Manual Bioquimica Clinica - Corregido Julio 2013

[Ao]
Programa Educativo:
Qumico Farmacutico
Bilogo

Manual de Prcticas de
Bioqumica Clnica

Compiladores: M. en C. Rosa Mara
De La A. Escalante Magaa
M. en C. Ligia Ma. Del C.
Tolosa Mendoza
M. en C. J osefina
Graciela Ancona Len
2

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE
CAMPECHE

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

PROGRAMA EDUCATIVO: QUMICO FARMACUTICO BILOGO

MANUAL DE PRCTICAS
DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA CLNICA

UNIDAD DE APRENDIZAJ E: BIOQUMICA CLNICA

SEMESTRE: 5

PERIODO ESCOLAR: AGOSTO / ENERO

HRS/SEM/MES: 6 HRS.

COMPILADOR: M. EN C. ROSA MARA DE LA A. ESCALANTE MAGAA
M. EN C. LIGIA MA. DEL C. TOLOSA MENDOZA
M. EN C. J OSEFINA GRACIELA ANCONA LEN
REVISIN: 01/2013.

CAMPECHE, CAM., JULIO 2013.

3

DIRECTORIO

Lic. Adriana Ortz Lanz
Rectora

Lic. Gerardo Montero Prez
Secretaria General

Mtra. Mara Guadalupe Maldonado Velzquez
Directora
Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas

Mtro. Pedro Pablo K Pech
Coordinador
Licenciatura en Qumico Farmacutico Bilogo.

Mtra. Patricia Margarita Garma Quen
Presidente
Academia de Qumico Farmacutico Bilogo.

4

PRESENTACIN

La Bioqumica es la ciencia que estudia las molculas qumicas que desempean
una funcin biolgica. Gran parte de la historia de la investigacin de esta ciencia
se ha realizado en torno a las enzimas. Muchas de ellas se han aislado en forma
pura y homognea, y alrededor de unas 200 se han podido cristalizar.

Las enzimas son protenas especialidad que realizan rpidamente mltiples
reacciones esenciales que hacen posible la vida en la tierra y de aqu su impacto
en numerosos campos de la ciencia biomdica. Los qumicos se dedican
continuamente al estudio de estas biomolculas ya que tienen la propiedad
especialmente notable de llevar acabo reacciones qumicas con un rendimiento
del 100% en el laboratorio.

El presente manual de prcticas de laboratorio, se ha diseado con la finalidad de
que el alumno, a travs de experimentos sencillos con enzimas comprenda
muchos de los fenmenos bioqumicos que con frecuencia se ponen de
manifiesto en nuestro organismo y en la vida cotidiana. Y adems con base en los
fundamentos tericos que aprenda a interpretar los resultados obtenidos en el
laboratorio relacionndolos con su diario acontecer.

El manual consta de 8 prcticas de laboratorio; las cuales estn estrechamente
vinculadas con el contenido terico de la asignatura. Las primeras 5 prcticas
experimentales muestran los efectos de concentracin tanto del sustrato como de
la enzima, tiempo de incubacin, temperatura y pH sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica. Las ltimas 3 prcticas, se realiza una extraccin previa de la
enzima as como la determinacin de la actividad de amilasa salival, amilasa
pancretica y lipasa pancretica y las ltimas estn relacionadas con el
metabolismo de protenas y cidos nucleicos.

5

Con respecto a las acciones de sustentabilidad, la Universidad Autnoma de
Campeche est comprometida profundamente con el ambiente, como se puede
observar en el Plan de Desarrollo Institucional 2008-2012 y en el Programa
Ambiental Institucional que cuenta con el Sistema de Gestin Ambiental basado en
la Norma ISO 14001:2004 que coordina todas las reas de la institucin para el
logro de los objetivos ambientales. Considerando lo anterior, los Programas
Educativos que comprendan prcticas de laboratorio que generen Residuos
Qumicos y/o Peligrosos, Biolgico Infecciosos (RPBI), deben promover la
sustentabilidad y la cultura ambiental, en la realizacin de las prcticas de
laboratorio.

Por ello, el presente manual comprende prcticas considerando los siguientes
criterios: utilizacin mnima de reactivos qumicos, sustituir reactivos txicos por
otros menos txicos, empleo de tcnicas de microescala y el manejo adecuado de
los residuos que se generan en las mismas. A travs de los diagramas ecolgicos
se muestra de forma esquemtica el desarrollo de cada experimento. Tambin se
considera la composicin qumica esperada en cada etapa, el producto,
subproducto y residuos. De igual forma se explica el tratamiento recomendado
para los residuos y contribuyendo as en el cuidado de la salud y el medio
ambiente.

6

COMPETENCIAS Y SUBCOMPETENCIAS DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE
QUMICA ORGNICA APLICADA.

COMPETENCIA DE LA
UNIDAD DE APRENDIZAJE
Aplicar los principios del metabolismo de
biomolculas para el desarrollo e interpretacin de
tcnicas experimentales de bioqumica clnica
enfocadas a la investigacin clnica del estado
fisiolgico del paciente y de productos naturales con
actividad farmacolgica, siguiendo la metodologa y
tcnicas estandarizadas de la Bioqumica Clnica.

SUB-COMPETENCIAS
1. Usar los principios de cintica enzimtica para
operar e interpretar tcnicas enzimticas de anlisis
de muestras biolgicas, frmacos, materias primas y
productos naturales basados en los fundamentos de
la bioqumica clnica.
2. Analizar las rutas metablicas de los carbohidratos,
lpidos y protenas para inferir los mecanismos de
accin de drogas y frmacos as como el estado
fisiolgico de un organismo vivo, utilizando los
fundamentos de la Bioqumica Clnica.
3. Examinar muestras biolgicas por medio de tcnicas
enzimticas e instrumentales de anlisis para
evaluar las concentraciones de carbohidratos,
lpidos y protenas, siguiendo mtodos
estandarizados de anlisis.

7

NDICE GENERAL

SUBCOMPETENCIA 1 ......................................................................................................... 8
PRCTICA 1. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIN ...................................................................................... 8
PRCTICA 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIN .................................................................................... 14
PRCTICA 3. EFECTO DEL TIEMPO DE INCUBACIN SOBRE LA VELOCIDAD DE LA
REACCIN .................................................................................................................... 20
PRCTICA 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE LA
REACCIN .................................................................................................................... 26
PRCTICA 5. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN
ENZIMTICA ................................................................................................................. 32
SUBCOMPETENCIA 2 ....................................................................................................... 38
PRCTICA 6. EXTRACCIN DE AMILASA SALIVAL Y DETERMINACIN DE SU
ACTIVIDAD ................................................................................................................... 38
PRCTICA 7. EXTRACCIN DE AMILASA PANCRETICA Y DETERMINACIN DE SU
ACTIVIDAD ................................................................................................................... 42
PRCTICA 8. EXTRACCIN DE LIPASA PANCRETICA Y DETERMINACIN DE SU
ACTIVIDAD ................................................................................................................... 47
BIBLIOGRAFIA .................................................................... Error! Marcador no definido.

8

SUBCOMPETENCIA 1

PRCTICA 1. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO
SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN

GENERALIDADES.

Las enzimas son protenas especializadas en las reacciones catalticas de los sistemas
biolgicos. Un catalizador interviene en una reaccin para que sta ocurra ms
rpidamente y una vez que la reaccin se ha completado, queda tal como estaba al
principio. Poseen un elevado grado de especificidad respecto a sus sustratos acelerando
as sus reacciones qumicas especficas.

La cintica de las reacciones catalizadas por la enzima est regulada por la ecuacin de
MICHAELIS-MENTEN que presenta los efectos de la concentracin del sustrato sobre los
ndices de numerosas reacciones enzimticas. La expresin matemtica es:

Vo =Vmax [S]
Km +[S]

Km es la constante de MICHAELIS-MENTEN, la cual tiene las mismas dimensiones de la
concentracin molar y es igual a un medio de la velocidad mxima, producida por la
concentracin del sustrato.

La enzima ureasa, fue la primera enzima cristalizada en 1926 por J ames Summer, la ureasa
provino de la soya cuyo sustrato es la urea, y que al catalizarla produjo la hidrlisis de la
urea convirtindola a amoniaco y dixido de carbono, demostrando as que estos cristales
estaban constituidos por protenas.

La Figura 1 se muestra un complejo enzima-sustrato que ilustra las complementariedades
geomtricas y fsicas entre enzimas y sustratos.

9

Figura 1. Complejo enzima-sustrato

Si las concentraciones del sustrato aumenta y las dems condiciones se mantienen
constantes, la velocidad de las reacciones catalizadas por las enzimas aumentan hasta un
mximo, los aumentos ulteriores en la concentracin del sustrato no producen efectos
adicionales, probablemente porque se ha alcanzado el lmite de velocidad de formacin
de complejo enzima-sustrato y desde se momento la concentracin de la enzima se
convierte en el factor limitante.

OBJETIVO.

Demostrar el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin, por
medio de la cintica enzimtica, para conocer su variabilidad en una reaccin enzima-
sustrato.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS.

MATERIAL Y EQUIPO
10 tubos de ensayo de 15 X 150 mm
2 pipetas graduadas de 10 mL
1 pipeta graduada de 5 mL
10 matraces Erlenmeyer de 25 mL
2 vasos de precipitado de 50 mL
1 gotero
1 bureta graduada de 25 mL
1 piceta con agua destilada
1 propipeta
1 pinza para bureta
1 pinza para tubo de ensayo
1 soporte universal
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 par de Guantes de ltex
1 Googless
Bao mara a 50C (POTE DE PELTRE)

10

REACTIVOS
Enzima ureasa
HgCl2 al 1% (veneno)
Solucin de urea 0.25 M (con 250 Mmolas/mL (reciente)
Rojo de metilo como indicador (solucin alcalina)
Solucin amortiguadora de pH 7.2
Solucin de HCl 0.1 N (50 Mmoles de urea)

TCNICA
Precauciones: tngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos experimentos
bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden inactivar a la enzima e
impedir la observacin de los resultados.
Dispngase una serie de tubos como sigue:

* Cantidad de urea de acuerdo a la muestra
** Cantidad de Sol. Buffer de acuerdo a la muestra de la cual va a ser testigo.
T =testigo (o blanco)
De la muestra 1- 5 todos deben tener un tubo como testigo.

NOTAS:

Mezclar el contenido del tubo despus de agregar cada reactivo. El HgCl2 detiene
instantneamente la accin de la ureasa y despus de su adicin no ocurre cambio
enzimtico en el contenido de los tubos. Remojar los tubos en agua de la llave durante 15
min. Despus del procedimiento anterior, antes de titular.

PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta graduada psese 5mL del contenido del tubo T1 (blanco) a un
matraz Erlenmeyer de 25 mL.
2. Agregue 2 gotas del indicador rojo de metilo, que vira del amarillo en medio
alcalino, al rojo, en medio cido tomando como punto final de la titulacin
Procedimiento/tubos 1 2 3 4 5 Testigos
Urea 0.25 M (mL) 0.5 1.0 2.0 5.0 7.5 *
Sol. Buffer pH 7.2 (mL) 11.5 11.0 10.0 7.0 4.5 **
HgCl
2
1% (gotas) - - - - - 4
Bao Mara 50C (5 min.)
Ureasa (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
HgCl
2
(gotas) 4 4 4 4 4 -
11

cuando el contenido del matraz adquiera un color intermedio (canela) que
debe ser igual para todas las titulaciones de la serie.
3. Titule con HCl 0.1 N agregndole de la bureta poco a poco al mismo tiempo
que se mueve el matraz. Antese los mL de HCl gastados que constituyen la
titulacin del blanco.
4. Repita el procedimiento descrito en los incisos 1, 2 y 3 para los tubos 1, 2, 3,4 y
5, as como sus respectivos testigos (2, 3,4 y 5). Anote los mL de HCl 0.1N
gastados en cada caso.
5. Reste la titulacin del blanco de cada uno de los valores obtenidos, haga una
tabla y grafique micromolas de urea descompuesta en 30 min. contra
micromolas de urea hidrolizadas.

RESULTADOS IDEALES E INTERPRETACIN (ver en anexos el procedimiento de
conversin a micromolas molas)

Tubo Concentracin inicial de
Urea en molas por mL en el
medio
Valores de titulacin
corregidos
Micromolas de
urea hidrolizadas
1
2
3
4
5

CUESTIONARIO

1. Cmo es la concentracin del sustrato con respecto a la velocidad de
reaccin?

2. Qu relacin existe entre la velocidad de reaccin con la Km?

3. Qu cuidados debemos tener en el momento de titular?

4. Por qu titulamos despus de llevada a cabo la reaccin?

5. Qu objetivo se pretende alcanzar en la Prctica No 1?

12

TRATAMIENTO Y DISPOSICIN DE RESIDUOS.

Figura 1. Diagrama ecolgico de la prctica efecto de la concentracin del
sustrato sobre la velocidad de la reaccin.

D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y confinar para su posterior tratamiento.

3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
Solucin Buffer (pH=7.2) +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.

Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
minutos
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Solucin Buffer (pH=7.2)
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
13

BIBLIOGRAFA

1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioqumica. (1
ed.). San J os, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prcticas de Bioqumica. (2 ed.). Mxico: Mc Graw-
Hill / Interamericana.

14

SUBCOMPETENCIA 1

PRCTICA 2. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE LA ENZIMA
SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIN

GENERALIDADES

Las enzimas son catalizadores extraordinarios. Los aumentos de velocidad
conseguidos por las enzimas son de 7 a 14 rdenes de magnitud.

La velocidad de una reaccin es proporcional a la concentracin de la enzima. Por lo
tanto, si el sustrato se encuentra siempre en concentraciones saturantes y medimos
la velocidad de reaccin a distintas concentraciones de la enzima, obtendremos la
lnea recta en nuestra grfica.

La urea es el sustrato sobre el cual acta la enzima ureasa: esta enzima posee una Km
(M) igual a 2.5 x 10
-2
, una constante de Kcat (1/S) igual a 1.0 x 10
4
esta constante es
tambin llamada nmero de recambio de una enzima.

Figura 3. Estructura de una enzima.

Figura 4. Complejo especfico: enzima-sustrato
Enzima
Sustrato
Sitio
activo
15

Empleando una enzima purificada, la velocidad de la reaccin a la concentracin de la
enzima, dentro de un amplio margen de variacin: en forma eventual la
concentracin del sustrato o la acumulacin de productos de reaccin puede limitar
la velocidad.

OBJETIVO

Demostrar el efecto de la concentracin de la enzima sobre la velocidad de la
reaccin, por medio de la cintica enzimtica, para conocer su variabilidad en una
reaccin enzima-sustrato.


MATERIAL Y EQUIPO
1 gotero
1 propipeta
1 pinza para bureta
1 soporte universal
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Googless

REACTIVOS
Enzima ureasa

TCNICA

Precauciones: tngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos
experimentos bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden
inactivar a la enzima e impedir la observacin de los resultados.

16

Dispngase una serie de tubos como sigue con un volumen total de 13.5 mL.

* Por cada tubo un blanco.
** Gotas de HgCl
2

***Dependiendo de la muestra es la cantidad de ureasa aadida al testigo
correspondiente.
Nota: Volumen Total de 13.5 mL

PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada psese 5mL del contenido del blanco a un matraz
Erlenmeyer de 50 mL.
2. Agregue 2 gotas del indicador rojo de metilo, que vira del amarillo en medio
alcalino, al rojo, en medio cido, tomando como punto final de la titulacin
cuado el contenido del matraz adquiera el primer tono rojo, el cual perdure
durante 30 seg. sin cambio alguno.
3. Titule con HCl 0.1 N agregndole de la bureta poco a poco al mismo tiempo
que se mueve el matraz para mezclar perfectamente. Antese los mL de
gastados que constituyen la titulacin Testigo 1.
4. Repita el procedimiento descrito en los incisos 1, 2 y 3 para las muestras 2, 3, y
4. Anote los mL de HCL 0.1N gastados en cada caso.
5. Reste la titulacin del testigo de cada uno de los valores obtenidos, haga una
tabla y grafique micromolas de urea hidrolizada contra mL de enzima
empleada en cada tubo.

RESULTADOS
Tubo mL de
Ureasa
corregidos

Micromolas de urea
hidrolizadas.
1
2
3
4

Procedimiento/tubos 1 2 3 4 Testigos*
Urea 0.25 M (mL) 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5
Sol. Buffer pH 7.2 (mL) 3.5 3.5 3.5 3.5 3.5
HgCl
2
1% (gotas) - - - - 4**
Agua destilada (mL) 1.5 1.0 0.5 0.0
Ureasa (mL) 1.0 1.5 2.0 2.5 ***
HgCl
2
(gotas) 4 4 4 4 -
17

CUESTIONARIO
1. Qu factores pueden afectar la velocidad de reaccin en forma eventual?

2. Qu pasara si en los experimentos aadiramos 10 gotas de HgCl
2
en vez de
4?

3. Qu pasa, si en nuestro material existen residuos de HgCl
2
y por qu?

4. Qu objetivo se prende alcanzar en la Prctica No 2?

18


Figura 5. Diagrama ecolgico de la prctica efecto de la concentracin de la
enzima sobre la velocidad de la reaccin.

D1, D2: Mezclar los residuos de D1 y D2, y resguardar para su posterior
tratamiento.

3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.

Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
19

BIBLIOGRAFA

1. Quesada M.S. (2007). Manual de Experimentos de Laboratorio para Bioqumica.
(1 ed.). San J os, Costa Rica. Editorial Universidad Estatal a Distancia.
2. Flores, A.L. (2008). Manual de Prcticas de Bioqumica. (2 ed.). Mxico: Mc
Graw-Hill / Interamericana.
20

SUBCOMPETENCIA 1

PRCTICA 3. EFECTO DEL TIEMPO DE INCUBACIN SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIN

GENERALIDADES

La manera ms usual de medir la velocidad de una enzima es incubar la preparacin
enzimtica, generalmente de 37- 50C por periodos variables de tiempo y medir el
producto de la reaccin en enzimtica en un tiempo dado. Si la reaccin es lineal en
el tiempo, hasta un periodo determinado, se puede expresar la cantidad enzimtica
en trminos de velocidad, o sea la cantidad de producto formado por unidad de
tiempo de incubacin.

La velocidad de reaccin se expresa generalmente como micromolas de producto
formado por minuto, aunque cualquier otra expresin es correcta, si los valores se
toman dentro de la linealidad de la reaccin.

Las razones de que la grfica de resultados no sea indefinidamente lineal son varias:

1. Que la reaccin haya alcanzado su equilibrio.
2. Que la enzima empiece a desnaturalizarse al cabo de cierto tiempo y pierda
su actividad.
3. Que el producto de la reaccin tenga un efecto inhibitorio sobre la actividad
de la enzima, de modo que esta disminuye cuando el producto llega a cierta
concentracin.

Figura 6. Comportamiento de la velocidad de la reaccin enzimtica.
Medida de la
actividad
enzimtica a
diferentes
tiempos de
incubacin
Y
X
Y/X =velocidad
Y/X =cantidad de
producto
formado/tiempo.
Y/X =velocidad.
21

A concentraciones ptimas de enzima y sustrato y si no hay factores de interferencia
(como la acumulacin de productos de reaccin), la actividad enzimtica es
proporcional al tiempo de incubacin.

OBJETIVO

Demostrar cmo influye el tiempo de incubacin sobre la velocidad de la reaccin,
por medio de la cintica enzimtica, para conocer su variabilidad en una reaccin
enzima-sustrato.


MATERIAL Y EQUIPO
1 gotero
1 propipeta
1 pinza para bureta
1 soporte universal
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Googless

REACTIVOS
Enzima ureasa

TCNICA

Dispngase una serie de tubos como sigue con un volumen total de 13.0 mL
22

Procedimiento 1 2*
Urea 0.25 M (mL) 7.5 7.5
Sol. Buffer pH 7.2 (Ml) 4.5 4.5
Agua destilada (ml) 0.0 1.0
Ureasa (mL) 1.0 0.0
* Testigo

A partir del tiempo de accin de la ureasa, transcurridos 10 min., se extraen 3 mL del
contenido de cada uno de los tubos y se pasan a un matraz Erlenmeyer de 25 mL que
contenga 4 gotas de HgCl
2
al 1%, cuando los 3 mL procedan del tubo 1, y un matraz de
Erlenmeyer vacio para el tubo 2 (testigo).

Se titula a los 20 min., se repite el proceso a los 30 min., se hace la tercera titulacin. La
titulacin es de la forma acostumbrada. Realizar por duplicado.

A los resultados calcule las micromolas de urea hidrolizada a cada tiempo de anlisis.
Admitiendo que las concentraciones de enzima y sustrato son ptimas, es posible considerar
la reaccin como monomolecular y en tal caso la constante de velocidad por la frmula:

K = 1/t log a/(a-x)

En donde: t =es el tiempo en minutos, a =concentracin de urea inicial (sustrato) expresada
como 100%, x =cantidad de urea hidrolizada en %.

1. Determinar k para los tres tiempos de la reaccin.
2. Haga una tabla y grafique: log a/(a-x) contra tiempo y micromolas de urea
hidrolizada contra tiempo.

RESULTADOS

Tiempo de
incubacin
Tubo mL de Ureasa Micromolas de urea
hidrolizadas.
k

23

CUESTIONARIO

1. Cules son las condiciones mnimas para trabajar en el laboratorio con un
buen control de calidad?

2. Qu importancia tiene el cloruro de mercurio en esta prctica?

3. Por qu la cantidad de urea hidrolizada es proporcional al tiempo de
incubacin?

4. Cmo debe ser la grfica que se obtiene?

5. Qu objetivo se alcanz en sta prctica?

24


Figura 7. Diagrama ecolgico de la prctica efecto del tiempo de incubacin sobre
la velocidad de la reaccin.

tratamiento.
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.

Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
25

BIBLIOGRAFA


26

SUBCOMPETENCIA 1

PRCTICA 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA
VELOCIDAD DE LA REACCIN

GENERALIDADES

Las enzimas son los catalizadores de naturaleza proteica de la biosfera, las cuales rompen o
forman enlaces covalentes en los sustratos sobre los cuales actan.

Al igual que ocurre con la mayora de las reacciones qumicas, la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas se incrementan en general con la temperatura, dentro del intervalo
en que la enzima es estable y permanece totalmente activa.

La velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica, aproximadamente, por cada 10C
de aumento de la temperatura (Q
10
=2.0). Sin embargo el coeficiente de temperatura Q
10

varia algo, de una enzima a otra segn la energa de activacin (barrera de energa), de la
reaccin catalizada; que despus de excederla se rompen los enlaces dbiles de hidrgeno e
hidrfobos llegando as a una desnaturalizacin (prdida irreversible de la enzima).

Las enzimas presentan este proceso con una marcada fragilidad trmica a temperaturas
cercanas a los 55C o ms, perdiendo as su estructura terciaria, y como consecuencia se
alteran los sitios alostricos e isostricos. Como consecuencia del proceso anterior para casi
todas las enzimas muestran una temperatura ptima de accin igual o mayor a las
temperaturas de las clulas en las que se encuentran. A temperatura bajas se inactivan pero
recuperan su actividad a temperatura ambiente, sin perder su estructura terciaria.

A temperaturas muy bajas la accin enzimtica se reduce hasta ser nula y al aumentar la
temperatura tambin lo hace la velocidad de la reaccin y al mismo tiempo la velocidad de
desnaturalizacin de la enzima (protena hasta su destruccin total probablemente a
coagulacin por el calor).

El punto de equilibrio entre estos procesos, aumenta de velocidad de la reaccin por la
temperatura y desnaturalizacin en los que constituye la temperatura ptima de accin
enzimtica que es alrededor de 37C para las de origen animal y un poco ms alto 50C
para las procedentes de tejidos vegetales.
27

Se conoce con el nombre de reaccin de VantHoff o coeficiente de temperatura Q
10
, la
proporcin en que aumenta la actividad enzimtica por cada 10C de temperatura.

Figura 5. Desnaturalizacin de una enzima.

OBJETIVO
Demostrar cmo influye la temperatura sobre la velocidad de la reaccin, por medio de la
cintica enzimtica, para conocer su variabilidad en una reaccin enzima-sustrato.


MATERIAL Y EQUIPO
1 gotero
1 propipeta
1 pinza para bureta
1 soporte universal
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Googless
Bao de hielo

REACTIVOS
Enzima ureasa

Arrollamie
nto al azar
Desnaturalizacin
IRREVERSIBLE
(INACTIVA)
Estructur
a terciaria
Estructur
a
primaria
28

TCNICA


Procedimiento 1 2 3 4 Testigo*
Urea 0.25 M (mL) 0.5 1.0 2.0 5.0 7.5
Sol. Buffer pH 7.2 (mL) 11.5 11.0 10.0 7.0 4.5
Bao Mara C (5 min.) 0 22 50 80 **
Ureasa (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Bao Mara 50C (30 min.) 0 22 50 80 ***
HgCl
2
gotas 4 4 4 4 -
Volumen total 12. 5 mL
* Testigo para cada muestra
** Temperatura de cada tubo y en seguida 4 gotas de cloruro mercrico al 1 %.
***Temperatura de cada tubo

La titulacin es de forma acostumbrada como en las prcticas anteriores.

Hgase una tabla y grafique las micromolas de urea hidrolizada contra
temperatura y calcule para distintos intervalos de temperatura entre 10 y 20C
entre 20 y 30C, etc.

RESULTADOS

Tiempo de
incubacin
Tubo mL de
Ureasa
corregidos
Micromolas de
urea hidrolizada

29

CUESTIONARIO

1. Por qu se desnaturalizan las enzimas?

2. Cmo es la actividad enzimtica a 3C?

3. Qu pasara en esta prctica si no utilizo para nada el cloruro mercrico?

4. A qu temperatura acta idealmente la enzima ptialina?

5. Qu objetivo se pretende alcanzar en la prctica nmero cuatro?

6. Por qu en la grfica se obtiene una campana de gauss y explquela?

30


Figura 8. Diagrama ecolgico de la prctica efecto de la temperatura sobre la
velocidad de la reaccin.

tratamiento.
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.

Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
31

BIBLIOGRAFA


32

SUBCOMPETENCIA 1

PRCTICA 5. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE LA
REACCIN ENZIMTICA

GENERALIDADES

La mayora de las enzimas poseen un pH entre 5 y 9 al cual por debajo o por encima de ese
intervalo de pH la actividad disminuye, tambin posee un pH caracterstico al cual su
actividad es la mxima. Al ser solo activas las enzimas en el intervalo antes mencionado, esto
es resultado de los efectos del pH sobre una combinacin de factores:

1. La fijacin del sustrato a la enzima.
2. La actividad cataltica de la enzima.
3. La ionizacin del sustrato y
4. La variacin de la estructura proteica (normalmente, solo significa a pH extremos)

La Figura 5 nos muestra una enzima a pH ptimo y uno elevado.

Figura 9. Comportamiento cido-base de una enzima.

La forma de la curva de pH ptimo est determinada por:

1. Desnaturalizacin de la enzima a pH altos o bajos.
2. Alteraciones en el estado de carga de la enzima y/o sustrato.
3. pH ptimo de la enzima.
4. Cambio a una concentracin ms activa o inactiva.
5. Efectos anteriores combinados.

33

Figura 10. Curva de actividad en funcin del pH de algunas enzimas.

Los cambios extremos en el pH suelen causar la destruccin de la enzima por posible
desnaturalizacin pero cuando se modifica el pH dentro de lmites discretos la actividad de
la enzima vara desde un punto ptimo disminuyendo hacia ambos lados de la zona hasta la
inactivacin completa.

OBJETIVO

Demostrar cmo influye el pH sobre la velocidad de la reaccin cataltica, por medio de la
cintica enzimtica, para conocer su variabilidad en una reaccin enzima-sustrato.


MATERIAL Y EQUIPO
10 tubos de ensayo de 15 X 150
mm
1 gotero
1 propipeta
1 pinza para bureta
1 soporte universal
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Googless

Reaccin catalizada por una enzima
Energa
Sustrato
Producto
Sentido de la reaccin
34

REACTIVOS
Enzima ureasa
Solucin amortiguadora de pH 5.0, 6.0, 7.2, 9.0 Y 10

TCNICA

Precauciones: tngase cuidado en usar los tubos y todo el material de estos
experimentos bien lavados y enjuagados, pues si se queda Hg en ellos pueden
inactivar a la enzima e impedir la observacin de los resultados.


Procedimiento 1 2 3 4 5 Testigos
Urea 0.25 M (mL) en agua 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 *
Sol. Buffer de pH (5 mL) pH 5.0 pH 6.0 pH 7.2 pH 9.0 pH 10 **
***
Ureasa (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
HgCl
2
gotas 4 4 4 4 4 -

* Testigo para cada muestra.
** pH de acuerdo al tubo
*** 4 gotas de cloruro mercrico.

Titular de forma acostumbrada, restando el valor del testigo despreciando las pequeas
diferencias que pudieran deberse al valor de titulacin de los buffers de distinto pH de 7.2

Hgase una tabla y grafique las micromolas de urea hidrolizada a contra los distintos pH.
Seale el pH ptimo para la ureasa.

35

RESULTADOS

Tubo pH Valores de titulacin corregidos Micromolas de urea
hidrolizadas.
1
2
3
4
5

CUESTIONARIO

1. Cul es el objetivo que se persigue en esta prctica?

2. Qu es el pH y cmo influye en la velocidad de la reaccin?

3. Por qu es importante utilizar soluciones buffer en todas las prcticas?

4. Qu le sucede a la ureasa si se somete a un pH de 12?

5. Qu es la desnaturalizacin, qu le sucede a la enzima y por qu se
inactiva?

36


Figura 11. Diagrama ecolgico de la prctica efecto del pH sobre la velocidad de
la reaccin.

tratamiento.
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.
Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.
Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.
Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.

Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
3) Titular con HCl
(0.1 N)
Urea +
ureasa +HgCl
2
+HCl +rojo de
metilo
Urea +
ureasa +HgCl
2

5 mL.

Urea +
ureasa +HgCl
2

D1
D2
2) Bao Mara
50C por 5
1) Bao Mara 50C
por 5 minutos
Urea +
Ureasa
Urea +
ureasa
4 gotas de
HgCl
2
37

BIBLIOGRAFA

38

SUBCOMPETENCIA 2

PRCTICA 6. EXTRACCIN DE AMILASA SALIVAL Y
DETERMINACIN DE SU ACTIVIDAD

GENERALIDADES

Las amilasas son enzimas hidrolticas que degradan el almidn (polmero de glucosa);
para producir glucosa, maltosa o pequeos oligosacridos llamados dextrinas lmite.

La amilasa salival, es una enzima que tambin es conocida como ptialina; esta inicia la
degradacin de los almidones y de glucgeno hasta maltosa, sin embargo, esto es de
poca importancia en el cuerpo debido al corto tiempo que puede actuar sobre los
alimentos. Esta enzima acta en un pH ptimo de 6.8; pero es fcilmente inactiva a pH
4.0 o menos, cesando su actividad en el cido del estmago.

La funcin de la amilasa, es degradar los puentes qumicos entre los monosacridos en
los carbohidratos para producir los polisacridos de cadena larga hacia el disacrido
maltosa. En los alimentos deglutinados contina esta enzima sobre los almidones
durante otros 14 a 30 minutos en el estmago entes de que los cidos estomacales la
inactiven.

Figura 12. Glndulas salivales.
39

Al tratar el almidn con solucin de lugol, da una coloracin azul-oscuro. Al
desdoblarse por la amilasa salival, el almidn por hidrlisis, da dextrinas de peso
molecular menor, el color producido con el lugol es similar a la paja.

OBJETIVO

Demostrar la actividad de la amilasa salival, por medio de una reaccin sencilla, para
conocer dicha actividad cataltica de los carbohidratos.


MATERIAL Y EQUIPO
1 gotero
1 propipeta
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Googless

REACTIVOS
Solucin de almidn
Lugol

TCNICA
Extraer 10 mL de saliva, siendo esta la dilucin. Tomar el pH de la saliva.

PROCEDIMIENTO 1 2 3 4 5 6 Testigo*
Dilucin mL 2.5 2.0 1.6 1.2 0.8 0.5 -
Almidn mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Agua Destilada mL 0.0 0.5 0.9 1.3 1.7 2.0 2.5
Bao Mara a 40C (30
min.)
** ** ** ** ** ** **
Lugol (gotas) 3 3 3 3 3 3 3
* Solo un testigo
** Agitar cada 5 minutos para evitar sedimentacin.
Y se observa la coloracin, anotar los colores y concluir.

40

CUESTIONARIO

1. Por qu las muestras son sometidas a bao mara a 40C durante 30
minutos y no a otra temperatura?

2. Por qu el testigo no se le agrega muestra?

3. Por qu se le agrega lugol a las muestras?

4. Por qu se desarrolla el color?


.

Figura 13. Diagrama ecolgico de la prctica extraccin de amilasa salival y
determinacin de su actividad.

D1: Se inactiva con hipoclorito de sodio al 5% y se desecha en un recipiente de
plstico.

1) Medir pH
2) Agitar
3) Bao Mara a 40C
por 30 minutos.
Saliva
10mL
Saliva +Almidn+
Lugol
Saliva +Almidn+
Lugol
D1
41

BIBLIOGRAFA


42

SUBCOMPETENCIA 2

PRCTICA 7. EXTRACCIN DE AMILASA PANCRETICA Y

FUNDAMENTACIN
Las amilasas son enzimas hidrolticas que degradan el almidn (polmero de glucosa); para
producir glucosa, maltosa o pequeos oligosacridos llamados dextrina lmite.

La amilasa pancretica o amilopepsina, cataliza especficamente la hidrlisis de enlaces
glucosdicos alfa (1-4), al igual que la enzima salival. Los enlaces 1,6 no son hidrolizados por
estas enzimas y por ello se forman las dextrinas. Tampoco los enlaces beta pueden ser
hidrolizados por este tipo de amilasas.

Las amilasas son de utilidad en algunas industrias como la cervecera y textil y en
detergentes biolgicos. Las amilasas industriales se obtienen de diversos microorganismos,
ya que el proceso de obtencin que se realizar en esta prctica, resulta demasiado costoso
y no incluye beta-amilasas.
De la amilasa pancretica se tienen los siguientes datos:
Se activa y se trabaja en condiciones ptimas a un pH de 7.1
Los sustratos sobre los que trabajan son: almidn y glucgeno.
Productos finales o accin: maltosa ms 1:6 glucsidos (oligosacridos) ms
maltosa.

Figura 14. Anatoma del pncreas.
43

Al tratar el almidn con solucin de lugol, da una coloracin azul-oscuro. Al desdoblarse por
la amilasa salival, el almidn por hidrlisis, da dextrinas de peso molecular menor, el color
producido con el lugol es similar a la paja.

OBJETIVO
Demostrar la actividad de la amilasa pancretica extrada del pncreas de un porcino, para
conocer dicha actividad y comportamiento sobre los carbohidratos.


MATERIAL Y EQUIPO
1 gotero
Material para extraccin: mortero y
pistilo de porcelana, navaja, matraz
erlenmayer de 1000 mL

1 propipeta
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Par de Guantes de ltex
1 Googless
Balanza granataria
Placa de agitacin mecnica

REACTIVOS
Solucin de almidn al 5%
Alcohol etlico al 96%
Lugol
Arena lavada y seca 500 g

Material Biolgico:
Un Pncreas de cerdo desengrasado

TCNICA

1. EXTRACTO ENZIMTICO DE PNCREAS.
Pese el pncreas de cerdo, fresco y lo ms desengrasado posible; crtelo en trozos pequeos
y mzclelo en un mortero con arena lavada, agregue a la mezcla 3 veces su peso de agua y
una vez su peso de alcohol etlico al 96%. Deje esta mezcla bien tapada y a temperatura
ambiente, durante 2 das, agitando suavemente en un agitador mecnico.
44

Filtre a travs de 3 capas de grasa y guarde el extracto filtrado en refrigeracin. Este
extracto tiene actividad lipoltica y proteoltica tambin; si se filtra a travs de papel, pierde
la actividad lipoltica

Prepare dos diluciones del extracto pancretico, as: la primera 1:10 y la segunda 1:100,
conservando tambin una parte sin diluir. Rotule los extractos en la forma siguiente:

A-Sin diluir; B-diluido 1:10: C-diluido 1:100

2. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA

Los alumnos se distribuirn en 3 grupos, y cada uno trabajar con una dilucin (A, B, o C).
Prepare una serie de 6 tubos marcados con nmeros progresivos seguidos de la letra que
corresponda a la dilucin que le haya tocado trabajar. Agregue a los tubos lo que se indica en
el cuadro.

Ponga simultneamente todos los tubos en un bao de agua a 40C y almidn al 2%.
Despus de la adicin del almidn, mantenga en el bao exactamente durante media hora,
agitando bien cada 5 minutos. Al completar la media hora se saca los tubos, se ponen en una
gradilla en orden numrico y se agregan a cada uno 3 gotas de disolucin de lugol. Agite.


PROCEDIMIENTO 1 2 3 4 5 6 Testigo*
Dilucin mL 2.5 2.0 1.6 1.2 0.8 0.5 -
Almidn mL 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Agua destilada mL 0.0 0.5 0.9 1.3 1.7 2.0 2.5
Bao Mara a 40C (30
min.)
** ** ** ** ** ** **
Lugol (gotas) 3 3 3 3 3 3 3

* Solo un testigo
** Agitar cada 5 minutos para evitar sedimentacin.

Y se observa la coloracin.

CLCULOS

Una unidad de enzimtica de amilasa se define como el nmero de mL de solucin al 1%,
que pueden ser hidrolizados en 30 min. por 1 mL de extracto, puro, en las condiciones de pH
y temperatura a que se haya trabajado.

De acuerdo con esta definicin, se tomar en cuenta para los clculos, el tubo que haya
presentado hidrlisis total con la menor cantidad posible de extracto. Obviamente, para
45

todas las cantidades mayores de extracto tambin es completa la hidrlisis. Si por ejemplo,
este tubo fue el 3B, dicho tubo contiene 1.6 mL de extracto diluido 1:10 o sea, contiene 0.16
mL del extracto puro. La cantidad de sustrato es 2 mL al 2% o sea, el equivalente a 4 mL al
1%. Por lo tanto.

0.16 mL del extracto hidrolizan 4 mL de almidn al 1%
1.0 mL ------------------- X

En este caso: X =4(1.0)/0.16 =25 unidades de actividad enzimtica.

1.6 mL del extracto hidrolizan 10 mL de almidn al 1%
1.0 mL ------------------- X

En este caso: X =10(1.6)/1.6 =6.25 unidades de actividad enzimtica

CUESTIONARIO
1. Por qu el pncreas debe ser lo ms desengrasado posible y mezclado con arena
lavada?

2. Por qu se guarda en refrigeracin el extracto?

3. Por qu si se filtra el extracto a travs de papel, pierde su actividad lipoltica?, Nos
ayuda esto en algo, s o no y porque?

4. Por qu se debe evitar la sedimentacin?

46


Figura 15. Diagrama ecolgico de la prctica extraccin de amilasa pancretica y

D1 y D2: Se esteriliza en autoclave a 121C y se desecha en recipientes
adecuados.
D3: Se inactiva con hipoclorito de sodio al 5%y se desecha en recipiente
adecuado.

BIBLIOGRAFA


4) Bao Mara a
40C por 30 minutos
1) Agregar agua y alcohol etlico al 96%
2) Agitar durante 2 das.
3) Filtrar
Pncreas de cerdo
+
Arena lavada
Resto de grasa
de Hgado
D1
Extraccin
Resto de Hgado
con arena despus
de la extraccin
D2
Extracto +Almidn al
2%+lugol
D3
47

SUBCOMPETENCIA 2

PRCTICA 8. EXTRACCIN DE LIPASA PANCRETICA Y

GENERALIDADES

Las enzimas exocrinas son aquellas que vierten sus productos en conductos diferentes al
torrente sanguneo. La secrecin pancretica contiene enzimas que atacan a todos los
alimentos principales.

La lipasa pancretica generalmente degrada al enlace ster primario de trigliceroles. Esta
enzima acta en la interfase aceite-agua, de las gotitas finalmente emulsificadas de lpidos
formadas por la agitacin mecnica en el intestino en presencia de los productos de la
actividad de la lipasa lingual, sales biliares, colipasa, fosfolpidos y fosfolipasa. La presencia
de cidos grasos libres a partir de la accin de lipasa pancretica, particularmente de los
triacilgliceroles de la leche.

La lipasa es una enzima lbil y se inactiva en forma irreversible a un pH menor de 4.

Es activada por las sales biliares, fosfolpidos, colipasa a un pH de 8.0. En condiciones
normales, el bicarbonato, las sales biliares y un cofactor sintetizado y secretado por el
pncreas, la colipasa protege a la lipasa de ser inactivada.

La lipasa es una enzima que hidroliza a las grasas neutras hasta sus componentes: glicerol y
tres cidos grasos, y se encuentran en las secreciones pancreticas. Cuando existe una
enfermedad del pncreas y obstruccin de su conducto-secretor, las grasas no son
desdobladas por lo que son absorbidas normalmente producindose un aumento de ellas en
las materias fecales que recibe el nombre de Esteatorrea.

La accin de la lipasa sobre las grasas neutras producen su desdoblamiento hasta cidos
grasos y glicerol, esta accin puede ponerse de manifiesto mediante la titulacin de los
cidos grasos liberados por accin hidroltica de la lipasa con NaOH 0.1 N. Cuando la grasa
no est emulsificada, la superficie que presenta es muy poca, por lo que la accin de la lipasa
es incompleta, pero si hay una buena emulsificacin, la superficie de contacto aumenta y
tambin la accin de la enzima.

48

OBJETIVO

Demostrar la actividad de la lipasa pancretica, extrada de un pncreas porcino, para
conocer la actividad enzimtica sobre los lpidos.


MATERIAL Y EQUIPO
1 gotero

1 propipeta
1 gradilla
1 Cubrebocas
1 Par de Guantes de ltex
1 Googless

REACTIVOS
Crema de leche (media crema) con polvo tornasol (o rojo de fenol 0.04%)
Sol. de NaHCO
3
al 15%
Extracto pancretico o Sol. de pancreatina al 10%
NaOH 0.1 N
Rojo de fenol al 0.04%

Material Biolgico:
Un Pncreas de cerdo (150 gr. aprox.)

TCNICA

1. EXTRACTO ENZIMTICO DE PNCREAS:
Pese el pncreas de cerdo, fresco y lo ms desengrasado posible; crtelo en trozos
pequeos y mzclelo en un mortero con arena lavada, agregue a la mezcla 3 veces
su peso de agua y una vez su peso de alcohol al 96%. Deje esta mezcla bien
tapada y a temperatura ambiente, durante 2 das, agitando suavemente en un
agitador mecnico.

49

Filtre a travs de 3 capas de grasa o gasa y guarde el extracto filtrado en
refrigeracin. Este extracto tiene actividad lipoltica y proteoltica tambin; si se
filtra a travs de papel, pierde la actividad lipoltica


Procedimiento 1 2
Crema dulce diluida al 1% (mL) 5.0 5.0 Diluir a 1:100
Rojo de fenol 0.04% gotas: 5 5
Extracto pancretico fresco (mL) 1.0 - Aadir 5 mL de extracto
Extracto pancretico hervido (mL) - 1.0
NaHCO
3
al 5% gotas 2 2
Hasta color rosa en ambos
Incubar a 37 C 1 hora

Al terminar el perodo de incubacin e hidrlisis el tubo con pancreatina fresca debe
tener color amarillo. El tubo con pancreatina hervida debe conservar el color rosa.
Para hacer cuantitativamente la accin de la lipasa, pesar el contenido de los tubos a
dos veces de precipitado y titular con NaOH 1.0 N hasta neutralizacin completa, lo
cual se observar por el retorno del color amarillo al rosado.

CLCULOS
Calcular los meq. de cido graso liberado por la pancreatina en una hora de incubacin,
aplicando la siguiente frmula:
Gasto del lcali X normalidad del lcali = meq c Grasos libres.

Calcular los miligramos de cidos grasos liberados por la pancreatina en una hora de
incubacin, suponiendo que el peso molecular promedio de un cido graso =265,
aplicando la siguiente frmula:

meq de cido graso X P.M. = mg de cidos grasos liberados

CUESTIONARIO

1. Por qu al terminar el periodo de incubacin e hidrlisis el tubo con
pancreatina fresca debe tener color amarillo?

2. Por qu el tubo con pancreatina hervida debe conservar el color rosa?

3. Por qu el extracto pancretico hervido se emplea como testigo?

4. Por qu se emplea NaOH 1.0 N para titular?

50


Figura 16. Diagrama ecolgico de la prctica extraccin de lipasa pancretica y

D1: Se esterilizan en autoclave a 121 grados C y se desechan en recipiente
adecuado.
D2: Se esterilizan en autoclave a 121 grados C y se desechan en recipiente
adecuado.
D3: Se neutraliza con hipoclorito de sodio al 5 % y se desecha en recipiente
adecuado.

BIBLIOGRAFA

RESTOS DE GRASA DE HIGADO

CONTENIDO DE LOS
TUBOS
D2 D3 D2
D1
RESTOS DE HIGADO CON ARENA
DESPUES DE LA EXTRACCIN
CONTENIDO DE TUBOS: EXTRACTO +
ROJO DE FENOL+ BICARBONATO DE
SODIO

D3
RESTOS DE GRASA DE HIGADO

CONTENIDO DE LOS
TUBOS
RESTOS DE HIGADO CON ARENA
DESPUES DE LA EXTRACCIN
CONTENIDO DE TUBOS: EXTRACTO +
ROJO DE FENOL+ BICARBONATO DE
SODIO

51

BIBLIOGRAFA

3. Conm-Stumpt; et.al. (1996). Bioqumica Fundamental. (5ta. Edicin). Mxico:
LIMUSA.
4. Daz, H. (1995). Bioqumica. (2da. Edicin). Mxico: INTERAMERICANA-Mc-Graw
Hill.
5. Lehninger, A. (1991). Bioqumica. (2da. Edicin). Barcelona, Espaa. OMEGA.
6. Lehninger, A., Nelson, D.L. y Cox, M.M. (1993). Principios de Bioqumica.
Barcelona, Espaa. Ed. Omega.
7. Murria, Robert K; et.al.(1992). Bioqumica de Harper. 13 Edicin. Mxico, D.F.
Ed. El Manual Moderno.
8. Pea, D.A., Arroyo, B.A., Gmez, P.A. y Tapia, I.R. (1995). Bioqumica. (2da
Edicin). Mxico, D.F. Editorial LIMUSA.
9. Scanlon, V. C. (1995). Essential of anatomy and physiology. (2da Edcin).
Philadelphia. Editorial David Company.
10. Toperek, M. (1981). Bioqumica. (3ra. Edicin). Mxico, D.F. Editorial
Interamericana.
11. Tortora, G.J . (1993). Principios de anatoma y fisiologa. (6ta. Edicin). Mxico,
.D.F. Editorial HARLA.
12. Voet, D. et.al.(1992). Bioqumica. (1ra. Edicin). Barcelona, Espaa. Editorial
OMEGA.
52

ANEXOS

53

ANEXO 1
CONVERSIN A MICROMOLAS

54

CONVERSIN A MICROMOLAS

1 mol________1000 milimoles/litro si 1 milimol_________1000 micromoles/litro
entonces

1000 milimoles___X X=1000000 micromoles/litro

Por lo tanto 1 mol_____1'000'000 micromoles/litro
0.25 molar______X X=250,000 micromoles/litro

250,000 micromoles_____1000 mL
X micromoles_____ 1mL

X=250 micromoles/mL

APLICANDO A CADA UNO DE LOS TUBOS QUE CONTIENEN DIFERENTE
CONCENTRACIN DE SUSTRATO (UREA) 0.25 M NO DEBE QUEDAR DE LA
SIGUIENTE MANERA:

Tubo 1 S 250 micromoles______1 mL
X_________________0.5 mL

X=125 micromoles de Urea entre los 12.5 mL de volumen total nos
queda

125 micromoles de Urea = 10 micromoles/mL
12. 5 mL de Vol. total en el tubo

Tubo 2 Si 250 micromoles ____1 mL
X _______________ 1 mL
55

queda


Tubo 3 Si 250 micromoles ____1 mL
X _______________ 2 mL

queda


CALCULAR LOS DEMS TUBOS
Cada molcula de UREA da origen a 2 iones de amonio que reaccionan con el HCl
0.1N que contiene 100 micromoles por mL, por lo que 1 mL de sta solucin vale
100 entre 2 nos da 50 micromoles de urea, factor que se debe multiplicar por los
micromoles de UREA hidrolizadas despus de la titulacin y que son
transformadas en amoniaco.
La titulacin corregida se obtiene restando la titulacin del blanco de los
valores obtenidos en los dems tubos y sta cifra es multiplicada por 50.
Se realiza la grfica con los valores de Urea inicial en micromolas en el medio
contra los valores en micromolas de Urea hidrolizada.

56

ANEXO 2
FORMA DE REPORTE DE PRCTICA DE LABORATORIO

57

FORMA DE REPORTE DE PRCTICA DE LABORATORIO

PORTADA

Logotipo de la UAC y de la Facultad o Escuela
Nombre de la Universidad
Nombre de la Facultad o Escuela
Nombre del programa educativo
Nombre de la asignatura
Grado en el que se imparte
Perodo escolar en el que se imparte
Nombre del maestro responsable de la asignatura
Nombre de los integrantes del equipo de trabajo
Fecha de elaboracin

NMERO DE LA PRCTICA

NOMBRE DE LA PRCTICA

INTRODUCCIN
Incluye justificacin, objetivo e hiptesis de la prctica

MARCO TERICO
Incluir citas bibliogrficas

METODOLOGA UTILIZADA
Incluye procedimientos, materiales equipos, reactivos de laboratorio y
muestras problema y/o
Biolgicas utilizadas.

RESULTADOS OBTENIDOS
En estos resultados se pueden incluir dibujos, tablas o grficas.

OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

CUESTIONARIO RESUELTO

BIBLIOGRAFA CONSULTADA

58

ANEXO 3
LINEAMIENTOS GENERALES DE SEGURIDAD E HIGIENE EN EL LABORATORIO Y
MARCO JURDICO
59

LINEAMIENTOS GENERALES EN MATERIA DE SEGURIDAD E HIGIENE A SEGUIR EN LOS
LABORATORIOS

Las actividades de carcter docente e investigador que se llevan a cabo en las
prcticas de laboratorios del Programa Educativo de Qumico Farmacutico Bilogo
de la Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas (FCQB) de la Universidad Autnoma
de Campeche (UAC) conllevan, en determinados casos, un riesgo dependiendo del
tipo de trabajo que se desarrolle.

Este documento recoge los lineamientos necesarios para llevar a cabo un trabajo
seguro y eficiente atendiendo a las indicaciones del Reglamento Federal de
Seguridad e Higiene y Medio ambiente de Trabajo, publicado en el Diario Oficial de
la Federacin, el 21 de enero de 1997, Normatividad en materia de Seguridad e
Higiene de la Secretaria del Trabajo y Previsin Social, Sistema de Gestin
Ambiental Yum Kaax ISO 14001:2004 de la Universidad Autnoma de Campeche y
Reglamento Interno de los Laboratorios en los que se realizan prcticas de
docencia de la FCQB de la UAC.

Solo se permitir trabajar a los alumnos bajo la responsabilidad de un
profesor o de la persona asignada de manera previa por el Coordinador
del Programa Educativo o de Posgrado e Investigacin.
Realizar nicamente tareas enmarcadas en el mbito de trabajo del
laboratorio para las que ha sido autorizado.
Se deber llevar siempre la bata de manga larga y los equipos de
proteccin individual exigidos segn el tipo de trabajo que se realice
(goggles, mascarilla protectora, guantes de latex, calzado cerrado que
cubra el empeine, de tacn ancho o corrido con altura mxima de 4 cm,
de piel, que no sea de tela ni de material plstico, incluida la suela)
segn lo solicite el profesor.
No se permite ingresar con bermudas o short y, en el caso de las mujeres,
el largo de la falda debe ser debajo de la rodilla.
Hombres y mujeres con cabello largo debern portar el pelo recogido
hacia atrs.
No llevar pulseras, colgantes, mangas anchas ni prendas sueltas que
puedan trabarse en montajes, equipos o mquinas.
No fumar, comer ni beber.
No realizar reuniones o celebraciones.
No guardar alimentos ni bebidas en los frigorficos del laboratorio.
Mantener el orden en las sesiones de laboratorio y tratar con respeto al
laboratorista, compaeros y profesores.
Verificar que el material y los equipos de laboratorio a emplear se
encuentren en ptimas condiciones de funcionamiento.
Antes de hacer uso de cualquier material y/o equipo consulte su
operatividad con el laboratorista.
Mantener las mesas de trabajo limpias y sin objetos personales en las
superficies (libros, cajas o accesorios innecesarios) para el trabajo que se
est realizando.
60

Tener la autorizacin para el uso de un producto, equipo o instalacin
concreta.
Lavar y enjuagar todo el material de vidrio con agua destilada y secarlo.
Leer la etiqueta o consultar las fichas de seguridad de productos
qumicos antes de utilizarlos por primera vez.
Para efectuar pipeteos utilice siempre propipeta o perilla
No tocar ni probar, sin el uso de guantes a los productos qumicos.
Calentar tubos de ensayo de lado y utilizando pinzas.
Por su seguridad utilizar gradillas y soportes.
Comprobar la temperatura de los materiales antes de sujetarlos
directamente con las manos.
En caso de ser necesario utilizar las campanas de extraccin.
Etiquetar adecuadamente los frascos y recipientes a los que se haya
transvasado algn producto o donde se hayan preparado mezclas,
identificando su contenido, a quin pertenece y la informacin sobre su
peligrosidad (reproducir el etiquetado original).
Reportar cualquier accidente o anomala ocurrida durante la prctica, de
manera inmediata al laboratorista.
Salvaguardar todos los implementos y dispositivos de seguridad e
higiene (extintor, sealamientos, regadera y lavaojos de emergencia,
etc.) habilitados en el interior del laboratorio.
Revisar la Normativa correspondiente de acuerdo a la NOM-062-ZOO-
1999, Cuidado y uso de animales de laboratorios y la NOM-087-
SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin ambiental-Salud ambiental-Residuos
peligrosos biolgico-infecciosos-Clasificacin y especificaciones de
manejo para el caso de emplear animales de laboratorio y muestras
biolgico-infecciosas respectivamente.
El material y equipo que se rompa o sufra desperfectos en el transcurso
de la prctica, se deber reportar al laboratorista de inmediato.
Asegurar la desconexin de equipos, agua y gas al terminar el trabajo.
Recoger materiales, reactivos, equipos, y depositar los residuos en los
contenedores correspondientes.
Lavarse las manos antes de dejar el laboratorio.

61

MARCO JURDICO

Reglamento Federal de Seguridad e Higiene y Medio ambiente de Trabajo.
Publicado en el Diario Oficial de la Federacin (D.O.F.), el 21 de enero de
1997.
NOM-002-STPS-2010, Condiciones de seguridad - Prevencin y proteccin
contra incendios en los centros de trabajo. D.O.F. 9-XII-2010.
NOM-005-STPS-1998, Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en
los centros de trabajo para el manejo, transporte y almacenamiento de
sustancias qumicas peligrosas. D.O.F. 2-II-1999
NOM-010-STPS-1999, Condiciones de seguridad e higiene en los centros de
trabajo donde se manejen, transporten, procesen o almacenen sustancias
qumicas capaces de generar contaminacin en el medio ambiente laboral.
D.O.F. 13-III-2000.
NOM-017-STPS-2008, Equipo de proteccin personal - Seleccin, uso y
manejo en los centros de trabajo. D.O.F. 9-XII-2008.
NOM-018-STPS-2000, Sistema para la identificacin y comunicacin de
peligros y riesgos por sustancias qumicas peligrosas en los centros de
trabajo. D.O.F. 27-X-2000.
NOM-026-STPS-2008, Colores y seales de seguridad e higiene, e
identificacin de riesgos por fluidos conducidos en tuberas. D.O.F. 25-XI-
2008.
NOM-028-STPS-2004, Organizacin del Trabajo-Seguridad en los Procesos
de sustancias qumicas. D.O.F. 14-I-2005.
NOM-062-ZOO-1999. Cuidado y uso de animales de laboratorio. D.O.F. 18-
VI-2001.
NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin ambiental-Salud ambiental-
Residuos peligrosos biolgico-infecciosos-Clasificacin y especificaciones
de manejo. D.O.F. 17-II-2003.
NOM-052-SEMARNAT-2005, que establece las caractersticas, el
procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los residuos
peligrosos. D.O.F. 23-VI-2006.
Sistema de Gestin Ambiental Yum Kaax de la Universidad Autnoma de
Campeche. Octubre 2010.
Reglamento Interno de los Laboratorios en los que se realizan prcticas de
docencia de la Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas de la Universidad
Autnoma de Campeche. Agosto de 2012.

Manual Bioquimica Clinica - Corregido Julio 2013

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