de la electroforesis son las que se
enuncian a continuacin.
- Electroforesis capilar en zona (CZE).
- Cromatografa electrocintica micelar (MEKC).
- Electroforesis capilar en gel (ECG).
- Isoelectroenfoque (IEF).
- Isotacoforesis capilar (ITFC).
- Electrocromatografa capilar (CEC).
En el trabajo experimental que se refleja en esta memoria, se han utilizado las
dos primeras modalidades de la lista anterior, las cuales pasamos a comentar
brevemente.

Electroforesis capilar en zona

La CZE es uno de los modos ms ampliamente usados debido a la simplicidad
de operacin y a su gran versatilidad. Su nombre puede conducir a errores debido a que
tambin la MECK y la CGE son modos zonales, por lo que a veces se le denomina
tambin EC en disolucin libre.
Para llevar a cabo una separacin por EC se rellena el capilar con tampn, se
inyecta la muestra y se sumergen ambos extremos del capilar en sendos viales que
contienen tampn y comienza la separacin aplicando una diferencia de potencial (10-
30 KV) entre nodo y ctodo.
82 Introduccin
Una vez aplicada la diferencia de potencial, los cationes migrarn hacia el
ctodo separndose en distintas zonas dependiendo de su velocidad electrofortica y, si
existe FEO, los aniones en la mayor parte de los casos sern empujados por ste hacia el
detector (hacia el ctodo) separndose tambin en distintas zonas segn sus velocidades
electroforticas.
Los aniones, puesto que tienden a migrar en sentido contrario al FEO, salen a
tiempos ms elevados que ste, siendo los primeros aquellos que, a igual carga,
presentan mayor tamao y que, a igual tamao, presentan menor carga. Hay que resaltar
que en algunas ocasiones el flujo puede invertirse mediante la adicin de aditivos
haciendo que vaya desde el ctodo al nodo.

Cromatografa electrocintica micelar

Este mtodo combina el mecanismo de separacin de la cromatografa con el
movimiento electrofortico y electroosmtico de los analitos y de la disolucin. El
desarrollo de la MEKC fue un gran avance en la EC puesto que proporciona un mtodo
para la separacin de compuestos neutros as como de compuestos cargados (inicos).
Fue introducida por Terabe y colaboradores (53 55) en 1984 y desde entonces es uno
de los mtodos ms utilizados en la EC. Est basada en el reparto del soluto entre las
micelas y el tampn de separacin.
Los detergentes, tambin denominados surfactantes, son molculas que
contienen un grupo inico (hidroflico) en un extremo de la molcula y una regin
hidrofbica al otro extremo (que puede ser una cadena alqulica). Dependiendo del tipo
de grupo electroflico, los surfactantes se pueden calisficar en aninicos (grupos
Introduccin 83
sulfnicos o carboxlicos), catinicos (grupos de alquil amonio) anfolticos (tienen a su
vez grupos aninicos y catinicos) y no inicos (grupos polietoxi).
Cuando un detergente est en disolucin a una concentracin superior a su
concentracin micelar crtica, ste forma micelas, que son agregados moleculares,
normalmente de forma esfrica, en los que el grupo hidroflico est orientado hacia el
exterior y los grupos hidrofbicos hacia el interior de la misma, generando en el interior
de sta una cavidad altamente hidrofbica (Figura 16). Se denomina nmero de
agregacin al nmero de la molculas de ste que constituye una micela y depende del
tipo de surfactante.

Figura 16. Estructuras de micelas aninicas y catinicas

En la MECK, se aade al tampn de separacin un surfactante por encima de su
concentracin micelar crtica, con lo cual se originan dos fases, una acuosa y otra
micelar.
Si inyectamos una muestra formada nicamente por compuestos elctricamente
neutros en un sistema constituido por un surfactante que forme micelas aninicas y
donde la movilidad electrofortica de las micelas sea superior a la del FEO, stas sern
atradas hacia el nodo al aplicar el campo elctrico, pero el FEO las impulsar hacia el
ctodo. Los compuestos hidroflicos permanecern en el tampn y no entrarn en la
84 Introduccin
cavidad hidrofbica de la micela, por lo tanto migrarn a la misma velocidad que el
FEO. Las molculas muy hidrofbicas entrarn en las micelas y no tendrn ninguna
tendencia a salir de ellas, por lo que su tiempo de migracin coincidir con el de las
micelas (t
mic
).
Las molculas que son parcialmente solubles en las micelas se distribuirn entre
stas y el tampn establecindose un equilibrio entre ambas fases segn una constante
de reparto. stas saldrn en un tiempo comprendido entre el tiempo del FEO y el tiempo
micelar y que vendr determinado por su hidrofobicidad, es decir, el tiempo que estos
permanecen en la micela. A la diferencia entre el tiempo al que salen las micelas y al
que sale el flujo se conoce como ventana de retencin.
Para determinar el tiempo micelar, normalmente, se utiliza una sustancia
altamente hidrfoba como el Sudn III, Sudn IV y tambin el amarillo OB. Para
determinar el tiempo del FEO se suele utilizar una sustancia hidrfila que no se
introduce en la micela como es el metanol.
La resolucin en MECK entre dos picos adyacentes puede ser expresada en
funcin de la eficiencia, selectividad y retencin como:
(
(
(
(

+
|
.
|

\
|
=
1
2
2
2 / 1
' 1
1
' 1
' 1
4
K
t
t
t
t
K
K N
R
mc
FEO
mc
FEO
s

Donde N es la eficiencia expresada como el nmero de platos tericos, es la
selectividad (K
2
/K
1
) y los subndices 1 y 2 son los referentes al primer y al segundo
soluto.
Segn Foley, el factor de capacidad ptimo para obtener la mxima resolucin
por unidad de tiempo, viene dado por un valor comprendido entre 1.2 y 2.
Introduccin 85
Adems de la concentracin del tampn, un gran nmero de efectos tienen
influencia sobre la separacin en MECK, como son la naturaleza del surfactante, la
temperatura del tampn y la utilizacin de aditivos como los modificadores orgnicos.
La naturaleza del detergente puede afectar a la resolucin, ya que sta influye sobre K,
y la relacin t
FEO
/t
mc
. Adems, la resolucin puede verse influida por la adicin de
modificadores orgnicos al tampn.
Normalmente, una muestra puede contener analitos cargados y neutros, de tal
manera que, cuando se procede a su separacin por MECK, los neutros se separarn en
funcin de su distribucin entre el tampn y la micela y los que presentan carga, en
funcin de sus movilidades o en funcin de sus interacciones con las micelas
dependiendo de su carga y de la carga de las micelas.
La temperatura tiene un efecto importante en la separacin en MECK debido a
varios aspectos que se enumeran a continuacin. En primer lugar porque las micelas
slo se forman cuando se sobrepasa una temperatura micelar crtica denominada punto
de Kraft, independientemente de la concentracin del surfactante. En segundo lugar, la
temperatura influye en el coeficiente de particin del soluto. Un aumento de
temperatura provoca una disminucin del coeficiente de particin. En tercer lugar,
influye sobre el factor de capacidad K y en la eficiencia de manera inversamente
proporcional y por ltimo, un aumento de temperatura disminuye el tiempo de anlisis
y, normalmente, la resolucin.









86 Introduccin
INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

La cromatografa puede definirse como una tcnica de separacin de los
componentes de una mezcla, basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de
los mismos y que se establece al ser arrastrados por una fase mvil (lquida o gaseosa) a
travs de un lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser
lquida o slida.
La cromatografa es, probablemente, la ms verstil de las tcnicas de
separacin; es aplicable a cualquier mezcla soluble o voltil. De hecho las tcnicas de
separacin suelen dividirse en dos grandes grupos: cromatogrficas y no
cromatogrficas. La eleccin de una tcnica cromatogrfica concreta depender de la
naturaleza y cantidad de muestra, del objetivo de la separacin y de las limitaciones del
tiempo y equipo disponible.
Puede hacerse una primera distincin entre las tcnicas cromatogrficas
atendiendo a la integracin continua o no del sistema de deteccin. As, la
cromatografa plana no conlleva un sistema de deteccin continuo, mientras que
cualquier cromatgrafo de lquidos o gases lleva incorporado dicho sistema, siendo, por
tanto, autnticos instrumentos.
Las dificultades de la modalidad clsica, a baja presin, de la cromatografa
lquida en columna, tales como la lentitud, poca eficacia en la capacidad de
discriminacin y nmero de solutos que pueden separarse, necesidad de la intervencin
casi constante del operador e imposibilidad de aplicar deteccin continua, motivaron
que las aplicaciones de esta tcnica fueran restringidas, en contraste con el espectacular
desarrollo de la cromatografa de gases.
Introduccin 87
Para que la cromatografa lquida en columna sea competitiva con la
cromatografa de gases, es preciso, dada la diferencia de viscosidad de la fase mvil y
su capacidad para atravesar lechos empaquetados, trabajar a presiones elevadas en lugar
de utilizar slo la fuerza de la gravedad.
Ello permite reducir el tamao de la partcula de la fase estacionaria y por tanto
aumentar la eficacia separativa. Por otro lado, reduce drsticamente la duracin de la
separacin, equiparndola con la necesaria para una separacin por cromatografa de
gases, y permite una deteccin continua del eluido.
Las espectaculares aplicaciones de la configuracin de la cromatografa lquida
en columna a presin elevada, cubriendo aspectos inabordables o poco recomendables o
prcticos en cromatografa de gases (compuestos inicos, muy polares, termolbiles, no
voltiles, fases acuosas de muestras, etc.) la han convertido, junto con la electroforesis
capilar, en una tcnica analtica muy utilizada en reas tales como la Bioqumica,
Contaminacin, Alimentacin, Clnica, etc. Su desarrollo comercial comenz en los
setenta, y se consolid en los ochenta.
Entre las denominaciones que ha recibido esta modalidad y que hacen referencia
a sus caractersticas propias (alta resolucin, alta eficacia, rapidez y alta presin) la
utilizada con mayor frecuencia es la que hace referencia a su alta resolucin:
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN, cuyas siglas en espaol,
CLAR, o en ingls, HPLC, son las ms frecuentemente encontradas en la literatura
hispana y anglosajona respectivamente, si bien, ltimamente se viene utilizando
simplemente CL o LC.



88 Introduccin
Principios bsicos

La cromatografa, que es hoy en da la principal tcnica analtica de separacin,
se encuentra regida por factores termodinmicos y cinticos. Los aspectos
termodinmicos son los que determinan las caractersticas de retencin y selectividad
del sistema cromatogrfico y corresponden a los equilibrios de distribucin de los
solutos entre la fase mvil y la fase estacionaria. En cuanto a los aspectos cinticos,
consideran el tiempo para el que se alcancen los sucesivos equilibrios entre las fases en
el tiempo de contacto y la velocidad de desplazamiento diferencial de la mezcla de
solutos en el lecho cromatogrfico.
Aunque tanto los aspectos termodinmicos como los cinticos influyen en todo
el proceso cromatogrfico, son los termodinmicos los que determinan bsicamente la
situacin del pico, mientras que los cinticos influyen decisivamente en el
ensanchamiento de los mismos.

Concepto de plato terico

La eficacia del sistema se ha venido asociando histricamente en cromatografa
al concepto de plato terico definido como la porcin del lecho cromatogrfico en el
que se alcanza el equilibrio de distribucin. La altura equivalente del plato terico
(AEPT o H) se define como:
AEPT = H = L/n
Donde L es la longitud de la columna y n el nmero de veces que se alcanza el
equilibrio y que coincide con el nmero de platos tericos de la columna. Esta teora
asume para el mtodo cromatogrfico lo que ocurre en una extraccin lquido lquido
Introduccin 89
en contracorriente, donde el plato terico es equivalente a una unidad de extraccin. La
teora considera que la fase mvil fluye de modo discontinuo entre los platos y que la
relacin de distribucin es independiente de la concentracin, sin tener en cuenta la
influencia de la difusin axial del soluto ni la velocidad de flujo de la fase mvil.
La realidad experimental se describe mejor mediante las llamadas teoras de
velocidad o del plato dinmico en las que se tienen en cuenta la influencia de la difusin
axial, la velocidad del flujo de la fase mvil, el tamao de partcula del lecho y el
espesor de la fase estacionaria. Al contrario de lo que sucede en la teora clsica, la
AEPT no es constante sino que vara con los parmetros citados.

Retencin cromatogrfica

La causa de la diferente movilidad de los solutos analitos inicialmente en la
fase mvil, en un sistema cromatogrfico, es su diferente tendencia a ser retenidos en la
fase estacionaria, en relacin con su tendencia a permanecer en la fase mvil. En
definitiva, es la distribucin desigual de los solutos entre ambas fases la razn principal
de su separacin cromatogrfica. Esta distribucin est regida por el correspondiente
equilibrio heterogneo en unas condiciones determinadas en el sistema cromatogrfico.
Una vez alcanzado el equilibrio en cada plato terico, la constante de
distribucin que lo rige es:
mvil fase en soluto de in concentrac
ia estacionar fase en soluto de ion concentrac
K
D
=


90 Introduccin
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES DE LA CROMATOGRAFA
LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

La cromatografa lquida de alta resolucin se desarrolla en los denominados
cromatgrafos de lquidos que tienen categora de instrumento, ya que proporcionan
informacin sobre la composicin de la materia al tener un detector continuo integrado
en el sistema dinmico cromatogrfico.
En la figura 9 se muestra un diagrama esquemtico de los componentes de un
cromatgrafo de lquidos, entre los que se distinguen:

Sistemas de bombeo

Un aspecto bsico en HPLC es la consecucin de un sistema de suministro de
forma continuada de la fase mvil a presin suficiente como para que pase a travs de
una fase estacionaria con un pequeo tamao de partcula y fuertemente empaquetada,
constituyendo, por tanto la bomba de alta presin un componente esencial de los
cromatgrafos de lquidos. Los principales requerimientos exigidos a este tipo de
bombas son: que ofrezcan un rango suficientemente amplio de presiones, velocidades de
flujo variables y reproducibles al menos al 95 %, que el flujo se encuentre libre de las
pulsaciones debidas a su propio mecanismo y que presenten una elevada resistencia a la
corrosin de los distintos disolventes habitualmente empleados.




Introduccin 91
Sistema de inyeccin

En la actualidad el sistema de introduccin de la muestra ms utilizado en esta
tcnica se basa en el uso de vlvulas de inyeccin equipadas con los denominados
bucles de muestras intercambiables que proporcionan una imprecisin en el volumen de
la muestra inyectada al sistema de tan solo algunas dcimas por cien.

Columna cromatogrfica

Es la parte esencial del cromatgrafo de lquidos ya que en ella, a travs de
diferentes mecanismos (adsorcin, particin, cambio inico, etc.), tiene lugar la
separacin o discriminacin entre analitos e interferentes.

Detector

Se trata de un mdulo del cromatgrafo de lquidos, situado a la salida de la
columna, que proporciona de forma continua informacin acerca de la composicin del
flujo que circula a su travs. Generalmente origina una seal elctrica continua, que
debidamente amplificada y registrada, constituye el denominado cromatograma, del que
se extrae informacin cualitativa y cuantitativa de la muestra inyectada.
Los detectores ms utilizados en HPLC son detectores pticos (de absorcin
visible ultravioleta, de fluorescencia, de refractometra) y detectores electroqumicos
(potenciomtricos, culombimtricos, etc.)

92 Introduccin
Integrador o procesador

La obtencin de datos cromatogrficos mediante un simple registrador es hoy
da, solamente vlido para comprobar el funcionamiento del cromatgrafo, para
experiencias preliminares, etc. Pero la extraccin de informacin cualitativa y/o
cuantitativa de un cromatograma registrado mediante la intervencin humana directa o
indirecta es una opcin lenta, tediosa y sujeta a un gran nmero de errores. As, debido a
la necesidad de limitar la intervencin humana y aumentar la precisin en la
identificacin y cuantificacin, unido a que los cromatgrafos son cada vez ms
eficaces y pueden discriminar entre un gran nmero de solutos de propiedades muy
semejantes, hace imprescindible el empleo de un sistema electrnico o informtico que
realice la misin asignada al registrador simple y al operador humano.
La opcin ms simple y barata son los denominados integradores que son unos
mdulos imprescindibles en la versin ms simple de los cromatgrafos de lquidos.
Mucho ms interesante es el empleo de un microprocesador con memoria que acumula
el conjunto de datos sin tratar y posteriormente mediante la aplicacin de distintos
procedimientos matemticos extrae la informacin deseada.


Figura 9. Esquema de un cromatgrafo tipo.
Introduccin 93
Las caractersticas de los cromatgrafos de lquidos utilizados en nuestro estudio
se han detallado al principio de esta Memoria, en la seccin de instrumentos
utilizados.

PARMETROS CROMATOGRFICOS

Llamamos cromatograma a la representacin de la respuesta o seal del sistema
de deteccin continuo o discontinuo en funcin del tiempo, volumen del eluyente o
distancia en el lecho cromatogrfico. El cromatograma contiene informacin analtica
relativa a la muestra o del funcionamiento del sistema cromatogrfico. Los parmetros
que definen el comportamiento de un soluto en un sistema cromatogrfico de elucin y
que sirven de base para clculos analticos se detallan a continuacin.

Tiempo de retencin (t
R
). Tiempo que transcurre desde la insercin de la
muestra hasta su salida por el detector.

Factor de capacidad o de retencin (K). Es el parmetro ms comnmente
usado para caracterizar el comportamiento de un sistema cromatogrfico y su retencin.
Viene dado por:
0 0
0
t
t
t
t t
K
R R
=

=

donde t
R
es el tiempo de retencin del compuesto y t
0
es el tiempo muerto o tiempo
transcurrido desde la insercin a la salida de un trazador no retenido en el sistema. En
un sistema multicomponente, los valores de K deberan encontrarse entre 1 y 10.

94 Introduccin
Factor de separacin (). Es un parmetro definitorio de la selectividad
cromatogrfica entre dos analitos, definido como:

1
2
1
2
2 / 1
K
K
t
t
R
R
= =

Sin embargo, este factor no es decisivo para asegurar la separacin completa de
los picos ya que no tiene en cuenta el ensanchamiento de banda y por tanto, los posibles
solapamientos.

Resolucin cromatogrfica (R
s
). Este parmetro s que considera el posible
ensanchamiento y solapamiento de picos. Dicho parmetro es ms utilizado que el
anterior y se define como:

2 / ) ( 2 1
1 2
b b
R R
W W
t t
Rs
+

=

Donde W
b1
y W
b2
son los anchos de banda de ambos picos. En una separacin
considerada satisfactoria es normalmente aceptado un valor de R
S
de 1, correspondiente
a una separacin entre picos del orden del 94 % aunque para que exista una resolucin
prcticamente total (resolucin a lnea base), R
S
debe ser superior a 1.5.

As pues, el objetivo que perseguimos con la eleccin de la fase mvil adecuada
es conseguir que los factores de capacidad de los analitos tengan valores adecuados,
comprendidos entre 1 y 10, y que la resolucin entre los diferentes picos sea igual o
superior a 1.
Introduccin 95
MODALIDADES DE CROMATOGRAFA LQUIDA

La cromatografa lquida en columna tiene una gran variedad de alternativas
segn la naturaleza de la fase estacionaria, como se muestra en la Tabla 4. En ella, la
fase estacionaria activa ms frecuente es un slido, adems de actuar como soporte
inerte en la cromatografa de particin.

Tabla 4. Tipos bsicos de cromatografa lquida.
Nombre Fase estacionaria activa
Particin Lquido retenido por un soporte slido
Adsorcin Slido con propiedades superficiales
Cambio inico Slido con propiedades cambiadoras de iones
Afinidad Slido con propiedades de retencin bioespecficas
Exclusin por tamaos Slido con porosidad controlada

El fundamento de actuacin de la fase estacionaria es distinto, dependiendo del
tipo de cromatografa que utilicemos. As, dicho fundamento es fsico-qumico en
cromatografa de adsorcin, basado en la actividad superficial de la misma que retiene
con mayor o menor fuerza a los solutos. En la cromatografa de particin clsica, es la
absorcin el fundamento de la retencin de la fase estacionaria lquida.
Como es bien sabido, tanto en la cromatografa lquida de particin como en la
de adsorcin, podemos distinguir dos modalidades bsicas, dependiendo de la
naturaleza de las fases mvil y estacionaria. Dichas modalidades son:
- Fase normal: en ella la fase mvil es de naturaleza no polar, mientras que la
estacionaria es fundamentalmente polar.
96 Introduccin
- Fase invertida o reversa: en ella la fase mvil es de naturaleza polar y la
estacionaria no polar. Es la que actualmente tiene mayor importancia pues
ms de un 85 % de las aplicaciones en HPLC se basan en esta alternativa.

Cromatografa de particin en fase reversa

A continuacin pasamos a describir algunos aspectos relativos a la fase
estacionaria y a la fase mvil en cromatografa de particin en fase reversa.

1. Fase estacionaria
En el tipo de cromatografa utilizado en esta Memoria (particin en fase
reversa), dependiendo de la relacin entre el soporte slido inerte y la fase estacionaria
activa podemos distinguir dos tipos bsicos:
- Fase estacionaria adsorbida, esto es, retenida por interaccin fsico-qumica
del disolvente con los sitios activos del soporte slido.
- Fase estacionaria ligada, es decir, cuando se establece un anclaje qumico
entre el soporte slido y las molculas de la fase estacionaria lquida.

El tipo de empaquetamiento de columna utilizado para el desarrollo de este
trabajo como fase estacionaria es slice sometida a la incorporacin qumica, por
silanizacin, de una cadena hidrocarbonada larga C
18
(fases ligadas).

La retencin en cromatografa de fases ligadas no polares se debe, de manera
casi exclusiva, a las interacciones hidrofbicas no especficas soluto fase estacionaria,
es decir, al carcter hidrofbico o hidrocarbonado del soluto. Su casi universalidad en
Introduccin 97
relacin con el tipo de soluto se fundamenta, por lo tanto, en el hecho de que todas las
molculas orgnicas tienen regiones hidrofbicas ms o menos amplias en su estructura
y son capaces de interaccionar con la fase estacionaria.
La columna que hemos utilizado tiene un tamao de partcula de 3 m de
dimetro, 0.46 cm de dimetro interno y 15 cm de longitud.

2. Fase mvil
La naturaleza de la fase mvil es el factor clave para la discriminacin entre
solutos en HPLC, como ocurre con la temperatura en cromatografa de gases.
Las propiedades bsicas que nos interesan de la fase mvil son la fuerza o
capacidad de desplazamiento de los solutos y su selectividad, basadas en las
interacciones especficas entre el soluto y la fase mvil, ya sea de tipo polar, de
formacin de enlaces de hidrgeno, o mediante equilibrios secundarios provocados al
variar su composicin (cido base, formacin de complejos o pares inicos, adicin de
complejos metal ligando o reactivos quirales para separar ismeros pticos, etc).
En cromatografa de fase invertida, dado que la retencin de los solutos en la
fase estacionaria ocurre fundamentalmente a travs de su zona no polar, la relacin entre
fuerza o capacidad de desplazamiento y polaridad de la fase mvil es inversa. As, el
agua es el eluyente con mnimo poder de elucin y debe mezclarse con disolventes
menos polares para eluir solutos fuertemente retenidos por la fase estacionaria no polar.
En general, la estrategia en las separaciones cromatogrficas consiste, bien en ajustar la
fuerza de la fase mvil a un nivel constante para que la retencin de los solutos en la
fase estacionaria y su tiempo de permanencia en la columna sea el adecuado, o bien en
modificar la composicin de la fase mvil hasta conseguir la selectividad necesaria para
lograr la discriminacin entre solutos requerida.
98 Introduccin
En el caso de compuestos orgnicos fcilmente ionizables, como es el caso de
los compuestos estudiados en esta Memoria, la utilizacin de fases mviles constituidas
por mezclas de agua y un disolvente menos polar (metanol, acetonitrilo...) dara como
resultado retenciones de estos solutos en la fase estacionaria muy pequeas o incluso
nulas. En estos casos, la capacidad de desplazamiento de la fase mvil puede ser
modificada mediante los siguientes mecanismos:
1. Utilizacin de disoluciones reguladoras que pueden producir dos
efectos:
i. Supresin inica
ii. Reduccin de la solubilidad del soluto en la fase mvil,
tambin conocido como supresin de la solubilidad.
2. La presencia de un contrain de naturaleza orgnica que se puede
aadir a la fase mvil con el fin de formar un par inico hidrofbico,
incrementando de esta forma la retencin del soluto en la fase estacionaria.

Supresin inica
Para separar compuestos inicos, caracterizados por poseer retenciones muy
bajas, modificar el pH de la fase acuosa mediante un amortiguador podra ser una
solucin para aumentar l retencin del soluto en la fase estacionaria. Ajustando el pH en
la fase mvil de forma que ste inhiba, total o parcialmente, la disociacin de los grupos
cidos o bsicos de estos compuestos podramos aumentar la afinidad de los solutos por
la fase estacionaria.
El valor de pH adecuado depender en gran parte de los valores de pK
a
de los
grupos ionizables.
Introduccin 99
No es aconsejable la utilizacin de fases mviles cuyos pH sean inferiores a 2.5
ni superiores a 7.5 debido a que pueden producir efectos hidrolticos catalizados por
protones o hidroxilos, que pueden daar irreversiblemente la estructura de la fase ligada,
lo que limita la utilizacin de esta tcnica para grupos muy cidos, como es el caso de
grupos sulfnicos.

Supresin de la solubilidad
Otra forma de separar cromatogrficamente compuestos inicos, como se ha
dicho anteriormente, es controlar la solubilidad del soluto en la fase mvil mediante el
conocido efecto salino. Dicho fenmeno consiste en favorecer la extraccin de un
determinado soluto por adicin de sales a la fase acuosa, es decir aumentando la fuerza
inica de la misma. Dicho efecto aplicado a una tcnica como la cromatografa lquido-
lquido con fases ligadas se basa en que al aumentar la fuerza inica de la fase mvil,
disminuye la solubilidad del soluto en la misma y aumenta en la fase estacionaria, de
forma que conseguimos aumentar la retencin de los compuestos inicos.

Formacin de pares inicos
Se trata de otro tipo de cromatografa para separar compuestos inicos. Se basa
en la eliminacin de la carga del soluto mediante la formacin de un par inico, con un
contrain de naturaleza orgnica o inorgnica que se aade en la fase mvil. De esta
forma, la carga final del contrain conjugado con el soluto resulta muy pequea, con lo
cual tenemos un conjunto hidrofbico de baja polaridad.
Contrain + Soluto hidroflico Par inico hidrofbico


100 Introduccin
Un aspecto importante de este tipo de cromatografa es la naturaleza del
contrain, que puede ser de tres tipos:
a) Inorgnico (ClO
4
-
, H
2
PO
4
-
)
b) Orgnico de polaridad intermedia (cidos alquilsulfnicos, tetrabutilamonio)
c) Orgnico de escasa polaridad en la zona no ionizable (alquilsulfonatos de
cadena larga, dioctilamonio, etc).

La seleccin de los mismos depende del tipo de analito. Es preferible que sea
univalente, aprtico, soluble en la fase mvil, que no participe en equilibrios adicionales
y no corrosivo para el sistema cromatogrfico. Los ms empleados son:
a) Para solutos aninicos:
i. Aminas cuaternarias (tetrametil-, tetrabutilamonio)
ii. Aminas terciarias (trioctilamina)
b) Para solutos catinicos:
i. Alquil y aril sulfonatos
ii. cido perclrico
iii. Alquil y lauril sulfato
La concentracin ptima del contrain en la fase mvil es difcil de predecir, por
lo que es conveniente optimizarla en cada aplicacin. Adems, son aspectos importantes
el pH y porcentaje del disolvente orgnico de la fase mvil.
Por tanto, para lograr una buena discriminacin entre solutos mediante esta
tcnica cromatogrfica es necesario optimizar cada uno de los parmetros anteriormente
nombrados.


Introduccin 101
ANLISIS ESTADSTICO ELEMENTAL

Las tcnicas matemticas que se han aplicado en la presente Memoria pueden
incluirse dentro del grupo de las tcnicas estadsticas bsicas o elementales.
El anlisis estadstico elemental incluye una gran variedad de parmetros que
van desde aquellos que tratan de evaluar la exactitud y la precisin de una
determinacin hasta los relacionados con los clculos de rectas de regresin, lmites de
deteccin y cuantificacin. De los utilizados en la presente Memoria se va a hacer slo
una breve mencin puesto que son suficientemente conocidos.

Parmetros estadsticos descriptivos clsicos

- Media aritmtica. Es la suma de todas las medidas dividida por el nmero de
determinaciones
n
x
x
n
i
i
=
=
1

- Desviacin estndar, s. Es la medida ms utilizada de la variabilidad y viene definida
por la frmula:
1
) (
1
2

=

=
n
x x
s
n
i
i

- Varianza. Es el cuadrado de la desviacin estndar.




102 Introduccin
- Coeficiente de variacin, C.V. tambin es conocido como desviacin estndar relativa,
cuyas unidades se expresan en porcentaje y viene definido por:
100 .(%) . =
x
s
V C

- Amplitud total, A
t
. Tambin se denomina intervalo y es otra medida de la dispersin
que viene definida por la diferencia entre el valor mximo y el mnimo
min
x x A
mx t
=
- Intervalo de confianza del la media. Conocer este intervalo implica en qu intervalo se
puede decir que est incluido el valor verdadero, para un intervalo de confianza dado.
n
s
t x =

Test estadstico t de Student

Se ha utilizado para determinar si la ordenada en el origen de las rectas de
calibrado propuestas es despreciable.
El valor de t viene dado por:
n
s
x
t
cal
) (
=
Si el valor absoluto de t
cal
es menor que un cierto valor crtico, que es el valor de
t tabulado para (n 1) grados de libertad y a un nivel de significacin , entonces se
acepta la hiptesis nula, esto es, se concluye que al nivel de significacin escogido y
con ese tamao de muestra, no existen diferencias estadsticamente significativas entre
el valor medio calculado y el valor verdadero, . En el caso de la ordenada en el origen,
Introduccin 103
el valor verdadero ser cero y x ser el valor de la ordenada en el origen de la recta de
calibrado.

Mtodos de correlacin

En muchas ocasiones, dos o ms variables se miden en los mismos objetos o
individuos y es importante encontrar una medida cuantitativa de la relacin entre estas
variables dependientes. Con este fin se pueden utilizar la covarianza y el coeficiente de
correlacin, puesto que ambos expresan cuantitativamente la relacin lineal entre
variables. En general, se prefiere utilizar el coeficiente de correlacin, r, puesto que es
independiente de las escalas de medida escogidas, el cual viene dado por la ecuacin:

( )( ) | |
( ) ( )
2 / 1
2 2
)
`

=


y y x x
y y x x
r
i i
i i


El coeficiente de correlacin puede tomar valores entre 1 y +1. El mximo
valor absoluto de correlacin es uno y se encuentra cuando entre ambas variables existe
una correlacin perfecta. Cuando no existe correlacin el valor de r es cero, aunque esto
no significa que estas dos variables no estn relacionadas sino que no lo estn
linealmente. Debe tenerse en cuenta que el clculo de r generar siempre un valor aun
cuando la relacin entre los datos sea claramente de carcter no lineal, por lo que
siempre es necesario representar grficamente los puntos, ya que, si no es as, del
clculo de r se puede deducir errneamente una relacin de carcter lineal.
Cuando tenemos ms de dos variables aleatorias es interesante utilizar la matriz
de correlacin, donde se representan las correlaciones entre todos los pares posibles de
104 Introduccin
variables. Resulta as una matriz cuadrada con igual nmero de filas que de columnas e
igual nmero de variables, donde los elementos de la diagonal son todos 1 mientras que
los elementos de fuera de la diagonal tienen valores entre 1 y +1.

Rectas de calibracin (Regresin por mnimos cuadrados)

En las tcnicas de anlisis instrumental la concentracin de una muestra no
puede ser medida directamente, sino que es determinada a travs de la medida de una
cantidad fsica o seal, y. La condicin para poder relacionar esta medida es que haya
una relacin emprica o terica no ambigua entre ella y la concentracin, x. Para la
mayora de las tcnicas analticas dicha relacin se expresa mediante la siguiente
ecuacin:
y = + x +
donde y representan los valores verdaderos de los parmetros denominados
ordenada en el origen y pendiente, respectivamente, y es el valor de error aleatorio
asociado a la respuesta, y. Dado que , y representan valores verdaderos,
conceptualmente stos nunca podrn calcularse con total certeza. En la prctica
hallaremos estimaciones de estos valores. Dichas estimaciones se representan mediante
los trminos a, b y e. As, para n pares de valores concretos (x
i
, y
i
) se posee la relacin:
y
i
= a + bx
i
+ e
i
i = 1, 2,..., n

El problema del establecimiento del modelo consiste en hallar las estimaciones a
y b. Como sabemos, en todo proceso de calibracin se considera la existencia de errores
e
i
en las respuestas y
i
. Los valores e
i
reciben el nombre de residuos y representan las
diferencias entre los valores y
i
observados y los valores de y predichos por el modelo.
Introduccin 105
Por el contrario, se considera que las variables independientes utilizadas en el
establecimiento del modelo, x
i
, estn libres de error o ste es muy pequeo comparado
con los e
i
. Esta condicin es realista en los problemas de calibracin, donde se considera
que los errores cometidos al preparar los patrones de calibracin son significativamente
ms pequeos que los errores de medida.
Las estimaciones a y b de la mejor recta en la cual se haya minimizado la
influencia de estos errores, e
i
, se puede calcular mediante diversos criterios
matemticos, pero normalmente se utiliza el mtodo de mnimos cuadrados, que
minimiza la suma de los cuadrados de los residuos.

( ) | |

+ =
2
2
i i i
bx a y e

mediante la derivacin de esta expresin respecto a a y b e igualando a cero, se obtienen
las expresiones de la pendiente y la ordenad en el origen presentadas a continuacin:

( )( )
( )
x b y a
x x
y y x x
b
i
i i
=

2


donde x e y son los valores medios del conjunto de valores de x e y, respectivamente.
La recta de regresin calculada se utiliza para estimar la concentracin de las
muestras problema por interpolacin. La precisin de la estimacin depende del error de
la medida de la muestra y del intervalo de confianza de la curva de calibracin, lo cual
est relacionado con la incertidumbre de las estimaciones a y b. A partir de las
106 Introduccin
expresiones de la pendiente y la ordenada en el origen se pueden calcular sus
desviaciones estndar, S
a
y S
b
que vienen dadas por:
{ }
2 / 1
2
/
2 / 1
2
2
/
) (
) (

=
x x
S
S
x x n
x
S S
i
x y
b
i
i
x y a


donde x es la media aritmtica de los valores del eje de abscisas y S
y/x
es la estimacin
de la desviacin estndar de los errores de las respuestas o residuos:
2 / 1
2
/
2
) (

=

n
y y
S
i i
x y


siendo
i
los valores de las respuestas calculadas de acuerdo con el modelo.

Los valores de S
a
y S
b
se pueden utilizar para calcular los lmites de confianza
para la pendiente y la ordenada en el origen. As, en esta Memoria, los lmites de
confianza para la pendiente estarn dados por b tS
b
, donde el valor de t se obtiene para
un nivel de confianza deseado y (n-2) grados de libertad. De manera similar los lmites
de confianza para la ordenada en el origen estn dados por a tS
a
.
Para estimar si los puntos experimentales se ajustan bien o no al modelo
propuesto de lnea recta, se calcula el coeficiente de correlacin, que se diferencia de los
de regresin en que se utiliza para investigar la relacin entre dos variables aleatorias y,
por tanto, con errores en ambas. Sin embargo, el coeficiente de correlacin es vlido
para evaluar la linealidad en mtodos de regresin porque est relacionado con el
coeficiente de regresin a travs de las desviaciones estndar de las variables. No
Introduccin 107
obstante, es ms til calcular el coeficiente de determinacin, r
2
, puesto que en la recta
de regresin tiene el significado de la parte de variacin de y que es explicada por x; as,
si r
2
= 0.98 significa que el 98 % de la variacin puede ser explicada por x y slo un 2%
permanecera sin ser explicada si ajustamos a un modelo lineal.

Comparacin de las pendientes de dos rectas de calibrado

Cuando tenemos dos pendientes empricas, b1 y b2, y se trata de decidir si son
iguales o no, existe un test estadstico que nos permite realizar esta comparacin.
En primer lugar, se aplica la prueba de la F para evaluar si las varianzas de las
dos pendientes son iguales. Se calcula un valor F que viene dado por la siguiente
expresin:
2
2
2
1
b
b
S
S
F =
Este valor experimental de F se compara con un valor terico (F
t
) que es calculado para
un nmero adecuado de grados de libertad (n
1
-1 y n
2
-1) para un nivel de confianza dado.
Si F es menor que F
t
no hay una diferencia estadsticamente significativa entre las
varianzas estimadas de los residuos de ambas lneas.
El test se realiza calculando una varianza estimada conjunta de las pendientes de
las dos rectas de calibrado, S
b1,2
2
, a travs de la siguiente ecuacin:
4
) 2 ( ) 2 (
2 1
2
2 2
2
1 1
2
2 , 1
+
+
=
n n
S n S n
S
b b
b

y comparando el valor de t
calculado

2 / 1
2
2
2
2
1
1
2
2 , 1
2 1
) (
1
) (
1
(
(

|
|
.
|

\
|

=

x x x x
S
b b
t
i i
b
calculado

108 Introduccin
con el valor de t
tabulado
con n
1
+ n
2
- 4 grados de libertad para el intervalo de confianza
elegido. Si el t
calculado
es menor que el t
tabulado
se asume que no existen diferencias
significativas entre las pendientes de ambos calibrados.
Si existe una diferencia estadsticamente significativa entre las varianzas
estimadas de los residuos de ambas rectas, el test se lleva a cabo calculando otro valor
de t:
2 / 1 2
2
2
1
2 1
) (
b b
S S
b b
t
+

=
siendo b
1
, b
2
, S
b1
2
y S
b2
2
las pendientes de las respectivas rectas de calibrado y sus
respectivas varianzas. En este ltimo caso, el valor de t
calculado
se compara con el valor
terico de t:
2
2
2
1
2
2 2
2
1 1
b b
b b
S S
S t S t
t
+
+
=
donde t
1
y t
2
son los valores tericos, obtenidos a partir de las tablas para un nivel de
significacin elegido y n
1
-2 y n
2
-2 son los grados de libertad respectivos. Si t
calculado
es
menor que t no existen diferencias estadsticamente significativas entre las pendientes.































PARTE EXPERIMENTAL



















































MATERIAL Y DISOLUCIONES


































Material y disoluciones 113
INSTRUMENTACIN UTILIZADA

Equipos de electroforesis capilar

1. Equipo Beckman P/ACE 5500 con detector de diodos en lnea, controlado por
un ordenador equipado con el programa Beckman P/ACE para el registro y tratamiento
de los datos.
2. Equipo Beckman MDQ con detector de diodos en lnea, controlado por un
ordenador con el programa Beckman MDQ para el registro y tratamiento de los datos.
En estos equipos se utilizan capilares Beckman de slice fundida de 50 cm de
longitud efectiva, cuyos dimetros interno y externo son, respectivamente, 75 y 375 m,
alojados en una carcasa con una ventana de deteccin de 800 100 m.

Equipos de HPLC

1. Cromatgrafo Shimadzu LC-10A con detector de diodos en lnea SPD-M10A,
equipado con un sistema de doble bomba, que permite trabajar en gradiente. El inyector
es una vlvula Rheodyne 7725 con un bucle de 20 L. El sistema cromatogrfico est
controlado por un ordenador Silicon 486/33 equipado con el programa CLASS-LC 10,
que permite controlar tanto el registro como el tratamiento de los datos.
2. Cromatgrafo Waters serie 35 con detector de longitud de onda variable
Waters 486, equipado con un sistema de cudruple bomba, que permite trabajar en
gradiente. El inyector es una vlvula Rheodyne modelo 7125 con un bucle de 20 L. El
sistema est controlado por un ordenador NEC 386/25 equipado con el programa Water
Baseline, que permite tanto el registro como el tratamiento de los datos.
Material y disoluciones 114
La columna analtica utilizada en cromatografa es una Kromasil C
18
de 150 mm
de longitud y 4.6 mm de dimetro interno, con un tamao de partcula de 5 m.

Medidas de pH

Las medidas de pH realizadas en todos los estudios presentados se obtuvieron
con un equipo digital Crison, modelo 74, con una sensibilidad de 0.01 unidades de
pH, que est provisto de un electrodo combinado de vidrio y Ag/AgCl.

Balanzas

Las cantidades necesarias para preparar las disoluciones de los analitos se
obtuvieron por pesada en una balanza Sartorius MC1, con resolucin para 0.01 mg.
Para preparar las disoluciones que no eran de analitos se utiliz un granatario
Sartorius basic, con resolucin para 0.1 g.

Aparato de purificacin de agua

El agua utilizada en la preparacin de todas las disoluciones fue obtenida
mediante el sistema de purificacin Elix/Milli-Q.





Material y disoluciones 115
DISOLUCIONES UTILIZADAS

Disoluciones de analitos

Se consideran analitos todos los compuestos qumicos estudiados en este trabajo
para ser determinados, es decir, sulfamidas, compuestos asociados, productos de
degradacin y metabolitos. He aqu las caractersticas de las disoluciones utilizadas en
este trabajo.

Compuesto Procedencia Disolvente Concentracin (mg/L)
Sulfametacina sdica Sigma H
2
O 100
Sulfaquinoxalina sdica Sigma EtOH : H
2
O (50:50) 100
Menadiona Merck EtOH : H
2
O (50:50) 100
Pirimetamina Sigma EtOH 100
Trimetoprim Sigma EtOH : H
2
O (50:50) 100
Sulfametoxipiridacina Sigma HCl 1M + H
2
O 100
Sulfametoxazol Sigma EtOH : H
2
O (50:50) 100
Sulfadimetoxina sdica Sigma H
2
O 100
Bromhexina, clorhidrato Sigma EtOH : H
2
O (10:90) 100
Sulfadiacina sdica Vorqumica H
2
O 100
Guayacol potsico Sigma H
2
O 100
cido trimetoxibenzico Sigma EtOH : H
2
O (50:50) 150
Sulfanilamida Sigma EtOH : H
2
O (50:50) 150
cido sulfanlico Sigma H
2
O 150
Trimetoprim-1-xido Roche EtOH : H
2
O (50:50) 220
Trimetoprim-3-xido Roche EtOH : H
2
O (50:50) 210
N
4
-acetil-sulfametoxazol Roche EtOH : H
2
O (50:50) 210



Material y disoluciones 116
Disoluciones reguladoras

Se prepararon disoluciones de concentracin 100 mM de fosfato, borato y citrato
a partir de sus correspondientes sales sdicas aadiendo HCl o NaOH hasta alcanzar el
pH deseado en cada caso.

Disolucin de dodecilsulfato sdico (SDS)

Se prepararon disoluciones de SDS de concentracin 200 mM a partir del
reactivo slido, proporcionado por Sigma. La dilucin exacta de las mismas
proporciona disoluciones de menor concentracin.

Otras disoluciones y disolventes utilizados

Disoluciones de hidrxido sdico y cido clorhdrico de diferentes
concentraciones, utilizadas en el estudio del pH y preparadas a partir de reactivos de
calidad analtica.
Los disolventes utilizados fueron de calidad para anlisis en electroforesis
capilar y HPLC en cromatografa lquida.




























CAPTULO I

DETERMINACIN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA
EN PRODUCTOS ZOOSANITARIOS
POR CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR

Captulo I 119
I.1. INTRODUCCIN

Las sulfamidas son agentes antibacterianos y antiinfecciosos, utilizados
ampliamente en medicina y en veterinaria porque se absorben rpidamente.
En la actualidad, los productos comerciales tanto para uso mdico como para uso
veterinario contienen, frecuentemente, sulfamidas combinadas con otros compuestos que
incrementan su actividad, llamados potenciadores. La accin teraputica de estas
combinaciones puede completarse con vitaminas, expectorantes u otros compuestos
asociados.
La sulfaquinoxalina (SQX) es una sulfamida cuyo radical R est constituido por la
quinoxalina (benzopiracina), siendo R un tomo de H. Se absorbe fcilmente por el tracto
gastrointestinal y produce niveles sanguneos persistentes. Bacteriosttico respecto a un
gran nmero de microbios intestinales, tiene la particularidad de presentar una gran eficacia
contra la coccidiosis de las aves. Frecuentemente se utiliza asociada a un potenciador, la
pirimetamina (PMT), en proporciones 3:1 y se excreta en parte por la orina y en parte por
las heces. No obstante, existen productos veterinarios que presentan asociada otra
sulfamida, la sulfametacina (SMT) y una vitamina, la menadiona (MEN) o vitamina K
3
, por
lo que se consider de inters incluir estos dos ltimos compuestos en este trabajo para su
determinacin conjunta.
El inters por abordar la resolucin de esta mezcla radica en el gran uso que se hace
de ella en la prctica veterinaria. El presente estudio se ha realizado con la finalidad de
establecer nuevos mtodos analticos que permitan la determinacin simultnea, rpida y
econmica de SQX, SMT, PMT y MEN utilizando el gran poder de resolucin de la
electroforesis capilar.
Captulo I 120

H
2
N SO
2
NH CH
3
CH
3
H
2
N SO
2
NH
N
N
Cl
N
N
H
2
N
NH
2
O
O
CH
3
SMT
SQX
PMT
MEN


Figura I.1. Estructuras qumicas de SMT, SQX, MEN y PMT.



La estabilidad de las disoluciones de SQX, SMT y PMT y el efecto del pH sobre sus
espectros de absorcin ha sido ampliamente estudiado en nuestros laboratorios. A modo de
resumen, se comentan a continuacin algunos aspectos en cuanto a estabilidad de las
disoluciones y clculo de pK
a
por mtodos espectrofotomtricos, ya realizados en nuestros
laboratorios.


Captulo I 121
I.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina, sulfametacina, menadiona y
pirimetamina

En primer lugar se estudi el comportamiento en disolucin de cada una de las
drogas. As, se estudi el disolvente apropiado, la estabilidad de sus disoluciones y la
influencia que ejerce el pH sobre los espectros de absorcin UV-VIS de cada una de las
drogas.
1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina
Se prepar una disolucin en etanol-agua al 50% de SQX (10
-3
M), estudindose su
estabilidad a travs de disoluciones diluidas de concentracin 410
-5
M y que fueron
preparadas diariamente a partir de la anterior. Se observ que los espectros de absorcin, as
obtenidos, se mantenan invariables durante un mes.
Por otra parte, se prepararon disoluciones diluidas de SQX (410
-5
M) con un
contenido del 10% de etanol a diferentes valores de pH, cido, neutro y bsico, a las que se les
estudi su estabilidad en estos medios registrando sus espectros cada 15 minutos, los cuales no
mostraron variaciones apreciables durante, al menos, dos horas.
2. Estabilidad de las disoluciones de sulfametacina
Se prepar una disolucin en etanol agua al 50% de SMT (10
-3
M), estudindose su
estabilidad con el tiempo a travs del registro diario de los espectros de absorcin de
disoluciones diluidas, de concentracin 410
-5
M, observndose que son estables al menos
durante un mes.
Posteriormente se procedi a estudiar la estabilidad de las disoluciones diluidas (410
-5

M) de SMT en distintos porcentajes de etanol. Para ello se prepararon tres disoluciones de
SMT conteniendo 10, 25 y 50 % de etanol, registrndose sus espectros de absorcin cada 15
Captulo I 122
minutos durante aproximadamente dos horas. Se pudo observar que, para el espacio de tiempo
estudiado, los espectros de absorcin permanecan invariables o bien no mostraban cambios
apreciables.
3. Estabilidad de las disoluciones de pirimetamina
Se prepararon disoluciones de concentracin 10
-3
M de PMT en etanol-agua al 10, 50 y
96%, a las que se les estudi la estabilidad diariamente haciendo diluciones 1:25 y registrando
posteriormente su espectro de absorcin UV-VIS. Se observ que los espectros obtenidos para
las muestras con 10 y 50 % de etanol mostraban modificaciones apreciables al segundo da,
mientras que la disolucin preparada en 96 % de etanol presentaba espectros que no
mostraban variaciones apreciables al menos durante 18 das.
Se estudi la estabilidad de las disoluciones diluidas de PMT (410
-5
M) con un
contenido en etanol del 10 % (v:v) a diferentes valores de pH. Para ellose registraron los
espectros de absorcin de cada una de las muestras cada 15 minutos y se comprob que en
todos los casos, los espectros no presentaron variaciones apreciables durante al menos una
hora.
4. Estudio de la estabilidad de las disoluciones de menadiona
Se prepar una disolucin en etanol al 96 % de MEN (100 mg/L) a la que se le estudi
la estabilidad aprovechando las separaciones electroforticas que se iban efectuando da a da.
Las muestras, que se preparaban por dilucin 1:5 a partir de la disolucin madre, se inyectaban
en el equipo de electroforesis capilar y, gracias al sistema de diodos en lnea, se iban
almacenando diariamente los espectros de absorcin UV-VIS correspondientes a MEN. Se
observ que durante un perodo de un mes las disoluciones preparadas a partir de la disolucin
madre de MEN presentaban espectros de absorcin invariables.
Captulo I 123
I.1.2. Influencia del contenido de etanol

En este trabajo se ha utilizado la sal sdica de la SMT, lo cual hace posible la
preparacin de sus disoluciones en agua y evita la necesidad de emplear disolventes orgnicos.
Los otros tres compuestos estudiados son poco solubles en agua, siendo necesaria la presencia
de algn disolvente orgnico, que permita la preparacin de disoluciones estables. Como la
variacin del contenido de etanol puede modificar los espectros de absorcin, es necesario
estudiar la influencia que ejerce este disolvente y seleccionar el porcentaje ptimo.
Se prepararon, en 50% de etanol, muestras independientes de SQX y PMT de
concentracin 10
-3
M, a partir de ellas se prepararon por dilucin (1:25) muestras de
concentracin 410
-5
M que contenan distintos porcentajes de etanol (10, 25, 50 y 80%). Los
mximos de los espectros de absorcin de SQX no mostraron variaciones apreciables al variar
el porcentaje de etanol en las muestras, mientras que los espectros de PMT mostraron un
ligero desplazamiento batocrmico a la vez que un ligero desplazamiento hipsocrmico al
disminuir el porcentaje de etanol de la muestra.
En el caso de MEN, se observ que solamente se disolva completamente en etanol al
96% (v:v), por lo que no se estudi la influencia del contenido en etanol sobre sus
disoluciones.







Captulo I 124
I.1.3. Influencia del pH sobre los espectros de absorcin

Se prepararon, por separado, disoluciones de 500 ml con concentraciones de 10
mg/L de SMX, SMT, MEN y PMT. El pH se ajust adicionando pequeas cantidades de
disolucin de NaOH o HCl, de concentracin variable, sobre los 500 ml de disolucin, de
tal manera que el error por dilucin result despreciable. Finalmente, se registraron los
espectros de absorcin entre 200 y 350 nm frente a un blanco.
Utilizando los datos obtenidos en el apartado anterior, se procedi a determinar las
constantes de ionizacin de SQX, SMT y PMT. Para ello se utilizaron dos mtodos
espectrofotomtricos, el de Stenstrom y Goldsmith (154) y el de Wilson y Lester (155). En
el caso de MEN, no se observaron caractersticas cidobase. Igualmente, en la bibliografa
consultada no aparece ningn valor de pK
a
para esta molcula. Los valores medios de pK
a

obtenidos por los dos mtodos se muestran a continuacin en la tabla I.1 y se comparan con
los encontrados en bibliografa (31)

Tabla I.1. Valores de pK
a
para SQX, SMT y PMT.
Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografa
SQX 6.70 6.68 6.7
SMT 7.56 7.56 7.4
PMT 6.66 6.66 7.0



Captulo I 125
I.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES

I.2.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones madres de 100 mg/L de SQX en etanol-agua (25:75), de
SMT en agua y de MEN y PMT en etanol al 96 % (v:v). A partir de stas y por dilucin se
prepar, en un matraz de 25 mL, una disolucin, que llamaremos A, y que contena 40,
30, 20 y 20 mg/L de SQX, SMT, MEN y PMT respectivamente. Esta disolucin A se
utiliz para optimizar todos los parmetros, qumicos e instrumentales, que influyen en la
separacin.
El equipo utilizado fue un Beckman P/ACE 5500, dotado con un detector de diodos
en lnea, y controlado por ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un capilar de
slice fundida de 50 cm de longitud efectiva, 75 m de dimetro interno, y 375 m de
dimetro externo, con recubrimiento de poliamida. Para su refrigeracin por lquido, el
capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de deteccin de 100 800 m.
forma
catinica
forma
aninica
forma
neutra
1 3 5 7 9 11 13
SQX
SMT
MEN
PMT
pH

Figura I.2. Esquema de la ionizacin de SMT, SQX, MEN y PMT en funcin del pH
Captulo I 126
Debido a los diferentes valores de pK
a
de las molculas en estudio (Tabla I.1), no se
pudo encontrar ningn pH al cual todas ellas estuviesen ionizadas, bien como cationes, bien
como aniones (Figura I.2). Las sulfamidas, SQX y SMT, se encuentran en su forma
aninica a los valores de pH superiores a sus pK
a
. Por el contrario, PMT se encuentra en su
forma neutra por encima de su pK
a
, ya que ste corresponde a la desprotonacin de los
grupos amino cuaternarios. En cuanto a MEN, se puede afirmar que permanece en su forma
neutra a lo largo de toda la escala de pH, ya que es totalmente insoluble en agua, y que no
presenta en su estructura ningn grupo qumico con caractersticas de tipo cido-base.
Por esta razn se tuvo que acudir al empleo de la tcnica de MEKC para plantear la
separacin, de manera que los analitos ionizados se separasen de acuerdo a su relacin
carga/radio y que los analitos neutros se separasen en funcin de sus constantes de afinidad
con un agente micelar. En el caso que nos ocupa, se seleccion el dodecilsulfato sdico
(SDS) como agente micelar por ser el que se utiliza comnmente en MEKC.
Como se ha comentado anteriormente, se necesita un pH bsico para que las
sulfamidas se desprotonen y adquieran carga negativa. Debido a su pK
a1
= 9.2, el tampn
borato proporciona un pH suficientemente bsico para este fin, por lo que fue seleccionado
inicialmente para fijar el pH. As, las separaciones preliminares fueron efectuadas
utilizando tampn borato ajustado a pH 9.2, lo cual asegura que su capacidad reguladora es
mxima. Adems, el borato es un tampn recomendado para EC porque genera baja
corriente.




Captulo I 127
I.2.2. Influencia del modificador orgnico

Inicialmente, se realizaron separaciones de la muestra tipo A a 20 kV y 25 C,
utilizando como electrolito de separacin 20 mM de tampn borato de pH = 9.2 y 30 mM
de SDS. En estas condiciones, SMT y SQX no aparecan bien resueltos por lo que se
decidi incorporar al electrolito de separacin una cierta cantidad de modificador orgnico
y observar su influencia.
En electroforesis capilar hay veces que conviene mejorar la selectividad de la
separacin. Para ello se suele adicionar al electrolito un modificador orgnico que facilite la
disolucin de los analitos ms apolares en el electrolito, disminuyendo as la adsorcin de
los mismos sobre la pared del capilar. Adems, el modificador orgnico puede alterar la
constante dielctrica () del electrolito de separacin y variar el coeficiente de reparto del
analito entre la micela y el electrolito que la envuelve.
Los disolventes orgnicos que se utilizaron en este estudio fueron etanol y
acetonitrilo, y su concentracin se vari para obtener porcentajes entre el 3 y el 15 % (v:v)
en el electrolito de separacin.
Cuando se utiliz el etanol se observ que los picos de SMT y SQX quedaban
parcialmente solapados en todo el intervalo de concentraciones estudiado y, adems, en
algunos de los casos presentaban hombros. Por el contrario, los picos de PMT y MEN
aparecan bien resueltos pero eran considerablemente anchos.
Cuando se estudi el efecto del acetonitrilo, se observ que para una concentracin
del 6 % mejoraba la resolucin entre SMT y SQX a la vez que desaparecan los hombros
que mostraban (Figura I.3)
Captulo I 128
Adems, los picos de PMT y MEN aparecan bien separados y sus anchos
disminuan considerablemente. Asimismo, se observ que al aumentar el contenido en
disolvente orgnico, los tiempos de migracin de los analitos aumentaban, tanto en
presencia de metanol como de acetonitrilo. Este comportamiento puede explicarse porque
un aumento del disolvente orgnico provoca un aumento en la viscosidad del electrolito de
separacin, disminuyendo considerablemente la velocidad del flujo electroosmtico, lo que
origina que los tiempos de migracin de los compuestos sean mayores, de manera que
aumentan los tiempos de anlisis. En cuanto a los anchos de pico, la disminucin de las
movilidades de los analitos como consecuencia de la adicin de un disolvente orgnico
conlleva, a su vez, un aumento de la dispersin del analito por difusin, por lo que
aumentan los anchos de pico. Este efecto es ms acusado en presencia de etanol que en
presencia de acetonitrilo.
Teniendo en cuenta tiempos de migracin, anchos de pico y forma de los
electroferogramas se seleccion como ptima una concentracin de acetonitrilo del 6 % en
el electrolito de separacin ya que, trabajando en estas condiciones, se conseguan buenas
resoluciones entre SMT y SQX en un corto tiempo de anlisis.






Captulo I 129
Tabla I.2. Tiempos de migracin de los analitos a diferentes concentraciones de
modificador orgnico en el electrolito de separacin (20 mM borato pH 9.2 y 30 mM SDS)
Porcentaje de disolvente orgnico (%)
0 3 6 9 12 15
FEO EtOH 3.870 4.284 4.850 6.014 6.198 7.113
MeCN 3.870 4.120 4.409 4.630 4.933 5.249
SMT EtOH 5.434 6.018 6.968 8.455 9.265 10960
MeCN 5.434 5.829 6.319 6.801 7.452 8.202
SQX EtOH 5.480 6.094 7.063 8.562 9.369 11.066
MeCN 5.480 5.896 6.398 6.891 7.552 8.328
MEN EtOH 7.614 8.104 9.155 10.631 11.314 12.777
MeCN 7.614 7.970 8.426 8.698 8.828 8.923
PMT EtOH 9.769 11.139 13.445 >15 >15 >15
T
i
e
m
p
o
s

d
e

m
i
g
r
a
c
i

n

(
m
i
n
)

MeCN 9.769 11.038 12.453 13.491 13.861 14.117










6.0 6.5 7.0 7.5
Tiempo de migracin (min)
0
5
10
15
20
25
30
m
A
u
SMT
SQX
SMT
SQX
6 % Etanol
6 % Acetonitrilo
Figura I.3. Detalle de la resolucin de SQX y SMT utilizando 6 % de etanol y acetonitrilo
como modificadores orgnicos.
Captulo I 130
I.2.3. Influencia de la concentracin de SDS

Como se explic en el captulo de introduccin terica, la modalidad de
cromatografa electrocintica micelar se basa en la presencia en el electrolito de separacin
de un surfactante que tenga la capacidad de formar agregados micelares. Tal es el caso del
SDS, que presenta esta capacidad a concentraciones superiores a 10 mM.
Cuando hay agregados micelares en el medio electrofortico, las molculas neutras,
que en CZE se moveran en el campo elctrico a la velocidad del flujo electroosmtico,
pueden interaccionar con las micelas, que actan a modo de fase pseudo-estacionaria.
Como la parte exterior de las micelas presenta carga, negativa en este caso, stas migrarn
en el campo elctrico como un compuesto aninico ms, pero con una velocidad aparente
muy baja, llevando en su seno el analito en su forma neutra. El tiempo de residencia de los
compuestos dentro de la micela condicionar la posicin del analito neutro dentro de la
ventana de deteccin o ventana de trabajo
La influencia de la concentracin de SDS en el electrolito de separacin sobre el
tiempo de migracin se muestra en la figura I.4. Todos los electroferogramas fueron
registrados utilizando un potencial de 20 kV, una temperatura de 25 C y un electrolito de
separacin compuesto por tampn borato 20 mM, y 6 % (v:v) de acetonitrilo, en el que la
concentracin de SDS se fue variando desde 0 hasta 80 mM. Los resultados muestran que
un aumento en la concentracin de SDS no afecta sensiblemente a los tiempos de migracin
de SQX y SMT. La pequea variacin en los tiempos de migracin de estos dos
compuestos se debe a que, al aumentar la concentracin de SDS se modifica tambin la
fuerza inica del electrolito de separacin, disminuyendo el potencial zeta de la doble capa
y, como consecuencia, la velocidad del FEO, lo cual provoca un ligero aumento de los
Captulo I 131
tiempos de migracin de SQX y SMT. Este comportamiento puede explicarse porque, a
este pH, SQX y SMT presentan carga negativa al igual que las micelas, producindose
repulsiones electrostticas que evitan la interaccin entre ambos. Por el contrario, la
concentracin de SDS ejerce una influencia notable sobre los tiempos de migracin de
MEN y PMT ya que estos compuestos estn en su forma neutra al pH de la separacin, por
lo que interaccionan con las micelas del medio. Esto se constata al observar que, a medida
que aumenta la concentracin de SDS, los tiempos de migracin de MEN y PMT aumentan
notablemente.
Mientras que para bajas concentraciones de SDS los tiempos de migracin de MEN
y PMT son bajos, llegando a solapar con los de SMT y SQX, a medida que se aumenta la
concentracin de SDS aumentan las interacciones de los primeros con los agregados
micelares, produciendo un claro efecto de diferenciacin de sus tiempos de migracin.
Cabe destacar el efecto que la concentracin de SDS tiene sobre PMT, ya que
incluso a bajas concentraciones produce un cambio en la selectividad de la separacin,
pasando de tener el menor tiempo de migracin al mayor cuando la concentracin de SDS
es 15 mM. En vista de los resultados de este estudio y para posteriores experiencias, se
seleccion como ptima una concentracin de 40 mM de SDS en el electrolito, porque en
estas condiciones se consiguen picos estrechos, bien resueltos y en un tiempo de anlisis
aceptable.




Captulo I 132
Tabla I.3. Variacin de los tiempos de migracin con la concentracin de SDS
SDS (mM) Tiempo de migracin (min)
FEO SMT SQX MEN PMT
0 4.008 5.730 5.730 4.008 4.008
15 4.301 6.158 6.242 6.387 10.367
30 4.496 6.517 6.600 8.750 13.296
40 4.600 6.708 6.796 10.021 14.721
50 4.712 6.933 7.025 11.296 16.246
60 4.676 7.196 7.300 12.821 18.146
70 4.710 7.383 7.496 14.075 19.675
80 4.740 7.463 7.604 15.512 >20


0.00 20.00 40.00 60.00 80.00
Concentracin de SDS (mM)
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
n

(
m
i
n
)
FEO
SMT
SQX
MEN
PMT


Figura I.4. Influencia de la concentracin de SDS en los tiempos de migracin
Captulo I 133
I.2.4. Influencia de la concentracin del tampn

El efecto que produce sobre una separacin electrofortica la variacin de la fuerza
inica del medio no tiene por qu seguir una regla fija. En la gran mayora de los casos, un
aumento de la concentracin de tampn supone un aumento en los tiempos de migracin,
mejorando la resolucin y evitando, en algunos casos, distorsiones en los picos del
electroferograma debido a efectos de electrodispersin. Sin embargo, un aumento de la
concentracin del tampn tambin ocasiona altas intensidades de corriente que recorren el
capilar generando mucho calor por efecto Joule y puede provocar el ensanchamiento de los
picos y prdida de resolucin.
Para optimizar este parmetro, se prepararon diferentes disoluciones de electrolito
de separacin que contenan 40 mM de SDS, 6 % (v/v) de acetonitrilo y tampn borato de
concentraciones entre 10 y 40 mM. Las separaciones correspondientes se realizaron a 20
kV y 25 C.
En esta ocasin, dado que los tiempos de migracin de los compuestos SMT y SQX
eran tan prximos, el tiempo de anlisis se podra sacrificar a favor del parmetro crtico,
que result ser la resolucin entre estos dos compuestos. En los electroferogramas
obtenidos, solamente a partir de una concentracin de 20 mM de borato, los picos de estos
dos compuestos aparecieron sin solapamiento alguno.
Dentro de este comportamiento, se puede ver en la tabla I.4 que la mxima
resolucin de SQX y SMT se produce para una concentracin de 30 mM.

Captulo I 134
Tabla I.4. Influencia de la concentracin del tampn borato. Tiempos en minutos y
anchuras medidas al 50 % de la altura de los picos.
Concentracin de Borato (mM)
10 20 30 40
FEO t
m
4.325 4.554 4.821 5.046
t
m
6.050 6.637 7.225 7.767 SMT
Ancho 0.030 0.030 0.031 0.055
t
m
6.117 6.725 7.333 7.912
R
s
1.123 1.516 1.792 1.282
SQX
Ancho 0.029 0.029 0.031 0.034
t
m
8.879 9.863 10.946 12.067
R
s
20.877 14.381 9.417 14.682
MEN
Ancho 0.037 0.044 0.051 0.059
t
m
12.488 14.337 16.667 19.413
R
s
51.093 55.664 58.847 87.060
PMT
Ancho 0.042 0.051 0.061 0.078

En lo que concierne al ancho de pico, medido al 50 % de la altura, se puede ver que
a concentraciones mayores de 30 mM empezaba a aumentar sensiblemente, a la vez que
disminua la altura del pico, particularmente aquellos con mayores tiempos de migracin,
cosa que no es deseable con las miras puestas en la posterior integracin de esos picos para
el anlisis cuantitativo.
Esto se explica porque para una concentracin de 30 mM de tampn se obtiene una
corriente de 48.7 A lo cual produce una importante cantidad de calor por efecto Joule que
es difcil eliminar por medio del sistema de refrigeracin.
Captulo I 135
Finalmente, el aumento de fuerza inica se tradujo en aumento de los tiempos de
migracin y, por consiguiente, del tiempo de anlisis, llegando a ser ste de casi 20 minutos
cuando la concentracin es de 40 mM.
En consecuencia, y a la vista de los resultados, se consider como ptima una
concentracin de tampn borato en el electrolito de 30 mM porque, aunque el tiempo de
anlisis sea algo elevado, la resolucin de SQX, que en esta separacin es crtica, es
mxima, mientras que a concentraciones mayores, se pierde resolucin y adems los picos
empiezan a ensancharse.

I.2.5. Efecto de la temperatura

Una vez optimizadas las variables qumicas de la separacin, abordamos la
optimizacin de las variables instrumentales, comenzando con la temperatura.
La temperatura se relaciona con la viscosidad del medio electrofortico. De este
modo, un aumento de la temperatura disminuye la viscosidad, por lo que aumenta la
velocidad del FEO y, como consecuencia, la movilidad aparente de los compuestos. Todo
ello acorta el tiempo de anlisis, aunque a veces a expensas de perder resolucin. El
intervalo de trabajo suele oscilar entre 20 y 50 C, y aunque es habitual trabajar a
temperatura ambiente, lo ms importante es mantenerla constante. Durante el proceso de
separacin, se estudi el efecto de la temperatura en la migracin de los compuestos. Para
ello, se utiliz como electrolito de separacin una disolucin que contena tampn borato
30 mM de pH 9.2, SDS de concentracin 40 mM y 6 % (v:v) de acetonitrilo. Todos los
electroferogramas se registraron a 25 kV, pero a diferentes temperaturas, comprendidas en
el intervalo de 20 a 40 C.
Captulo I 136
Como se prevea, una aumento de la temperatura produjo una disminucin de los
tiempos de migracin y por consiguiente, del tiempo de anlisis. As, se puede ver que a
40C, la separacin termina en menos de 11 minutos. Sin embargo, considerando que en el
electrolito hay un componente tan voltil como el acetonitrilo, se corra el riesgo de su
evaporacin si la temperatura era elevada. Por otro lado, se observ que en todo el intervalo
de temperatura estudiado, los picos de SMT y SQX aparecan perfectamente separados, si
bien la mxima resolucin de la SQX se produca a 20 C, disminuyendo gradualmente a
medida que aumentaba la temperatura de separacin. Ante esta situacin, hubo que
encontrar una solucin de compromiso que tuviera en cuenta ambos factores.
La influencia de la temperatura sobre las anchuras de los picos no se consider
significativa y la pequea disminucin que se observa se puede deber a que cuanto mayor
es la temperatura, menor es la viscosidad del medio y los tiempos de retencin se acortan,
disminuyendo as la dispersin. Finalmente se seleccion como ptima una temperatura de
30 C porque se consigue una resolucin buena en un tiempo de anlisis aceptable.









Captulo I 137
Tabla I.5. Influencia de la temperatura
Temperatura (C)
20 25 30 35 40
FEO t
m
5.549 4.950 4.517 4.117 3.737
t
m
7.871 6.954 6.275 5.692 5.200 SMT
Ancho 0.032 0.029 0.027 0.025 0.023
t
m
7.988 7.054 6.363 5.771 5.267
R
s
1.908 1.746 1.690 1.604 1.340
SQX
Ancho 0.032 0.029 0.027 0.025 0.024
t
m
12.233 10.321 8.921 7.767 6.804
R
s
13.284 15.736 17.055 9.868 3.398
MEN
Ancho 0.059 0.051 0.046 0.043 0.040
t
m
18.146 15.321 13.225 11.467 10.042
R
s
54.06 15.558 52.100 71.769 72.854
PMT
Ancho 0.066 0.055 0.047 0.040 0.033











20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
Temperatura de separacion (C)
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i

n

(
m
i
n
)
FEO
SMT
SQX
MEN
PMT
Figura I.5. Influencia de la temperatura en los tiempos de migracin.
Captulo I 138
I.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separacin

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado
mayores eficacias se obtienen y ms cortos tiempos de anlisis aunque ello conlleva una
disminucin de resolucin, debida a la mayor produccin de calor.
En principio, el mximo voltaje que se puede aplicar viene dado por el punto en el
cual se pierde la linealidad en la representacin de la ley de Ohm, es decir, la
representacin de la intensidad que atraviesa el capilar relleno del electrolito de separacin
cuando se vara el voltaje desde valores muy bajos hasta 30 kV. Este mximo valor
depende de las caractersticas de la disolucin tampn, siendo los valores ms frecuentes
para el trabajo en electroforesis capilar voltajes hasta 30 kV, intensidades de corriente hasta
300 A y potencias hasta 6 W.
De igual manera, la aplicacin del voltaje requiere hacerlo de manera gradual, es
decir, aplicar una rampa de voltaje. Se sabe que hay una relacin directa entre voltaje
aplicado y calor generado. Aplicando una rampa de voltaje progresiva y adecuada se puede
evitar un calentamiento brusco del capilar, de manera que se evite un calentamiento
instantneo de la zona de muestra que provoque su dilatacin y, como consecuencia, la
prdida de la misma.
Para optimizar el voltaje, se llevaron a cabo separaciones de la muestra A
utilizando como electrolito de separacin una disolucin que contena tampn borato 30
mM de pH 9.2, SDS de concentracin 40 mM y 6 % (v:v) de acetonitrilo. Todos los
electroferogramas se registraron a 30 C, pero aplicando diferentes voltajes, comprendidos
en el intervalo de 5 y 30 kV. La representacin grfica de la Ley de Ohm prob que exista

Captulo I 139
linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la
figura I.6.

0 10 20
Voltaje (kV)
30
0.00
20.00
40.00
60.00
80.00
100.00
C
o
r
r
i
e
n
t
e

(
m
i
c
r
o
a
m
p
e
r
i
o
s
)


Figura I.6. Influencia del voltaje en la corriente obtenida.

El criterio de optimizacin del voltaje aplicado fue la resolucin entre SQX y SMT,
siendo a 20 kV (en 0.4 minutos) cuando sta es mxima, segn se indica en la tabla I.6.
En cuanto a la rampa de voltaje, se realizaron separaciones a 20 kV con diferentes
rampas en un intervalo comprendido entre 0.2 y 0.8 minutos. La rampa de voltaje que
proporcion mayor resolucin fue la de 0.4 minutos y por ello fue seleccionada como
ptima (Tabla I.7).

Captulo I 140
Tabla I.6. Influencia del voltaje sobre la resolucin de SQX y SMT
Voltaje (kV) 10 15 20 25
Resolucin 1.526 1.589 2.920 1.294

Tabla I.7. Influencia de la rampa de voltaje en la resolucin de SQX y SMT
Tiempo (min) 0.2 0.4 0.6 0.8
Resolucin 1.484 2.818 1.720 1.639

Sin embargo, en estas condiciones el tiempo de anlisis era demasiado largo, 15
minutos, por lo que se decidi aplicar una segunda rampa de voltaje una vez empezada la
separacin.
Tras varias experiencias, se decidi aumentar el voltaje hasta 30 kV en 0.4 minutos
al alcanzar los 5 minutos en la separacin como nico medio de disminuir el tiempo de
anlisis sin perjudicar la resolucin entre SQX y SMT. Lgicamente el aumento de voltaje
aplicado a un tiempo de anlisis superior al tiempo de migracin de estos compuestos, no
interfera en su resolucin. Obviamente tampoco interfera en la resolucin de los otros dos
compuestos, MEN y PMT.






Captulo I 141
I.2.7. Efecto del disolvente de la muestra

Se estudi cmo afecta el disolvente en que se encuentre la muestra sobre la
resolucin, dado que la de SQX es crtica. Teniendo en cuenta que estas muestras se
preparan por dilucin de las madres, en todos los casos contendrn 12 % de etanol. Se
prepararon tres tipos de muestra:
1. Muestra en disolucin hidroalcohlica al 12 % (v:v).
2. Muestra diluida en tampn borato 20 mM de pH 9.2 al 10 % (v:v).
3. Muestra diluida en electrolito de separacin al 10 % (v:v).

En el caso de la muestra disuelta en el electrolito de separacin, se observ que los
picos de SMT y SQX no aparecen bien resueltos y que los de MEN y PMT son bastante
ms anchos que en los otros dos casos.
Este comportamiento puede explicarse debido a que cuando se disuelve la muestra
en electrolito de separacin, la fuerza inica en la zona de muestra aumenta y por lo tanto,
no se producir una compresin de los compuestos en el lmite de la zona de muestra con la
zona del tampn, impidiendo as la compresin en los picos. Este fenmeno afecta de
manera importante a la resolucin entre SQX y SMT, que es el parmetro crtico en esta
separacin. Por el contrario, cuando se utilizaron como disolventes tampn y agua no se
observaron diferencias en las resoluciones de SQX con respecto a SMT.
Por esta razn, se decidi que las muestras se preparasen por simple dilucin de las
madres, manteniendo constante el porcentaje de etanol al 12 %.


Captulo I 142
Finalmente, en la tabla I.8 se muestran las condiciones qumicas e instrumentales
optimizadas para la separacin de SQX, SMT, MEN y PMT. Asimismo, en la figura I.7 se
muestra un electroferograma de una muestra tipo A utilizando el mtodo optimizado y
registrado a 214 nm.

Tabla I.8. Mtodo optimizado para la separacin.
Capilar Slice fundida: 57 cm longitud 75 m dimetro interno
Electrolito Borato (pH = 9.2) 30 mM : SDS 40 mM : 6 % (v/v) acetonitrilo
Temperatura 30 C
Voltaje 20 kV en los 5 primeros minutos y posteriormente 30 kV hasta el final
Detector Barra de diodos en lnea
Ventana deteccin 800 100 m











Captulo I 143
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
Tiempo de migracin (min)
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
m
A
u
SMT
SQX
PMT
MEN


Figura I.7. Electroferograma de una muestra tipo A utilizando el mtodo optimizado y
registrado a 214 nm.

5.6 5.8 6.0 6.2
Tiempo de migracin (min)
-5.0
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
m
A
u
SMT
SQX







Figura I.8. Detalle de la resolucin entre sulfaquinoxalina y sulfametacina
Captulo I 144
I.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

I.3.1. Lmites de deteccin y cuantificacin.

El lmite de deteccin es un nmero, expresado en unidades de concentracin que
describe la concentracin ms baja del analito que un analista puede decir que es
estadsticamente diferente de un blanco analito.
La definicin que adopt la I.U.P.A.C. en 1975 dice que el lmite de deteccin
expresado como una concentracin C
L
, se deriva de la medida ms pequea Y
L
, que puede
ser detectada con una certeza razonable, para un procedimiento analtico dado (156). Este
concepto fue aclarado posteriormente por la ACS que dice que el lmite de deteccin es la
concentracin ms baja de un analito que un procedimiento analtico puede detectar con
seguridad(157). En la definicin del lmite de deteccin, la IUPAC establece ese nivel de
seguridad segn las siguientes expresiones:
Y
L
= Y
B
+ (K S
B
)
Y
B
: Valor medio de la seal del blanco
S
B
: Desviacin estndar del blanco
K : Factor numrico escogido segn el nivel de confianza deseado. El uso de un valor de
K=3, recomendado por la IUPAC, nos da un nivel de confianza del 99.86 % si el error
debido a la seal del blanco sigue una distribucin normal.
El lmite de deteccin C
L
es, por tanto, la concentracin del analito que da una seal
que es tres veces la desviacin estndar del blanco:
C
L
= (Y
L
+ Y
B
) / m
m: pendiente de la recta de calibrado
Captulo I 145
si sustituimos Y
L
por su valor obtendremos:
C
L
= 3 S
B
/ m
Por otra parte, se define el lmite de cuantificacin como la concentracin del
analito que da una seal que es diez veces la desviacin estndar del blanco:
C
Q
= 10 S
B
/ m
A la regin de concentraciones comprendida entre C
L
y C
Q
se la denomina regin
de deteccin, mientras que la regin de determinacin o de cuantificacin comienza en
el valor del lmite de cuantificacin, C
Q
.
Aunque la IUPAC propone las frmulas citadas anteriormente para el clculo de los
lmites de deteccin y de cuantificacin, se pueden establecer estos lmites a partir de los
datos obtenidos para la recta de calibrado. As, los lmites de deteccin se calculan
partiendo de la frmula
Y Y
B
= 3 S
B

Y : prediccin del valor de Y por la recta de regresin
Y
B
: seal de una muestra en blanco o seal de fondo
S
B
: desviacin estndar del blanco
Al final, la frmula que permite deducir el lmite de deteccin de la recta de
regresin es:
C
L
= Y
B
+ 3 S
B

Y
B
: ordenada en el origen
S
B
= S
Y/X
= [(y
i
y)
2
/(n-2)]
1/2

y
i
: valores de y obtenidos de la recta de regresin.
Captulo I 146
De igual forma, el lmite de determinacin o cuantificacin se calcula mediante la
siguiente expresin:
C
Q
= Y
B
+ 10 S
B

En las tcnicas de separacin tales como cromatografa y electroforesis capilar la
forma ms extendida para establecer estos lmites es en funcin del ruido de la lnea base a
nivel del tiempo de retencin o de migracin del analito de inters. Kevin D. Altria
particulariza para la electroforesis capilar los conceptos de lmite de deteccin y
cuantificacin en su libro Capillary electrophoresis Guidebook. Principles, operation and
applications, segn el cual, el lmite de deteccin (LOD) denota el nivel mnimo
detectable de impurezas. El LOD se define (158) a menudo como la concentracin de
muestra que produce un pico con una altura tres veces el nivel del ruido de la lnea base. El
LOD puede tambin expresarse como el menor pico que se puede detectar como porcentaje
rea/rea del electroferograma cuando se determina la pureza, por ejemplo, es posible dar
un LOD del 0.1 % de un enantimero en presencia del principal componente.
Estos niveles de LOD dependern de la absorbancia del analito, del dimetro interno
del capilar y de la carga de la muestra.
El lmite de cuantificacin (LOQ) da cuenta de la menor cantidad de impureza que
se puede medir de manera exacta y precisa. El LOQ puede calcularse (159) como diez
veces el ruido de la lnea base. Normalmente, el anlisis de rplicas de una muestra en
concentraciones iguales al LOQ produce un valor de desviacin estndar relativa prxima
al 10 %.
El procedimiento utilizado en esta Memoria para establecer los lmites de deteccin
y de cuantificacin tanto en electroforesis capilar como en cromatografa lquida de alta
resolucin se basa en el mtodo del ruido de la lnea base. Se estim la fluctuacin de la
Captulo I 147
lnea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco a lo largo de un intervalo
de tiempo equivalente a diez veces el ancho de pico. As, el LOD se obtuvo como la
concentracin de muestra que produjo un ancho de pico tres veces la fluctuacin de la lnea
base y el LOQ se calcul como la concentracin de muestra que produjo un ancho de pico
diez veces la fluctuacin de la lnea base. As, se obtuvieron lmites de deteccin y
cuantificacin en torno a 300 g/L y 1 mg/L, respectivamente, para cada uno de los
componentes.

I.3.2. Linealidad de la respuesta

Como es sabido, en anlisis cuantitativo se utiliza la Ley de Beer cuando la
deteccin es espectrofotomtrica, como en este caso. Sin embargo hay que determinar cul
es el intervalo donde se cumple, es decir, dnde estn sus lmites. Obviamente, el lmite
inferior lo da el lmite de cuantificacin, mientras que, para altas concentraciones de
analito, aparece una desviacin de la linealidad que toma la forma de pendiente decreciente
en la recta de calibrado. El intervalo de linealidad est limitado principalmente por la luz
dispersada que llega al detector, ya que, en el caso ideal, toda la luz debera pasar por el
centro del capilar, y no por la pared.
En todos los casos, para realizar los clculos se obtuvieron los resultados usando
reas de pico corregidas obtenidas al dividir el rea de cada pico por el tiempo de migracin
del compuesto. La determinacin de cada compuesto fue realizada a la longitud de onda
correspondiente a su mximo de absorcin, es decir, 263, 252, 250 y 210 nm para SMT,
Captulo I 148
SQX, MEN y PMT, respectivamente. Para seleccionar esta longitud de onda se utilizaron
los espectros de absorcin UV-Visible obtenidos con el detector de diodos en lnea.
El estudio de la linealidad se realiz inyectando muestras de SMT, SQX, MEN y
PMT disueltas en agua (conteniendo 12 % de etanol) en un rango de concentraciones entre
2 y 80 mg/L con un tiempo de inyeccin constante de 5 segundos
En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relacin lineal entre
concentracin y rea de pico corregida y tambin que las ordenadas en el origen resultaron
ser despreciables, segn el estadstico t de Student para un nivel de significacin de 0.05.
En la figura I.9 se representan las reas corregidas de los compuestos frente a las
concentraciones. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mnimos cuadrados se
muestran en la tabla I.9 y se puede apreciar que la linealidad obtenida es satisfactoria y que
las ordenadas en el origen son despreciables en todos los casos.

0 15 30 45 60 75 9
Concentracion (mg/L)
0
0
5000
10000
15000
A
r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a
SMT
SQX
MEN
PMT

Figura I.9. Rectas de calibrado.
Captulo I 149
Tabla I.9. Ecuaciones de las rectas de calibrado e intervalos de linealidad.
Ecuacin r
2
Intervalo lineal (mg/L)
SMT A = -17 ( 89) + 120.7 ( 1.9) C (mg/L) 0.9998 2 80
SQX A = 52 ( 190) + 164.4 ( 4.2) C (mg/L) 0.9995 2 80
MEN A = -94 ( 122) + 183.3 ( 2.7) C (mg/L) 0.9998 2 80
PMT A = -56 ( 149) + 229.9 ( 5.3) C (mg/L) 0.9997 2 45


I.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del mtodo descrito anteriormente se
prepar una muestra tipo A y se hicieron once separaciones consecutivas en las
condiciones qumicas e instrumentales elegidas como ptimas.
Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes das, se prepar una muestra igual
que la anteriormente citada y se hicieron dos series de once separaciones cada una, en das
consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviacin estndar relativa
superior al 1.1 %, lo que indica el alto grado de precisin y fiabilidad del mtodo
propuesto.
En cuanto a la reproducibilidad, se compararon las varianzas de las series segn el
test estadstico F de Snedecor para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque
se trata de dilucidar si las varianzas entre las series de diferentes das son significativamente
diferentes. As, se encontr que no existan diferencias significativas entre las series para un
intervalo de confianza del 95 %.
Captulo I 150
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentajes de desviacin estndar relativa (% DER) se muestran en la tabla I.10.

Tabla I.10. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo.
Serie 1 Serie 2
x S % DER x S % DER S
1
2
/S
2
2
F
(0.05)

SMT 1737 19 1.1 2201 12 0.54 2.5 3.717
SQX 8025 30 0.37 7862 22 0.28 1.8 3.717
MEN 10816 88 0.81 10130 56 0.55 2.5 3.717
PMT 17669 95 0.54 16206 88 0.54 1.2 3.717


I.4. APLICACIONES

El mtodo propuesto se utiliz para la determinacin de los compuestos estudiados en
seis preparados comerciales ampliamente utilizados en veterinaria.
Debido a la alta viscosidad de los productos comerciales, no es posible tomar un
volumen exacto de stos con una pipeta. Por esta razn se decidi tomar la cantidad de
producto necesaria para llenar hasta enrase un matraz aforado de 10 mL. Este
procedimiento permite, adems, calcular el peso de un volumen conocido de producto, de
tal manera que se pueden dar resultados en unidades de peso/peso o peso/volumen, segn
venga especificado en cada uno de los productos comerciales.
Captulo I 151
Estos 10 mL de producto comercial se llevaron a un matraz de 250 mL y se diluyeron
con etanol hasta la marca. Posteriormente se tomaron alcuotas de 1 mL (para Coccivet y
Coccilina) y 0.5 mL (para Cocciamn, Cocichemical, Coccirex y Quinoxipra-P) que fueron
transferidas a un matraz de 25 mL, donde se les adicion etanol hasta alcanzar el 12 % y
agua desionizada hasta enrase. Estas disoluciones fueron inyectadas en el sistema de
separacin para obtener los electroferogramas correspondientes.


Figura I.10. Esquema de preparacin de las muestras

A partir de estos electroferogramas y basndonos en el uso de patrones que contenan
mezclas de SMT, SQX, MEN y PMT, disueltas tambin en el mismo medio
hidroalcohlico, se obtuvieron los porcentajes de recuperacin para cada compuesto en
cada preparado comercial, tomando el rea corregida como seal analtica.
El mtodo seguido a la hora de cuantificar cada uno de los compuestos en los
preparados veterinarios se bas en las inyecciones sucesivas de patrones y muestras, segn
la secuencia:

PATRN 1 - MUESTRA 1A - PATRN 2 - MUESTRA 1B - PATRN 1

Captulo I 152
Los patrones 1 y 2 eran dos disoluciones independientes que contenan diferentes
concentraciones conocidas de SQX, SMT, MEN y PMT segn el producto a analizar. Por
su parte, las muestras 1 A y 1 B se inyectaron por triplicado y se calcul la media arimtica
de las reas de pico corregidas.
Las reas corregidas de los patrones fueron utilizadas para obtener los factores de
respuesta de cada compuesto atendiendo a la expresin:

F = [(A
P1
/C
P1
) + (A
P2
/C
P2
)]/2

Para calcular la concentracin de las muestras multiplicamos el factor de respuesta
por el rea corregida promedio de cada compuesto.

C
M1
= A
M1
/F
F: factor de respuesta; A: rea corregida; P: patrn; C: concentracin; M: muestra

En la tabla I.11 se muestran los resultados obtenidos, que se expresan como
concentraciones encontradas y porcentaje de recuperacin para cada uno de los compuestos
con respecto a las concentraciones indicadas en las etiquetas de los productos. En todos los
casos, los datos corresponden a la media de tres determinaciones.



Captulo I 153
Tabla I.11. Concentraciones encontradas (g/L)* y recuperaciones (%) obtenidas en
productos comerciales.
Producto y etiquetado Encontrado Recuperacin
Cocciamin SQX
PMT
50
15
28.71 0.31
8.32 0.20
57.5
55.3
Cocichemical SQX
PMT
50
15
29.62 0.84
0.0
59.1
0.0
Coccilina SQX
PMT
SMT
39
1.3
0
3.13 0.10
0.913 0.043
0.8018 0.0057
80.3
68.2
0.0
Coccirex SQX
PMT
44
12
42.01 0.86
10.20 0.36
95.4
85.2
Coccivet SQX
PMT
MEN
36
9
50
32.32 0.64
8.31 0.12
0.0
89.8
92.1
0.0
Quinoxipra-P SQX
PMT
50
15
48.71 0.89
14.20 0.42
97.4
94.6
*Las unidades de concentracin en Coccilina son g/100g.

Como puede observarse, en muchos casos las recuperaciones estn muy alejadas de
lo indicado en las etiquetas de los productos comerciales. A continuacin se destacan
algunos aspectos que pueden aclarar el porqu de estas bajas recuperaciones:
1. A lo largo del procedimiento de preparacin de las muestras en el anlisis de
Cocciamin y Coccilina, no se observ precipitado ni turbidez alguna ni posibles prdidas
que pudieran justificar las recuperaciones encontradas, lo que implica que stas son
consecuencia de sus propios contenidos.
Captulo I 154
2. En Coccivet y Cocichemical no se cuantificaron ni menadiona ni pirimetamina
porque no se registraron sus picos en los electroferogramas correspondientes. Este hecho
puede deberse a que ninguno de ellos est presente como compuesto puro, sino como
derivado soluble, dado que estos productos veterinarios son suministrados a las aves en el
agua de bebida. A este respecto, se consult con los laboratorios responsables de la
comercializacin de estos productos.
Con respecto a menadiona, vitamina incluida en Coccivet, se recibi como respuesta
que no se utilizaba dicha vitamina como tal, sino su derivado bisulfito sdico. Sin embargo,
se comprob mediante adiciones estndar que tampoco apareca el mencionado derivado en
este producto. En la figura I.11 se muestra un electroferograma de Coccivet
correspondiente a una muestra en el proceso de cuantificacin.
En lo que concierne a la explicacin de la ausencia de pirimetamina en
Cocichemical, fue imposible establecer contacto con el laboratorio responsable de su
comercializacin. En la figura I.12. se muestra un electroferograma de Cocichemical
correspondiente a una muestra en el proceso de cuantificacin.
3. Se encontr sulfametacina en Coccilina, aunque no estaba etiquetada. Su presencia
se confirm por superposicin de los espectros del pico en la muestra y en un patrn de
sulfametacina y tambin por el mtodo de las adiciones estndar. En la figura I.13 se
muestra un electroferograma de Coccilina correspondiente a una muestra en el proceso de
cuantificacin.




Captulo I 155


7.00 7.20 7.40 7.60 7.80
Tiempo (minutos)
0.00
10.00
20.00
m
A
u
Patrn
MEN








Figura I.11. Detalle del pico de MEN obtenido en el anlisis cuantitativo de Coccivet.
Muestra
Muestra

9.60 9.80 10.00 10.20 10.40
Tiempo (minutos)
0.00
5.00
10.00
15.00
m
A
u
Patrn
PMT







Figura I.12. Detalle del pico de PMT obtenido en el anlisis cuantitativo de Cocichemical



Captulo I 156


5.60 5.80 6.00 6.20
Tiempo (minutos)
0.00
10.00
20.00
m
A
u
Patrn
SMT
SQX

Muestra








Figura I.13. Detalle de los picos de SMT y SQX obtenidos en el anlisis cuantitativo de
Coccilina

Estas bajas recuperaciones registradas en general crearon la necesidad de poner a
punto un nuevo mtodo de contraste para confirmar o desmentir los datos obtenidos hasta el
momento. Se pens en desarrollar un nuevo mtodo utilizando la tcnica de cromatografa
lquida de alta resolucin, aplicada a las mismas muestras que el ya comentado de
electroforesis capilar y posteriormente comparar resultados por ambos mtodos.


























CAPTULO II

DETERMINACIN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA Y PIRIMETAMINA
EN PRODUCTOS ZOOSANITARIOS
POR CROMATOGRAFA LQUIDA

Captulo II 159
II.1. INTRODUCCIN

Los resultados experimentales obtenidos en la determinacin, por electroforesis
capilar, de sulfaquinoxalina, sulfametacina, menadiona y pirimetamina no fueron los
esperados, si atendemos a la informacin de la composicin que consta en las etiquetas de
los diferentes productos comerciales analizados.
Es por esto por lo que se decidi poner a punto un nuevo mtodo por LC para
comparar los resultados con los del ya propuesto por electroforesis capilar descrito en el
captulo anterior.
La nica variante en cuanto al planteamiento del problema analtico reside en que en
este captulo no se incluye en el estudio la Menadiona, o vitamina K
3
, porque se consider
suficientemente demostrado que no estaba presente en Coccivet, ni en su forma pura ni
como derivado bisulfito sdico.
Por lo tanto, este captulo, que est ntimamente relacionado con el anterior, est
dedicado a poner a punto un nuevo mtodo por cromatografa lquida para resolver la
mezcla ternaria formada por SQX, SMT y PMT en los productos veterinarios ya citados en
el captulo anterior. Los resultados obtenidos por este mtodo se comparan con los
obtenidos por el mtodo de electroforesis capilar, que ocupa el primer captulo de esta
Memoria.




Captulo II 160
II.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES

II.2.1. Estudios preliminares

Nuestro grupo de investigacin public recientemente un mtodo
espectrofotomtrico para la determinacin de SMT, SQX y PMT en productos veterinarios
(24). En este trabajo, se emplea el mtodo desarrollado por J. J. Berzas y col. (20), vlido
para resolver mezclas ternarias, que consiste bsicamente en utilizar conjuntamente el
mtodo de los espectros cocientes derivados con la medida de la seal en el punto de corte
o zero-crossing de los espectros tratados. Los resultados de las determinaciones fueron
comparados con los que se obtuvieron utilizando dos mtodos alternativos, uno de
calibracin multivariante PLS-1 y otro de cromatografa lquida de alta resolucin. Este
ltimo mtodo utilizaba NaH
2
PO
4
(pH 3.0) 0.1 M:acetonitrilo (7:3) como fase mvil y una
columna Nova-Pack C
18
. La muestra se inyectaba siempre mediante un bucle de 20 L, el
caudal de fase mvil era de 1 mL/min y la deteccin se llevaba a cabo a una nica longitud
de onda, 270 nm. Partiendo de esa base, en este captulo se ha utilizado la cromatografa
lquida en fase reversa para estudiar la separacin de SQX, SMT y PMT en una columna
Kromasil C
18
cuyas dimensiones son 150 mm de longitud 4.6 mm de dimetro interno,
con un tamao de partcula de 5 m, mientras que la columna utilizada en el mencionado
trabajo tena 3 m de tamao de partcula. Por esta razn, el mtodo all descrito tuvo que
ser replanteado en algunos aspectos.
La utilizacin de la columna Kromasil C
18
como fase estacionaria tiene la limitacin
de no poder trabajar fuera del intervalo de pH que va de 2 a 8, ya que se puede daar el
Captulo II 161
relleno de la misma, como advierte el fabricante. En lo que concierne a la fase mvil, en
cromatografa de particin en fase reversa es habitual el empleo de mezclas de agua o
tampn y un disolvente orgnico, generalmente metanol o acetonitrilo, el cual modifica la
capacidad de elucin de la fase mvil, presentando deferente selectividad.
As, inicialmente se prepar una disolucin que contena 2 mg/L de cada
compuesto, y que llamaremos Z, por dilucin exacta de las respectivas disoluciones
madre y se comenzaron a realizar las separaciones utilizando tampn fosfato de pH 3 en la
fase mvil y metanol y acetonitrilo como disolventes orgnicos.
El equipo que se utiliz fue un Shimadzu LC10 con detector de diodos en lnea
SPD-M10A, equipado con un sistema de doble bomba. La inyeccin se realiz mediante
una vlvula Rheodyne 7725 con un bucle de 20 L.
Antes de llevar a cabo la primera separacin de cada serie, la fase mvil era filtrada
con un equipo de filtracin Millipore y purgada con helio durante 10 minutos para eliminar
los gases disueltos.
Inicialmente se observ que los picos obtenidos cuando se utiliz metanol eran ms
anchos que cuando se utiliz acetonitrilo, por lo que se seleccion ste como disolvente
orgnico en la fase mvil.
Asimismo, en estas experiencias preliminares se observ falta de reproducibilidad
en el tiempo de retencin y en las reas de PMT, mientras que en el caso de las dos
sulfamidas no se observaron anomalas de este tipo. Segn la figura II.1, la PMT, cuyo pK
a

es 7.0, presenta carga a pH 3. Esta carga puede estar interaccionando con la matriz de la
fase estacionaria, lo que podra explicar su comportamiento. Por su parte, SQX (pK
a
= 6.7)
Captulo II 162
y SMT (pK
a
= 7.4) no presentan carga a este pH, por lo que no les afectan estas
interacciones electrostticas.


forma
neut ra
forma
cat inica
forma
aninica
2 4 6 8
pH
PMT
SMT
SQX

Figura II.1. Esquema de la ionizacin de SMT, SQX y PMT en funcin del pH

Para solventar este inconveniente se introdujo en la fase mvil un anin
voluminoso, el perclorato, con la finalidad de formar un par inico con la PMT, que
podramos esquematizar como PMT
+
ClO
4
-
, y evitar as la interaccin de sta con los grupos
ionizables de la columna.
Con la adicin de perclorato, se solucionaron las dificultades mencionadas, sin
embargo, el pico de PMT presentaba colas. Esto es debido a que, dado que el par inico
PMT
+
ClO
4
-
tiene carga neta nula, su afinidad por la fase estacionaria es muy alta. Para
solucionar este problema, hubo que disolver la muestra en un 10 % (v:v) de fase mvil, tras
lo cual, se consigui un pico ms simtrico.
Captulo II 163
Sentadas estas bases, se tom como fase mvil tampn fosfato de pH 3, conteniendo
ClO
4
-
y acetonitrilo, con un caudal de 1.5 mL/min como condiciones iniciales para la
posterior optimizacin de la separacin de la mezcla Z.
En esta modalidad cromatogrfica la fase mvil est compuesta por una fraccin
acuosa convenientemente tamponada y un disolvente orgnico para establecer el equilibrio
de particin hasta conseguir la resolucin apropiada sin que el tiempo de desarrollo del
cromatograma sea excesivo.
Por tanto, es necesario optimizar el valor de pH, la concentracin de perclorato, la
concentracin de tampn y la proporcin de disolvente orgnico en la misma.

II.2.2. Optimizacin del pH de la fase mvil

Para optimizar este parmetro, se prepar por dilucin directa de las disoluciones
madre, una disolucin tipo Z que contena un 10 % (v:v) de fase mvil. Se inyectaron
alcuotas en el sistema cromatogrfico, obtenindose los correspondientes cromatogramas
con fases mviles constituidas por una fraccin acuosa tamponada con fosfato de
concentracin 0.1 M a distintos valores de pH, conteniendo 10 mM de perclorato sdico y
una fraccin orgnica, constituida por acetonitrilo en proporcin 70:30 (v:v). Todos los
cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase mvil constante de 1.5
mL/min y midiendo como seal analtica la absorbancia a las longitudes de onda de
mxima absorcin de cada uno de los compuestos.
A partir de los cromatogramas obtenidos se midieron los tiempos de retencin para
los distintos valores de pH.
Captulo II 164
En la tabla II.1 se resumen los resultados obtenidos. Se puede observar que a los
cuatro valores de pH estudiados, los tiempos de retencin no sufren variaciones apreciables,
siendo el tiempo de anlisis siempre inferior a 6 minutos.

Tabla II.1. Influencia del pH en los tiempos de retencin.
pH SMT PMT SQX
3 2.348 4.098 5.693
4 2.373 4.110 5.694
5 2.373 4.259 5.563
6 2.326 4.819 4.820

3.0 4.0 5.0 6.0
pH
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
n

(
m
i
n
)
SMT
PMT
SQX

Figura II.2. Influencia del pH en los tiempos de retencin.

Captulo II 165
Se observ que, al aumentar el pH el tiempo de retencin de SMT permaneca
invariable, mientras que el tiempo de retencin de SQX aumentaba y el de PMT disminua,
registrndose un solapamiento de estos compuestos.
La explicacin de este comportamiento se encuentra en la relacin que existe entre
el intervalo de pH de trabajo y los pK
a
de los distintos compuestos estudiados.
En el caso de la SMT, cuyo pK
a
es 7.4, la constancia del tiempo de retencin se
debe a que, en el intervalo de pH estudiado (de 3 a 6) no adquiere fraccin de carga, es
decir, se mantiene en su forma neutra.
En el caso de SQX, la disminucin del tiempo de retencin cuando el pH aumenta
se explica por la misma razn. En el intervalo de pH estudiado se encuentra en su forma
neutra, ya que su pK
a
es 6.7. Por lo tanto, a partir de pH 4.7 empieza a adquirir cierta
fraccin de carga, lo cual hace a la molcula ms polar y queda menos retenida en la fase
estacionaria, acortando su tiempo de retencin.
Por su parte, la PMT interacciona con el perclorato sdico, segn se coment en el
apartado correspondiente, confirmando que en el intervalo de pH estudiado, se encuentra en
su forma catinica. No obstante, el aumento en su tiempo de retencin al aumentar el pH
obedece a que, al acercarse el pH a su pK
a
, que es 7.0, la molcula va perdiendo fraccin de
carga y, por lo tanto va cobrando mayor afinidad por la fase estacionaria y menos por el
contrain suministrado, el perclorato. Esto hace que su tiempo de retencin aumente con el
pH.
Finalmente, se seleccion como ptimo el pH 3 porque, dentro del intervalo
estudiado, el tampn fosfato muestra su mxima capacidad reguladora a este pH.

Captulo II 166
II.2.3. Influencia de la concentracin de perclorato

Como ya se ha comentado anteriormente PMT se encuentra como catin al pH al
que estamos trabajando. En general, cuando los solutos tienen carga elctrica, su polaridad
es muy elevada y para reducir la carga efectiva, una de las tcnicas que se utilizan se basa
en aadir un agente que provoque la formacin de un par inico, con lo que la carga final
del agente conjugado con el soluto disminuye mucho y resulta, por tanto, un compuesto de
polaridad inferior al soluto ionizado. Por lo general, puesto que el complejo formado
(muestra problemacontrain) ha de ser soluble en la fase orgnica del eluyente, dichos
compuestos suelen ser voluminosos. En nuestro caso, necesitamos un contrain aninico
para formar el par inico con PMT.
Hemos utilizado perclorato como contrain, cuya concentracin en la fase mvil es
la que vamos a optimizar en este apartado.
Para realizar este estudio se prepar por dilucin directa de las disoluciones madre
una muestra de tipo Z que contena un 10 % (v:v) de fase mvil. Se inyectaron alcuotas
de 20 L en el sistema cromatogrfico, utilizndose como fase mvil tampn fosfato de pH
3.0 y acetonitrilo en proporcin 70:30 (v:v), variando nicamente la concentracin de
perclorato. El caudal de fase mvil se mantuvo en 1.5 mL/min y se midi la absorbancia a
las longitudes de onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos.
A modo de ejemplo, en la figura II.3 se muestran dos cromatogramas
correspondientes a la separacin de dos muestras de SQX, SMT y PMT en ausencia de
contrain perclorato (a) y cuando la concentracin de ste en la fase mvil es 20 mM (b),
registrados a la longitud de onda de mxima absorcin de PMT, es decir, 210 nm.
Captulo II 167
a)
0 2 4 6
Tiempo de retencin (min)
8
0
10
20
30
40
50
60
m
A
u
SMT
PMT
SQX

b)
0 2 4 6 8
Tiempo de retencin (min)
-10
0
10
20
30
40
m
A
u
SMT
PMT
SQX


Figura II.3. Cromatogramas de muestras de SQX, SMT y PMT, cuando la
concentracin de NaClO
4
es (a) 0 y (b) 20 mM ( =210 nm)

Captulo II 168
La figura II.4 muestra la influencia de la concentracin de perclorato en los tiempos
de retencin. Como se esperaba, a medida que aumentaba la concentracin de perclorato, el
tiempo de retencin de la PMT aumentaba tambin, mientras que los tiempos de retencin
de las sulfamidas permanecan prcticamente inalterables. Este comportamiento confirma
que, a pH 3, la PMT se encuentra en su forma catinica y forma el correspondiente par
inico PMT
+
ClO
4
-
.
Como se puede observar, una concentracin de 10 mM de perclorato proporciona la
mejor separacin entre los picos en un corto tiempo de anlisis, por lo que se seleccion
como ptima esta concentracin de perclorato para continuar las experiencias.














Captulo II 169
Tabla II.2. Influencia de la concentracin de perclorato sdico.
Tiempo de retencin (min) Perclorato (mM)
SMT PMT SQX
0 2.328 2.974 5.607
10 2.348 4.098 5.693
20 2.327 4.804 5.548
30 2.325 5.614 5.614
40 2.319 6.352 5.556
50 2.303 6.865 5.472

0 10 20 30 40 5
Concentracion de perclorato sdico (mM)
0
2.0
4.0
6.0
8.0
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
o
n

(
m
i
n
)
SMT
PMT
SQX


Figura II.4. Influencia de la concentracin de perclorato.
Captulo II 170
II.2.4. Influencia de la fuerza inica en la fase mvil

Como norma general, un aumento en la fuerza inica del tampn produce el
conocido efecto salino, que consiste en que, al aumentar la concentracin de iones en la
fase mvil, sta se va saturando poco a poco, dificultando cada vez ms la disolucin de los
analitos previamente adsorbidos en la fase estacionaria. Lgicamente, este comportamiento
se traduce en un aumento de los tiempos de retencin y en un ensanchamiento de los picos.
La fuerza inica ejerce tambin su influencia sobre la dispersin de la muestra. A
altas concentraciones de tampn se dificulta la dispersin de la muestra ms que a bajas
concentraciones, lo que hace disminuir la anchura de pico.
En definitiva, un aumento de la fuerza inica puede aumentar o disminuir los
anchos de pico y, en consecuencia, variar la eficacia de la separacin. Tanto es as, que
estos efectos pueden llegar a anularse entre s, por lo que este parmetro puede tener una
influencia neta sobre los anchos de pico que puede ser nula.
Este estudio se realiz con el fin de comprobar cmo influye la fuerza inica de la
fase mvil en la retencin de los compuestos estudiados.
Para ello se prepar una muestra de tipo Z de la misma manera que en el apartado
anterior y se inyect en el sistema cromatogrfico manteniendo las condiciones
cromatogrficas anteriormente seleccionadas, en las que se variaba nicamente la
concentracin de la disolucin reguladora en la fase acuosa de la fase mvil entre 20 y 100
mM. Todos los cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase mvil
constante de 1.5 mL/min y midiendo como seal analtica la absorbancia a las longitudes de
onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos.
Captulo II 171
Los resultados obtenidos aparecen en la figura II.5, donde se muestra la influencia
de la concentracin de tampn en los tiempos de retencin y puede verse que, a medida que
la concentracin de tampn aumenta, el tiempo de retencin de PMT disminuye levemente,
mientras que no se registraron efectos dignos de mencin en el caso de SQX y SMT.
Recordemos que, a este pH, las sulfamidas en estudio se encuentran en su forma
neutra, mientras que la PMT se encuentra en su forma ionizada. Al aumentar la fuerza
inica del tampn en la fase mvil, aumenta la proporcin H
2
PO
4
-
/ClO
4
-
porque se
mantiene constante la concentracin de contrain perclorato en 10 mM. Este hecho puede
hacer disminuir la afinidad de PMT por el contrain perclorato en beneficio del
hidrgenofosfato. Esta competitividad podra llegar a anular la asociacin inica entre PMT
y perclorato a altas concentraciones de tampn.
En los casos de SMT y SQX, el aumento de la concentracin de tampn de la fase
mvil no tuvo efecto significativo sobre sus tiempos de retencin, es decir el efecto salino
no fue suficiente para modificar sensiblemente las afinidades de estos dos compuestos por
sendas fases. Como conclusin, se seleccion 40 mM como concentracin ptima de
tampn porque se consider suficiente para mantener el pH a 3 y tambin porque a esta
concentracin se produca la mejor resolucin de los tres picos.






Captulo II 172
Tabla II.3. Influencia de la concentracin del tampn
Fosfato (mM) Tiempos de retencin
SMT PMT SQX
20 2.265 5.257 5.381
40 2.259 4.672 5.362
60 2.292 4.469 5.443
80 2.301 4.256 5.466
100 2.303 4.098 5.472

20 40 60 80 100
Concentracion de fosfato (mM)
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
o
n

(
m
i
n
)
SMT
PMT
SQX


Figura II.5. Influencia de la concentracin de fosfato en los tiempos de retencin.

Captulo II 173
II.2.5. Influencia de la concentracin de acetonitrilo

Dentro de los parmetros qumicos que influyen en una separacin cromatogrfica,
la composicin de la fase mvil es de una importancia capital. La proporcin de fraccin
orgnica de la fase mvil determina fuertemente los tiempos de retencin de los analitos y,
en consecuencia, el tiempo de anlisis. En cromatografa lquida en fase reversa, la fase
mvil es ms polar que la fase estacionaria y la polaridad de la fase mvil se fija variando
las proporciones de la fraccin acuosa, en este caso tampn fosfato (pH 3.0), y de la
fraccin orgnica, en este caso, acetonitrilo.
Cuanto mayor es la proporcin de fraccin orgnica de la fase mvil, mayor
afinidad tendrn por ella los analitos que se encuentran adsorbidos en la fase estacionaria y,
en consecuencia, sus tiempos de retencin disminuirn, lo cual implica necesariamente una
disminucin en el tiempo de anlisis.
Para realizar este estudio, se prepar por dilucin directa de las disoluciones madre
una disolucin de tipo Z que contena 10 % (v:v) de fase mvil y se inyectaron alcuotas
de 20 L en el sistema cromatogrfico. Por ste flua una fase mvil cuya fraccin acuosa
estaba formada por solucin reguladora H
3
PO
4
/H
2
PO
4
-
de pH 3.0 y concentracin 40 mM,
que contena 10 mM de perclorato sdico y cuya fraccin orgnica era acetonitrilo,
desarrollndose los correspondientes cromatogramas para cada una de las proporciones de
disolvente orgnico ensayadas, comprendidas en el intervalo de 30 a 40%.
Todos los cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase mvil
constante de 1.5 mL/min y midiendo como seal analtica la absorbancia a las longitudes de
Captulo II 174
onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos. Los datos obtenidos se
muestran en la tabla II.4.

Tabla II.4. Influencia de la concentracin de acetonitrilo
% CH
3
CN Tiempos de retencin (min)
SMT PMT SQX
30 2.315 4.812 5.654
35 1.975 3.081 3.798
40 1.727 1.940 2.809

30 35 40
Porcentaje de acetonitrilo
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i
o
n

(
m
i
n
)
SMT
PMT
SQX

Figura II.5. Influencia del porcentaje de acetonitrilo en la fase mvil en los tiempos
de retencin.

Captulo II 175
Para todos los componentes, se observ que cuando la proporcin de acetonitrilo
aumentaba, el tiempo de retencin de los compuestos disminua, acortndose as el tiempo
de anlisis.
Tambin se puede observar que mientras que la separacin entre los picos de SQX y
PMT se mantiene constante, los picos de PMT y SMT tienden a converger en un tiempo
prximo a dos minutos.
En la figura II.5 se muestra la influencia del porcentaje de acetonitrilo en la fase
mvil sobre los tiempos de retencin. Considerando la resolucin entre los picos y el
tiempo de anlisis, se seleccion como ptimo un porcentaje de acetonitrilo de 35%.

II.2.6. Influencia del caudal de la fase mvil.

Como es sabido, la cromatografa es una tcnica analtica de separacin con un doble
fundamento, termodinmico y cintico. Ya se ha comentado que los aspectos
termodinmicos son los que rigen el equilibrio de distribucin o reparto de los
solutos/analitos entre las dos fases, mvil y estacionaria, por tanto, son responsables de
caractersticas cromatogrficas tan importantes como retencin y selectividad. Los aspectos
cinticos juegan en cromatografa un doble papel, por una parte, debe considerarse el
tiempo en que se alcanza el equilibrio de distribucin en cada porcin del sistema y, por
otra parte, la velocidad de desplazamiento diferencial de la mezcla de solutos en el lecho
cromatogrfico, que es la responsable ltima de la separacin. Sobre ella influyen aspectos
termodinmicos y aspectos cinticos fsicos relacionados con la dispersin axial, flujo a
travs del medio poroso, etc.
Captulo II 176
Las caractersticas cinticas del proceso son claves para definir el ensanchamiento de
banda o ancho de pico que es el que determina, en definitiva, la eficacia del sistema
cromatogrfico. En general, los trminos que contribuyen a sta corresponden a la difusin
por remolino, difusin longitudinal y a la resistencia a la transferencia de materia en la fase
mvil y estacionaria que, a su vez, van a depender de la velocidad de flujo o del caudal de
la fase mvil a travs de la fase estacionaria.
Con objeto de elegir el caudal de la fase mvil ms apropiado, se ha estudiado cmo
influye esta variable en la eficacia del sistema cromatogrfico para los tres compuestos
estudiados, reflejado en la resolucin y en el tiempo de anlisis.
Para la optimizacin de este parmetro, se prepar una muestra de la forma habitual y
se insert en el sistema cromatogrfico manteniendo las condiciones optimizadas en
apartados anteriores, en las que nicamente se variaba el flujo de la fase mvil entre 1 y 2
ml/min. No se tuvieron en cuenta mayores caudales debido a que las altas presiones
alcanzadas en el sistema cromatogrfico podran llegar a disparar los sistemas de seguridad,
parndose de este modo el equipo.
Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla II.5. Como era de esperar, los
tiempos de retencin disminuan al aumentar el caudal de fase mvil. Sin embargo, al
disminuir el tiempo de retencin de los tres compuestos, la resolucin entre PMT y SMT
disminuy considerablemente.
Teniendo en cuenta estos resultados y con el fin de mantener buenas resoluciones
entre picos, se seleccion como ptimo un caudal de 1.5 mL/min, con el cual la separacin
se completa en menos de cuatro minutos.

Captulo II 177
Tabla II.5. Influencia del caudal de fase mvil en los tiempos de retencin.
Caudal (mL/min) Tiempo de retencin (min)
SMT PMT SQX
1.0 2.964 3.966 5.692
1.5 2.086 3.182 3.904
2.0 1.494 1.990 2.863


II.2.7. Mtodo cromatogrfico propuesto

De los estudios realizados anteriormente, se propuso el mtodo cromatogrfico que
se esquematiza en la tabla II.6. En la figura II.6 se muestra un cromatograma obtenido
utilizando el mtodo propuesto para la separacin de una muestra de 2 mg/L de SQX, SMT
y PMT, registrado a 270 nm. Se puede ver que todos los picos estn bien resueltos en un
tiempo de anlisis del orden de 4 minutos.

Tabla II.6. Mtodo cromatogrfico propuesto.
Columna Kromasil C
18

Fase mvil 40 mM fosfato (pH 3.0), 10 mM ClO
4
-
: Acetonitrilo (65:35)
Caudal 1.5 mL/min
Volumen inyectado 20 L
Deteccin Barra de diodos en lnea

Captulo II 178





0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
Time (min)
-2.00
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
m
A
u
SMT
PMT
SQX










Figura II.6. Cromatograma de una muestra de 2 mg/L de SQX, SMT y PMT registrado a
270 nm.






Captulo II 179
II.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

En el proceso de optimizacin del mtodo, lo ms importante es dar con las
condiciones que permitan una separacin con buenas resoluciones en un tiempo de anlisis
razonable. Para evaluar estos parmetros en las separaciones que se han realizado en la
mencionada etapa habra bastado con monitorizar la seal a una nica longitud de onda. Sin
embargo, a la hora de cuantificar, es necesaria la mxima sensibilidad en la seal analtica
de medida, por lo que en esta etapa de anlisis cuantitativo, las medidas se realizaron a las
longitudes de onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos, que se obtuvieron
a partir de sus espectros de absorcin UV-Visible. As, las longitudes de onda
seleccionadas fueron 263, 252 y 210 nm para SMT, SQX y PMT, respectivamente.

II.3.1. Lmites de deteccin y de cuantificacin

Los lmites de deteccin y cuantificacin, LOD y LOQ, respectivamente, se
establecieron por medio del mtodo del ruido de la lnea base. Se estim la fluctuacin de
la lnea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco a lo largo de un
intervalo de tiempo equivalente a diez veces el ancho de pico. As, el LOD se obtuvo como
la concentracin de muestra que produjo una altura de pico equivalente a tres veces la
fluctuacin de la lnea base y el LOQ se calcul como la concentracin de muestra que
produjo una altura de pico equivalente a diez veces la fluctuacin de la lnea base. As, se
obtuvieron los lmites de deteccin y cuantificacin que figuran en la tabla II.7.

Captulo II 180
Tabla II.7. Lmites de deteccin (LOD) y de cuantificacin (LOQ) en mg/L.
SMT SQX PMT
LOD 0.048 0.054 0.051
LOQ 0.16 0.18 0.17


II.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad

La linealidad de la respuesta se estudi inyectando una serie de patrones segn el
mtodo cromatogrfico optimizado. Las rectas de calibrado se establecieron de tal manera
que la concentracin correspondiente al lmite de cuantificacin fuese el punto de menor
concentracin y donde el punto de mayor concentracin fuese unas 20 veces ms
concentrado. A la vista de sus espectros ultravioleta-visible, para cada componente se
represent el rea de pico y su altura, a la longitud de onda de mxima absorcin en cada
caso.
En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relacin lineal entre
concentracin y las reas y alturas de pico y tambin que las ordenadas en el origen
resultaron ser despreciables, a la vista de los intervalos de confianza, calculados utilizando
el estadstico t de Student para un nivel de significacin de 0.05.
En la figura II.7 se representan las reas y alturas de pico frente a las
concentraciones de cada uno de los compuestos. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por
mnimos cuadrados se muestran en la tabla II.8, pudindose apreciar la buena linealidad
Captulo II 181
obtenida, como lo demuestra el coeficiente de determinacin r
2
, para el intervalo de
concentraciones indicado en la misma tabla.




Tabla II.8. Rectas de calibrado. Concentraciones (en mg/L) frente a alturas (H)
y reas de pico (A).
Ecuacin r
2
Intervalo lineal
(mg/L)
SMT H = 0.83 ( 0.90) 10
3
+ 7.656 ( 0.19) 10
3
C 0.9991 0.2 11.5
A = 2.5 ( 6.3) 10
3
+ 54.62 ( 1.3) 10
3
C 0.9994 0.2 11.5
PMT H = -1.24 ( 1.26) 10
3
+ 15.63 ( 0.67) 10
3
C 0.9985 0.2 4.0
A = -3.4 ( 6.1) 10
3
+ 133.5 ( 5.0) 10
3
C 0.9992 0.2 2.0
SQX H = 0.32 ( 0.41) 10
3
+ 6.616 ( 0.20) 10
3
C 0.9992 0.2 4.4
A = 2.2 ( 6.1) 10
3
+ 67.9 ( 2.8) 10
3
C 0.9986 0.2 4.4






Captulo II 182

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
Concentracin (mg/L)
0
25000
50000
75000
100000
A
l
t
u
r
a
SMT
PMT
SQX

(a)

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0
Concentracin (mg/L)
0
200000
400000
600000
800000
1000000
A
r
e
a
PMT
SQX
SMT

(b)
Figura II.7. Rectas de calibrado en funcin de las alturas (a) y de las reas de pico (b)

Captulo II 183
II.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del mtodo descrito anteriormente se
prepar una muestra que contena de tipo Z en un matraz de 25 mL y se hicieron once
separaciones consecutivas en las condiciones qumicas e instrumentales elegidas como
ptimas.
Para evaluar la reproducibilidad entre dos series, se prepar una muestra en un
matraz de 25 mL y se hicieron dos series de once separaciones cada una en das
consecutivos. Se compararon las varianzas de las series segn el test estadstico F de
Snedecor para pruebas de dos colas y se encontr que no existan diferencias significativas
de precisin entre las series para un nivel de significacin de 0.05.
De la misma manera que se evaluaron las reproducibilidades de reas y alturas de
pico, se estim la reproducibilidad sobre los tiempos de retencin en once separaciones
realizadas en das diferentes. Especial atencin merece la PMT que, gracias a la formacin
del par inico con perclorato, consigui mantener estable su tiempo de retencin. En cuanto
a SMT y SQX se puede ver que las reproducibilidades de los tiempos de retencin
resultaron ser excelentes. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla II.9 en trminos
de media aritmtica (x), desviacin estndar (S) y porcentaje de desviacin estndar
relativa (% DER).




Captulo II 184




Tabla II.9. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo.
Da 1 Da 2
x S % DER x S %DER S
1
2
/S
2
2
F
(0.05)

Altura
SMT 29125 337 1.1 28952 566 1.9 2.8 3.717
SQX 44361 1119 2.5 43377 977 2.2 1.3 3.717
PMT 54781 1750 3.2 50299 1846 3.7 2.1 3.717
rea
SMT 2122142 7282 3.43 212527 5754 2.71 1.60 3.717
SQX 245653 8213 3.34 248598 6690 2.69 1.51 3.717
PMT 435598 45892 10.53 407289 27136 6.66 2.86 3.717
Tiempo de retencin (min)
SMT 1.969 0.005 0.26 1.960 0.003 0.17 2.8 3.717
SQX 3.053 0.011 0.36 3.040 0.006 0.18 3.36 3.717
PMT 3.862 0.008 0.20 3.850 0.010 0.27 1.56 3.717




Captulo II 185
II.4. APLICACIONES

Se aplic el mtodo cromatogrfico optimizado a los mismos productos veterinarios
que en el captulo anterior de esta Memoria. Se utilizaron dos mtodos para cuantificar, el
mtodo directo, es decir, preparando patrones a partir de las disoluciones madre, y por el
mtodo de las adiciones estndar.
Operativamente, se volvi a utilizar el mismo procedimiento para poder tomar un
volumen exacto de estos productos, es decir, llenar un matraz aforado de 10 mL hasta la
marca. Se transfirieron estos 10 mL a un matraz de 250 mL, lavando varias veces el matraz
con etanol para arrastrar todo el contenido. Seguidamente se diluy y enras ste con
etanol, dando lugar a una disolucin que llamaremos X. As, todo el producto comercial
qued totalmente disuelto y con una viscosidad que permita utilizar el material
volumtrico habitual para tomar volmenes conocidos.
Para cuantificar por el mtodo de las adiciones estndar, se tom 1 mL de la
disolucin X y se transfiri a un matraz de 100 mL, llevando a enrase con agua
desionizada (disolucin Y). Por ltimo, se tomaron cinco alcuotas de 2 mL cada una de
la disolucin Y y fueron transferidas a sendos matraces de 25 mL. Finalmente, se
aadieron diferentes concentraciones de SMT, SQX y PMT, se llevaron a enrase y se
inyectaron en el cromatgrafo segn el mtodo optimizado.
Para cuantificar por el mtodo directo, se tomaron tres alcuotas de 2 mL de la
disolucin Y, se transfirieron a sendos matraces de 25 mL y se llevaron a enrase con agua
desionizada. Estas muestras fueron inyectadas en el equipo y los cromatogramas
correspondientes fueron almacenados en el ordenador.
Captulo II 186



Figura II.8. Esquema de preparacin de las muestras.



A partir de los cromatogramas y basndonos en el uso de patrones de mezclas de
SMT, SQX y PMT, disueltas tambin en un 10 % de fase mvil, se obtuvieron los
porcentajes de recuperacin para cada compuesto en cada preparado comercial en funcin
de la altura de pico. Como en el captulo anterior, se utiliz la secuencia de patrones y
muestras descrita en el captulo I de esta Memoria.
En la tabla II.10 se muestran los resultados obtenidos que se expresan como
porcentaje de recuperacin para SQX, SMT y PMT con respecto a las concentraciones
indicadas en la etiqueta de cada uno de los productos y que corresponden a la media de tres
determinaciones.



Captulo II 187
Tabla II.10. Concentraciones encontradas y porcentajes de recuperacin obtenidos en
productos comerciales por medida directa, por adiciones estndar (A. E.) y por MEKC.
Encontrado (g/L) Recuperacin (%) Producto y etiquetado (g/L)
Directa A. E. Directa A.E. MEKC
Cocciamin
SQX 50
PMT 15
25.50 0.91
9.11 0.34
26.71 0.89
9.16 0.39
51.1
60.9
53.4
60.8
57.5
55.3
Cocichemical
SQX 50
PMT 15
28.42 0.91
0
28.78 0.91
0
56.8
0
57.8
0
59.1
0
Coccilina*
SQX 3.9
PMT 1.3
SMT 0
3.01 0.12
1.021 0.052
0.7013 0.0061
3.12 0.15
0.897 0.055
0.7105 0.0062
77.4
73.8
-
80.0
72.5
-
80.3
68.2
0
Coccirex
SQX 44
PMT 12
42.9 1.6
11.32 0.43
44.19 0.96
11.06 0.41
97.6
94.6
100.2
91.4
95.4
85.2
Coccivet
SQX 50
PMT 15
MEN 50
31.32 0.75
8.122 0.089
-
30.14 0.68
7.53 0.11
-
87.0
89.3
-
85.7
83.5
-
89.8
92.1
0
Quinoxipra-P
SQX 50
PMT 15
47.9 1.1
14.12 0.34
46.43 0.98
14.15 0.42
95.9
94.0
93.3
93.6
97.4
94.6

*Las unidades en Coccilina son g/100 g.

Como se puede observar en la tabla de resultados, se han obtenido recuperaciones
similares en la determinacin de SMT, SQX y PMT en productos comerciales cuando se
utiliz como tcnica instrumental la cromatografa lquida de alta resolucin,
independientemente del mtodo de cuantificacin, ya sea por medida directa o por
adiciones estndar.
Captulo II 188
Tambin se puede observar que estos resultados son comparables con los obtenidos
en el captulo I, en el que se propuso un mtodo para la determinacin de estos mismos
productos utilizando la electroforesis capilar en su modalidad de cromatografa micelar.
Atendiendo a estas observaciones podemos concluir que:
1. Los mtodos propuestos en los captulos I y II son adecuados para la
determinacin de SQX, SMT y PMT en productos comerciales, dado que las
recuperaciones obtenidas son comparables cuando se aplican a las mismas muestras.
2. Se confirman definitivamente las discordancias entre concentraciones etiquetadas
y contenidos reales en los productos analizados.



























CAPTULO III

DETERMINACIN DE SULFAMETOXAZOL, SULFADIMETOXINA,
SULFAMETOXIPIRIDACINA, TRIMETOPRIM Y BROMHEXINA EN
PRODUCTOS ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFA LQUIDA

Captulo III 191
III.1. INTRODUCCIN

Los agentes teraputicos pueden tener actividad bacteriosttica o bactericida. Al
primer grupo pertenecen las sulfamidas, ya que producen la detencin en el crecimiento
de las bacterias y evitan la multiplicacin de los grmenes existentes, mientras que al
segundo grupo pertenecen las penicilinas, cefalosporinas y la combinacin
sulfametoxazol-trimetoprim, ya que actan sobre los grmenes, en fase activa o en fase
de latencia, con un efecto letal.
El trimetoprim (TMP) se asocia por regla general al sulfametoxazol (SMX) o a
otras sulfamidas con parecidas caractersticas farmacocinticas, tales como
sulfametoxipiridacina (SMP) y/o sulfadimetoxina (SDM). El inters de las
determinaciones cuantitativas de estos compuestos radica en el gran uso que se hace de
estas asociaciones en la prctica mdica, veterinaria y farmacutica.
Enfermedades como la coccidiosis y la neumona, as como otro tipo de
trastornos, como la diarrea o la gastroenteritis se pueden tratar con combinaciones de las
mencionadas sulfamidas. Para ello, TMP se utiliza como potenciador.
Por otra parte, cuando se trata de combatir enfermedades de tipo respiratorio, se
pueden utilizar combinaciones de sulfamidas reforzadas con la presencia de algn
expectorante como la bromhexina (BRO), que restablezca la ventilacin pulmonar.
El inters de resolver la mezcla compuesta por SMX, TMP, SDM, SMP y BRO,
cuyas estructuras qumicas se hallan en la figura III.1, radica en que existen
combinaciones de estos compuestos, fundamentalmente de tipo sulfamidatrimetoprim,
que se aplican normalmente en la prctica veterinaria para el tratamiento de las citadas
enfermedades.
Captulo III 192
La tcnica instrumental seleccionada para este trabajo fue la cromatografa
lquida.

H
2
N S NH
O
O
N
O
CH
3
H
2
N S
O
O
NH
N
N
OCH
3
OCH
3
SMX
N
N
H
2
N CH
2
OCH
3
OCH
3
OCH
3
TMP
N CH
2
CH
3
Br
Br H
2
N
BRO
SDM
H
2
N S
O
O
NH
N N
OCH
3
SMP


Figura III.1. Estructuras qumicas de los compuestos en estudio.

La estabilidad de las disoluciones de estos compuestos as como el efecto del pH
y del contenido en etanol en su espectro de absorcin han sido ampliamente estudiadas
en nuestro laboratorio. A modo de resumen, se citan brevemente algunos aspectos
referentes a las disoluciones de estos compuestos.

Captulo III 193
III.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfametoxazol, sulfadimetoxina,
sulfametoxipiridacina, trimetoprim y bromhexina.

En primer lugar se estudi el comportamiento en disolucin de cada una de los
compuestos. As, se comienza estudiando el disolvente apropiado, la estabilidad de sus
disoluciones y la influencia que ejerce el pH sobre los espectros de absorcin UV-VIS de
cada una de las drogas.
1. Estabilidad de las disoluciones de sulfametoxazol
Se prepar una disolucin en etanol-agua al 50% de SMX (10
-3
M), estudindose
su estabilidad a travs de disoluciones diluidas de concentracin 4x10
-5
M y que fueron
preparadas diariamente a partir de la anterior. Se observ que durante un mes, las
disoluciones que se preparaban a partir de la concentrada, presentaban espectros de
absorcin iguales, en los que se mantenan invariables la intensidad y la longitud de onda
del mximo de absorcin caracterstico.
2. Estabilidad de las disoluciones de sulfadimetoxina
Se prepar una disolucin acuosa de SDM (100 mg/L) a la que se le estudi la
estabilidad, utilizando para ello la cromatografa lquida. Las muestras, que se preparaban
por dilucin 1:5 a partir de la disolucin madre, se inyectaban en el cromatgrafo y se iban
almacenando diariamente los cromatogramas, registrados a 255 nm. Se observ que,
durante un perodo de un mes, las disoluciones preparadas a partir de la disolucin madre
de SDM presentaban picos invariables en cuanto a rea y altura.
3. Estabilidad de las disoluciones de sulfametoxipiridacina
Se prepararon dos disoluciones de 250 mg/L de SMP, la primera en agua y la
segunda en una mezcla de disolventes etanol-agua al 50%. Se estudi la estabilidad con el
tiempo de cada una de estas disoluciones registrando los espectros de absorcin de
Captulo III 194
disoluciones diluidas de 10 mg/L, que fueron preparadas a partir de las concentradas en el
momento de efectuar la medida. Se observ que las disoluciones diluidas mostraron
espectros de absorcin que permanecieron invariables durante al menos 5 das, cuando se
utiliz como disolvente la mezcla etanol-agua, mientras que cuando se utiliz como
disolvente el agua, los espectros fueron invariables durante al menos 18 das.
Se prepar una disolucin de SMP (100 mg/L) disolviendo en la mnima cantidad
de HCl 1 M y posteriormente llevando a enrase con agua desionizada para estudiar su
estabilidad cromatogrficamente. Se observ que durante un perodo de un mes, las
disoluciones preparadas a partir de la disolucin madre de SMP presentaban picos
invariables.
4. Estabilidad de las disoluciones de trimetoprim
Se prepar una disolucin en etanol-agua al 50% de TMP (10
-3
M) a la que se le
estudi la estabilidad haciendo diariamente una dilucin 1:25 y registrando posteriormente
su espectro de absorcin UV-VIS. Se observ que, durante un perodo de un mes, las
disoluciones preparadas a partir de la disolucin madre de TMP presentaban espectros de
absorcin invariables.
5. Estabilidad de las disoluciones de bromhexina
Se prepar una disolucin de BRO (100 mg/L) en agua:etanol (90:10) a la que se le
estudi la estabilidad de la misma manera que se ha comentado en el caso de SDM y se
observ que durante un perodo de un mes, las disoluciones preparadas a partir de la
disolucin madre de BRO presentaban picos invariables.




Captulo III 195
III.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorcin

Se prepararon, de forma independiente, cuatro disoluciones de 500 mL de una
concentracin de 12 mg/L de TMP en el primer caso, 5 mg/L de SMX en el segundo caso,
5 mg/L de SDM en el tercer caso y 10 mg/L de SMP en el cuarto caso. En todos los casos,
el valor del pH se ajust por adicin de pequeas cantidades de disolucin de NaOH o
HCl, de concentracin variable, sobre los 500 mL de disolucin, de tal manera que el error
por dilucin resultara despreciable. Finalmente, se registraron los espectros de absorcin
entre 200 y 350 nm frente a un blanco.
Utilizando los datos obtenidos en el apartado anterior, se procedi a determinar las
constantes de ionizacin de SMX, TMP, SDM y SMP. Para ello se utilizaron dos mtodos
espectrofotomtricos, el de Stenstrom y Goldsmith (154) y el de Wilson y Lester (155).
Los valores medios de pK
a
obtenidos por los dos mtodos se muestran a
continuacin en la tabla III.1 y se comparan con los encontrados en bibliografa (31)

Tabla III.1. Valores de pK
a
para SMX, TMP, SMP, SDM y BRO.
Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografa
SMX
6.0 5.9 5.9
SDM
- - 6.2
SMP
7.2 7.2 6.7
TMP
7.1 7.1 6.6
BRO
- - -



Captulo III 196
III.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES

III.2.1. Estudios preliminares

En este captulo, se ha utilizado la cromatografa lquida en fase reversa para
estudiar la separacin de SMX, SMP, SDM, TMP y BRO, utilizando una columna
Kromasil C
18
de 150 mm de longitud por 4.6 mm de dimetro interno, con un tamao de
partcula de 5 m. El cromatgrafo que se utiliz fue un Waters serie 35 con detector de
longitud de onda variable Waters 486, equipado con un sistema de cudruple bomba,
que permite trabajar en gradiente. La inyeccin se realiz mediante una vlvula
Rheodyne 7725 con un bucle de 20 L. Todo se control por ordenador, provisto del
programa informtico Waters Baseline que permite el registro y el tratamiento de datos.
Se prepar una disolucin por dilucin exacta de las respectivas disoluciones
madres que contena 2 mg/L de cada compuesto. Esta disolucin, que llamaremos C
se utiliz para optimizar todos los parmetros, qumicos e instrumentales, de la
separacin.
Antes de poner en marcha el cromatgrafo, la fase mvil era filtrada con un
equipo de filtracin Millipore y purgada con helio durante diez minutos para eliminar
los gases disueltos. Asimismo, cada da, antes de realizar la primera separacin, se haca
pasar fase mvil por el sistema hasta conseguir la estabilizacin de la lnea base.
El caudal de fase mvil y la longitud de onda del detector fueron inicialmente 1
mL/min y 255 nm, respectivamente. La seleccin de esta longitud de onda se debe a que
las sulfamidas presentan un mximo de absorcin en torno a esa zona de su espectro.
Atendiendo a las condiciones ptimas encontradas para las sulfamidas que
fueron objeto de estudio en el captulo anterior y dado que las que se estudian en ste,
Captulo III 197
comparten similitudes estructurales y funcionales con aqullas, se decidi comenzar a
trabajar en condiciones similares a las empleadas entonces, es decir, a pH 3, impuesto
con un tampn fosfato 100 mM y acetonitrilo como fase mvil.

III.2.2. Optimizacin del pH de la fase mvil

Para estudiar la influencia del pH de la fase mvil en los tiempos de retencin,
se prepararon cuatro disoluciones de tampn fosfato 100 mM de pH comprendidos entre
3.0 y 6.0, que se mezclaron en el equipo con acetonitrilo en proporcin 60:40 (v:v;
tampn:acetonitrilo). Se inyectaron alcuotas de la disolucin C en el sistema
cromatogrfico y se registraron los correspondientes cromatogramas.
La influencia del pH en la retencin de los compuestos se muestra en la tabla
III.2 y en la figura III.2. Anlogamente, en la figura III.3 se muestra, esquemticamente
cmo afecta el pH en la ionizacin de los compuestos en estudio.
Observando la figura III.2, es de destacar que el tiempo de retencin de BRO
aumenta sensiblemente cuando pasamos de pH 3 a pH 4, y que a partir de este pH es
superior a 15 minutos, por lo que no se recoge en este grfico a partir del pH citado.
Este comportamiento indica que a pH 3, la molcula de BRO presenta carga positiva,
por lo que su tiempo de retencin no es muy superior al de los otros compuestos. Sin
embargo, al comenzar a aumentar el pH, pierde gradualmente esa fraccin de carga
positiva, por lo que es ms retenida en la fase estacionaria. Tanto es as que a pH > 4, su
tiempo de retencin supera los 15 minutos, lo cual no es interesante desde el punto de
vista de anlisis rutinario. Esta prdida de carga positiva hace que la BRO se vuelva
insoluble en medio acuoso, llegando a precipitar en las proximidades del pH 7.

Captulo III 198
Tabla III.2. Influencia del pH en la retencin de los compuestos
Tiempo de retencin (min) pH
TMP SMP SMX SDM BRO
3 1.838 2.464 3.600 4.432 5.460
4 1.811 2.422 3.455 4.268 13.806
5 1.808 2.411 3.293 4.128 >15
6 1.824 2.360 2.636 3.445 >15












3.0 4.0 5.0 6.0
pH
0
5
10
15
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i

n

(
m
i
n
)
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO

Figura III.2. Influencia del pH en los tiempos de retencin.

Tambin se puede ver que los tiempos de retencin de TMP y SMP no se ven
afectados por el cambio del pH dentro del intervalo estudiado. El TMP se encuentra en
su forma catinica en el intervalo de pH estudiado y por tener esta carga positiva en su
Captulo III 199
estructura es poco retenido. En cuanto a SMP, en el intervalo de pH estudiado se
encuentra en su forma neutra, como las dems sulfamidas estudiadas. Dentro de este
intervalo, se observa que el pH no afecta a la retencin de este compuesto porque su pK
a

es 6.7, por lo que no llega a ionizarse en este intervalo.
Por ltimo, es de destacar que de pH 3 a pH 5, los tiempos de retencin de las
sulfamidas SMX y SDM permanecen constantes, mientras que a partir de pH 5,
empiezan a disminuir. Al igual que SMP, estos compuestos se encuentran en su forma
neutra en el intervalo de pH estudiado. Sin embargo, sus pK
a
estn ms prximos a 6,
por lo que a partir de pH 5 empiezan a adquirir una importante fraccin de carga
negativa. Por ello empieza a detectarse un cambio en la tendencia de la retencin de
estos compuestos, que empiezan a eluir ms rpidamente.
Como consecuencia de este estudio, se seleccion como ptimo el pH 3 porque
los compuestos aparecen bien resueltos y la separacin se completa en un tiempo
aceptable, mientras que a pH superiores, la separacin no es tan buena y el tiempo de
retencin de la BRO se vuelve demasiado elevado, lo que aumentara innecesariamente
el tiempo de anlisis.
forma
catinica
forma
aninica
forma
neutra
2 3 4 5 6 7 8
SMX
SDM
SMP
TMP
BRO
pH

Figura III.3. Esquema de la ionizacin de los compuestos en estudio.
Captulo III 200
III.2.3. Influencia de la concentracin del tampn en la fase mvil

Este estudio se realiz con el fin de comprobar cmo influye la fuerza inica de
la fraccin acuosa de la fase mvil en la retencin de los compuestos estudiados.
Para estudiar la influencia de la concentracin del tampn de la fase mvil sobre
los tiempos de retencin, se prepararon disoluciones de tampn fosfato de
concentraciones comprendidas entre 10 y 80 mM, ajustadas a pH 3.0, que se mezclaron
en el equipo con acetonitrilo en proporcin 60:40 (v:v; tampn:acetonitrilo). Se
inyectaron alcuotas de la disolucin C en el sistema cromatogrfico y se registraron
los correspondientes cromatogramas. La influencia del pH en la retencin de los
compuestos se muestra en la tabla III.3 y en la figura III.4.
Como era de esperar, debido al efecto salino, un aumento de la concentracin del
tampn en la fase mvil supuso un aumento de los tiempos de retencin, si bien ste
solamente result ser significativo en el caso de BRO. Como conclusin, se seleccion
como ptima una concentracin de 10 mM porque muestra suficiente capacidad
reguladora y porque, dado que es la concentracin ms baja del intervalo estudiado, es
la que presenta menor tiempo de anlisis.








Captulo III 201

Tabla III.3. Influencia de la concentracin de tampn
Tiempos de retencin (min) Conc. (mM)
TMP SMP SMX SDM BRO
10 1.809 2.459 3.584 4.432 5.607
20 1.809 2.459 3.584 4.432 5.705
40 1.837 2.461 3.596 4.438 5.792
60 1.826 2.468 3.613 4.452 6.012
80 1.846 2.476 3.639 4.478 6.116













0 20 40 60
Concentracin de tampn (mM)
0
2
4
6
8
T
i
e
m
p
o

d
e

r
e
t
e
n
c
i

n

(
m
i
n
)
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO
80

Figura III.4. Influencia de la concentracin de tampn
Captulo III 202
III.2.4. Seleccin del disolvente orgnico

Aunque el pH seleccionado como ptimo produce buenas separaciones entre los
compuestos, se observ que TMP mostraba cierto grado de solapamiento con el t
0
y
tambin mostraba un hombro en las condiciones estudiadas, dentro de todo el intervalo
de pH.
Se comprob que utilizando metanol en vez de acetonitrilo, se consegua que
TMP no solapara con el t
0
en las mismas condiciones de pH y concentracin de tampn.
Por el contrario, el tiempo de retencin de SDM y BRO llegaron a ser mayores de 20
minutos.
A pesar de este elevado tiempo de anlisis, se opt por continuar el trabajo con
metanol porque se soluciona el problema del solapamiento del TMP aunque para
disminuir los tiempos de anlisis se opt por trabajar en la modalidad de gradiente.

III.2.5. Optimizacin del gradiente

Como ya hemos indicado, es necesario la utilizacin de un gradiente de elucin
para abordar la separacin de los compuestos en estudio en un tiempo de anlisis no
muy elevado.
El cambio controlado de la composicin de la fase mvil durante el proceso
cromatogrfico ampla enormemente las posibilidades de la LC, al obtenerse
discriminaciones ms efectivas e incluso posibilitar separaciones vedadas cuando se
utiliza un sistema isocrtico, adems de reducir considerablemente el tiempo de anlisis.
Los gradientes de elucin pueden ser de varios tipos segn se considere el perfil
concentracintiempo. El ms utilizado en LC es el lineal, ya que origina una mejor
Captulo III 203
discriminacin entre solutos, reflejada en un cromatograma con picos bien resueltos y
homogneamente distribuidos.
Sin embargo el equipo utilizado tambin permite programar gradientes de
elucin no lineales. Dentro de stos, ofrece dos posibilidades:
1. Cncavos. En este tipo de gradientes, la concentracin de fase orgnica
aumenta poco a poco al principio y posteriormente registra un aumento
considerable, cada vez mayor, hasta alcanzar la concentracin final
deseada.
2. Convexos. En este tipo de gradientes, la concentracin de fase orgnica
aumenta mucho al principio y posteriormente registra un aumento ms
leve hasta alcanzar la concentracin final deseada.

Son diversos los sistemas de mezcla controlada de disolventes, empleados para
originar gradientes en LC. En nuestro caso, la mezcla se realizaba, inicialmente, a baja
presin, utilizando una vlvula de mezcla controlada. Posteriormente, la mezcla entraba
en una bomba de alta presin. Mediante un programador de gradiente se control el
funcionamiento del sistema variando la composicin de la fase mvil con el tiempo.
Para optimizar el gradiente de elucin se ensayaron varios de ellos, siempre
comenzando por pequeas proporciones de metanol en la fase mvil con el fin de eluir
separadamente los compuestos menos retenidos (TMP, SMP y SMX) y acabando con
contenidos elevados de metanol para eluir rpidamente los ms retenidos (SDM y
BRO).
En primer lugar se prepar una muestra de tipo C por dilucin directa de las
disoluciones madre. Se insert una alcuota de 20 L en el sistema cromatogrfico, por
el que flua una fase mvil cuya fraccin acuosa estaba formada por disolucin
Captulo III 204
reguladora de H
3
PO
4
/H
2
PO
4
-
de pH 3.0 y concentracin 10 mM y cuya fraccin
orgnica era metanol, desarrollndose los correspondientes cromatogramas para cada
uno de los gradientes de elucin ensayados, tanto lineales como no lineales.
Todos los cromatogramas fueron obtenidos manteniendo un caudal de fase
mvil de 1 mL/min y se midi como seal analtica la absorbancia a 255 nm.
Se seleccion aquel gradiente lineal de elucin de la fase mvil que proporcion
buenas resoluciones cromatogrficas y tiempos de retencin no demasiado elevados,
con el fin de no alargar demasiado el tiempo de anlisis.
El gradiente seleccionado, de tipo cncavo, fue el siguiente:

% Acuosa* % CH
3
OH
0 min. 69 31
4 min. 31 69
14 min. 31 69
16 min. 69 31
* Disolucin reguladora de H
3
PO
4
/H
2
PO
4
-
de pH 3.0 y de concentracin 10 mM.

Sin embargo, en lo que se refiere a estabilidad de lnea base a la longitud de
onda de inters para la cuantificacin, ninguno de los gradientes ensayados produjo
resultados aceptables, ya que en todos los casos se observ una deriva en ella que
afectaba al pico de SDM.
Para solventar esta complicacin se decidi utilizar otra disolucin reguladora
del mismo pH en la fase mvil. De esta manera, se sustituy el tampn fosfato por el
citrato (pK
a
3.06) y se inyect una muestra preparada del modo habitual en el sistema
cromatogrfico segn el gradiente optimizado.
Captulo III 205
Como resultado, se observ que la deriva de la lnea base anteriormente citada se
corrigi hasta ser imperceptible, por lo que se decidi utilizar tampn citrato 10 mM de
pH 3.0 en lugar de fosfato. Asimismo, el gradiente optimizado anteriormente se
mantuvo invariable porque con citrato como tampn, se mantiene una excelente
separacin en un tiempo aceptable.

III.2.6. Influencia del caudal de fase mvil

Este estudio se realiz con la finalidad de ver cmo influye este parmetro
instrumental en la eficacia del sistema cromatogrfico seleccionado, para la separacin
de los compuestos en estudio, reflejada en el ancho de pico que presentan, as como en
los tiempos de retencin.
Para estudiar la influencia del caudal de fase mvil, se utiliz una disolucin de
tampn citrato pH 3.0 de concentracin 10 mM, que se mezcl en el equipo con
acetonitrilo segn el gradiente optimizado. Se inyectaron alcuotas de la disolucin C
en el sistema cromatogrfico y se registraron los correspondientes cromatogramas. La
influencia del pH en la retencin de los compuestos se muestra en la tabla III.4.
En ella podemos observar que, en el intervalo de valores ensayados, el aumento
del caudal hace disminuir notablemente los tiempos de retencin, como era de esperar.
Asimismo, se observa que el aumento del caudal de fase mvil conlleva una ligera
disminucin de los anchos de pico. Este comportamiento se debe a que la dispersin es
menor cuanto mayor es el caudal de fase mvil, segn se explic con detalle en el
apartado II.2.6 de esta Memoria.
Sin embargo, se observ que la estabilidad de la lnea base era mejor cuando las
separaciones se llevaban a cabo con un caudal de 1 mL/min.
Captulo III 206
Teniendo en cuenta estos resultados, se propone utilizar en lo sucesivo un caudal
de 1 mL/min, con el cual, el cromatograma puede obtenerse completo en 14 minutos.

Tabla III.4. Influencia del caudal de la fase mvil
TMP SMP SQX SDM BRO
1.0
T
r
(min)

Ancho (min)

4.125
0.616
5.217
0.867
6.850
1.088
9.017
0.633
12.240
0.820
C
a
u
d
a
l

(
m
l
/
m
i
n
)

1.5
T
r
(min)

Ancho (min)
2.742
0.458
3.500
0.508
4.608
0.950
7.142
0.550
8.160
0.555


III.2.7. Seleccin de la longitud de onda de medida

El hecho de que el detector utilizado no sea de barra de diodos en lnea, sino de
longitud de onda variable, implica que hay que realizar tantas separaciones como
compuestos en estudio si se quiere realizar la determinacin de cada uno de ellos a las
respectivas longitudes de onda de mxima absorcin. Esto significara multiplicar por
cinco el tiempo y el coste del anlisis, cuando realmente no es necesario. Debido a que
las muestras estn suficientemente concentradas, basta con realizar una sola separacin
para determinar varios compuestos, seleccionando una sola longitud de onda, a la cual,
la absortividad molar de cada compuesto sea suficientemente elevada para su posterior
determinacin cuantitativa.
Este estudio se realiz con la finalidad de ver cmo influye este parmetro
instrumental sobre la sensibilidad de la separacin, ya que la longitud de onda de
medida afecta a las reas y alturas de los picos as como al ruido de la lnea base.
Captulo III 207
Para estudiar la influencia de la longitud de onda de medida en la sensibilidad, se
utiliz una disolucin de tampn citrato pH 3.0 de concentracin 10 mM, que se mezcl
en el equipo con acetonitrilo segn el gradiente optimizado. Se inyectaron alcuotas de
la disolucin C en el sistema cromatogrfico y se registraron los correspondientes
cromatogramas a diferentes longitudes de onda. La influencia de la longitud de onda de
medida en la separacin de los compuestos, en trminos de ancho y rea de pico se
muestra en la tabla III.5.

Tabla III.5. Optimizacin de la longitud de onda de medida.
TMP SMP SQX SDM BRO
250
W (min)

A(mvols)

0.542
59643
0.792
157961
0.850
108793
0.508
116471
0.690
85814
255
W (min)

A(mvols)

0.567
53254
0.667
181922
0.908
159652
0.500
157371
0.680
66333
L
o
n
g
i
t
u
d

d
e

o
n
d
a

(
n
m
)

260
W (min)

A(mvols)

0.617
46775
0.700
187524
1.384
193498
0.542
168841
0.670
36604

En ella podemos observar que, mientras que los anchos de pico en el intervalo de
valores ensayado no varan significativamente, las reas de pico s que varan con la
longitud de onda. Esto es lgico, puesto que la absortividad molar de los diferentes
compuestos en estudio vara con la longitud de onda. Aunque las longitudes de onda de
mxima absorcin de TMP y BRO son 210 y 213 nm, respectivamente, la absorbancia
de estos compuestos en el intervalo de longitudes de onda estudiado es suficiente para
realizar su cuantificacin. Las reas de pico son mayores para TMP y BRO cuando la
Captulo III 208
deteccin se hace a 250 nm, mientras que para SMP, SMX y SDM, lo son cuando se
mide a 260 nm. As, las mayores reas no coincidieron en una sola longitud de onda.
Otro parmetro a tener en cuenta fue la perturbacin de la lnea base por efecto
del gradiente. sta es menos acusada cuando se realiza la deteccin a 255 nm que
cuando se realiza a otra longitud de onda.
Teniendo en cuenta todo lo expuesto anteriormente, se decidi seleccionar 255
nm como ptima, como solucin de compromiso entre la absorcin de los distintos
compuestos y el ruido de la lnea base, consiguiendo as la mejor relacin seal/ruido
para el conjunto de los compuestos a analizar.

III.2.8. Mtodo cromatogrfico propuesto

A partir de los estudios realizados anteriormente, se propuso un mtodo
cromatogrfico que se esquematiza en la tabla III.6. Asimismo, en la figura III.5 se
muestra un cromatograma obtenido bajo el mtodo propuesto en este captulo para la
separacin de una muestra que contena 16 mg/L de TMP, SMP, SMX, SDM y BRO y
que fue registrado a 255 nm.
Se puede ver que los picos estn bien resueltos y que el cambio de la lnea base
debido al gradiente es inapreciable.






Captulo III 209
Tabla III.6. Mtodo cromatogrfico propuesto.
Columna Kromasil C
18

Fase mvil Citrato 10 mM (pH 3) : metanol (Gradiente)
Caudal 1 mL/min
Volumen inyectado 20 L
Deteccin UV/VIS: 255 nm














0.00 4.00 8.00 12.00 16.00
Tiempo de retencin (min)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO

Figura III.5. Cromatograma de una disolucin de 16 mg/L de SMX, SDM, SMP, TMP y
BRO, registrado a 255 nm


Captulo III 210
III.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

III.3.1. Lmites de deteccin y cuantificacin

Los lmites de deteccin y cuantificacin, LOD y LOQ, reprectivamente, se
establecieron por medio del mtodo del ruido de la lnea base. Se estim la fluctuacin
de la lnea base registrando la respuesta del detector frente a un blanco, a lo largo de un
intervalo de tiempo equivalente a diez veces el ancho del pico. As, el LOD se obtuvo
como la concentracin de muestra que produjo una altura de pico de tres veces la
fluctuacin de la lnea base y el LOQ se calcul como la concentracin de muestra que
produjo una altura de pico diez veces la fluctuacin de la lnea base. As, se obtuvieron
los lmites de deteccin y cuantificacin que figuran en la tabla III.7.

Tabla III.7. Lmites de deteccin (LOD) y (LOQ) en mg/L
TMP SMP SMX SDM BRO
LOD 0.30 0.11 0.13 0.05 0.34
LOQ 1.0 0.4 0.4 0.2 1.1


III.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad

La linealidad del mtodo se estudi inyectando una serie de patrones de distinta
concentracin, utilizando el mtodo cromatogrfico optimizado. Las rectas de calibrado
se establecieron de tal manera que la concentracin correspondiente al lmite de
Captulo III 211
cuantificacin fuese el punto de menor concentracin y el de mayor concentracin,
aqul que fuese 20 veces ms concentrado que el primero.
Las rectas de calibrado se obtuvieron para cada componente, representando las
reas de pico, medidas a 255 nm.
En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relacin lineal entre
concentracin y rea de pico y tambin que las ordenadas en el origen resultaron ser
despreciables, segn el intervalo de confianza calculado para un nivel de significacin
de 0.05.
En la figura III.6 se representan las reas de pico frente a las concentraciones de
cada uno de los compuestos. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mnimos
cuadrados se muestran en la tabla III.8, donde se puede apreciar la buena linealidad
obtenida, como lo demuestra el coeficiente de determinacin r
2
, para el intervalo de
concentraciones indicado en la misma tabla.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0
Concentracin (mg/L)
0
400000
800000
1200000
1600000
A
r
e
a
TMP
SMP
SMX
SDM
BRO


Figura III.6. Rectas de calibrado
Captulo III 212

Tabla III.8. Ecuaciones de las rectas de calibrado e intervalo de linealidad.
Concentraciones e intervalo lineal en mg/L
Ecuacin r
2
Intervalo lineal
TMP A = -0.7 (6.4) 10
3
+ 27.72 (0.71) 10
3
C 0.9995 1-16
SMP A = 0.6 (7.7) 10
3
+ 94.83 (0.89) 10
3
C 0.9999 1-16
SMX A = 2.5 (8.2) 10
3
+ 71.19 (0.90) 10
3
C 0.9999 1-16
SDM A = 0.8 (2.0) 10
4
+ 89.5 (2.1) 10
3
C 0.9995 1-16
BRO A = 0.1 (5.9) 10
3
+ 25.19 (0.62) 10
3
C 0.9995 1-18


III.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Se prepararon dos muestras independientes que contenan, cada una, 4 mg/L de
cada compuesto. La repetibilidad se estudi realizando una serie de diez separaciones de
una de las dos muestras citadas anteriormente. En cuanto a la reproducibilidad, se
estudi realizando una serie de diez separaciones de la otra muestra, pasado un plazo de
24 horas y en las mismas condiciones.
Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes das, se prepar una muestra
igual que la anteriormente citada y se hicieron dos series de diez separaciones, cada una
en das consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviacin estndar
relativa mayor de 2.5 %, lo que indica el alto grado de precisin y fiabilidad del mtodo
propuesto.
Se compararon las varianzas de las series segn el test estadstico F de Snedecor
para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque se trata de dilucidar si las
Captulo III 213
variaciones entre las series de diferentes das son significativamente diferentes. As, se
encontr que no existan diferencias significativas entre las series para un intervalo de
confianza del 95 %.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentaje de desviacin estndar relativa (% DER) se muestran en la tabla III.9.

Tabla III.9. Repetibilidad y reproducibilidad
Serie 1 Serie 2
x S % DER x S % DER S
1
2
/ S
2
2
F
0.05
TMP 11657 2581 2.2 114744 1452 1.3 3.1 4.026
SMP 386286 7065 1.8 381377 3878 1.0 3.3 4.026
SMX 305511 4505 1.5 301005 2709 0.9 2.8 4.026
SDM 385400 6292 1.6 385383 3229 0.8 3.8 4.026
BRO 112891 1707 1.5 110316 1309 1.2 1.7 4.026


III.4. APLICACIONES

Una vez ms hay que resear que dada la alta viscosidad de los productos
comerciales en los que se encuentran los compuestos qumicos de nuestro inters, no se
puede tomar un volumen exacto con una pipeta. As, se decidi trabajar de modo similar
al de los captulos anteriores. Se tom una cierta cantidad con una jeringa y se llen con
ella un matraz de 10 mL hasta la marca. Seguidamente, estos 10 mL se transfirieron a
un matraz de 100 mL, lavando varias veces con etanol el matraz de 10 mL con el fin de
Captulo III 214
arrastrar todo el producto comercial. Ms tarde, el matraz de 100 mL se llev a enrase
con etanol (disolucin W).
Tras ser agitado manualmente, se transfiri 1 mL de la disolucin W a otro
matraz aforado de 100 mL, se aadi etanol para alcanzar una composicin final del 25
% y se llev a enrase con agua desionizada (disolucin X).




Figura III.7. Esquema para la preparacin de las muestras a partir de los productos
comerciales.

Para la determinacin de TMP, SMP, SMX y SDM, se tom 1 mL de la
disolucin X, se transfiri a un matraz de 25 mL y se diluy con agua hasta la marca.
Por otra parte, para la determinacin de BRO, fue necesario inyectar
directamente la disolucin X en el sistema cromatogrfico, ya que su concentracin
en los productos veterinarios es cien veces menor que la de SMP y veinte veces menor
que el TMP.
En el anlisis de los productos comerciales, las cantidades se calcularon a partir
de unos patrones preparados por dilucin exacta de las disoluciones madre, e inyectados
entre las muestras segn el siguiente esquema:
PATRN 1 MUESTRA 1A PATRN 2 MUESTRA 1B PATRN 1
Captulo III 215
Las recuperaciones fueron calculadas en base a los valores de concentracin
etiquetados en los productos.
Los resultados de los anlisis practicados estn resumidos en la tabla III.10.

Tabla III.10. Concentraciones encontradas y recuperaciones
Etiquetado (g/L) Encontrado (g/L) Recuperacin (%)
Hiprasulfa TS SMX 200
TMP 40
0
0
0
0
Sulfamiven SMP 200
TMP 40
117.9 1.7
15.61 0.25
59.0
39.0
Totaprim SMP 200
TMP 40
BRO 2
162.6 4.8
32.3 4.1
2.01 0.10
81.3
80.9
100.1
Metazaries SMX 200 116.59 0.71 58.3

A la vista de los resultados, cabe hacer los siguientes comentarios:
1. En Hiprasulfa TS, solamente apareci un pico en los cromatogramas. Su tiempo
de retencin no coincida con ningn compuesto de los estudiados en este captulo.
En la figura III.8 se ha superpuesto el cromatograma de una muestra de este
producto veterinario y el de su patrn corespondiente.
Adems de la superposicin de cromatogramas, esto fue confirmado por adiciones
estndar, adicionando al producto cada una de las tres sulfamidas que estn
incluidas en la mezcla objeto de nuestro estudio. En estas experiencias, se vio que el
pico que se detectaba en este producto comercial no coincida con el de ninguna de
las tres sulfamidas.
Captulo III 216

0.0 1.5 3.0 4.5 6.0 7
Tiempo (min)
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
Muestra
TMP
SMP


Patrn







.5

Figura III.8. Cromatogramas superpuestos de una muestra de Hiprasulfa TS y de su
patrn correspondiente.

2. Las bajas recuperaciones obtenidas en general en los productos analizados pueden
deberse al empleo de mezclas de sulfamidas con sus correspondientes derivados
fenil-propanol disulfonato sdicos. Estos derivados son muy utilizados en este tipo
de productos porque son ms solubles en agua que los productos puros, lo cual
facilita su administracin a los animales en el agua de bebida. Cuando se utilizan
estas mezclas, en los productos elaborados estarn presentes tanto el compuesto
puro como el correspondiente derivado, sin embargo, en la etiqueta puede que figure
la concentracin expresada, nicamente, como compuesto puro. Por esta razn, las
recuperaciones, que se calculan con respecto al valor etiquetado, no son las
esperadas. A este respecto, se trat de contactar con los responsables de los
laboratorios implicados, pero no se obtuvo ninguna respuesta.
Captulo III 217
3. En los productos veterinarios que contienen la combinacin SMX-TMP se han
observado discrepancias notables entre los valores etiquetados y los encontrados
aplicando el mtodo analtico propuesto, como sucede cuando se analizan los
productos veterinarios que contienen la combinacin SQX-PMT. Esto indica una
grave falta de control en la fabricacin de este tipo de productos, lo que puede
repercutir seriamente en la salud de los animales y, por medio de la cadena
alimenticia, en la salud humana.


























CAPTULO IV

DETERMINACIN DE SULFAMETOXAZOL, SULFADIACINA,
TRIMETOPRIM, BROMHEXINA Y GUAYACOL EN PRODUCTOS
FARMACUTICOS POR ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA

Captulo IV 221
IV.1. INTRODUCCIN

En el captulo III de esta Memoria ya se dio cuenta de las propiedades
bactericidas de la combinacin sufametoxazoltrimetoprim y de sus aplicaciones a
ciertas enfermedades conocidas en el terreno de la prctica veterinaria.
Sin embargo, esta combinacin tambin se puede encontrar en preparados
farmacuticos y se utiliza en tratamientos contra trastornos habituales en los seres
humanos. A veces, como se coment en el caso de los productos veterinarios, la funcin
del sulfametoxazol la puede desempear con plenas garantas otra sulfamida, en este
caso, la sulfadiacina (SDC). sta pertenece al grupo de sulfamidas sistmicas de accin
rpida y se utiliza de forma libre o como sal sdica. Se ha comprobado que es mucho ms
activa y mucho mejor tolerada que las otras sulfamidas. Alcanza concentraciones elevadas
en sangre y en el lquido cefalorraqudeo, por lo que est indicada para el tratamiento de la
encefalitis o meningitis causadas por microorganismos sensibles. Esta sulfamida, al igual
que SMX, se suele asociar con el trimetoprim en proporciones (5:1).en los preparados
farmacuticos.
Como en el caso de los animales, cuando se trata de combatir enfermedades de
tipo respiratorio, se pueden utilizar combinaciones de sulfamidas reforzadas con la
presencia de algn expectorante como la bromhexina (BRO), que restablece la
ventilacin pulmonar.
El Guayacol (GUA) tambin puede encontrarse como compuesto asociado a esta
combinacin por su funcin balsmica y expectorante.
El inters por resolver la mezcla compuesta por SMX, SDC, TMP, BRO y GUA
reside en que existen combinaciones de estos compuestos, fundamentalmente de tipo
Captulo IV 222
sulfamidatrimetoprim, que se aplican en la prctica mdica para el tratamiento de
enfermedades.
Asimismo, desde el punto de vista cuantitativo, es interesante comparar los
resultados encontrados en los productos farmacuticos con los de los productos
veterinarios, dado que ya ha quedado demostrado que en los productos veterinarios no
suelen coincidir las concentraciones etiquetadas con las encontradas.
La tcnica instrumental seleccionada para este trabajo fue la electroforesis
capilar.















H
2
N S NH
N
O
CH
3
O
O
SMX
N
N
H
2
N CH
2
OCH
3
OCH
3
OCH
3
TMP
N CH
2
CH
3
Br
Br H
2
N
BRO
SDC
H
2
N S NH
N
N
O
O
OH
OCH
3
GUA
Figura IV.1. Estructuras qumicas de los compuestos en estudio.

Captulo IV 223
La estabilidad de las disoluciones de SDC y el efecto del pH sobre su espectro de
absorcin ha sido ampliamente estudiado en nuestro laboratorio. A modo de resumen, se
citan brevemente algunos aspectos referentes a las disoluciones de SDC, tales como
estabilidad y clculo de pK
a
por mtodos espectrofotomtricos, ya realizados en nuestros
laboratorios.

VI.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfadiacina y guayacol

En primer lugar se estudi el comportamiento en disolucin de SDC, con objeto de
seleccionar las condiciones ptimas de operacin que sean comunes a las de TMP, las
cuales fueron estudiadas en el captulo anterior. As, se estudi la estabilidad de sus
disoluciones, y la influencia que ejerce el pH sobre los espectros de absorcin UV/VIS de
SDC.
1. Estabilidad de las disoluciones acuosas de sulfadiacina
Se estudi la estabilidad de las disoluciones concentradas (250 mg/L) de SDC
registrando espectros de absorcin UV/VIS a disoluciones diluidas preparadas diariamente
a partir de la concentrada.
As, se prepararon disoluciones concentradas de SDC en etanol-agua al 96%, en
etanol-agua al 50%, en agua desionizada y en NaOH 10
-5
M. A partir de ellas se
prepararon, primero cada media hora durante la tres primeras horas y posteriormente cada
da, disoluciones diluidas de 10 mg/L, registrndose inmediatamente despus de su
preparacin los espectros de absorcin frente a sus respectivos blancos entre 190 y 400
nm. Se pudo observar que cuando se utiliza un 96 50% de etanol el espectro inicial no es
estable ms de tres horas, mientras que para los dos casos restantes los espectros de
absorcin permanecen invariables durante al menos 10 das.
Captulo IV 224
Debido a que la SDC mostr una gran estabilidad en agua, se utiliz este medio para
preparar las disoluciones madres de la sulfamida.
2. Estabilidad de las disoluciones de guayacol
Se prepar una disolucin acuosa de GUA (100 mg/L) a la que se le estudi la
estabilidad, aprovechando las separaciones electroforticas que se iban efectuando da a
da. Las muestras, que se preparaban por dilucin directa a partir de la disolucin madre, se
inyectaban en el equipo de electroforesis capilar y, gracias al sistema de diodos en lnea, se
iban almacenando diariamente los espectros de absorcin UV-VIS correspondientes a
GUA. Se observ que durante un perodo de un mes, las disoluciones preparadas a partir
de la disolucin madre de GUA presentaban espectros de absorcin invariables.

IV.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorcin

El estudio fue realizado a temperatura ambiente, utilizando 500 ml de una
disolucin de 10 mg/L de SDC. Se ajust el valor del pH por adicin de pequeas
cantidades de disolucin de NaOH o HCl, de concentracin variable, sobre los 500 ml de
disolucin, de tal manera que el error por dilucin resultara despreciable.
A partir de los datos de absorcin frente al pH, obtenidos en el apartado anterior
se calcul la constante de ionizacin de la sulfadiacina, utilizando los mtodos
espectrofotomtricos de Stenstrom-Goldsmith (154) y de Wilson-Lester (155). Los
valores medios del pK
a
, obtenidos por estos mtodos, se muestran a continuacin en la
tabla IV.1. y se comparan con el encontrado en bibliografa (31).



Captulo IV 225
Tabla IV.I. Valores de pK
a
para SDC
Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografa
SDC 6.5 6.5 6.5

En el caso de GUA, se ha utilizado en esta Memoria la sal sdica de su derivado
sulfnico. Por lo tanto, incluso a valores muy bajos de pH estar desprotonado, es decir,
en su forma aninica. Anlogamente, BRO ha sido utilizada en su forma de clorhidrato,
por lo que, en disolucin cida estar en forma catinica y a medida que aumente el pH,
esa carga ir disminuyendo hasta que la molcula quede en su forma neutra.

IV.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES

IV.2.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones hidroalcohlicas de 100 mg/L de SMX y TMP
(50:50 etanol:agua) y de BRO (10:90 etanol:agua). Tambin se prepararon disoluciones
acuosas de 100 mg/L de SDC y GUA. A partir de stas, y por dilucin directa se
prepar, en un matraz de 25 mL, una disolucin que contena 20 mg/L de SMX, SDC,
TMP, BRO y GUA. Esta disolucin, que llamaremos Q se utiliz para optimizar
todos los parmetros qumicos e instrumentales que influyen en la separacin.
El equipo que se utiliz fue un Beckman MDQ, dotado con un detector de
diodos en lnea y controlado por ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un
capilar de slice fundida de 50 cm de longitud efectiva, 75 m de dimetro interno y 375
m de dimetro externo, con recubrimiento de poliamida. Para su refrigeracin por
Captulo IV 226
lquido el capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de deteccin de
100800 m.
Inicialmente se utiliz la electroforesis capilar en zona para separar los
compuestos en estudio. En esta modalidad, es posible separar cationes y aniones,
coincidiendo el tiempo de migracin de las molculas neutras con el del flujo
electroosmtico. De esta manera, la variable crtica en la separacin ser el pH, ya que
ste condicionar la ionizacin de las especies qumicas segn sea su pK
a
(figura IV.2).
Forma
cat inica
Forma
neut ra
Forma
aninica
4 5 6 7 8 9 10
pH
SMX
TMP
SDC
GUA
BRO

Figura IV.2. Esquema de la ionizacin de SMX, TMP, SDC, GUA y BRO en funcin del
pH

Para seleccionar un pH adecuado es necesario tener presente que BRO y TMP
no son solubles en disolucin acuosa a pH superior a 7. Adems, cuando se utiliz un
pH inferior a 5.5, regulado por tampn acetato, los picos de BRO y TMP solapaban
parcialmente, ya que presentan relaciones carga/masa similares. Este comportamiento
oblig a trabajar en un reducido intervalo de pH, entre 5.5 y 7.0. A valores de pH
cercanos a 6, los picos de BRO y TMP empiezan a separarse entre s. Sin embargo
Captulo IV 227
tambin se observ que a pH 6.5 el pico de BRO empezaba a perder intensidad, lo que
sugiere que empieza la precipitacin de este compuesto (figura IV.3).

a)
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de migracin (min)
-2
0
2
4
6
8
10
m
A
u
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA









b)
0 1 2 3 4 5 6
Tiempo de migracin (min)
-2
0
2
4
6
8
10
m
A
u
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA









Figura IV.3. Electroferogramas de una muestra tipo Q registrados a 214 nm.
Electrolito de separacin: tampn fosfato 15 mM de pH a) 6.0 y b) 6.5.
Captulo IV 228
Como conclusin, se decidi utilizar tampn fosfato para ajustar el pH del
electrolito de separacin a valores comprendidos en el intervalo citado. Segn se
observa en la Figura IV.2, entre pH 6 y 7 coexisten compuestos catinicos y aninicos
en la disolucin Q que pueden ser separados utilizando la electroforesis capilar en
zona.
Para estudiar la influencia de los diferentes parmetros, qumicos e
instrumentales en la separacin, se comenz trabajando con un electrolito compuesto
por tampn fosfato (pH 6.0) 15 mM, separando con un voltaje de 25 kV a 20 C y un
tiempo de inyeccin de 5 s a una presin de 0.5 psi.

IV.2.2. Optimizacion del pH del electrolito

Para optimizar este parmetro, se prepar una disolucin de tipo Q por
dilucin directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obtenindose
los correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato
de concentracin 15 mM pero ajustados a diferentes pH. Se mantuvo siempre una
presin de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyeccin de la muestra y se realiz
la deteccin simultnea a las longitudes de onda de mxima absorcin de cada uno de
los compuestos.
A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de
migracin para los distintos valores de pH.
En la tabla IV.2 y en la figura IV.4 se resumen los resultados obtenidos. En una
primera aproximacin se puede ver que el tiempo del FEO disminuye a medida que
aumenta el pH. Esto es debido a que cuanto mayor es el pH, mayor ser la ionizacin de
la pared del capilar y ms acusado ser el fenmeno de la electrosmosis.
Captulo IV 229

Tabla IV.2. Influencia del pH en los tiempos de migracin.
Tiempo de migracin (min) pH
FEO BRO TMP SDC SMX GUA
5.0 3.36 2.42 2.42 3.36 3.59 7.17
5.5 3.11 2.35 2.35 3.26 3.66 5.84
6.0 2.85 2.19 2.28 3.28 3.81 4.94
6.5 2.82 2.19 2.43 3.79 4.13 4.89



5.00 5.50 6.00 6.50
pH
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i

n

(
m
i
n
)
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA











Figura IV.4. Influencia del pH en los tiempos de migracin.


Captulo IV 230
Asimismo, se puede observar que TMP y BRO estn en su forma catinica en
todo el intervalo de pH estudiado, ya que su tiempo de migracin es inferior al del FEO.
Si se profundiza en el comportamiento electrofortico de estos dos compuestos, merece
la pena comentar que a valores de pH comprendidos entre 5 y 5.5, BRO y TMP solapan,
mientras que empiezan a separarse a partir de pH 6, estando, a su vez, sus tiempos de
migracin ms prximos al del FEO. Como sabemos, ambos compuestos tienen un pK
a

alrededor de 7, por lo que a partir de pH 6, su fraccin de carga ir desapareciendo, y
tenderan a converger con el FEO si siguiese aumentando el pH (figura IV.3).
Por otro lado, el tiempo de migracin de SDC coincide con el del FEO a pH 5 y
va aumentando, diferenciandose de ste a medida que aumenta el pH. Este
comportamiento tiene su explicacin en que, por debajo de su pK
a
, predomina la forma
neutra de SDC, por lo que su tiempo de migracin coincidir, en estas circunstancias,
con el del FEO. As, a medida que aumenta el pH, la molcula de SDC va adquiriendo
fraccin de carga negativa, por lo que, como especie aninica, su tiempo de migracin
ser superior al del FEO, como as ocurre.
En el caso de SMX, (pK
a
5.6), aunque a pH 5 predomine su forma neutra, ya
presenta cierta fraccin de carga negativa a este pH. Por esta razn su tiempo de
migracin es prximo al del FEO, pero superior, puesto que est comenzando a adquirir
cierta fraccin de carga negativa. Como se ve en la figura IV.4, al ir aumentando el pH,
el tiempo de migracin de SMX va aumentando porque la molcula va adquiriendo cada
vez mayor fraccin de carga
Finalmente, BRO, que est en forma de sulfonato, presenta carga negativa en
todo el intervalo estudiado, y su tiempo de migracin disminuye a medida que aumenta
el pH. El comportamiento electrofortico de esta molcula no viene, pues, determinado
Captulo IV 231
por su pK
a
, sino por el aumento de la velocidad del FEO cuando aumenta el pH, lo que
conlleva una disminucin en su tiempo de migracin.
As, a pH 6.5 se obtienen buenas resoluciones para todos los picos, sin embargo
el pico de BRO empieza a perder intensidad, por lo que, finalmente, se seleccion como
ptimo el pH 6.2 porque los picos aparecen bien resueltos, sin que BRO precipite.

IV.2.3. Influencia de la concentracin de tampn

Como sabemos, el efecto que produce sobre una separacin electrofortica la
variacin de la fuerza inica del medio no sigue una regla fija. Sin embargo, en la
mayora de los casos un aumento de la concentracin de tampn supone un aumento en
los tiempos de migracin, a la vez que se mejora la resolucin.
Para optimizar este parmetro se prepararon diferentes disoluciones de
electrolito de separacin, que contenan tampn fosfato de pH 6.2 en concentraciones
variables entre 10 y 30 mM. En todos los casos, las separaciones correspondientes se
realizaron a 25 kV y 20 C, con un tiempo de inyeccin de 5 s a una presin de 0.5 psi
sobre una muestra de tipo Q. Los resultados de este estudio se encuentran en la tabla
IV.3.
A lo largo de todo el intervalo de concentraciones estudiado se puede ver que la
variacin de la fuerza inica no ejerce una influencia crucial en lo que se refiere a la
resolucin de los picos de TMP y BRO.
Por ejemplo, en el caso de GUA, el tiempo de migracin aumenta notablemente
con la concentracin de tampn, mientras que en los casos de SDC y SMX, la influencia
es mucho menor. Esto puede explicarse en base a la mayor movilidad que presenta
GUA con respecto a SDC y SMX. Un aumento de fuerza inica produce una
Captulo IV 232
disminucin de la velocidad del FEO, ocasionando un efecto ms pronunciado sobre
aquellos compuestos aninicos que presentan mayores movilidades.

Tabla IV.3. Influencia de la concentracin del tampn borato. Tiempos en minutos y
anchuras medidas al 50 % de la altura de los picos.
Concentracin de Fosfato (mM)
10 15 20 30
FEO t
m
2.58 2.79 2.96 3.22
t
m
2.02 2.16 2.25 2.41 BRO
Ancho 0.025 0.027 0.025 0.028
t
m
2.13 2.27 2.40 2.59
R
s
2.308 2.597 3.365 3.709
TMP
Ancho 0.025 0.027 0.028 0.030
t
m
3.05 3.35 3.62 3.91
R
s
18.861 20.585 24.199 26.819
SDC
Ancho 0.031 0.034 0.035 0.037
t
m
3.47 3.87 4.26 4.47
R
s
8.848 11.208 13.731
SMX
Ancho 0.028 0.035 0.035 0.039
t
m
4.18 4.78 5.36 6.39
R
s
9.288 10.167 12.633 14.715
GUA
Ancho 0.058 0.070 0.071 0.093







Captulo IV 233
En lo que concierne al ancho de pico, medido al 50 % de la altura, se puede ver
que a medida que aumenta la concentracin de tampn en el electrolito de separacin,
los anchos de pico de todos los compuestos aumentan. Este aumento es mayor cuanto
mayor es el tiempo de migracin de los compuestos porque la difusin es mayor cuanto
mayor es el tiempo de migracin, lo que se traduce en un pico ms ancho. No obstante,
a pesar de este comportamiento, los picos obtenidos en todo el intervalo estudiado eran
simtricos y no llegaron a presentar desdoblamiento ni hombro alguno.
Finalmente, se consider como ptima una concentracin de tampn fosfato en
el electrolito de 15 mM por las siguientes razones:
1. Es una concentracin suficiente para mantener el pH fijado en 6.2
2. Las resoluciones de los picos de BRO y TMP mejoran ligeramente con
un aumento de la fuerza inica aunque tambin aumenta la corriente
generada.
3. En un corto tiempo de anlisis se pueden separar los cinco compuestos
estudiados.

IV.2.4. Seleccin del voltaje de separacin

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado
mayor ser la eficacia obtenida y ms cortos sern los tiempos de anlisis aunque ello
conlleva una disminucin de resolucin, debida a la mayor produccin de calor.
Inicialmente, se comprob mediante la representacin de la ley de Ohm, que
exista linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta los 15 kV, como se
puede ver en la figura IV.5.

Captulo IV 234


0.00 10.00 20.00 30.00
Potencial (kV)
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
C
o
r
r
i
e
n
t
e

(
m
i
c
r
o
a
m
p
e
r
i
o
s
)










Figura IV.5. Influencia del voltaje en la corriente obtenida.

Posteriormente, para optimizar el voltaje se llevaron a cabo separaciones de la
muestra Q bajo las condiciones establecidas anteriormente, aplicando diferentes
voltajes entre 15 y 30 kV aplicados en una rampa lineal de 0.4 minutos de duracin
(tabla IV.4 y figura IV.6)
Aunque un voltaje de 30 kV implica que no todo el calor generado es evacuado
del capilar, se obtienen buenas resoluciones en bajos tiempos de anlisis, por lo que se
seleccion este voltaje ptimo.



Captulo IV 235

Tabla IV.4. Influencia del voltaje en los tiempos de migracin
Tiempos de migracin (min)
Voltaje (kV) FEO BRO TMP SDC SMX GUA
15 6.49 4.93 5.22 8.13 9.65 12.52
20 4.71 3.60 3.80 5.83 6.86 8.81
25 3.69 2.82 2.98 4.55 5.32 6.86
30 2.97 2.27 2.41 3.63 4.24 5.45


15.00 20.00 25.00 30.00
Potencial (kV)
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
14.00
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i

n

(
m
i
n
)
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA











Figura IV.6. Influencia del voltaje aplicado en la separacin.



Captulo IV 236
IV.2.5. Efecto de la temperatura.

Como sabemos, la temperatura se relaciona con la viscosidad del medio
electrofortico. As, un aumento de la temperatura incrementa la velocidad de migracin
y por lo tanto disminuye el tiempo de anlisis aunque a veces es a expensas de perder
resolucin. El intervalo de trabajo suele ir de 20 a 50 C, aunque es habitual trabajar a
temperatura ambiente, pero lo ms importante es mantenerla constante.
Bajo las condiciones qumicas seleccionadas en apartados anteriores, se estudi
el efecto de la temperatura en la migracin de los compuestos. Para ello, se realizaron
separaciones a diferentes temperaturas en el intervalo comprendido entre 20 y 35 C. No
se consideraron temperaturas inferiores porque la regulacin de la temperatura con
nuestro equipo no es eficaz a ms de 4 C por debajo de la temperatura ambiente.
Como se observa en la tabla IV.5 y figura IV.7, a medida que la temperatura
disminuye, se produce un incremento en los tiempos de migracin de los compuestos.
Esto es consecuencia de una disminucin en la velocidad del flujo electroosmtico,
debida al aumento de viscosidad del electrolito.
Tambin puede verse que a 35 C la separacin se completa en menos de 6
minutos, sin embargo, la corriente generada es elevada, 75.4 A.
Por otro lado, aunque un aumento de la temperatura produce un aumento de la
resolucin entre TMP y BRO, se observa que la variacin de estos cambios no es
significativa. En lo que concierne al ancho de pico, se puede observar que un aumento
de la temperatura produce una disminucin de los anchos de pico en todos los casos.
Esto se debe a que, al aumentar la temperatura de separacin, la viscosidad del
electrolito de separacin disminuye y los tiempos de migracin se acortan, lo que reduce
la dispersin por difusin.
Captulo IV 237






Tabla IV.5. Influencia de la temperatura
Temperatura (C)
20 25 30 35
FEO t
m
3.339 2.983 2.701 2.496
t
m
2.53 2.27 2.05 1.89 BRO
Ancho 0.032 0.031 0.031 0.030
t
m
2.64 2.39 2.19 2.03
R
s
2.114 2.335 2.314 2.911
TMP
Ancho 0.034 0.033 0.032 0.028
t
m
3.99 3.60 3.26 3.03
R
s
20.052 18.652 17.486 18.990
SDC
Ancho 0.042 0.040 0.039 0.032
t
m
4.66 4.19 3.78 3.52
R
s
9.070 8.441 7.876 8.359
SMX
Ancho 0.038 0.035 0.035 0.032
t
m
6.03 5.38 4.85 4.47
R
s
11.405 10.711 10.134 9.970
GUA
Ancho 0.098 0.091 0.085 0.073





Captulo IV 238



20.00 25.00 30.00 35.00
Temperatura (C)
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i

n

(
m
i
n
)
FEO
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA











Figura IV.7. Influencia de la temperatura en los tiempos de migracin.

Finalmente se seleccion una temperatura de separacin de 25 C porque se
consigue una separacin rpida, con buena resolucin y una lnea base ms limpia, sin
perturbaciones.
Los parmetros qumicos e instrumentales que afectan a la separacin de los
compuestos en estudio, una vez estudiada su influencia y optimizado su valor se
encuentran resumidos en la tabla IV.6. Asimismo, en la figura IV.8 se muestra un
electroferograma, registrado a 235 nm de una muestra tipo Q utilizando el mtodo
optimizado. Como se puede observar, los cuatro compuestos pueden ser separados
perfectamente, con el mtodo propuesto, en un tiempo de 5 minutos.
Captulo IV 239

Tabla IV.6. Mtodo optimizado para la separacin
Capilar Slice fundida: 57 cm longitud 75 m dimetro interno
Electrolito Tampn fosfato 15 mM pH 6.2
Temperatura 25 C
Rampa de voltaje 30 kV (150 kV/min en 0.2 min)
Detector Barra de diodos en lnea
Ventana deteccin 800 100 m













0 1 2 3 4 5
Tiempo de migracin (min)
-2000
0
2000
4000
6000
8000
m
A
u
BRO
TMP
SDC
SMX
GUA
6

Figura IV.8. Electroferograma de una muestra tipo Q utilizando el mtodo
optimizado y registrado a 235 nm.

Captulo IV 240
IV.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

En este captulo se seleccion como seal analtica el rea de pico corregida,
medida a la longitud de onda de mxima absorcin de cada compuesto, es decir, 213,
205, 241, 262 y 204 nm para BRO, TMP, SDC, SMX y GUA, respectivamente.

IV.3.1. Lmites de deteccin y de cuantificacin

En este captulo se ha utilizado el mtodo que se expuso en el captulo I de esta
Memoria para calcular los el lmite de deteccin y de cuantificacin, tanto en
electroforesis capilar como en cromatografa lquida de alta resolucin. Como ya se
indic anteriormente, el citado mtodo se basa en la fluctuacin de la lnea base.
As, se obtuvieron los lmites de deteccin y cuantificacin que constan en la
tabla IV.7. stos son aceptables, teniendo presente la absortividad de los compuestos a
las longitudes de onda de medida y estn en consonancia con los obtenidos para esta
familia de compuestos en otros trabajos encontrados en bibliografa (ver introduccin).


Tabla IV.7. Lmite de deteccin (LOD) y lmite de cuantificacin (LOQ) en mg/L.
BRO TMP SDC SMX GUA
LOD 0.3 0.1 0.3 0.2 0.2
LOQ 1.1 0.4 1.0 0.6 0.7



Captulo IV 241
IV.3.2. Linealidad de la respuesta

El estudio de la linealidad se realiz inyectando muestras preparadas a partir de
las disoluciones madre por dilucin directa en un intervalo de concentraciones entre 1 y
25 mg/L.
En todos los casos, las separaciones se realizaron utilizando el mtodo
optimizado. Las rectas de calibrado fueron obtenidas representando la concentracin
frente al rea corregida, medida a la longitud de onda de mxima absorcin para cada
componente.
Se obtuvo una buena linealidad entre concentracin y rea corregida para cada
uno de los compuestos estudiados. En la tabla IV.8 se muestran las ecuaciones,
coeficientes de determinacin e intervalos de linealidad. En todos los casos, la ordenada
en el origen fue considerada despreciable, segn el intervalo de confianza calculado
para un nivel de significacin de 0.05. La representacin de las rectas se halla en la
figura IV.9.

Tabla IV.8. Ecuaciones de las rectas de calibrado obtenidas e intervalos de linealidad.
Ecuacin R
2
Intervalo lineal (mg/L)
BRO A = -109 (43) + 202.0 (3.3) C (mg/L) 0.9987 1.2 24
TMP A = -2 (18) + 549 (13) C (mg/L) 0.9970 1.2 24
SDC A = 20 (69) + 188.3 (5.1) C (mg/L) 0.9964 1.2 25
SMX A = -14 (60) + 181.7 (4.3) C(mg/L) 0.9972 1.3 26
GUA A = 4 (15) + 387 (12) C(mg/L) 0.9954 1.1 23


Captulo IV 242

a)
0 10 20 3
Concentracin (mg/L)
0
1000
2000
3000
4000
5000

r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a
SDC
SMX
0 10 20 3
Concentracin (mg/L)
0
5000
10000
15000

r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a
BRO
TMP
GUA
0
0










b)










Figura IV.9. Rectas de calibrado de a) BRO, TMP y GUA y b) SDC y SMX

Captulo IV 243
IV.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del mtodo descrito
anteriormente se prepar una muestra que contena una concentracin de 12 mg/L de
cada componente y se hicieron doce replicados consecutivos en las condiciones
qumicas e instrumentales seleccionadas como ptimas.
Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes das, se prepararon dos muestras
igual que la anteriormente citada y se hicieron dos series de doce separaciones cada una
en das consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviacin estndar
relativa superior al 3.5 %.
Se compararon las varianzas de las series segn el test estadstico F de Snedecor
para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque se trata de dilucidar si las
variaciones entre las series de diferentes das son significativamente diferentes. As, se
encontr que no existan diferencias significativas entre las series para un intervalo de
confianza del 95 %.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentaje de desviacin estndar relativa (% DER) se muestran en la tabla IV.9.
Tabla IV.9. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo.
Serie 1 Serie 2
x S % DER x S % DER S
1
2
/S
2
2
F
(0.05)

BRO 3151 103 3.3 3101 108 3.5 1.084 3.717
TMP 8624 232 2.7 8744 306 3.5 1.739 3.717
SDC 3094 97 3.1 3171 88 2.8 1.203 3.717
SMX 3187 105 3.3 3070 82 2.7 1.625 3.717
GUA 6183 201 3.2 6225 182 2.9 1.227 3.717
Captulo IV 244
IV.4. APLICACIONES

El mtodo propuesto se utiliz para la determinacin de los compuestos
estudiados en seis preparados comerciales ampliamente utilizados en la prctica mdica.
Los medicamentos analizados se comercializan, bien en comprimidos, bien en
cpsulas. Independientemente de este hecho, los anlisis siempre se llevaron a cabo
tomando diez unidades del medicamento. Las cpsulas se vaciaron cuidadosamente y se
pesaron, tomando luego el peso equivalente a una unidad para los posteriores anlisis.
En el caso de los comprimidos, se pesaron las diez unidades y se pulverizaron
mecnicamente en el mortero. Posteriormente se pes la cantidad equivalente a una
unidad para continuar los anlisis.
La cantidad equivalente a una cpsula o comprimido se disolvi en 400 mL de
agua desionizada y posteriormente se aadieron 500 mL de etanol. Tras unos minutos
de agitacin mecnica, esta disolucin se transfiri a un matraz aforado de 1000 mL y
finalmente se diluy hasta la marca con agua desionizada (Disolucin X). Este
tratamiento se esquematiza en la figura IV.10.


Figura IV.10. Esquema del tratamiento de las muestras

Captulo IV 245
Para la determinacin de las mezclas binarias de SMX y TMP y SDC y TMP, se
tomaron tres alcuotas de 1 mL de la disolucin X, se llevaron a tres matraces de 25
mL y, finalmente, se diluy hasta la marca con agua desionizada.
Para la determinacin de BRO no fue necesario diluir la disolucin X sino que
la determinacin se hizo inyectando directamente esta disolucin.
A partir de los electroferogramas registrados y basndonos en el uso de patrones
de mezclas de SDC, SMX, TMP, BRO y GUA, disueltas tambin en el mismo medio
hidroalcohlico, se obtuvieron los porcentajes de recuperacin para cada preparado
comercial en funcin del rea corregida.
El mtodo seguido a la hora de cuantificar cada uno de los compuestos en los
preparados comerciales se bas en las inyecciones sucesivas de patrones y muestras,
segn la secuencia:

PATRN 1 MUESTRA 1 PATRN 2 MUESTRA 2 PATRN 1

En la tabla IV.10 se muestran los resultados obtenidos, que se expresan como
concentraciones encontradas y porcentaje de recuperacin para cada uno de los
compuestos con respecto a las concentraciones indicadas en las etiquetas de los
productos y corresponden a la media de tres determinaciones.






Captulo IV 246

Tabla IV.10. Concentraciones encontradas (mg/L) y recuperaciones (%) obtenidas en
productos comerciales.
Producto y etiquetado Encontrado Recuperacin
BRONGENIT SMX
TMP
400
80
404.0 9.3
81.6 1.9
101.0
102.1
TRIGLOBE SDC
TMP
820
180
811 17
178.8 8.6
99.3
98.9
BALSOPRIM SMX
TMP
BRO
400
80
5
386.9 8.2
78.3 2.6
4.91 0.19
97.7
97.9
98.2
PULMOSTERN SMX
TMP
BRO
400
80
5
394.9 3.5
79.9 1.4
5.148 0.043
98.7
99.9
102.9
EDUPRIM SMX
TMP
400
80
390 10
78.1 2.5
97.6
97.6
SEPTRN SMX
TMP
400
80
410 14
81.5 2.5
102.5
101.9





Captulo IV 247
Como puede observarse, las recuperaciones son satisfactorias en todos los casos
y estn de acuerdo con lo esperado segn las etiquetas de los distintos productos
farmacuticos analizados. En este sentido es de destacar que los productos
farmacuticos basados en la accin de la mezcla SMXTMP presentan recuperaciones
prximas al 100 % mientras que los productos veterinarios basados en la accin de la
misma combinacin presentan recuperaciones muy lejanas del 100 %, como se vio en el
captulo III.



























CAPTULO V

DETERMINACIN DE LOS PRINCIPALES PRODUCTOS DE
DEGRADACIN DE SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM
EN PRODUCTOS FARMACUTICOS
POR CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR

Captulo V 251
V.1. INTRODUCCIN

En los captulos III y IV de esta Memoria se han propuesto sendos mtodos de
separacin para la combinacin SMXTMP en productos zoosanitarios y farmacuticos,
utilizando cromatografa lquida de alta resolucin y electroforesis capilar,
respectivamente.
Sin embargo es posible la aparicin de subproductos que tengan su origen en los
principios activos presentes en productos farmacuticos y/o zoosanitarios y que se
hayan generado en el seno de ese producto, segn se explica en el captulo de
introduccin de esta Memoria.
En este captulo abordamos como problema analtico la determinacin de los
principales productos de degradacin que podran generarse en frmacos que contienen
una de las combinaciones ms ampliamente utilizadas de sulfamida y potenciador, como
es la combinacin entre sulfametoxazol y trimetoprim. Los principales productos de
degradacin de sulfametoxazol son sulfanilamida (SAM) y cido sulfanlico (ASU)
mientras que el de trimetoprim es el cido 3,4,5-trimetoxibenzoico (ATMB).









Captulo V 252




H
2
N S NH
O
O
N
O
CH
3
N
N
H
2
N CH
2
OCH
3
OCH
3
OCH
3
SO
2
NH
2
H
2
N
H
2
N S
3
-
H
+
COOH
H
3
CO
OCH
3
OCH
3
SMX
TMP
ASU
SAM
ATMB
O


Figura V.1. Estructuras qumicas de los compuestos en estudio.



Captulo V 253
V.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES

V.2.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones hidroalcolhlicas de 100 mg/L de SMX, SAM,
ATMB y TMP (50:50 etanol:agua) y una disolucin acuosa de ASU de la misma
concentracin. A partir de stas, y por dilucin directa, se prepar, en un matraz de 25
mL, una disolucin que contena 20 mg/L de SMX, TMP, SAM, ASU y ATBM, que
llamaremos E para optimizar los parmetros qumicos e instrumentales que influyen
en la separacin.
El equipo que se utiliz fue un Beckman MDQ, dotado con un detector de
diodos en lnea y controlado por ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un
capilar de slice fundida de 50 cm de longitud efectiva, 75 m de dimetro interno y 375
m de dimetro externo, con recubrimiento de poliamida. Para su refrigeracin por
lquido, el capilar estaba alojado en una carcasa con una ventana de deteccin de 100
800 m.
Dado que en la separacin que se plantea en este captulo intervienen molculas
que ya han sido separadas por electroforesis capilar en zona, (SMX y TMP) en el
captulo IV, se decidi realizar una primera separacin mediante esta tcnica, gracias a
la cual es posible separar simultneamente cationes y aniones, mientras que las
molculas neutras eluirn junto con el flujo electroosmtico.
Para establecer unas condiciones iniciales de separacin, se tuvieron en cuenta
los valores de pK
a
de cada uno de los compuestos, as como sus ionizaciones
respectivas, que se encuentran en la tabla V.1 y en la figura V.2, respectivamente.

Captulo V 254



Tabla V.1. Valores de pK
a
para SMX, TMP, ASU, SAM y ATBM
SMX TMP ASU SAM ATMB
pK
a
5.6 7.2 3.2 2.4; 10.4 4.7




zwitterion
forma
catinica
forma
neutra
forma
aninica
1 3 5 7 9 11 13
SMX
SAM
ASU
TMP
ATMB
pH

Figura V.2. Esquema de la ionizacin de SMX, TMP, ASU, SAM y ATMB





Captulo V 255
Como se ve en la figura V.2, a priori, no existe ningn valor de pH donde no se
encuentre algn compuesto en su forma neutra, lo cual indica la necesidad de utilizar la
modalidad de cromatografa electrocintica micelar.
Para confirmar este comportamiento experimentalmente, se realiz una
separacin utilizando el mismo electrolito que se utiliz en el captulo IV, es decir,
tampn fosfato de pH 6.2 de concentracin 15 mM. Se inyect una muestra tipo E en
modo hidrodinmico aplicando una presin de 0.5 psi durante un tiempo de 5s. La
separacin se llev a cabo a 30 kV y 25 C y el electroferograma correspondiente a esta
primera separacin es el que se muestra en la figura V.3.

0 2 4 6 8 10
Tiempo de migracin (min)
0
5
10
15
20
25
m
A
u
TMP
SMX
ATMB
ASU
FEO


Figura V.3. Electroferograma correspondiente a la separacin de un muestra tipo E
utilizando fosfato de pH 6.2 (15 mM) como electrolito de separacin


Captulo V 256
Segn muestra el electroferograma, el tiempo de migracin del TMP es inferior
al del FEO, mientras que los tiempos de migracin de SMX, ATMB y ASU son
superiores al del FEO. Por su parte, se comprob que el tiempo de migracin de SAM
coincida con el del FEO. Esto confirma que, a pH 6.2, el TMP est en forma de catin,
que SMX, ATMB y ASU estn en forma aninica y que SAM est en su forma neutra.
El TMP se protona por debajo de su pK
a
, que es 7.2. Esto hace que aparezca una
carga positiva en esta molcula a pH 6.2, por lo que su tiempo de migracin es menor
que el del FEO.
El ASU y el ATMB tienen en sus estructuras dos grupos cidos orgnicos, uno
sulfnico y otro carboxlico, respectivamente. stos se desprotonan a valores de pH
superiores a sus pK
a
, que para ASU es 3.2 y para ATMB es 4.7. Esta desprotonacin
implica que estos compuestos estn en forma aninica cuando trabajamos a este pH, por
lo que sus tiempos de migracin son superiores al del FEO.
En el caso de SMX, la desprotonacin del nitrgeno en posicin 4 se produce a
pH superiores a 5.6, por lo que a pH 6.2, esta molcula presentar carga negativa y su
tiempo de migracin ser superior al del FEO.
Por su parte, el segundo pK
a
de SAM es 10.4, que corresponde a la
desprotonacin de la agrupacin sulfamdica que presenta la molcula. Por esta razn
no presenta carga a pH 6.2 y su tiempo de migracin coincide con el del FEO.
Como se puede ver, las conclusiones que se sacaron a partir del esquema de
ionizacin de los compuestos en estudio quedan plenamente avaladas por los resultados
experimentales. Consecuentemente, fue necesario trabajar en la modalidad de
cromatografa micelar electrocintica para poder separar todos los compuestos en
estudio.

Captulo V 257
V.2.2. Optimizacin del pH del electrolito

Sabiendo de la necesidad de trabajar en medio micelar, sea cual sea el pH del
electrolito de separacin, se plante cul sera el pH ptimo para realizar esta
separacin. Como agente micelar se seleccion el SDS por las mismas razones que se
explicaron en el captulo I de esta Memoria e, inicialmente, se emple en una
concentracin de 40 mM.
Atendiendo a la figura V.2, aparecen dos zonas de pH en las cuales, solamente
existe una especie en su forma neutra, que ser la que interaccione con las micelas del
medio. Entre pH 6 y 7, la nica especie neutra que habr ser SAM. Por otra parte, a
partir de pH 10.5, la nica especie que se encontrar en forma neutra ser TMP. A
cualquier otro valor de pH, siempre tendremos, al menos, dos especies en su forma
neutra. Esto indica la conveniencia de estudiar qu ocurre en estos intervalos de pH.
Para ello se prepar una disolucin de tipo E por dilucin directa de las
disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obtenindose los correspondientes
electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato de concentracin 10
mM ajustados a pH 6.5, 11.4 y 12.6 y 40 mM de SDS. Se mantuvo siempre una presin
de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyeccin de la muestra y se realiz la
separacin a 25 C, aplicando una diferencia de potencial de 20 kV .
Se observ que, a pH 6.5, la concentracin de 40 mM SDS no era suficiente para
que SAM, que es el compuesto que se encuentra en su forma neutra a este pH, se
separara del flujo electrosmtico. Asimismo, cuando se realiz la separacin a pH 11.4
se observ un comportamiento anlogo para TMP, que es el compuesto que se
encuentra en su forma neutra a este pH. Sin embargo, cuando la separacin se realiz a
pH 12.6, el TMP se separ del FEO, pudindose finalmente llevar a cabo la separacin
Captulo V 258
de todos los compuestos estudiados. El electroferograma resultante se muestra en la
figura V.4. En l se puede ver que todos los compuestos en estudio se separaron en un
tiempo de 12 minutos. Aunque el pico de TMP presenta un hombro, ste se puede
eliminar en posteriores etapas de la optimizacin del mtodo. As, se decidi seguir
trabajando con tampn fosfato de pH 12.6 en posteriores separaciones.

0 2 4 6 8 10 12
Tiempo de migracin (min)
14
-5
0
5
10
15
20
25
m
A
u
SMX
ATMB
SAM
ASU
TMP
FEO


Figura V.4. Electroferograma correspondiente a la separacin de un muestra tipo E.
Electrolito de separacin: tampn fosfato de pH 12.6 (8 mM) y 40 mM de SDS.






Captulo V 259
V.2.3. Influencia de la concentracin de SDS

Para optimizar este parmetro se prepar una disolucin de tipo E por dilucin
directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obtenindose los
correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato 10
mM de pH 12.6 pero con cantidades variables de SDS. Se mantuvo siempre una presin
de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyeccin de la muestra y se realiz la
separacin a 25 C, aplicando una diferencia de potencial de 25 kV .
A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de
migracin para los distintos valores de concentracin de SDS.
A la vista de los resultados (tabla V.2 y figura V.5) se puede observar que el
nico componente cuyo tiempo de migracin se ve afectado por la presencia de micelas
es TMP, que no presenta carga a este pH, por lo que, a medida que la concentracin de
SDS aumenta, tambin lo hace el tiempo de migracin del TMP.
As, se seleccion como ptima una concentracin de SDS 20 mM porque
proporcionaba una separacin con buenas resoluciones y un tiempo de anlisis de 7
minutos.
Sin embargo tambin se observa que el pico de TMP presenta un hombro en
estas condiciones (figura V.6). Este comportamiento debe atribuirse a que este
compuesto no es suficientemente soluble en el electrolito. Para salvar esta dificultad, se
puede adicionar algn modificador orgnico al electrolito de separacin que favorezca
la disolucin de TMP en ste.



Captulo V 260
Tabla V.2. Influencia de la concentracin de SDS en la separacin
SDS (mM) Tiempos de migracin (min)
FEO SMX ATMB SAM ASU TMP
10 3.41 5.28 5.36 5.80 6.77 5.02
20 3.49 5.35 5.44 5.88 6.89 6.70
30 3.43 5.13 5.21 5.61 6.52 7.26
40 3.49 5.24 5.32 5.73 6.68 8.14
50 3.62 5.49 5.56 5.99 7.03 9.23
60 3.65 5.47 5.55 6.00 7.03 9.72


10 20 30 40 50 60
Concentracin de SDS (mM)
2
4
6
8
10
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
n

(
m
i
n
)
FEO
SMX
ATMB
SAM
ASU
TMP

Figura V.5. Influencia de la concentracin de SDS.



Captulo V 261





0 2 4 6 8
Tiempo de migracin (min)
0
10
20
m
A
u
SMX
ATMB
SAM
TMP
ASU
FEO


Figura V.6. Electroferograma correspondiente a la separacin de un muestra tipo E.
Electrolito de separacin tampn fosfato de pH 12.6 (10 mM) y 20 mM de SDS.






Captulo V 262
V.2.4. Influencia de la concentracin de modificador orgnico

Ya se ha comentado anteriormente que el efecto de la adicin de un modificador
orgnico al electrolito no sigue una regla fija, por lo que no se puede predecir fcilmente
el tipo de modificador a utilizar ni tampoco su concentracin. En este caso, se utilizaron
como modificadores orgnicos acetonitrilo, metanol y etanol.
Cualitativamente, se observ que cuando se realizaban las separaciones en
presencia de acetonitrilo, se conseguan picos ms simtricos, mientras que en presencia
de metanol y etanol, los picos del TMP aparecan desdoblados o presentaban hombros.
Por esta razn, el acetonitrilo fue seleccionado como modificador orgnico ptimo para
posteriores separaciones.
Para estudiar la influencia de la presencia y concentracin del acetonitrilo, se
realizaron separaciones de una muestra de tipo E, obtenindose los correspondientes
electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato 10 mM de pH 12.6 y
SDS 20 mM, adicionando cantidades de modificador orgnico de tal manera que las
concentraciones finales de ste fueran 1, 2.5, 5 y 15 %. Se mantuvo siempre una presin
de 0.5 psi y un tiempo de 5 segundos en la inyeccin de la muestra. Se realizaron las
separaciones a 25 C, aplicando una diferencia de potencial de 25 kV .
Como resultado se obtuvo que la adicin de diferentes concentraciones de
acetonitrilo afectaba a la forma del pico del TMP, que se mostraba sin hombros ni
desdoblamientos. En lo referente a los tiempos de migracin, se puede apreciar que
todos los compuestos salvo TMP, experimentan un incremento en sus tiempos de
migracin cuando se aumenta la cantidad de acetonitrilo debido al aumento de
viscosidad del electrolito de separacin. En el caso de TMP, se observa que, para una
concentracin de acetonitrilo del 2.5 %, su tiempo de migracin disminuye y se produce
Captulo V 263
un cambio en la selectividad de la separacin. Este comportamiento es debido a que el
TMP se vuelve ms soluble en el electrolito cuanto mayor es la cantidad de disolvente
orgnico que se encuentra en l, por lo tanto, menor afinidad muestra por la fase
micelar.
Desafortunadamente, para esta concentracin de acetonitrilo no se consiguieron
resoluciones aceptables. Como consecuencia, y teniendo en cuenta la resolucin, el
tiempo de anlisis y la forma del pico de TMP, se seleccion como ptima una
concentracin de acetonitrilo de 5 % para posteriores separaciones (figura V.7).



0.00 2.00 4.00 6.00 8.00
Tiempo de migracin (min)
0.00
10.00
20.00
m
A
u
TMP
SMX
ATMB
SAM
ASU
FEO

Figura V.7. Electroferograma correspondiente a la separacin de un muestra tipo E.
Electrolito de separacin: tampn fosfato de pH 12.6 (10 mM), 20 mM de SDS y5 % de
acetonitrilo

Captulo V 264
V.2.5. Influencia de la concentracin del tampn

Para optimizar este parmetro se prepar una disolucin de tipo E por dilucin
directa de las disoluciones madre. Se realizaron las separaciones, obtenindose los
correspondientes electroferogramas con electrolitos constituidos por tampn fosfato de
pH 12.6 de concentraciones variables (entre 5 y 30 mM) y 20 mM de SDS, en presencia
de un 5 % de acetonitrilo. Se mantuvo siempre una presin de 0.5 psi y un tiempo de 5
segundos en la inyeccin de la muestra y se realiz la deteccin simultnea a las
longitudes de onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos. Las
separaciones se llevaron a cabo a 25 kV y 25 C.
A partir de los electroferogramas obtenidos se midieron los tiempos de
migracin, las resoluciones y los anchos de pico medidos al 50 % de altura, para los
distintos valores de concentracin de tampn (tabla V.3).
En lo concerniente a los tiempos de migracin y a las resoluciones, stos
aumentan con la concentracin del tampn en todos los casos.
Por el contrario los anchos de pico aumentan significativamente, tambin en
todos los casos, a partir de una concentracin de 10 mM, lo cual es debido a que cuanto
mayor es la concentracin del tampn, mayor ser la corriente generada y mayor ser el
calor generado por efecto Joule. Esto tiene como consecuencia un ensanchamiento de
los picos. En el caso del TMP, este efecto es tan acusado para una concentracin de 30
mM de tampn que su pico correspondiente aparece como una perturbacin de la lnea
base. Por esta razn no figura en la tabla su ancho de pico ni la resolucin de SMX con
respecto a TMP.
La ligera disminucin que se registra en los anchos de pico de SMX y ATMB
hasta 10 mM se debe a que en esas concentraciones de tampn predomina el efecto de
Captulo V 265
compresin de pico, que se produce en la zona de muestra cuando la fuerza inica en
sta es menor que la que existe en el electrolito. Sin embargo, a partir de esta
concentracin empieza a predominar el calentamiento por efecto Joule, que produce los
efectos anteriormente comentados, por lo que los anchos de pico empiezan a aumentar.
Como conclusin, se decidi seleccionar 10 mM como concentracin ptima de
tampn porque el pico de TMP es ms estrecho y adems porque se consigue una buena
resolucin entre SMX y ATMB, mantenindose la corriente a 80 A.

Tabla V.3. Influencia de la concentracin del tampn fosfato. Tiempos en minutos y
anchos medidos al 50 % de la altura de los picos.
Concentracin de Fosfato (mM)
5 10 20 30
FEO t
m
3.404 3.750 4.342 4.697
t
m
4.904 5.535 6.718 7.578 TMP
Ancho 0.107 0.098 0.143 -
t
m
5.108 5.914 7.579 8.925
R
s
1.722 3.582 6.164 12.913
SMX
Ancho 0.039 0.032 0.040 0.050
t
m
5.165 5.995 7.709 9.133
R
s
0.411 1.339 1.870 2.739
ATMB
Ancho 0.031 0.030 0.040 0.050
t
m
5.299 6.453 8.799 10.933
R
s
2.360 7.638 13.351 17.263
SAM
Ancho 0.032 0.035 0.052 0.070
t
m
6.263 7.653 10.892 >12
R
s
15.243 17.074 20.254 -
ASU
Ancho 0.037 0.042 0.067 -


Captulo V 266
V.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separacin

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado,
mayor ser la eficacia obtenida y ms cortos sern los tiempos de anlisis aunque ello
puede conllevar una disminucin de la resolucin, debida a la mayor produccin de
calor.
Para optimizar el voltaje, se llevaron a cabo separaciones de la muestra E
utilizando como electrolito de separacin una disolucin que contena tampn fosfato
10 mM de pH 12.6, SDS de concentracin 20 mM y 5 % (v:v) de acetonitrilo. Todos los
electroferogramas se registraron a 25 C, pero aplicando diferentes voltajes,
comprendidos en el intervalo de 5 y 30 kV en una rampa lineal de 0.4 minutos de
duracin. La representacin grfica de la Ley de Ohm prob que exista linealidad entre
voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la figura V.8.
0 5 10 15 20 25 30
Voltaje (kV)
0.00
25.00
50.00
75.00
100.00
C
o
r
r
i
e
n
t
e

(
m
i
c
r
o
A
m
p
e
r
i
o
s
)


Figura V.8. Influencia del voltaje en la corriente obtenida.
Captulo V 267
Por otra parte, para optimizar el voltaje de separacin se llevaron a cabo
separaciones de una muestra que tipo E, utilizando el electrolito de separacin
optimizado previamente y aplicando diferentes voltajes entre 15 y 30 kV.

Tabla V.4. Influencia del voltaje aplicado en los tiempos de migracin
Voltaje (kV) Tiempos de migracin (min)
FEO TMP SMX ATMB SAM ASU
15 6.619 10.21 10.55 10.67 11.55 13.90
20 4.940 7.52 7.92 8.02 8.76 10.46
25 3.911 5.88 6.23 6.31 6.86 8.19
30 3.075 4.15 4.90 4.96 5.37 6.44

15 20 25 30
Voltaje (kV)
0
3
6
9
12
15
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
o
n

(
m
i
n
)
FEO
SMX
ATMB
SAM
ASU
TMP


Figura V.9. Influencia del voltaje aplicado en la separacin

Captulo V 268
Observando los datos de la tabla V.4 y la figura V.9 se puede ver que un
aumento del potencial de separacin acorta los tiempos de migracin en todos los casos,
como era de esperar. Merece la pena comentar que, cuando se realiza la separacin a 20
kV, el tiempo de anlisis es superior en 5 minutos al que se obtiene con 25 kV, pero la
resolucin es similar en ambos casos. Anlogamente, cuando se realiza la separacin a
30 kV el tiempo de anlisis es menor pero, por el contrario, la resolucin disminuye y la
corriente generada aumenta demasiado.
Como conclusin, se seleccion 25 kV como voltaje ptimo porque se consigue
un tiempo de anlisis razonable y adems la resolucin entre los picos de SMX y
ATMB es mxima. La corriente generada bajo estas condiciones es de 80 A.

V.2.7. Influencia de la temperatura en la separacin

Bajo las condiciones qumicas seleccionadas en apartados anteriores, se estudi
el efecto de la temperatura en los tiempos de migracin, as como en las resoluciones y
anchos de pico de los compuestos. Para ello, se realizaron separaciones a diferentes
temperaturas en el intervalo comprendido entre 20 y 35 C.
Como se observa en la tabla V.5, a medida que la temperatura aumenta, se
produce una disminucin en los tiempos de migracin de los compuestos como
consecuencia de un aumento en el flujo elctroosmtico, producido por la disminucin
de viscosidad del electrolito. Por supuesto, esto se traduce una disminucin en las
resoluciones. Por otra parte, la temperatura tambin tiene influencia sobre la constante
de reparto entre compuestos y micelas. As, un aumento de temperatura hace que
disminuyan las interacciones entre el compuesto, en este caso TMP, y la micela. Esto
tendra como efecto un aumento en el tiempo de migracin de TMP, sin embargo se
Captulo V 269
observa lo contrario porque predomina el efecto de la disminucin de la viscosidad del
electrolito a medida que aumenta la temperatura de separacin.
A bajas temperaturas, la viscosidad del electrolito de separacin aumenta y los
tiempos de migracin, tambin. Como consecuencia, los picos sern ms anchos,
llegando a solapar parcialmente en algunos casos, como ocurre entre SMX y TMP a una
temperatura de 20 C.


Tabla V.5. Influencia de la temperatura
Temperatura (C)
20 25 30 35
FEO t
m
4.285 3.785 3.323 3.060
t
m
6.581 5.583 4.665 4.133 TMP
Ancho - 0.080 0.114 -
t
m
6.677 5.952 5.075 4.656
R
s
- 3.979 3.426 0.244
SMX
Ancho - 0.036 0.029 0.027
t
m
6.754 6.025 5.131 4.710
R
s
1.243 1.187 1.168 1.148
ATMB
Ancho 0.033 0.032 0.026 0.024
t
m
7.367 6.490 5.412 4.919
R
s
9.278 7.236 5.616 4.382
SAM
Ancho 0.041 0.039 0.030 0.028
t
m
8.648 7.681 6.381 5.808
R
s
16.593 15.981 15.515 15.216
ASU
Ancho 0.046 0.045 0.035 0.033



Captulo V 270
Por otra parte, cuando se realiza la separacin a 35 C se obtiene el menor
tiempo de anlisis, alrededor de 6 minutos, sin embargo la corriente generada es la
mayor (87.1 A).
Finalmente, se seleccion una temperatura de 25 C como ptima porque se
consigue una separacin rpida, con buena resolucin y una lnea base sin
perturbaciones.

V.2.8. Efecto del disolvente de la muestra

Se estudi cmo afecta el disolvente en que se encuentre la muestra sobre la
resolucin y sobre la forma del pico de TMP. Teniendo en cuenta que estas muestras se
preparan por dilucin de las madres, en todos los casos contendrn 10 % de etanol. Se
prepararon tres tipos de muestra:
1. Muestra preparada por dilucin directa de las disoluciones madre.
2. Muestra preparada por dilucin directa de las disoluciones madre, aadiendo
una cantidad de electrolito de separacin de manera que su concentracin
final fuese 10 % (v:v).

En el caso de la muestra disuelta en el electrolito de separacin, se observ que
el pico de TMP es ms estrecho que en el otro caso. Este comportamiento puede
explicarse debido a que cuando se disuelve la muestra en electrolito de separacin,
debido probablemente a que la fuerza inica en la zona de muestra aumenta, la difusin
del compuesto en la zona de muestra ser menor y como consecuencia, el pico
correspondiente aparecer menos ancho.
Captulo V 271
Por otra parte, no se apreciaron diferencias significativas entre las resoluciones
de ATMB con respecto a SMX cuando se disolvi la muestra en uno u otro disolvente.
Por esta razn, se decidi que las muestras se preparasen por dilucin de las
disoluciones madre y adicionando una cantidad de electrolito de separacin tal que su
concentracin final fuera del 10 % (v:v).


Los parmetros qumicos e instrumentales que afectan a la separacin de los
compuestos en estudio, una vez analizada su influencia y optimizado su valor, se
encuentran resumidos en la tabla V.6. Asimismo, en la figura V.10. se muestra un
electroferograma de una muestra de 24 mg/L de SMX, 4.8 mg/L de TMP, 5.6 mg/L de
ATMB, 7.9 mg/L de SAM y 6.4 mg/L de ASU utilizando el mtodo optimizado y
registrado a 214 nm.


Tabla V.6. Mtodo optimizado para la separacin
Capilar Slice fundida: 57 cm longitud 75 m de dimetro interno
Electrolito Tampn fosfato 15 mM pH 12.6; SDS 20 mM; 5 % CH
3
CN
Rampa de voltaje 25 kV (62.5 kV/min en 0.4 min)
Temperatura 25 C
Detector Barra de diodos en lnea
Ventana de deteccin 800 100 m



Captulo V 272
0 2 4 6 8
Tiempo de migracin (min)
10
0
10
20
m
A
u
TMP
ATMB
SMX
SAM
ASU

Figura V.10. Electroferograma de una muestra que contena 24 mg/L de SMX, 4.8
mg/L de TMP, 5.6 mg/L de ATMB, 7.9 mg/L de SAM y 6.4 mg/L de ASU utilizando el
mtodo optimizado y registrado a 214 nnm.
6.4 6.6 6.8
Tiempo de migracin (min)
0
10
20
m
A
u
ATMB
SMX

Figura V.11. Detalle de la resolucin entre cido 3,4,5-trimetoxibenzoico y
sulfametoxazol

Captulo V 273
V.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS

Para el anlisis cualitativo del problema analtico del que nos ocupamos en este
captulo, hemos realizado las separaciones en medio acuoso, es decir, simplemente
disolviendo nuestros compuestos en agua. Hemos trabajado con disoluciones de 20
mg/L en medio acuoso, es decir con concentraciones de sulfamida y potenciador hasta
20 veces menores que las que existen en los productos farmacuticos. Si realizramos
las separaciones en muestras reales a estas concentraciones, la matriz tambin quedara
diluida por igual y su influencia no sera apreciable. Sin embargo, por la propia
naturaleza de los compuestos con los que trabajamos, stos siempre aparecern en el
seno de un producto comercial, es decir, en el seno de una matriz.
Por esta razn se han abordado los aspectos cuantitativos concernientes a la
determinacin de los productos de degradacin de sulfametoxazol y trimetoprim en
productos farmacuticos realizando las correspondientes separaciones en la matriz en la
que estn presentes.
En este captulo, se ha abordado como problema analtico la determinacin de
los productos de degradacin en una concentracin del 1 % con respecto a los productos
principales y en presencia de stos. Sin embargo, para la determinacin de los productos
principales, es decir, SMX y TMP, se propone el mtodo de electroforesis capilar en
zona descrito en el captulo IV de esta Memoria.





Captulo V 274
V.3.1. Lmites de deteccin y de cuantificacin

El problema analtico que nos ocupa presenta la peculiaridad de que no todos los
componentes de la mezcla estn en proporciones parecidas en el seno de la muestra real,
sino todo lo contrario. Esto significa que hay que determinar unos compuestos, los
productos de degradacin, en concentraciones muy pequeas, en presencia de otros, los
principios activos, cuyas concentraciones son mucho mayores.
En este sentido, se realizaron experiencias para ver si se podan determinar los
productos de degradacin en una concentracin equivalente al 1 % de la de los
principios activos. Esta experiencia se realiz disolviendo una tableta de uno de los
productos farmacuticos (Septrn) en medio hidroalcohlico (50:50, v:v) y
adicionando cantidades de SAM y ASU equivalentes a un 1 % de la concentracin de
SMX y de ATMB equivalente a un 1 % de la concentracin de TMP. Finalmente se
llev esta disolucin a un volumen final de 1 L. Se realiz la separacin de esta
disolucin bajo el procedimiento optimizado y se registr el electroferograma
correspondiente, que se muestra en la figura V.14.
En el electroferograma se observa que los productos de degradacin del
sulfametoxazol (cido sulfanlico y sulfanilamida) se encuentran suficientemente
resueltos para su determinacin, tanto cualitativa como cuantitativa, mientras que el
producto de degradacin del TMP, el ATMB queda parcialmente solapado por el pico
del SMX, cuya concentracin es 500 veces mayor, por lo que el ATMB se puede
detectar, pero es muy difcil su cuantificacin. Para la determinacin cuantitativa de
ATBM, en la actualidad se est desarrollando en nuestro laboratorio un mtodo basado
en las condiciones en las que se obtuvo el electroferograma de la figura V.3, aunque an
no se tiene optimizado.
Captulo V 275

0 2 4 6 8
Tiempo de migracin (min)
10
-5
0
5
10
15
20
m
A
u
TMP
SMX
SAM
ASU


Figura V.14. Electroferograma de una disolucin de una tableta de Septrn en 1L de
disolucin hidroalcohlica al 50 % (v:v) en presencia de un 1 % de los productos de
degradacin de SMX y TMP


As, utilizando las condiciones antes descritas, se obtuvieron los lmites de
deteccin y de cuantificacin. En este captulo se ha utilizado el mtodo que se ha
expuesto en captulos anteriores de esta Memoria y los resultados se encuentran en la
tabla V.7.

Tabla V.7. Lmites de deteccin (LOD) y de cuantificacin (LOQ) en mg/L
SAM ASU
LOD 0.6 1.26
LOQ 2.0 4.2

Captulo V 276
V.3.2. Linealidad de la respuesta

El estudio de la linealidad se realiz preparando muestras de concentraciones
crecientes de ASU y SAM en presencia y ausencia de la matriz del medicamento donde
se encuentran. Es decir, para la obtencin de la recta de calibrado en la matriz del
medicamento, se disolvi una tableta de uno de los productos farmacuticos en medio
hidroalcohlico (50:50, v:v) y se llev a 1 L en un matraz aforado (disolucin X). Se
transfirieron 20 mL de esta disolucin a un matraz aforado de 25 mL y se adicionaron
cantidades variables de las disoluciones madre de SAM y ASU de manera que su
concentraciones finales estuvieran entre 3 y 12 mg/L. Finalmente se llev a enrase con
agua desionizada.
Para la obtencin de la recta de calibrado en ausencia de la matriz del
medicamento, se pusieron en un matraz aforado 10 mL de etanol, 10 mL de agua
desionizada y cantidades variables de las disoluciones madre de SAM y ASU de manera
que su concentraciones finales estuvieran entre 3 y 12 mg/L. Finalmente se llev a
enrase con agua desionizada.
En todos los casos, las separaciones se efectuaron utilizando el mtodo
optimizado. Las rectas de calibrado fueron obtenidas representando la concentracin
frente al rea corregida, medida a la longitud de onda de mxima absorcin para cada
compuesto, es decir, 254 y 251 nm para SAM y ASU, respectivamente.
Se obtuvo una buena linealidad entre concentracin y rea corregida para cada
uno de los compuestos estudiados. En las tablas V.8 y V.9, se muestran las ecuaciones,
coeficientes de determinacin e intervalos de linealidad. En todos los casos, la ordenada
en el origen fue considerada despreciable segn el intervalo de confianza obtenido para
un nivel de significacin de 0.05.
Captulo V 277
Para estudiar el posible efecto de la interferencia de la matriz, se llevaron a cabo
dos calibrados, uno en presencia de la matriz y otro en su ausencia. Puesto que las
pendientes obtenidas son estimaciones de la pendiente verdadera se aplic un test
estadstico, descrito pormenorizadamente en el apartado de la introduccin dedicado a
los mtodos estadsticos, para decidir si las pendientes diferan o no de una manera
significativa y evaluar as la interferencia de la matriz. De esta forma, se han comparado
las pendientes de las rectas de regresin obtenidas en presencia de la matriz con la
pendiente del calibrado preparado en ausencia de la misma.

Tabla V.8. Rectas de calibrado obtenidas en presencia de la matriz
Ecuacin r
2
Intervalo lineal (mg/L)
ASU A= 1.1 ( 1.4) 10
2
+ 109 ( 17) C (mg/L) 0.9973 3.2 13
SAM A= 0.3 ( 2.2) 10
2
+ 159 ( 21) C (mg/L) 0.9982 3.9 16


Tabla V.9. Rectas de calibrado obtenidas en ausencia de la matriz
Ecuacin r
2
Intervalo lineal (mg/L)
ASU A= -0.5 ( 1.9) 10
2
+ 114 ( 22)C (mg/L) 0.9960 3.2 13
SAM A= -0.8 ( 2.6) 10
2
+ 154 ( 24)C (mg/L) 0.9974 3.9 16

En la tabla V.10, se resumen los resultados obtenidos en el estudio estadstico
aplicado, que se describi con detalle en el apartado dedicado al anlisis estadstico
elemental, en la introduccin de esta Memoria.

Captulo V 278
Tabla V.10. Comparacin de las rectas de ASU y SAM
Varianzas de los residuales Pendientes
ASU F
experimental
= 1.336 F
tabulado
= 19.00 t
experimental
= 0.737 t
tabulado
= 2.78
SAM F
experimental
= 52.7 F
tabulado
= 19.00 t
experimental
= 1.046 t
calculado
= 4.303


Observando la comparacin entre los valores de t, se ve que no existen
diferencias significativas entre las pendientes de las rectas en presencia y en ausencia de
la matriz. De todo ello se deduce que se podra realizar la cuantificacin en ausencia de
la matriz, es decir, a partir del calibrado preparado con las muestras sintticas.


V.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del mtodo descrito
anteriormente se prepar una muestra que contena una concentracin de 3.93 mg/L de
SAM y 3.32 mg/L de ASU en disolucin hidroalcohlica (50:50, v:v) por dilucin
directa de las disoluciones madre y se hicieron doce replicados consecutivos en las
condiciones qumicas e instrumentales seleccionadas como ptimas.
Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes das, se prepar una muestra
igual que la anteriormente citada y se hicieron dos series de once separaciones cada una
en das consecutivos. En ninguna de las dos series se obtuvo una desviacin estndar
relativa superior al 3.5 %.
Se compararon las varianzas de las series segn el test estadstico F de Snedecor
para pruebas de dos colas, que se aplica en este caso porque se trata de dilucidar si las
Captulo V 279
variaciones entre las series de diferentes das son significativamente diferentes. As, se
encontr que no existan diferencias significativas entre las series para un intervalo de
confianza del 95 %.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentajes de desviacin estndar relativa ( %DER) se muestran en la tabla V.11.

Tabla V.11. Repetibilidad y reproducibilidad en las reas corregidas en medio
hidroalcohlico (50:50, v:v)
Serie 1 Serie 2 F
exp
F
tab

x S %DER x S %DER
SAM 745 24 3.3 660 19 2.9 1.67 3.717
ASU 460 12 2.7 418 14 3.4 1.26 3.717

Tambin se estudi si la repetibilidad de las medidas variaba en presencia de la
matriz. Para ello se sigui un procedimiento similar al del caso anterior. Se prepararon
sendas muestras que contenan 3.93 mg/L de SAM y 3.32 mg/L de ASU por dilucin
directa de las disoluciones madre en sendos matraces aforados de 25 mL. Uno de ellos
contena 20 mL de disolucin X y el otro contena 20 mL de disolucin
hidroalcohlica (50:50 v,v). Despus de llevar a enrase con agua desionizada, se
hicieron once replicados consecutivos de cada muestra en las condiciones qumicas e
instrumentales seleccionadas como ptimas.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentajes de desviacin estndar relativa ( %DER) se muestran en la tabla V.12.


Captulo V 280
Tabla V.12. Repetibilidad en etanol:agua y en presencia de la matriz.
Etanol:agua Matriz F
exp
F
tab

x S %DER x S %DER
SAM 745 24 3.3 727 24 3.3 1.0 3.717
ASU 460 12 2.7 575 19 3.2 2.2 3.717

Como se desprende de los datos de esta tabla, las repetibilidades entre series
fueron comparables y nunca superiores al 3.3 %. Adems, la comparacin de las
varianzas por medio del estadstico F de Snedecor para un nivel de confianza del 95 %
revel que no existan diferencias significativas entre las dos series.
Al finalizar este estudio podemos concluir que se puede realizar la
determinacin cuantitativa de los compuestos de degradacin del sulfametoxazol (cido
sulfanlico y sulfanilamida) sin necesidad de trabajar en presencia de la matriz.

V.4. APLICACIONES

La determinacin cuantitativa de ASU y SAM se realiz en muestras sintticas
porque, segn se ha comprobado con anterioridad, la matriz no afecta ni a la linealidad
ni a la precisin de la determinacin. Las concentraciones relativas ensayadas fueron
desde la 1:1 hasta la 4:1 (ASU:SAM) y viceversa. De esta manera, las muestras cuya
concentracin de ASU permaneci fija se prepararon en matraces aforados de 25 mL,
que contenan lo siguiente:
- 3.12 mg/L de ASU
- Concentraciones variables de SAM
- 2.5 mL de electrolito de separacin
Captulo V 281
Anlogamente se prepararon las disoluciones correspondientes a las muestras
sintticas cuya concentracin de SAM permaneca constante. Las proporciones relativas
entre los productos de degradacin, ASU y SAM, se seleccionaron teniendo en cuenta
que la formacin de uno de ellos pudiera estar ms favorecida que la del otro,
dependiendo de las condiciones en que se haya producido la aparicin de estos
compuestos.
La disolucin que actuaban como patrn se prepar de manera similar a las
muestras. La concentracin del patrn era 6.27 mg/L de SAM y 6.25 mg/L de ASU.
Una vez preparadas todas las disoluciones, se procedi a la efectuar la secuencia
de separacin:

PATRN M
1
PATRN M
2
PATRN M
3
PATRN M
4
PATRN

Se realizaron todas las separaciones segn el mtodo analtico optimizado y
siguiendo la secuencia descrita anteriormente.
Lgicamente, para la determinacin de ASU y SAM en muestras sintticas con
concentracin fija de SAM y variable de ASU se trabaj de manera anloga.
Los resultados de las determinaciones figuran en la tabla V.13 y en ella se puede
ver claramente que las recuperaciones fueron prximas al 100 % en todos los casos.






Captulo V 282

Tabla V.13. Concentraciones encontradas y recuperaciones de ASU y SAM.
SAM:ASU Concentracin (mg/L) Recuperacin (%)
SAM ASU SAM ASU
1:1 3.436 3.124 97.8 101.2
2:1 6.872 3.124 97.9 96.9
3:1 10.308 3.124 100.9 99.1
4:1 13.744 3.124 103.4 97.2
1:2 3.436 6.248 103.0 104.5
1:3 3.436 9.372 102.5 103.1
1:4 3.436 12.496 99.0 100.1



























CAPTULO VI

DETERMINACIN DE LOS PRINCIPALES METABOLITOS DE
DEGRADACIN DE SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM
EN SUERO HUMANO POR CROMATOGRAFA
ELECTROCINTICA MICELAR

Captulo VI 285
VI.1. INTRODUCCIN

Parte importante en la investigacin analtica de las sulfamidas es la referente a su
determinacin en fluidos biolgicos. Una vez que son ingeridas, tanto las propias
sulfamidas como sus potenciadores sufren reacciones metablicas dentro del organismo.
Estas reacciones originan unos derivados, los metabolitos, que pueden ser detectados en
sangre, orina, leche, carne y otros tejidos animales.
En esta Memoria, el estudio y la determinacin de las sulfamidas y sus metabolitos
se concret en la combinacin SMX-TMP, que es una de las ms utilizadas en la industria
farmacutica y veterinaria.
Los principales metabolitos del TMP son el Trimetoprim-1-xido (TMP
1
) y el
Trimetoprim-3-xido (TMP
3
), mientras que el principal metabolito de SMX es el N
4
-Acetil-
sulfametoxazol (NAC), y proceden, respectivamente, de la oxidacin y acetilacin de los
productos principales en las posiciones indicadas.
Tanto la optimizacin del mtodo de separacin como la determinacin de estos
compuestos se realiz en suero humano, previa desproteinizacin del mismo con
acetonitrilo.






Captulo VI 286
VI.2. PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA

VI.2.1. Obtencin del suero

La sangre utilizada fue extrada de personas sanas, en ayunas, y posteriormente
centrifugada a 582 g. El suero obtenido de esta manera se deposit en tubos de plstico con
fondo cnico de 2 mL de volumen, provistos de una tapa. Seguidamente se guardaron los
tubos de plstico a -18 C para su conservacin.

VI.2.2. Desproteinizacin del suero

Segn consta en el apartado dedicado a bibliografa, uno de los tratamientos ms
extendidos para el tratamiento previo del suero consiste en precipitar las protenas que ste
contiene mediante adicin de acetonitrilo. Por esta razn se decidi establecer un mtodo
de tratamiento previo del suero a utilizar, basado en su desproteinizacin con acetonitrilo,
que reuniera las siguientes caractersticas:
1. La precipitacin de las protenas del suero ha de ser cuantitativa.
2. Los compuesto de nuestro inters, es decir, SMX, TMP y sus metabolitos no deben
coprecipitar.
3. El sobrenadante o extracto debe evaporarse hasta sequedad. En esta etapa, el control
de la temperatura es crtico, porque hay que evaporar todo el sobrenadante (fraccin
lquida de acetonitrilo) sin llegar a afectar a los compuestos de nuestro inters.
4. Todo el residuo seco debe disolverse en un volumen conocido, bien de agua
desionizada, de disolucin hidroalcohlica o de electrolito de separacin.
Captulo VI 287
Con el fin de evaluar la conveniencia del tratamiento previo, se prepararon dos
disoluciones de 100 mg/L de SMX y TMP en las condiciones que se detallan en el apartado
de Material y disoluciones de esta Memoria.
El pretratamiento siempre se llev a cabo por duplicado. A una de las muestras de
suero, se le adicionaban 100 L de las disoluciones madre de SMX y TMP antes de iniciar
el pretratamiento y a la otra se le adicionaban estas cantidades una vez evaporado el
extracto, de manera que se pudiera evaluar si haba ocurrido algn fenmeno de
coprecipitacin y/o degradacin por calefaccin de las muestras.
Tras efectuar el pretratamiento, se inyectaban las disoluciones resultantes en el
equipo de electroforesis capilar y se obtuvieron los electroferogramas en las condiciones
establecidas para la separacin de SMX y TMP en el captulo IV. El equipo que se utiliz
fue un Beckman MDQ, dotado con un detector de diodos en lnea, y controlado por
ordenador. Las separaciones se llevaron a cabo en un capilar de slice fundida de 50 cm de
longitud efectiva, 75 m de dimetro interno, y 375 m de dimetro externo, con
recubrimiento de poliamida. Para su refrigeracin por lquido, el capilar estaba alojado en
una carcasa con una ventana de deteccin de 100 800 m.
Posteriormente, se evalu si haba habido prdida de analito por precipitacin y/o
degradacin comparando las reas de los compuestos en los dos casos. Tras numerosos
ensayos, se tom como ptimo el siguiente proceso de pretratamiento del suero:




Captulo VI 288
1. Se toman 500 L de suero con una micropipeta, una vez descongelado, y se ponen
en un tubo de centrfuga de 5 mL.
2. Se aade 1 mL de acetonitrilo.
3. Se centrifuga a 582 g durante 10 minutos y posteriormente se separa el
sobrenadante con una pipeta Pasteur.
4. En el mismo tubo de centrfuga, al precipitado se le aaden 500 L de acetonitrilo y
se agitan con una varilla de vidrio fina hasta la generacin de una suspensin.
5. Se centrifuga nuevamente en las mismas condiciones, se separa el sobrenadante y
ste se une con el obtenido en la etapa 3.
6. Se toman 800 L del sobrenadante y se evaporan a 80 C en una estufa hasta llevar
a sequedad.
7. Se disuelve el residuo obtenido en 400 L de agua y 100 L de electrolito de
separacin.
8. De esta ltima disolucin, se toman 200 L para realizar la separacin.

Con este procedimiento se consigue evitar la coprecipitacin y tambin controlar la
temperatura de evaporacin para evitar, en ambos casos, la prdida de analito.






Captulo VI 289
VI.3. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES

VI.3.1. Estudios preliminares

Se prepararon disoluciones madres de 100 mg/L de SMX y TMP y de 200 mg/L de
TMP
1
, TMP
3
y NAC en etanol-agua (50:50). Se adicionaron 100 L de las disoluciones de
SMX y TMP y 50 L de las disoluciones de TMP
1
, TMP
3
y NAC a 500 L de suero. Esta
disolucin se someti a pretratamiento. El residuo obtenido tras evaporar a 80 C se
disolvi en una disolucin que contena 400 L de agua desionizada y 100 L del
electrolito de separacin que se fuera a utilizar en cada momento. Con un simple clculo, se
puede ver que la concentracin de todos los compuestos de esta disolucin resultante, que
llamaremos S, era 20 mg/L, de la cual se tomaron alcuotas de 200 L para optimizar
todos los parmetros, qumicos e instrumentales, que influyen en la separacin.
Inicialmente se estudi la posibilidad de realizar la separacin por CZE. Teniendo
en cuenta los pK
a
de los componentes de la mezcla (Tabla VI.1), y asumiendo que los
metabolitos de SMX y TMP presentaran pK
a
parecidos a los de stos, solamente era
posible efectuar estas experiencias en las proximidades de pH 6.5, que es donde,
presumiblemente, podemos tener SMX y NAC en su forma aninica y TMP, TMP
1
y TMP
3

en su forma catinica, segn el esquema de ionizacin de estos compuestos, propuesto en la
figura VI.1.



Captulo VI 290
Tabla VI.1. Valores de pK
a
para SMX y TMP.
Stenstrom y Goldsmith Wilson y Lester Bibliografa
SMX 6.0 5.9 5.6
TMP 7.1 7.1 7.2


forma
catinica
forma
neutra
forma
aninica
1 3 5 7 9 11 13
SMX
TMP
pH

Figura VI.1. Esquema de ionizacin de SMX y TMP

As, se llev a cabo una separacin de una muestra tipo S utilizando como
electrolito de separacin tampn fosfato de pH 6.5 de concentracin 20 mM. Se inyect la
muestra en modo hidrodinmico aplicando una presin de 0.5 psi durante 5 segundos. La
separacin se realiz a 25 kV y 20 C. El electroferograma correspondiente se muestra en la
figura VI.2.
Captulo VI 291
0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
Tiempo de migracin (min)
0
5
10
15
m
A
u
TMP
FEO+TMP1 + TMP3
SMX
NAC


Figura VI.2. Electroferograma de una muestra tipo Sregistrado a 214 nm.
Electrolito de separacin: tampn fosfato 20 mM de pH 6.5

En este electroferograma se observa que SMX y NAC presentan tiempos de
migracin superiores al del FEO, lo cual indica que son aniones a este pH, segn se indic,
a priori, a partir del esquema de ionizacin de SMX y suponiendo una ionizacin similar
para su derivado acetilado.
Igualmente, se comprueba que TMP est en forma catinica a este pH, segn indica
dicho esquema.
Desafortunadamente, no fue posible separar los metabolitos del TMP, TMP
1
y
TMP
3
, entre s, sino que ambos presentaban un mismo tiempo de migracin, el cual,
adems coincida con el del FEO al pH estudiado. Este comportamiento se debe a que los
Captulo VI 292
mencionados compuestos no estn ionizados, sino en su forma neutra a pH 6.5. Esto
significa que la modificacin en su estructura molecular es suficiente para cambiar las
caractersticas cido-base del TMP.
Debido a la imposibilidad de realizar esta separacin por CZE, se decidi utilizar la
modalidad de MEKC y, en este caso, tambin se utiliz SDS como agente micelar por ser el
que ms comnmente se utiliza en MECK para la separacin de este tipo de compuestos.

VI.3.2. Influencia del pH en la separacin

A la vista de los resultados anteriores y teniendo en cuenta la ionizacin de los
diferentes compuestos, se observ que se necesitaba un pH suficientemente bsico, por una
parte para que SMX y NAC adquierieran carga negativa y por otra parte para que las
micelas presentaran una migracin neta hacia el ctodo que permitiera obtener un tiempo
de anlisis razonable. Por esta razn, el estudio de la optimizacin del pH en el electrolito
de separacin se realiz por encima de pH 7.0, utilizando tampn fosfato o borato segn el
pH al que se deseara fijar el electrolito.
As, para optimizar este parmetro, se realizaron separaciones de la muestra S,
utilizando como electrolito de separacin diferentes disoluciones reguladoras de
concentracin 20 mM ajustadas a valores de pH de 7.0, 8.0 (fosfato), 9.3 y 10.0 (borato) y
SDS de concentracin 20 mM. Estas separaciones se llevaron a cabo aplicando un potencial
de 25 kV y a manteniendo una temperatura de 20 C.
Finalmente, se seleccion como ptimo un pH de 9.3, proporcionado por disolucin
reguladora de borato. Como se ve en el electroferograma de la figura VI.3, todos los picos
correspondientes a los analiltos aparecen perfectamente separados entre s y tambin con
Captulo VI 293
respecto a los compuestos que se encuentran en la matriz y que no han podido ser
eliminados mediante el tratamiento previo de las muestras de suero.


0.00 4.00 8.00 12.00
Tiempo de migracin (min)
0.00
5.00
10.00
15.00
m
A
u
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP
FEO


Figura VI.3. Electroferograma de una muestra tipo Sregistrado a 214 nm.
Electrolito de separacin: tampn borato 20 mM de pH 9.3 y 20 mM de SDS






Captulo VI 294
VI.3.3. Influencia de la concentracin del tampn

Ya se ha comentado con anterioridad que, aunque en la gran mayora de los casos
un aumento de la concentracin de tampn supone un aumento en los tiempos de
migracin, mejorando la resolucin y evitando, en algunos casos, distorsiones en los picos
del electroferograma debido a efectos de electrodispersin, tambin tiene el inconveniente
de ocasionar altas intensidades de corriente que recorren el capilar generando mucho calor
por efecto Joule, provocando el ensanchamiento de los picos y prdida de resolucin.
As, para optimizar este parmetro, se realizaron separaciones de la muestra S,
utilizando como electrolito de separacin disoluciones que contenan 20 mM de SDS y
tampn borato de pH 9.3 de concentraciones entre 10 y 40 mM. Estas separaciones se
llevaron a cabo aplicando un potencial de 25 kV y manteniendo una temperatura de 20 C.
En general, se cumple que a mayor concentracin de tampn en el electrolito de
separacin, mayores son los tiempos de migracin de todos los compuestos (tabla VI.2).
Sin embargo, este aumento es ms acusado en los casos de SMX y NAC que en los de
TMP, TMP
1
y TMP
3
. Este hecho se puede apreciar claramente en la figura VI.4, donde se
puede ver que un aumento de la fuerza inica de la disolucin hace que los picos de SMX y
TMP
3
vayan aproximndose hasta solapar cuando la concentracin es 30 mM. A
concentraciones mayores, se llega a producir una variacin de la selectividad de la
separacin.
Aunque la resolucin entre TMP
3
y SMX no es buena en ningn punto del intervalo
estudiado, esta dificultad puede salvarse variando la concentracin de SDS porque, como
sabemos, SMX presenta carga negativa al pH de trabajo mientras que TMP
3
se encuentra
en su forma neutra. Este hecho propiciar la interaccin de TMP
3
con las micelas,
Captulo VI 295
aumentando su tiempo de migracin a medida que aumente la concentracin de SDS,
mientras que SMX no presentar afinidad por la fase micelar, por lo que su tiempo de
migracin no se ver afectado por interacciones con las micelas.

Tabla VI.2. Influencia de la concentracin del tampn borato. Tiempos en minutos y
anchuras medidas al 50 % de la altura de los picos.
Concentracin de Borato (mM)
10 20 30 40
FEO t
m
3.74 4.28 4.78 5.17
t
m
4.87 5.70 6.46 7.15 TMP
1

Ancho 0.042 0.053 0.059 0.124
t
m
5.20 6.40 7.48 8.56
R
s
4.070 8.163 11.532 10.897
NAC
Ancho 0.061 0.045 0.042 0.047
t
m
5.51 6.89 8.06 9.46
R
s
3.561 6.387 2.269 2.111
SMX
Ancho 0.051 0.039 - 0.052
t
m
5.78 6.96 8.15 9.18
R
s
3.000 0.787 0.323 4.721
TMP
3

Ancho 0.049 0.075 - 0.106
t
m
8.12 10.09 12.12 14.46
R
s
24.395 17.297 18.001 19.877
TMP
Ancho - 0.131 0.189 0.235


Captulo VI 296
10 20 30 40
Concentracin de borato (mM)
2
4
6
8
10
12
14
16
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
o
n

(
m
i
n
)
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP


Figura VI.4. Influencia de la concentracin de borato en la separacin.

En cuanto a los anchos de pico, se pueden observar dos tendencias. Por una parte,
en los casos de TMP, TMP
1
y TMP
3
se observa que cuanto mayor es la fuerza inica del
electrolito, sus anchos de pico tambin son mayores porque aumenta el tiempo de
migracin debido a que disminuye la movilidad. Por otra parte, en los casos de SMX y
NAC, se observa que sus anchos de pico disminuyen al aumentar la fuerza inica hasta 30
mM y que aumentan para concentraciones mayores. Este comportamiento se debe a que en
la primera fase, es decir, hasta concentraciones de 30 mM, predomina el efecto de
compresin de pico, producido porque la fuerza inica en la zona de muestra es mucho
menor que en el electrolito de separacin.
Captulo VI 297
En consecuencia, y a la vista de los resultados, se consider como ptima una
concentracin de tampn borato en el electrolito de 20 mM porque esta concentracin es
suficiente para fijar el pH y porque la corriente generada no es tan elevada como para
producir distorsiones significativas en los picos, debidas a la dispersin por efecto Joule.
Por otra parte, aunque la resolucin entre TMP
3
y SMX no es buena, se puede mejorar
sensiblemente variando la concentracin de SDS.

VI.3.4. Influencia de la concentracin de SDS

Ya se ha explicado en esta Memoria que la modalidad de cromatografa
electrocintica micelar se basa en la presencia en el electrolito de separacin de un
surfactante que tenga la capacidad de formar agregados micelares, como el dodecilsulfato
de sodio.
Cuando hay agregados micelares en el medio electrofortico, las molculas neutras
pueden interaccionar con las micelas, cuya parte exterior tiene carga negativa, de tal
manera que stas migrarn en el campo elctrico como un compuesto aninico ms, pero
llevando en su seno el analito en su forma neutra.
Se realizaron separaciones de una muestra S, utilizando como electrolito de
separacin una disolucin compuesta por tampn borato de pH 9.3 y de concentracin 20
mM, en el que la concentracin de SDS se fue variando desde 10 hasta 50 mM. Las
separaciones se realizaron aplicando un potencial de 25 kV y manteniendo una temperatura
de 20 C.
La influencia de la concentracin de SDS en el electrolito de separacin sobre el
tiempo de migracin se muestra en la figura VI.5. Los resultados muestran que un aumento
Captulo VI 298
en la concentracin de SDS produce un ligero aumento de los tiempos de migracin de
NAC y SMX. Como sabemos, a este pH, estos compuestos presentan carga negativa, al
igual que las micelas, producindose repulsiones electrostticas que evitan la interaccin
entre ambos. Por lo tanto ese ligero aumento no se debe a la interaccin con las micelas,
sino al aumento de fuerza inica del electrolito de separacin que conlleva la adicin de
cantidades crecientes de SDS. Por el contrario, la concentracin de SDS ejerce una
influencia notable sobre los tiempos de migracin de TMP
1
, TMP
3
y TMP, ya que estos
compuestos estn en su forma neutra al pH de la separacin, por lo que interaccionan con
las micelas del medio. Esto se constata al observar que a medida que aumenta la
concentracin de SDS los tiempos de migracin de TMP
1
, TMP
3
y TMP aumentan
notablemente. Mientras que, a bajas concentraciones de SDS, los tiempos de migracin de
TMP
1
, TMP
3
y TMP son bajos, a medida que se aumenta la concentracin de SDS
aumentan las interacciones de estos compuestos con los agregados micelares, produciendo
un claro efecto de diferenciacin de sus tiempos de migracin.
Este efecto es especialmente notable en el caso de TMP entre 10 y 20 mM de SDS,
ya que es en este intervalo donde ms aguda es la diferenciacin de su tiempo de migracin
con respecto a los de sus metabolitos.
En vista de los resultados de este estudio y para posteriores experiencias, se
seleccion como ptima una concentracin de 25 mM de SDS en el electrolito, porque en
estas condiciones se consiguen picos estrechos, bien resueltos y en un tiempo de anlisis
aceptable.



Captulo VI 299

Tabla VI.3. Variacin de los tiempos de migracin con la concentracin de SDS
SDS (mM) Tiempo de migracin (min)
FEO TMP
1
NAC SMX TMP
3
TMP
10 4.275 4.275 6.469 7.000 4.275 4.275
20 4.400 5.912 6.660 7.18 7.260 10.750
25 4.435 6.348 6.695 7.209 7.952 11.691
30 4.504 6.760 6.760 7.286 8.609 12.499
40 4.600 7.572 6.913 7.438 9.796 14.005
50 4.734 8.546 7.163 7.710 11.257 16.152

10 20 30 40 50
Concentracin de SDS (mM)
0
5
10
15
20
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
n

(
m
i
n
)
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP

Figura VI.5. Influencia de la concentracin de SDS en los tiempos de migracin.


Captulo VI 300
VI.3.5. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separacin

Como ya se ha expuesto anteriormente, cuanto mayor sea el voltaje aplicado
mayores eficacias se obtienen y ms cortos tiempos de anlisis aunque ello conlleva una
disminucin de resolucin, debida a la mayor produccin de calor.
En este sentido, la representacin grfica de la Ley de Ohm prob que exista
linealidad entre voltaje aplicado y corriente generada hasta 15 kV, como se puede ver en la
figura VI.6.


0 10 20
Voltaje (kV)
30
0
20
40
60
80
100
C
o
r
r
i
e
n
t
e

(
m
i
c
r
o
A
m
p
e
r
i
o
s
)


Figura VI.6. Influencia del voltaje en la corriente obtenida

Captulo VI 301
De igual manera, la aplicacin del voltaje requiere hacerlo de manera gradual, es
decir, aplicar una rampa de voltaje. Se sabe que hay una relacin directa entre voltaje
aplicado y calor generado. Aplicando una rampa de voltaje progresiva y adecuada se puede
evitar un calentamiento brusco del capilar, de manera que se evite un calentamiento
instantneo de la zona de muestra que provoque su dilatacin y, como consecuencia, la
prdida de la misma.
Para optimizar el voltaje, se llevaron a cabo separaciones de la muestra S
utilizando como electrolito de separacin una disolucin que contena tampn borato 20
mM de pH 9.3 y SDS de concentracin 25 mM. Todos los electroferogramas se registraron
a 20 C, pero aplicando diferentes voltajes, comprendidos en el intervalo de 15 a 30 kV,
todos ellos en una rampa de 0.2 minutos.
Como se esperaba, se observ que los tiempos de migracin de todos los
compuestos disminuan a medida que aumentaba el potencial de separacin (tabla VI.4), lo
cual redujo notablemente el tiempo de anlisis sin que por ello, las resoluciones de los
compuestos variaran de manera significativa (figura VI.7). Por estas razones, se seleccion
como ptimo un voltaje de 30 kV para efectuar la separacin. Por otro lado, aunque en la
representacin de la corriente generada frente al voltaje, se puede ver claramente que el
efecto Joule empieza a ser importante a partir de 20 kV, se comprob que, a 30 kV, la
dispersin producida por este fenmeno no afectaba a las resoluciones, aunque s a la forma
de los picos y, especialmente en el caso de TMP, que se estrecha considerablemente a
medida que aumenta el voltaje aplicado, por ser el de mayor tiempo de migracin.
En cuanto a la rampa de potencial, se mantuvo la inicialmente ensayada, de 0.2
minutos porque con ella, se consiguen resoluciones y tiempos de anlisis aceptables.

Captulo VI 302

Tabla VI.4. Influencia del voltaje en los tiempos de migracin.
Voltaje (kV) Tiempo de migracin (min)
FEO TMP
1
NAC SMX TMP
3
TMP
15 7.450 10.624 11.052 11.855 13.216 19.148
20 5.444 7.791 8.148 8.759 9.715 14.185
25 4.356 6.194 6.497 6.985 7.715 11.227
30 3.510 4.945 5.232 5.623 6.136 8.847



15 20 25 30
Voltaje (kV)
0
5
10
15
20
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
o
n

(
m
i
n
)
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP


Figura VI.7. Influencia del voltaje aplicado sobre los tiempos de migracin
Captulo VI 303
IV.3.6. Efecto de la temperatura

Como sabemos, la temperatura se relaciona con la viscosidad del medio
electrofortico. De este modo, un aumento de la temperatura diminuye la viscosidad, por lo
que aumenta la velocidad del FEO y como consecuencia la movilidad aparente de los
compuestos, acortando el tiempo de anlisis.
Durante el proceso de separacin, se estudi el efecto de la temperatura en la
migracin de los compuestos. Para ello, se realizaron separaciones de una muestra tipo S,
utilizando como electrolito de separacin una disolucin que contena tampn borato 20
mM de pH 9.3 y SDS de concentracin 25 mM. Todos los electroferogramas se registraron
a 30 kV, pero a diferentes temperaturas, comprendidas en el intervalo de 15 a 30 C.
Como se prevea, una aumento de la temperatura produjo una disminucin de los
tiempos de migracin (tabla VI.5) y, por consiguiente, del tiempo de anlisis. As, se puede
ver que a 30 C, la separacin est completada en menos de 8 minutos. Sin embargo,
tambin se ve que los picos de SMX y TMP
3
solapan a esa temperatura. Por otro lado, se
observ que a lo largo de todo el intervalo de temperatura estudiado, los picos de todos los
compuestos aparecan perfectamente separados, si bien el tiempo de migracin de TMP a
15 C era superior a 10 minutos, lo cual resultaba demasiado elevado. Ante esta situacin,
hubo que encontrar una solucin de compromiso que tuviera en cuenta la mejor resolucin
en un tiempo de anlisis aceptable.
La influencia de la temperatura sobre las anchuras de los picos no se consider
significativa. La pequea disminucin que produce el aumento de la temperatura se puede
deber a que cuanto mayor es sta, menor es la viscosidad del medio y los tiempos de
migracin se acortan, disminuyendo as la dispersin.
Captulo VI 304
Finalmente se seleccion como ptima una temperatura de 20 C porque se consigue
una buena resolucin en un tiempo de anlisis aceptable.

Tabla VI.5. Influencia de la temperatura
Temperatura (C)
15 20 25 30
FEO t
m
4.032 3.515 2.812 2.781
t
m
5.849 4.948 3.956 3.687 TMP
1

Ancho 0.043 0.041 0.038 0.035
t
m
6.048 5.256 4.205 4.129
R
s
2.647 4.480 6.102 7.724
NAC
Ancho 0.042 0.039 0.040 0.041
t
m
6.509 5.649 4.519 4.441
R
s
6.708 6.128 5.829 5.531
SMX
Ancho 0.036 0.034 0.032 0.031
t
m
7.356 6.139 4.911 4.491
R
s
8.501 5.872 4.056 -
TMP
3

Ancho 0.076 0.063 0.050 -
t
m
>10 8.814 7.051 5.908
R
s
- 18.580 17.815 17.049
TMP
Ancho - 0.098 0.082 0.067






Captulo VI 305
VI.3.5. Influencia del modificador orgnico

Hasta este momento se ha visto que hay una diferencia de 1.2 minutos entre el
tiempo de migracin del TMP
1
, el primer compuesto en ser detectado, y el del TMP
3
, que
es el cuarto compuesto en ser detectado. Esta circunstancia no impide la cuantificacin de
ninguno de ellos porque sus picos aparecen bien resueltos. No obstante, la resolucin puede
mejorarse incorporando al electrolito una cierta cantidad de modificador orgnico para
alterar la selectividad de la separacin.
El disolvente orgnico que se utiliz en este estudio fue el acetonitrilo, y su
concentracin se vari para obtener porcentajes entre el 2.5 y el 15 % (v:v) en el electrolito
de separacin.
Cuando se estudi el efecto del acetonitrilo (figura VI.8), se observ que un
aumento en la concentracin de modificador orgnico supona un aumento en los tiempos
de migracin de aquellos compuestos que presentaban ionizacin al pH de trabajo, es decir,
NAC y SMX. Este comportamiento puede explicarse porque un aumento del disolvente
orgnico provoca un aumento en la viscosidad del electrolito de separacin, disminuyendo
considerablemente la velocidad del flujo electroosmtico, lo que origina que los tiempos de
migracin de los compuestos sean mayores, de manera que aumentan los tiempos de
anlisis.
Por el contrario, en los casos de los compuestos que interaccionan con las micelas,
es decir, TMP y sus metabolitos, la tendencia es diferente. Los tiempos de migracin de los
compuestos TMP
1
y TMP
3
disminuyen levemente a concentraciones bajas de acetonitrilo,
se estabilizan a concentraciones moderadas y aumentan manifiestamente a concentraciones
elevadas. El tiempo de migracin del TMP disminuye drsticamente al aumentar la
Captulo VI 306
concentracin de acetonitrilo, pero a partir de un 10 % de concentracin de modificador,
aumenta notablemente. La disminucin de los tiempos de migracin de estos compuestos se
produce a bajas concentraciones de acetonitrilo, cuando no es tan acusado el aumento de la
viscosidad. Como sabemos TMP y sus metabolitos son muy poco solubles en disolucin
acuosa, de manera que la presencia de acetonitrilo favorece su disolucin en el electrolito
de separacin, por lo que disminuir su tendencia a la asociacin con las micelas. Sin
embargo, para concentraciones mayores, predomina el efecto de la viscosidad del medio,
que al aumentar, hace que la velocidad del FEO disminuya y su tiempos de migracin
aumenten.

2 4 6 8 10 12 14
Concentracin de acetonitrilo (%)
16
2
4
6
8
10
T
i
e
m
p
o

d
e

m
i
g
r
a
c
i
o
n

(
m
i
n
)
FEO
TMP1
NAC
SMX
TMP3
TMP

Figura VI.8. Influencia de la concentracin de acetonitrilo en los tiempos de migracin

Captulo VI 307
Este modificador orgnico permite alterar la selectividad de la separacin y adems,
rebajar el tiempo de anlisis. Cuando la concentracin de acetonitrilo alcanza el 5 %, los
tiempos de migracin de los cuatro compuestos mencionados al principio de este apartado
estn separados en un intervalo de 1.9 minutos, lo cual mejora la resolucin, y el tiempo de
migracin del TMP disminuye en 1.6 minutos, lo cual redunda en beneficio del tiempo de
anlisis.
Por estas razones se seleccion como ptima una concentracin de 5 % de
acetonitrilo en el electrolito de separacin.

VI.3.6. Influencia del disolvente de la muestra

Se estudi el efecto del disolvente en que se encuentre la muestra sobre la simetra
de los picos. Se prepararon muestras en presencia y en ausencia de electrolito de separacin
segn se indica a continuacin:
1. Muestra en disolucin de etanol : agua al 10 % (v:v).
2. Muestra diluida en electrolito de separacin al 10 % (v:v).
Se registraron y compararon los electroferogramas correspondientes y se observ
que cuando se disolvi la muestra en un 10 % de electrolito, los picos de TMP y sus
metabolitos eran ligeramente ms altos. Por el contrario, los de SMX y NAC no mostraban
ninguna diferencia significativa en estos aspectos. Por esta razn se decidi adicionar a las
muestras electrolito de separacin hasta alcanzar una concentracin final de un 10 % para
disolver el residuo seco resultante del pretratamiento de la muestra.
Finalmente, en la tabla VI.6 se muestran las condiciones qumicas e instrumentales
optimizadas para la separacin de TMP
1
, TMP
3
, NAC, SMX y TMP. Asimismo, en la
Captulo VI 308
figura VI.9 se muestra un electroferograma de una muestra tipo S utilizando el mtodo
optimizado y registrado a 214 nm.

Tabla VI.6. Mtodo optimizado para la separacin.
Capilar Slice fundida: 57 cm longitud 75 m dimetro interno
Electrolito Borato (pH = 9.3) 20 mM : SDS 25 mM : 5 % (v:v) acetonitrilo
Temperatura 20 C
Rampa de voltaje 30 kV (150 kV/min)
Detector Barra de diodos en lnea
Ventana deteccin 800 100 m

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00
Tiempo de migracin (min)
0
5
10
m
A
u
TMP1
TMP3
NAC
SMX
TMP

Figura VI.9. Electroferograma de una muestra tipo S utilizando el mtodo optimizado y
registrado a 214 nm

Captulo VI 309
VI.4. ASPECTOS CUANTITATIVOS

En este captulo, se ha abordado como problema analtico la determinacin de
SMX, TMP y sus metabolitos principales en suero humano. Aunque en el captulo IV de
esta Memoria se propuso un mtodo por electroforesis capilar en zona para la
determinacin de SMX y TMP, ste estaba enfocado al anlisis de estos dos compuestos,
entre otros, en productos farmacuticos. Sin embargo, en el caso que nos ocupa, estos dos
compuestos, se encuentran en una matriz muy diferente, por lo que es muy probable que
aquel mtodo no se pudiera aplicar en este caso. Adems, cuando SMX y TMP se
encuentran presentes en medio biolgico, suelen ir acompaados por sus metabolitos, por lo
que parece ms apropiado aplicar un mismo mtodo para la determinacin de todos los
compuestos. Por estas razones, no slo se determinaron los metabolitos, sino tambin los
compuestos de los que derivan, es decir, los principios activos.


VI.4.1. Lmites de deteccin y cuantificacin

Como en los captulos precedentes, el procedimiento utilizado para establecer los
lmites de deteccin y de cuantificacin, tanto en electroforesis capilar como en
cromatografa lquida de alta resolucin, se basa en el mtodo del ruido de la lnea base.
Para ello se prepararon dos muestras, de las cuales una actu como blanco, siguiendo el
siguiente procedimiento:

Captulo VI 310
1. Se tratan 2.5 mL de suero con 5 mL de acetonitrilo y se centrfuga segn el
procedimiento descrito en el apartado correspondiente.
2. Se separa el sobrenadante y se lava el precipitado con 2.5 mL de acetonitrilo,
volviendo a centrifugar.
3. Se unen ambos sobrenadantes y se lleva todo el volumen (10 mL) a sequedad a
80C.
4. Se repiten los pasos 1 a 3, utilizando un suero al que se le han aadido todos los
compuestos de manera que su concentracin fuera 0.4 mg/L de cada uno.
5. Los residuos de estas disoluciones se disuelven en 250 L de electrolito al 10 %
(v:v), dando lugar a dos nuevas disoluciones, con analitos (M) y sin ellos (B).
6. Finalmente, se registran los electroferogramas correspondientes bajo las condiciones
optimizadas previamente.

De esta manera, comparando las fluctuaciones de la lnea base de M frente a B
se pueden calcular los lmites de deteccin y cuantificacin en el extracto obtenido.
Evidentemente, como se ha concentrado la muestra inicial de suero 10 veces, los lmites de
deteccin y cuantificacin en el suero sern proporcionales al factor de concentracin, y as
se refleja en la tabla VI.7.





Captulo VI 311
Tabla VI.7. Lmites de deteccin y de cuantificacin (mg/L)
Extracto Suero
LOD LOQ LOD LOQ
TMP
1
0.6 2.1 0.06 0.21
TMP
3
0.7 2.4 0.07 0.24
NAC 0.4 1.4 0.04 0.14
SMX 0.4 1.3 0.04 0.13
TMP 0.6 1.9 0.06 0.19


VI.4.2. Linealidad de la respuesta

El estudio de la linealidad se realiz adicionando diferentes cantidades de TMP
1
,
TMP
3
, NAC, SMX y TMP, en un intervalo de concentraciones entre 0.2 y 3 mg/L en suero,
siguiendo el tratamiento establecido. Posteriormente, estas disoluciones se inyectaron en el
equipo de electroforesis capilar y se procedi a su separacin de acuerdo con el mtodo
optimizado anteriormente.
En todos los casos, para realizar los clculos se obtuvieron los resultados usando
reas de pico corregidas y la determinacin de cada compuesto fue realizada a la longitud
de onda correspondiente a su mximo de absorcin, es decir, 206 nm para TMP, TMP
1
y
TMP
3
y 260 nm para SMX y NAC. Para seleccionar esta longitud de onda se utilizaron los
espectros de absorcin UV-Visible obtenidos con el detector de diodos en lnea.
Captulo VI 312
En las rectas de calibrado obtenidas puede verse una buena relacin lineal entre
concentracin y rea de pico corregida y tambin que las ordenadas en el origen resultaron
ser despreciables, segn el intervalo de confianza obtenido para un nivel de significacin de
0.05.
En las figura VI.10 a VI.12 se representan las reas corregidas de los compuestos
frente a las concentraciones. Las ecuaciones de las rectas obtenidas por mnimos cuadrados
se muestran en la tabla VI.8 y se puede apreciar que la linealidad obtenida es satisfactoria y
que las ordenadas en el origen son despreciables en todos los casos.



Tabla VI.8. Ecuaciones de las rectas de calibrado e intervalos de linealidad.
Ecuacin r
2
Intervalo lineal (mg/L)
TMP
1
A = 33 ( 56) + 272.5 ( 3.4) C (mg/L) 0.9999 0.2 3
TMP
3
A = -10 ( 90) + 240.4 ( 5.4) C (mg/L) 0.9997 0.2 3
NAC A = -10 ( 13) + 109.70 ( 0.75) C (mg/L) 0.9997 0.2 3
SMX A = -30 ( 62) + 112.2 ( 3.7) C (mg/L) 0.9994 0.2 3
TMP A = -0.2 ( 1.3)10
2
+ 286.4 ( 2.5) C (mg/L) 0.9967 0.2 3





Captulo VI 313
a)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
0
2500
5000
7500
10000
A
r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a

b)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
0
1000
2000
3000
4000
A
r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a

Figura VI.10. Rectas de calibrado de a) TMP
1
y b) NAC
Captulo VI 314
a)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
0
2000
4000
6000
8000
A
r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a

b)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
0
1000
2000
3000
4000
A
r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a


Figura VI.11. Rectas de calibrado de a)TMP
3
y b)SMX
Captulo VI 315







0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
Concentracin (mg/L)
0
2000
4000
6000
8000
10000
A
r
e
a

c
o
r
r
e
g
i
d
a


Figura VI.12. Recta de calibrado de TMP





Captulo VI 316
VI.4.3. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo

Para llevar a cabo el estudio de la repetibilidad del mtodo descrito anteriormente se
prepar una muestra de suero que contena unas concentraciones de 8 mg/L de TMP
1
,
TMP
3
, NAC, SMX y 12 mg/L de TMP y se hicieron once separaciones consecutivas en las
condiciones qumicas e instrumentales seleccionadas como ptimas. Se comprob que la
precisin de las medias de rea corregida mejoraba cuando se lavaba el capilar con NaOH
0.1 M durante 2 minutos entre separaciones.
Para evaluar la reproducibilidad entre diferentes das, se prepar una muestra igual
que la anteriormente citada y se hicieron dos series de once separaciones, cada una en das
consecutivos y se compararon las varianzas de las dos series segn el test estadstico F de
Snedecor para pruebas de dos colas. As, se encontr que no existan diferencias
significativas entre las series para un intervalo de confianza del 95 %.
Los resultados obtenidos, en trminos de medias (x), desviaciones estndar (S) y
porcentaje de desviacin estndar relativa (%DER) se muestran en la tabla VI.9.
Tabla VI.9. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo.
Serie 1 Serie 2
x S %DER x S %DER S
1
2
/S
2
2
F
(0.05)

TMP
1
2002 93 4.6 2036 64 3.2 2.08 3.717
TMP
3
1697 89 5.2 1696 65 3.8 1.82 3.717
NAC 854 38 4.4 859 40 4.7 1.16 3.717
SMX 780 34 4.4 777 34 4.4 1.00 3.717
TMP 2688 127 4.7 2542 114 4.5 1.24 3.717
Captulo VI 317
VI.5. APLICACIONES

El mtodo propuesto se aplic a la cuantificacin de los componentes de la mezcla
en estudio en muestras preparadas en el laboratorio, con distintas relaciones entre sus
concentraciones, todas ellas, naturalmente, dentro del intervalo de linealidad encontrado.
Las recuperaciones se calcularon con respecto a patrones preparados tambin en el
laboratorio. La secuencia de separacin fue similar a la realizada en captulos anteriores, es
decir, intercalando la medida de la muestra (por triplicado) con la medida de dos patrones.
El parmetro seleccionado para la cuantificacin fue el rea de pico corregida,
medida a la longitud de onda de mxima absorcin de cada uno de los compuestos, como se
hizo en los captulos anteriores.
Se realizaron las separaciones y se registraron los electroferogramas para su
posterior anlisis cuantitativo. En la tabla VI.10 se recogen los valores de recuperacin para
todas las muestras preparadas en el laboratorio.
Como se puede ver, todos las recuperaciones estuvieron prximas al 100 %, dentro
de la precisin que se espera para la determinacin de cada uno de los compuestos. El nico
caso en el que no se consigui una buena recuperacin fue el de TMP
3
en la mezcla
denominada M 3, donde se obtiene un valor algo elevado. Esto podra deberse a un
pequeo error cometido a la hora de la preparacin de la muestra, ya que las dems estn en
intervalos de error menores.




Captulo VI 318

Tabla VI.10. Recuperaciones obtenidas en las muestras preparadas en el laboratorio
TMP
1
TMP
3
NAC SMX TMP
Concentracin (mg/L) 0.83 0.83 0.42 0.83 0.60
M

1

Recuperacin (%) 104.5 104.5 99.8 101.9 101.2
Concentracin (mg/L) 0.41 0.42 0.85 0.42 1.20
M

2

Recuperacin (%) 98.3 103.5 98.2 100.6 104.0
Concentracin (mg/L) 0.41 0.42 0.42 0.83 1.20
M

3

Recuperacin (%) 103.3 108.6 99.5 104.9 102.7
Concentracin (mg/L) 0.83 0.83 0.85 0.42 0.60
M

4

Recuperacin (%) 100.1 101.8 96.5 95.0 97.5
Concentracin (mg/L) 0.21 0.21 1.06 1.04 0.30
M

5

Recuperacin (%) 95.4 101.5 100.2 97.3 94.9
Concentracin (mg/L) 1.04 1.04 0.21 1.67 1.51
M

6

Recuperacin (%) 101.8 98.0 97.1 95.8 99.6




























CONCLUSIONES

Conclusiones 321
La cromatografa lquida, utilizando columna C
18
y fase mvil formada por tampn
fosfato 40 mM (pH 3.0), 10 mM de NaClO
4
:acetonitrilo es til para la separacin entre las
sulfamidas sulfaquinoxalina y sulfametacina y el compuesto asociado pirimetamina.
Igualmente, utilizando columna C
18
y fase mvil formada por tampn citrato 10 mM (pH
3.0):metanol, en modo de gradiente, es til para la separacin entre las sulfamidas
sulfametoxipiridacina, sulfadimetoxina y sulfametoxazol y de los compuestos asociados
bromhexina y trimetoprim.

La electroforesis capilar, en su modalidad de cromatografa electrocintica micelar,
resuelve, en menos de 10 minutos, muestras que contienen las sulfamidas sulfaquinoxalina
y sulfametacina y los compuestos asociados pirimetamina y menadiona. Igualmente, en su
modalidad de electroforesis capilar en zona, resuelve, en menos de 6 minutos, muestras que
contienen las sulfamidas sulfadiacina y sulfametoxazol y los compuestos asociados
trimetoprim, bromhexina y guayacol.

Tanto la cromatografa lquida como la electroforesis capilar pueden recomendarse
para el control de calidad de los productos farmacuticos y zoosanitarios que contengan
este tipo de combinaciones.

Los resultados encontrados en el anlisis de productos zoosanitarios, muy
discordantes con los sealados en sus etiquetas, tanto por cromatografa lquida como por
electroforesis capilar, nos permiten comprobar el prcticamente inexistente control de
calidad que se ejerce en estos productos, ni por parte de los laboratorios implicados, no por
parte de la Administracin.
Conclusiones 322
La cromatografa electrocintica micelar es apropiada para cuantificar cido
sulfanlico y sulfanilamida, dos de los principales productos de degradacin de
sulfametoxazol. Sin embargo no fue posible la cuantificacin del cido 3,4,5-
trimetoxibenzoico, principal producto de degradacin de trimetorpim, aunque s fue posible
su deteccin.

La comatografa electrocintica micelar es apropiada para la determinacin de los
principales metabolitos de sulfametoxazol y trimetoprim, N
4
-acetil-sulfametoxazol,
trimetoprim-1-xido y trimetoprim-3-xido, en suero humano. Adems, gracias a la tcnica
de preconcentracin utilizada, consistente en la extraccin de los compuestos de nuestro
inters con acetonitrilo y su posterior evaporacin, se consiguen unos lmites de deteccin
del orden de 10
-2
mg/L.



























BIBLIOGRAFA

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NDICE

ndice 337
OBJETO DE LA TESIS

INTRODUCCIN

ANTECEDENTES HISTRICOS DE LAS SULFAMIDAS ............................ 5
CLASIFICACIN DE LAS SULFAMIDAS ..................................................... 10
ANLISIS DE SULFAMIDAS.......................................................................... 13
Determinacin de sulfamidas y metabolitos.................................................. 33
Determinacin de sulfamidas, potenciadores y sus productos
de degradacin............................................................................................... 43
INTRODUCCIN A LA ELECTROFORESIS CAPILAR................................ 57
Definicin de electroforesis y principios generales de la tcnica ................. 58
TEORA DE LA ELECTROFORESIS............................................................... 61
Aspectos tericos........................................................................................... 61
El fenmeno de electroforesis y el flujo electroosmtico ............................. 63
Los beneficios del flujo electroosmtico....................................................... 64
El tampn de separacin................................................................................ 68
Parmetros determinantes de la separacin................................................... 69
Factores que afectan al desarrollo de la separacin ...................................... 72
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPERACIONALES
DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR ............................................................ 75
Inyeccin de la muestra................................................................................. 75
Fuente de alto voltaje..................................................................................... 77
Capilar ........................................................................................................... 78
Sistemas de termostatizacin del capilar....................................................... 79
Sistemas de deteccin.................................................................................... 79
MODALIDADES DE ELECTROFORESIS CAPILAR..................................... 81
Electroforesis capilar en zona........................................................................ 81
Cromatografa electrocintica micelar .......................................................... 82
INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA LQUIDA
DE ALTA RESOLUCIN.................................................................................. 86
Principios bsicos .......................................................................................... 88
Concepto de plato terico.............................................................................. 88
ndice 338
Retencin cromatogrfica.............................................................................. 89
ASPECTOS INSTRUMENTALES Y OPRACIONALES DE LA
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN ............................ 90
Sistemas de bombeo ...................................................................................... 90
Sistema de inyeccin ..................................................................................... 91
Columna cromatogrfica ............................................................................... 91
Detector ......................................................................................................... 91
Integrador o procesador................................................................................. 92
PARMETROS CROMATOGRFICOS.......................................................... 93
MODALIDADES DE CROMATOGRAFA LQUIDA.................................... 95
Cromatografa de particin en fase reversa................................................... 96
ANLISIS ESTADSTICO ELEMENTAL ....................................................... 101
Parmetros estadsticos descriptivos clsicos................................................ 101
Test estadstico t de Student .......................................................................... 102
Mtodos de correlacin ................................................................................. 103
Rectas de calibracin (Regresin por mnimos cuadrados) .......................... 104
Comparacin de las pendientes de dos rectas de calibrado........................... 107

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL Y DISOLUCIONES
INSTRUMENTACIN UTILIZADA...................................................................... 113
DISOLUCIONES UTILIZADAS ............................................................................. 115


I. DETERMINACIN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA EN
PRODUCTOS ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFA
ELECTROCINTICA MICELAR

I.1. INTRODUCCIN........................................................................................ 119
I.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina,
sulfametacina, menadiona y pirimetamina............................................ 121
ndice 339
I.1.2. Influencia del contenido en etanol..................................................... 123
I.1.3. Influencia del pH sobre los espectros de absorcin ......................... 124

I.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES...................... 125
I.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 125
I.2.2. Influencia del modificador orgnico ................................................. 127
I.2.3. Influencia de la concentracin de SDS.............................................. 130
I.2.4. Influencia de la concentracin de tampn......................................... 133
I.2.5. Efecto de la temperatura.................................................................... 135
I.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separacin.................... 138
I.2.7. Efecto del disolvente de la muestra................................................... 141

I.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS................................................................. 144
I.3.1. Lmites de deteccin y cuantificacin............................................... 144
I.3.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 147
I.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo .................................... 149

I.4.. APLICACIONES......................................................................................... 150


II. DETERMINACIN DE SULFAQUINOXALINA,
SULFAMETACINA, PIRIMETAMINA Y MENADIONA EN
PRODUCTOS ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFA
LQUIDA

II.1. INTRODUCCIN........................................................................................ 159
II.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES...................... 160
II.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 160
II.2.2. Optimizacin del pH de la fase mvil ............................................... 163
II.2.3. Influencia de la concentracin de perclorato..................................... 166
II.2.4. Influencia de la fuerza inica en la fase mvil .................................. 170
II.2.5. Influencia de la concentracin de acetonitrilo................................... 173
II.2.6. Influencia del caudal de fase mvil .................................................. 175
II.2.7. Mtodo cromatogrfico propuesto .................................................... 177
ndice 340
II.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS................................................................. 179
II.3.1. Lmites de deteccin y cuantificacin............................................... 179
II.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad .................................... 180
II.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad....................................................... 183

II.4. APLICACIONES......................................................................................... 185


III. DETERMINACIN DE SULFAMETOXAZOL,
SULFADIMETOXINA, SULFAMETOXIPIRIDACINA,
TRIMETOPRIM Y BROMHEXINA EN PRODUCTOS
ZOOSANITARIOS POR CROMATOGRAFA LQUIDA

III.1. INTRODUCCIN...................................................................................... 191
III.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfaquinoxalina,
sulfametacina, menadiona y pirimetamina ........................................ 193
III.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorcin .......................... 195

III.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES.................... 196
III.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 196
III.2.2. Optimizacin del pH de la fase mvil ............................................... 197
III.2.3. Influencia de la concentracin del tampn en la fase mvil ............. 200
III.2.4. Seleccin del disolvente orgnico ..................................................... 202
III.2.5. Optimizacin del gradiente................................................................ 202
III.2.6. Influencia del caudal de fase mvil ................................................... 205
III.2.7. Seleccin de la longitud de onda de medida ..................................... 206
III.2.8. Mtodo cromatogrfico propuesto .................................................... 208

III.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS............................................................... 210
III.3.1. Lmites de deteccin y cuantificacin............................................... 210
III.3.2. Rectas de calibrado e intervalo de linealidad .................................... 210
III.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad....................................................... 212

III.4. APLICACIONES ....................................................................................... 213
ndice 341
IV. DETERMINACIN DE SULFAMETOXAZOL, SULFADIACINA,
TRIMETOPRIM, GUAYACOL Y BROMHEXINA EN PRODUCTOS
FARMACUTICOS POR ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONA

IV.1. INTRODUCCIN...................................................................................... 221
IV.1.1. Estabilidad de las disoluciones de sulfadiacina y guayacol .............. 223
IV.1.2. Influencia del pH sobre los espectros de absorcin .......................... 224

IV.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES.................... 225
IV.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 225
IV.2.2. Optimizacin del pH del electrolito .................................................. 228
IV.2.3. Influencia de la concentracin del tampn........................................ 231
IV.2.4. Seleccin del voltaje de separacin................................................... 233
IV.2.5. Efecto de la temperatura.................................................................... 236

IV.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS............................................................... 240
IV.3.1. Lmites de deteccin y cuantificacin............................................... 240
IV.3.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 241
IV.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad....................................................... 243

IV.4. APLICACIONES ....................................................................................... 244

V. DETERMINACIN DE LOS PRINCIPALES PRODUCTOS DE
DEGRADACIN DE SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM POR
CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR

V.1. INTRODUCCIN........................................................................................ 251

V.2. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES...................... 253
V.2.1. Estudios preliminares ........................................................................ 253
V.2.2. Optimizacin del pH del electrolito .................................................. 257
V.2.3. Influencia de la concentracin de SDS.............................................. 259
V.2.4. Influencia de la concentracin de modificador orgnico .................. 262
V.2.5. Influencia de la concentracin del tampn........................................ 264
ndice 342
V.2.6. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separacin.................... 266
V.2.7. Influencia de la temperatura en la separacin ................................... 268
V.2.8. Efecto del disolvente de la muestra................................................... 270

V.3. ASPECTOS CUANTITATIVOS................................................................. 273
V.3.1. Lmites de deteccin y de cuantificacin .......................................... 274
V.3.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 276
V.3.3. Repetibilidad y reproducibilidad....................................................... 278

V.4. APLICACIONES......................................................................................... 280

VI. DETERMINACIN DE LOS PRINCIPALES METABOLITOS DE
SULFAMETOXAZOL Y TRIMETOPRIM EN SUERO HUMANO
POR CROMATOGRAFA ELECTROCINTICA MICELAR

VI.1. INTRODUCCIN...................................................................................... 285

VI.2. PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA............................................... 286
VI.2.1. Obtencin del suero........................................................................... 286
VI.2.2. Desproteinizacin del suero .............................................................. 286

VI.3. ESTUDIO DE LOS PARMETROS EXPERIMENTALES.................... 289
VI.3.1. Estudios preliminares ........................................................................ 289
VI.3.2. Influencia del pH en la separacin .................................................... 292
VI.3.3. Influencia de la concentracin del tampn........................................ 294
VI.3.4. Influencia de la concentracin de SDS.............................................. 297
VI.3.5. Estudio de la influencia del voltaje sobre la separacin.................... 300
VI.3.6. Efecto de la temperatura.................................................................... 303
VI.3.7. Influencia del modificador orgnico ................................................. 305
VI.3.8. Influencia del disolvente de la muestra ............................................. 307

VI.4. ASPECTOS CUANTITATIVOS............................................................... 309
VI.4.1. Limites de deteccin y cuantificacin............................................... 309
VI.4.2. Linealidad de la respuesta ................................................................. 311
ndice 343
VI.4.3. Repetibilidad y reproducibilidad del mtodo .................................... 316

VI.5. APLICACIONES ....................................................................................... 317

CONCLUSIONES ................................................................................................... 319

BIBLIOGRAFA..................................................................................................... 323

NDICE..................................................................................................................... 335