ML04 S Aureus. Rev002

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LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL

PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA
NUMERACION DE Staphylococcus coagulasa positivo
(Staphylococcus aureus y otras especies)

LSA P5.4-ML04

INDICE

1. OBJETIVO.................................................................................................................. 2

2. ALCANCE..................................................................................................... 2

3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... .. 2

4. DEFINICIONES..... 2

5. RESUMEN . 2

6. DESARROLLO.... 2

7. FORMULARIOS Y REGISTROS.. 7

8 REFERENCIAS... 7

9. ANEXOS .... 8

FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008
FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008

REVISION: 02

NOMBRE CARGO FIRMA
APROBO

Blga. Soledad Osorio Alva.
Directora del Laboratorio de Salud
Ambiental - DIGESA

REVISO

Blga. Edith Villanueva Huamn
Aseguramiento de calidad. Laboratorio
de Salud Ambiental DIGESA.

Blga. Aydee Valenzuela
Warthon.
Jefa del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.

ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos.
Analista del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.

LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL
NUMERACIN DE Staphylococcus coagulasa
positiva

Cdigo: LSA P5.4-ML04
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Fecha : 25/08/2008
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I OBJETIVO

Describir el mtodo de ensayo para la numeracin de Staphylococcus coagulasa-positivo mediante la
tcnica de conteo de colonias, de acuerdo a lo indicado en la Norma ISO 6888 1:1999. Amd. 1:
2003.

II ALCANCE

Este mtodo se aplica a muestras de alimentos destinados para consumo humano.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.
Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.
Procedimiento de aseguramiento de la calidad de los resultados.

IV DEFINICIONES

a) Staphylococcus coagulasa-positiva: bacterias que forman colonias tpicas y/o atpicas sobre la
superficie de un medio de cultivo selectivo, las cuales muestran una reaccin coagulasa-positiva.

b) Numeracin de los Staphylococcus coagulasa-positiva: : determinacin del nmero de
Staphylococcus coagulasa-positiva encontrado por mililitro o por gramo de muestra.

V RESUMEN

El mtodo de numeracin de Staphylococcus se basa en la inoculacin sobre la superficie de un
medio de cultivo slido selectivo usando placas por duplicado, con una cantidad especfica de la
muestra si el producto es lquido, o con una cantidad especfica de la suspensin inicial en el caso de
otros productos. La incubacin de las placas se realiza a 35C y el examen luego de 24 horas y/o 48
horas.
El clculo del nmero de Staphylococcus coagulasa-positiva por mililitro o por gramo, de muestra
proviene del nmero de colonias tpicas y/o atpicas obtenidas de las placas en las diluciones
elegidas dando un resultado significativo y confirmado por el resultado de la prueba coagulasa-
positiva.

VI DESARROLLO

6.1 Medios de cultivo reactivos y/o suplementos.

Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos
para anlisis microbiolgico:

6.1.1 Agar Baird Parker (BP)
6.1.2 Emulsin de yema de huevo con telurito.
6.1.3 Caldo infusin cerebro corazn Brain heart infusion (BHI)
6.1.4 Plasma de conejo con EDTA

6.2 Equipos y materiales.
Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos
para anlisis microbiolgico e Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo:

6.2.1 Incubadora bao mara o aparatos similares, capaz de mantener a una temperatura en un rango de
47C + 2C.

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6.2.2 Incubadora a 35C 1 C o 37C 1 C.
6.2.3 Incubadoras capaces de mantener la temperatura en un rango de 50C + 1C.
6.2.4 Pipetas graduadas terminales de vaciado total, capacidad nominal de 1 mL, 2 mL, graduada en
divisiones de 0,1 mL y 0,5 mL, respectivamente.
6.2.5 Placas Petri de vidrio de 22 x 150 mm.
6.2.6 Placas Petri de vidrio de 15 x 100 mm.
6.2.7 Tubos de ensayos, resistentes al autoclavado, con dimensiones de 13 x 100 mm de dimetro.
6.2.8 Asas de siembra de nquel-cromo o platino de 3,0 a 3,5 mm de dimetro.

6 6. .3 3 Preparacin de la muestra, suspensin inicial y diluciones.
6.3.1 Ver Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.

6.4 Inoculacin e Incubacin
6.4.1 Inoculacin
6.4.1.1 Transferir, por medio de una pipeta estril, 0,1 mL de la muestra a analizar si el producto es lquido,
0,1 mL de la suspensin inicial (dilucin 10
-1
) en el caso de otros productos, a cada una de las dos
placas con Agar Baird Parker (superficie del agar previamente secada). Repetir el procedimiento para
las siguientes diluciones si fuera el caso.
6.4.1.2 Para ciertos productos, se requiere el conteo de bajo recuento de Staphylococcus coagulasa-
positivo, los lmites de deteccin pueden ser llevados a un factor de 10 por inoculacin de 1,0 mL de
la muestra si el producto es lquido de la suspensin inicial para otros productos, sobre la superficie
de una placa grande de 150 mm de dimetro o sobre la superficie de tres placas pequeas de 100
mm de dimetro. En ambos casos, preparar duplicados usando 2 placas grandes o seis pequeas.
6.4.1.3 Extender el inculo rpida y cuidadosamente sobre la superficie de la placa con agar, usando una
esptula de Drigalsky (bastn, extensores), procurando no tocar los lados de la placa. Dejar secar las
placas cerca de 15 minutos con las tapas hacia arriba a temperatura de laboratorio.
6.4.2 Incubacin
6.4.1 Invertir las placas inoculadas e incubarlas de 24 h + 2 horas a 48 h + 2 horas a 35C 37 C.
6.5 Seleccin de placas e interpretacin
6.5.1 Despus de la incubacin por 24 h + 2 h, marcar sobre las bases de las placas, las posiciones de
algunas colonias tpicas presentes. (Ver nota 1).
6.5.2 Reincubar todas las placas a 35C 37C por 24 horas + 2 horas, y marcar la aparicin de alguna
colonia tpica nueva. Tambin marcar alguna colonia atpica presente (Ver Nota 2).
6.5.3 Tomar para la numeracin slo aquellas placas (Ver nota 1 y 2) que tengan como mximo 300
colonias con 150 colonias tpicas y/o atpicas en dos diluciones sucesivas. Una de las placas debe
contener como mnimo 15 colonias. Seleccionar para la confirmacin un nmero dado A (en general
5 colonias tpicas s hay slo colonias tpicas, o 5 colonias atpicas s slo hay colonias atpicas, o 5
colonias tpicas y 5 colonias atpicas s ambos tipos estn presentes, de cada placa).
6.5.4 Si hay menos de 15 colonias tpicas y/o atpicas presentes en placas inoculadas con la muestra
liquida o en la dilucin ms baja de otros productos, es posible hacer un conteo estimado como se
describe ms adelante.
Nota 1.- Las colonias tpicas son negras o grises, brillantes y convexas (1 mm a 1,5 mm de dimetro despus de la
incubacin por 24 horas y 1,5 mm a 2,5 mm de dimetro luego de la incubacin por 48 horas) y rodeada por una zona clara.
Despus de incubar por lo menos 24 horas puede aparecer un anillo opalescente en esta zona clara, en contacto inmediato
con las colonias
Nota 2.- Las colonias atpicas tienen el mismo tamao como las colonias tpicas y pueden presentar una de las siguientes
morfologas:
a) Colonias negro brillante con o sin un borde blanco estrecho, la zona clara esta ausente o escasamente visible y el anillo
opalescente esta ausente o fuertemente visible.

b) Colonias grises sin zonas claras.

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Las colonias atpicas estn formadas principalmente por cepas contaminantes de Staphylococcus coagulasa- positiva, por
ejemplo, productos lcteos, camarones y menudencias de pollo. Estas son menos frecuentes en otros productos.
Nota 3.- Otras bacterias no pertenecientes al genero Staphyloccocus pueden dar colonias con apariencia similar a colonias
Staphyloccocus. El examen microscpico de una coloracin Gram, antes de la confirmacin ayudara a la diferenciacin de
otros gneros que nos sean Staphylococus.
6.5.5 Si un inoculo de 1 mL fue diseminado sobre tres placas, tratar esas placas como una, en todos los
conteos subsecuentes y procedimientos de confirmacin.
6.5.6 Para hacer un conteo estimado de bajos recuentos de Staphylococcus coagulasa positiva, separar
todas las placas que tengan algunas colonias tpicas y atpicas. Seleccionar todas aquellas colonias
para la confirmacin dentro de los lmites establecidos.
6.6 Confirmacin (Prueba de la Coagulasa)
6.6.1 De la superficie de cada colonia seleccionada, remover un inoculo con un asa estril y transferir a un
tubo con caldo de infusin de cerebro corazn.
6.6.2 Incubar a 35C o 37C por 24 horas + 2 horas.
6.6.3 En tubos de 13 x 100 mm, de base redondeada, aadir aspticamente 0,1 mL de cada cultivo a 0,3
mL de plasma de conejo (a menos que el fabricante especifique otras cantidades), incubar a 35C o
37C.
6.6.4 Despus de 4 a 6 horas de incubacin, examinar la coagulacin del plasma, si la prueba es negativa
reexaminar a 24 horas de incubacin, o en tiempos de incubacin especificados por el fabricante.
6.6.5 Considerar la prueba de coagulasa como positiva si el volumen de cogulo ocupa ms de la mitad
del volumen original del lquido.
6.6.6 Como control negativo, para cada lote de plasma, aada 0,1 mL del caldo de infusin de cerebro-
corazn a la cantidad recomendada de plasma de conejo e incubar sin inoculacin. Para que la
prueba sea vlida, el plasma de control no debe mostrar signos de coagulacin.

6.7 Clculos

6.7.1 Caso general

6.7.1.1 Clculo del nmero a de Staphylococcus coagulasa-positiva identificados para cada placa
seleccionada.

Calcule, para cada una de las placas el nmero a de Staphylococcus coagulasa-positiva
identificados, de acuerdo a la ecuacin:

a = b
c
x c
c
+ b
nc
x c
nc
A
c
A
nc

Donde:

A
c
:

Es el nmero de colonias tpicas sometidas a la prueba de la coagulasa;
A
nc
: Es el nmero de colonias atpicas sometidas a la prueba de la coagulasa;
b
c
: Es el nmero de colonias tpicas que muestran ser coagulasa-positiva;
b
nc
: Es el nmero de colonias atpicas que muestran ser coagulasa positiva;
c
c
: Es el nmero total de colonias tpicas contadas en la placa Petri;
c
nc
: Es el nmero total de colonias atpicas contadas en la placa Petri.

Redondear el resultado calculado a dos cifras significativas. Para esto si la ltima cifra es un nmero
menor a 5, el nmero anterior no se modifica, si la ltima cifra es 5 o mas, la cifra precedente se
incrementa en una unidad. Proceder de la misma forma hasta conseguir las dos cifras significativas.

Ejemplo:

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1) Si el resultado da 19 182 con el redondeo seria 19 000.
2) Si el resultado es 18 576 con el redondeo seria 19 000.

6.7.1.2 Clculo del nmero N de Staphylococcus coagulasa-positiva identificados, presente en la porcin de
prueba.

Para aquellas placas Petri que contienen un mximo de 300 colonias con 150 colonias tpicas y/o
atpicas en dos diluciones consecutivas, calcule el nmero de Staphylococcus coagulasa-positiva
para cada placa Petri como se especifico y calcule en un promedio de las dos diluciones
consecutivas, el nmero N de Staphylococcus coagulasa-positiva identificados presentes en la
muestra, usando la siguiente ecuacin:

N = a .
V(n
1
+0,1n
2
) d

Donde:

a: Es la sumatoria de las colonias de Staphylococcus coagulasa-positiva identificados en todas
las placas petri seleccionados.
V: Es el volumen de inculo en cada placa Petri, en mililitros.
n
1
: Es el nmero de placas Petri seleccionados en la primera dilucin.
n
2
: Es el nmero de placas Petri seleccionados en la segunda dilucin.
d: Es la dilucin correspondiente a la primera dilucin seleccionada (la suspensin inicial es
una dilucin).

Redondear los resultados calculados en 2 cifras significativas.

Reportar el resultado como el Nmero de Staphylococcus coagulasa-positiva por mililitro (productos
lquidos) o por gramo (otros productos) expresados como un nmero entre 1,0 y 9,9 multiplicado por
10
x
donde X es la potencia asignada a 10.

6.7.1.3 Ejemplo

Un conteo de un producto despus de la inoculacin con 0,1 mL del producto, dio los siguientes
resultados:

Para la primera dilucin seleccionada (10
-2
): 65 colonias tpicas y 85 colonias tpicas y colonias no
atpicas;

Para la segunda dilucin seleccionada (10
-3
): 3 colonias tpicas y 7 colonias tpicas y colonias no
atpicas;

Los siguientes nmeros fueron picados:

De las 65 colonias, 5 colonias fueron picadas y todas las 5 probaron ser coagulasa-positiva, dando
a = 65;

De las 85 colonias, 5 colonias fueron picadas, 3 de las cuales probaron ser coagulasa-positiva, dando
a = 51;

De las 3 colonias, las 3 fueron picadas y probaron ser coagulasa-positiva, dando a = 3;
De las 7 colonias, 5 fueron picadas y las 5 probaron ser coagulasa-positiva, dando a =7.

N = 65 + 51 + 3 + 7 = 57 272
0,22 x 10
-2

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El resultado despus redondeado es 57 000 y se expresa como 5,7 x 10
4
.
6.7.2 Estimacin de recuentos bajos.

6.7.2.1 Si las 2 placas, correspondientes al anlisis de la muestra (productos lquidos) o de la suspensin
inicial (otros productos) contienen cada una menos de 15 colonias identificadas, reporte los
resultados de la siguiente manera:

a) Para productos lquidos, estimar el nmero de Staphylococcus coagulasa-positiva por
mililitro;

N
e
= a .
V x 2

Donde:

a: Es la suma de las colonias de Staphylococcus coagulasa-positiva identificada en las 2 placas
seleccionadas.
V : Es el volumen diseminado en cada placa.

a) Para otros productos, estimar el nmero de Staphylococcus coagulasa-positiva por gramo;

N
e
= a .
V x 2 x d

Donde:

a: Es la suma de las colonias de Staphylococcus coagulasa-positiva identificada en las 2 placas
seleccionadas.
d: Es la dilucin de la suspensin inicial.
V: Es el volumen diseminado en cada placa.

6.7.2.2 Si las 2 placas, correspondiente al anlisis de la muestra (productos lquidos) o de la suspensin
inicial (otros productos) no contienen ninguna colonia de Staphylococcus coagulasa-positiva y si el
inculo ha sido realizado con 0,1 mL de muestra, reportar el resultado como sigue:

Caso general, si la inoculacin ha sido realizada con 0,1 mL de inculo:

< 10 Staphylococcus coagulasa-positiva por mililitro (productos lquidos).
< 10/d Staphylococcus coagulasa-positiva por gramo (otros productos) donde d es la dilucin de la
suspensin inicial. (10
-1
). Es decir < 100 Staphylococcus coagulasa-positiva por gramo.

Si la inoculacin ha sido realizada con 1 mL de la muestra:

< 1 Staphylococcus coagulasa-positiva por mililitro (productos lquidos).
< 1/d Staphylococcus coagulasa-positiva por gramo (otros productos). Donde d es la dilucin de la
suspensin inicial. (10
-1
). Es decir < 10 Staphylococcus coagulasa-positiva por gramo.

6.8 Reporte

Los resultados obtenidos, se expresaran UFC de Staphylococcus coagulasa positiva / gramo o
mililitro.
Los resultados para cada muestra se transcriben al Registro interno de resultados que luego se
archiva.

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6.9 Control de calidad
6.9.1 Para verificar la capacidad del laboratorio para la numeracin de Staphylococcus coagulasa-positiva,
con los mtodos y medios descritos en este procedimiento, se siembra en el medio de cultivo con una
cepa apropiada de Staphylococcus, y se procede a travs de todo el protocolo analtico usado para la
muestra problema. Un medio de control positivo asegura que ninguna sustancia en el medio de
cultivo es inhibidor para el Staphylococcus.
6.9.3 Se incluyen adems dos tipos de control negativo. Un medio de control negativo que asegure que el
medio preparado no este contaminado con Staphylococcus. El control es preparado colocando una
placa con el medio de cultivo sin inocular a travs de todo el procedimiento realizado para la muestra
prueba. El otro control negativo es el diluyente inoculado en la placa.

VII FORMULARIOS Y REGISTROS

7.1 Registro de numeracin de Staphylococcus coagulasa-positiva

VIII REFERENCIAS

8.1 ISO 6888-1:1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the
enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) Part 1:
Technique using Baird-Parker agar medium.

8.2 ISO 6888-1: 1999/Adm.1:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for
the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)
Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium. AMENDMENT 1: Inclusion of precision data.

8.3 ISO 7218: 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs General rules for microbiological
examinations.

IX ANEXOS

N ANEXO TITULO
1 Diagrama de flujo del procedimiento
2 Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.

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ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)

10 g de muestra

Diseminar el inculo, sobre la superficie de placa
con agar, usando un extensor.

Incubar a 35C o 37C por 18-24h
Si no hay crecimiento, reincubar a 35C
o 37C por 24 horas

Seleccionar placas con un mximo
de 300 colonias (tpicas y/o atpicas) )

Aislar 5 colonias tpicas y atpicas y
colocar cada una de ellas en caldo BHI.

Examinar luego de 4-6 h y hasta un mximo de 24 h
y verificar la formacin de cogulo

No hay formacin de cogulo Formacin de cogulo

Prueba de coagulasa (-) Prueba de coagulasa (+)
Staphylococcus coagulasa-positiva

90 mL
APS
9 mL
APS
10
-1

1 mL 1 mL

10
-2
10
-3

1 mL
1 mL 1 mL
PRUEBA DE
COAGULASA

Reporte
Incubar a 35C o 37C por 24 horas + 2 h.
0,1 mL de cultivo (Caldo BHI)
+
0,3 mL plasma de conejo
....
Agar Baird Parker
(Placas de 150 mm de )
Ms placas para control (+) y (-)
Ms tubos para control (+) y (-)
Ms tubos para control (+) y (-)

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ANEXO 2: Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.

2.1 Medio agar Baird-Parker

Medio base

Composicin
Peptona de casena 10,0 g
Extracto de levadura 1,0 g
Extracto de carne 5,0 g
Piruvato de sdio 10,0 g
L-glicina 12,0 g
Cloruro de litio 5,0 g
Agar 12,0 a 22 g
a)

Agua, para un volumen final de 1000 mL

a)
Dependiendo de la resistencia del gel del agar.

Preparacin
Disolver los componentes o la base completa deshidratada en agua por ebullicin. Si es necesario, ajustar el
pH de modo que luego de la esterilizacin esta sea 7,2 + 0,2 a 25C.

Transferir el medio en cantidades de 100 mL a frascos o botellas de capacidad apropiada.
Esterilizar el medio por 15 minutos a 121C.

2.2 Soluciones

2.2.1 Solucin de Telurito de Potasio.

Composicin
Telurito de potasio
b)
(K
2
TeO
3
) 1 g
Agua 100 mL

b)
Es recomendable asegurar de antemano que el telurito de potasio disponible sea apropiado para esta
prueba.

Preparacin
Disolver el telurito de potasio completamente en agua con calentamiento mnimo.
Los slidos pueden ser fcilmente solubles. Si un material insoluble blanco est presente en el agua,
descarte el polvo.
Esterilizar por filtracin usando membranas con un tamao de poro de 0,22 m.
La solucin puede ser almacenada en un frasco mbar o cubierta con papel platina por un mes como
mximo a + 3 C + 2 C.
Descartar la solucin si forma un precipitado blanco.

2.2.2 Emulsin de yema de huevo (concentracin aproximada 20% o de acuerdo a las instrucciones de
fbrica).

Nota: Pueden utilizarse preparaciones comerciales. .

Usar huevos frescos de gallina con cscara intacta. Limpiar los huevos con escobilla utilizando un detergente
lquido. Enjuagar bajo corriente de agua, luego desinfectar la cscara por inmersin en etanol al 70 % por 30
segundos y llevarlos a secar al aire, o por roseado con alcohol seguido por flama de esterilizacin.

Proceder bajo condiciones aspticas, romper el huevo y separar la yema de la clara, transferir por repetidas
veces la yema a la otra mitad de la cscara. Colocar las yemas en un frasco estril y aadir cuatro veces su

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volumen de agua estril. Mezclar completamente. Calentar la mezcla en bao de agua a 47C por 2 horas y
llevar por 18 horas a 24 horas a 3 C +2 C para obtener una forma de precipitado.

Colectar aspticamente el sobrenadante lquido dentro de un frasco recientemente estril para usar.

La emulsin puede ser almacenada a 3C + 2C por un mximo de 72 horas.

2.2.3 Plasma de conejo.

Utilizar plasma de conejo, deshidratado comercialmente disponible y rehidratarlo de acuerdo a las
instrucciones del fabricante. A menos que sea establecido por el fabricante, el plasma rehidratado o diluido
debe ser usado inmediatamente.

Si el plasma de conejo, deshidratado no esta disponible, diluir un volumen de plasma de conejo, fresco estril
con tres volmenes de agua estril.

Aadir una solucin de EDTA (Acido etilendiaminotetraactico) para obtener un plasma diluido o rehidratado
con 0,1% EDTA, si el citrato de potasio o citrato de sodio ha sido usado como anticoagulante para el plasma.
(Plasma heparinizado y oxalatado no requiere EDTA).

Antes de ser usado pruebe cada lote de plasma con cepas de Staphylococcus coagulasa-positiva y
Staphylococcus coagulasa-negativa.

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