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v
v
v
= =
=
=
1
~
2 1
6
Espectroscopia: idias gerais
Transies vibracionais (infravermelho)
Transies eletrnicas (UV e visvel,
fluorescncia)
7
Espectroscopia: idias gerais
8
Mtodos Experimentais
Espectrmetros:
fonte da radiao
luz transmitida,
emitida ou
espalhada pela
amostra coletada,
analisada pelo
detector
9
Intensidade de transies
Espectroscopia de
absoro
Lei de Lambert-Beer
c (L mol
-1
cm
-1
)
| |
| |
0
0
0
10
log
I
I
T
I I
l J
I
I
A
l J
=
=
= =
c
c
10
Deduo
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
0
0
0
0
0
0
0
0
0
d d
d
d
d
d
ln
ln ln10 log
ln10
ln10xlog
log
ln10
log
log
log log
I l
I
I J I x
I
J x
I
I
J x
I
I
J l
I
x x
I
J l
I
J l
I
I
I
J l
I
I
J l
I
I I
A
I I
A J l
k
k
k
k
k
c
k
k
c
c
c
=
=
=
=
= =
=
=
=
=
= =
=
} }
11
Exemplo: c do triptofano
=280 nm; Clula 1 mm;
0,50 mmol L
-1
triptofano;
T = 0,54;
Calcular: A e c em 280
nm, e T para l = 2,0 mm
| |
) 27 , 0 2 (
1 1 2
10 29 , 0 ) mm 0 , 2 (
27 , 0 54 , 0 log
mm mol L 10 4 , 5
log
: .
= =
= =
= =
T
A
l J
T
R
- -
c
| |
| |
0
0
0
10
log
I
I
T
I I
l J
I
I
A
l J
=
=
= =
c
c
12
Intensidade das transies
Coeficiente de absoro
integrado (vs c, para
avaliar a intensidade de
uma transio)
Momento dipolar da
transio
13
Espectros UV e visvel
14
Princpio de Franck-Condon
As transies
eletrnicas acontecem
muito mais
rapidamente que os
ncleos conseguem
reagir, pois possuem
mais massa que os
eletrons.
Estrutura vibracional
de uma banda.
15
Princpio de Franck-Condon
A transio acontece
para um estado
vibracionalmente
excitado:
Ncleos parados
correspondem a um
desvio mximo do
equilbrio.
ORBITAL MOLECULAR E TRANSIES ELETRNICAS
n
2 1
E =
E = E E h
n n n
n n
H E
H
v
=
( )
A =
Aproximao de Born-
Oppenheimer
e N
| =
Probabilidade de transio proporcional a:
2
2,1
emi
>
exc
E
emi
< E
exc
Deslocamento
de Stokes
EX 3
EX 2
EX 1 EM 1
EM 2
EM 3
Espectro de
Excitaco
Espectro de
Emisso
Comprimento de onda
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
e
Espectros de Excitao e Emisso
Espectro de Absoro vs espectros de excitao e emisso
34
Fluorescncia e o relaxamento do
solvente
O da emisso
(fluorescncia)
maior que o de
absoro
Relaxamento do
solvente
Transferncia de
energia de excitao
ao solvente
35
Processos que causam a
fosforescncia
Diagrama de Jablonski
Desde um estado excitado triplete
(fluor.: estado excitado singlete)
Estado fundamental: singlete (eletrons
emparelhados)
Estado excitado depois de absorver
fotons: singlete
Processo de crusamento intersistemas
(S T)
Por acoplamento entre momento
angular orbital e o momento angular de
spin
Facilitado na presena de tomos
pesados, com uma carga nuclear maior
A transio T
1
S
0
proibida
emisso muito lenta
A fosforescncia mais intensa em
amostras slidas, onde a transferncia
de energia menos eficaz
Rendimento quntico de fluorescncia - |
f
Ou eficincia quntica para fluorescncia ou fosforescncia dada pela
razo entre o nmero total de molculas que fluorescem (ou
fosforescem) e o nmero total de molculas excitadas.
Todos os processos de desativao contribuem para a determinao do
rendimento quntico:
f ISC IC
f
f
k
k k k
| =
+ +
Tipos de transio eletrnica envolvidas na fluorescncia
Raramente se observa fluorescncia para absores no UV para < 250
nm
= 200 nm = 600 kJ/mol - a maioria das molculas possui pelo menos
algumas ligaes que se rompem para energias desta magnitude pr-
dissociao ou dissociao podem ocorrem.
Conseqncias :
Fluorescncia envolvendo transies do tipo o*o raramente
observada.
Fluorescncia comumente observada para transies de menor energia
do tipo t* t e t* n.
As transies t t* (absores) so mais intensas (de maior
probabilidade) do que as n t* emisses fluorescentes envolvendo
orbitais t,t* so as que apresentammaior eficincia quntica.
Determinao de Rendimento
Quntico
Determinado a partir de um padro de
fluorescncia pela expresso.
|
F
= |
F
[(Abs
padro
A
If
amostra
)/(Abs
amostra
A
If
padro
)]
Padro Solvente Regio, nm |
F
Sulfato de Quinina 0,1 M H
2
SO
4
400-600 0,5460,023
9,10-
Difenilantraceno
Ciclohexano 400-500 1,0000,050
2-Aminopiridina 0,1 N H
2
SO
4
315-480 0,6000,050
Triptofano H
2
O pH 7,20 300-380 0,1300,010
Rodamina 101 Etanol 600-650 1,0000,020
Violeta de Cresila Metanol 600-650 0,5400,030
Antraceno Etanol 360-480 0,2700,030
Naftaleno Ciclohexano 300-400 0,2300,020
Benzeno Ciclohexano 270-300 0,0500,020
40
Cintica de decaimento dos
estados excitados
Absoro: 10
-16
10
-15
s
Fluorescncia: 10
-12
10
-6
s
Reaes a partir do estado excitado singlete: 10
-15
10
-12
s
Viso
Fotossntese
Fosforescncia: 10
-6
10
-1
s
Reaes a partir do estado excitado triplete
*] [ * : interna Converso
*] [ * * : mas intersiste Crusamento
*] [ * : cia Fluorescn
* : Absoro
IC IC
ISC ISC
f f
abs abs
S k v S S
S k v T S
S k v h S S
I v S h S
f
i
=
=
= +
= +
v
v
41
Cintica de decaimento dos
estados excitados
Taxa (?) e rendimento quntico de fluorescncia
abs
f ISC IC
f ISC IC
0 0
Velocidade de formao de *:
Velocidade de decaimento de *: [ *] [ *] [ *]
( )[ *]
[ *] [ *] exp( / )
onde [ *] e a concentrao de S* no tempo t
Tempo de vida de fluoresc
t
t
S I
S k S k S k S
k k k S
S S t
S
t
=
=
= + +
=
0
f ISC IC
f
f
f ISC IC
1
ncia :
k k k
k
k k k
t
|
=
+ +
=
+ +
O tempo de vida de fluorescncia o
tempo necessrio para a intensidade
decair para 63,2% do valor inicial.
42
Deduo
) (
*] )[ (
*] [ cia fluorescn de Taxa
*] )[ (
0 *] )[ (
d
*] [ d
io estacionr estado do aprox. - Pequeno *] [
IC ISC f
f
f
IC ISC f
f
abs
f
IC ISC f abs
IC ISC f abs
k k k
k
S k k k
S k
I
S k k k I
S k k k I
t
S
S
+ +
=
+ +
= =
+ + =
= + + =
|
|
Tempo de Vida de
Fluorescncia
Velocidade de despopulao do primeiro estado
singlete excitado para o estado fundamental
t = 10
-4
/ c
mx
t ~ 10
-9
s para molculas com alta absoro
44
Exemplo
O tempo de vida de fluorescncia pode ser
medido.
Exemplo: triptofano em H
2
O; |
f
= 0,20;
t
0
= 2,6 ns;
Ento k
f
= 7,710
7
s
-1
f
f
f IC ISC f
f
IC ISC f
0
1 1
k k k k k
k
k k k
|
t =
|
|
.
|
\
|
+ +
=
+ +
=
45
Supresso (quenching) de
fluorescncia
Remoo de energia
sem emisso
Equao de Stern-
Volmer
| | Q k
Q 0
f
0 , f
1 t
|
|
+ =
46
Derivao
Equao de Stern-Volmer
| | ( )| |
| |
| |
| |
| |
| | Q 1
Q
Q
0 [Q] quando
Q
1
suppressor de presena na
Q
0 * Q
d
*] [ d
[Q][S*] supresso de taxa * Supresso
IC ISC f
Q
IC ISC f
Q IC ISC f
f
Q IC ISC f
IC ISC f
f
f
f,0
IC ISC f
f
f,0
Q IC ISC f
Q IC ISC f
f
f
Q IC ISC f abs
Q
k k k
k
k k k
k k k k
k
k k k k
k k k
k
k k k
k
k k k k
k k k k
k
S k k k k I
t
S
k Q S Q S
+ +
+ =
+ +
+ + +
=
|
|
.
|
\
| + + +
|
|
.
|
\
|
+ +
=
+ +
= =
+ + +
=
+ + +
=
= + + + =
+ +
|
|
|
t
|
47
Supresso (quenching) de
fluorescncia
Intensidade e tempo de
vida so proporcionais ao
rendimento quntico
obedecem a mesma
equao
| | Q k
I
I
Q 0
f
0 , f
0
f
0 , f
1 t
|
|
t
t
+ = = =
48
Exemplo: constante de supresso
Triptofano; O
2
dissolvido
[O
2
]/(10
-2
mol L
-1
) 0 2,3 5,5 8,0 10,8
t/(10
-9
s) 2,6 1,5 0,92 0,71 0,57
49
Exemplo: constante de supresso
Triptofano;
O
2
dissolvido
k
Q
= 1,310
10
L mol
-1
s
-1
| | Q k
Q
0
1 1
+ =
t t
50
T14
Mecanismos de supresso de
estados excitados
De-excitao por colises: S Q S Q
Transferncia eletronica : S Q S Q S Q
Transferncia ressonante de energia : S Q S Q*
*
* ou
*
+ +
+ +
+ + +
+ +
Por colises: eficaz com Q uma espcie
pesada, como tomo I
Ex.: triptofano pode ser suprimido quando est na
superfcie da protena
51
Transferncia eletrnica
Taxa de transferncia: Teoria de Marcus
1. Diminui com a distncia entre S* e Q
2. A
r
G < 0 : o potencial de reduo de S* deve
ser mais baixo que o do Q
3. A energia de reorganizao de S*, Q e
solvente deve ser prxima ao A
r
G
Pode ser estudado usando a
espectroscopia com resoluo temporal
52
Transferncia ressonante de
energia
S* + Q S + Q*
Teoria de Frster
S* e Q devem estar
prximos (ca. nm)
Fotons emitidos por S*
podem ser absorvidos
por Q
6 6
0
6
0
T
f,0
f
T
: rgido sistema
1
R R
R
+
=
=
c
|
|
c
53
Valores de R
0
54
Transferncia ressonante de
energia
Medio de
distncias em
sistemas biolgicos
Calcula-se a distncia
(entre 1 nm e 9 nm)
sabendo o R
0
6 6
0
6
0
T
f,0
f
T
: rgido sistema
1
R R
R
+
=
=
c
|
|
c
55
Exemplo: usar a tcnica FRET
Um aminocido na
superfcie de
rodopsina for
marcado com 1.5-I
AEDANS
Rendimento quntico
foi reduzido de 0,75
para 0,68 (supresso
por retinal)
c
T
= 0,093 (R
0
=5,4 nm)
R=7,9 nm
56
Viso
Xantofila:
transio tt*;
corrige aberrao
cromtica
11-cis-retinal, ligado a
rodopsina: pigmento
visual
Fotoisomerisao:
transio tt*; 200
ps; |=2/3;
em 0,25-0,50 ms
rodopsina fica ativada
57
Viso
Xantofila:
transio tt*; corrige
aberrao cromtica
11-cis-retinal, ligado ao
rodopsina: pigmento
visual
Fotoisomerisao:
transio tt*; 200 ps;
| = 2/3;
em 0,25-0,50 ms
fica a rodopsina ativada
58
Fotossntese
Complexos de pigmentos com protenas
A luz excita a molcula a um estado singlete
0,1 5 ps transferncia por Frster
Passados 100-200 ps, +90% da energia
chega ao centro da reao
Excita-se o dmero de clorofila a
Transfere-se a energia a feofitina a (3 ps)
Transferncia mais rpida que a emisso
(clorofila a: 5 ns)
59
Terapia fotodinmica
O medicamento
sensibiliza o oxignio
singlete
produtos reagentes
*
h
+
+ +
+
2
1
2
1
2
3 3
3
O : Oxidao
O P O P : bilizao Fotossensi
P P : mas intersiste Crusamento
* P P : Absoro v
Exerccios
1) A fluorescncia de uma soluo de um pigmento vegetal iluminada por radiao de 330 nm foi
estudada na presena de um agente de extino, com os seguintes resultados:
[Q]/(mmol.L
-1
) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
I
f
/I
abs
0,31 0,18 0,13 0,10 0,081
Em uma segunda srie de experimentos, a radiao incidente foi extinta e foi observado o tempo de
vida do decaimento de fluorescncia:
[Q]/(mmol.L
-1
) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
t/ns 76 45 32 25 20
Determine a constante de velocidade de extino e a meia-vida da fluorescncia.
R: constante de velocidade de extino = 9,2.10
9
Lmol
-1
s
-1
e meia-vida = 1,9.10
-7
s
2) Diferencie o processo de fluorescncia do processo de fosforescncia mostrando equaes,
diagramas, etc.
3) Discuta o efeito do tamanho da cadeia e estrutura molecular nos espectros de absoro e emisso.
60
61
0,0
2,0x10
-3
4,0x10
-3
6,0x10
-3
0,0
2,0x10
7
4,0x10
7
6,0x10
7
1
/
t
,
s
-
1
[Q], mol/L
Equation y = a + b*x
Adj. R-Square 0,99938
Value Standard Error
C Intercept 3,88743E6 378936,16269
C Slope 9,1462E9 1,14254E8
Referncias
Bibliografia
Atkins, P. W. e Paula, J. de, Fsico-Qumica, 8. ed.,Vol. 2, Rio de
Janeiro, LTC, 2008
Mac Quarrie, D. A. e Simon, J. D., Physical Chemistry A Molecular
Approach, University Science Books, 1997
Leitura recomendada:
1) Principles of Fluorescence Spectroscopy, J. R. Lakowicz, Plenum
Press, 1986.
2) Levine, I. N.; Molecular Spectroscopy; John Wiley and Sons,
1975, New York
62