APUNTES PARA LA CONFERENCIA DE INGENIERIA METABOLICA.

La ingeniera gentica de plantas surgi a principios de los aos 1980, cuando se

descubre como transferir fragmentos de informacin gentica de un organismo vegetal a
otro, permitiendo la expresin de caracteres deseables. Desde entonces, el desarrollo de
las tecnologas de transformacin y regeneracin de plantas ha sido tal que ha permitido
realizar modificaciones que parecan impensables.

Las primeras aplicaciones comerciales de la modificacin gentica de plantas se
encaminan a la obtencin de cultivos que presenten ventajas agronmicas como
tolerancias a herbicidas, resistencias a plagas y patgenos o tolerancia a condiciones
adversas como sequa y salinidad. El cultivo de estas plantas proporciona beneficios a los
agricultores debido a que implican mayores rendimientos y/o menores costos de
produccin.

La segunda generacin de plantas transgnicas corresponde a plantas que presentan
mejores propiedades organolpticas y nutricionales. Las modificaciones que se realizan
en estas plantas son ms complejas, ya que se encuentra implicado un mayor nmero de
genes. Se considera que los beneficios de este tipo de plantas repercuten tanto en los
productores de alimentos como en el consumidor final.

En ambos casos se trata de plantas modificadas genticamente utilizadas para la
elaboracin de alimentos destinados al consumo humano y animal.

Existe una tercera generacin de plantas transgnicas que corresponde a plantas
modificadas genticamente para producir compuestos de alto valor aadido. En este caso
no se busca la produccin de alimentos, sino que se pretende que la planta se convierta
en una BIOFACTORIA de productos de inters en los campos biosanitarios, farmacetico
o industrial.

Con el desarrollo de plantas modificadas genticamente en un sentido amplio se persigue
la creacin de nuevas variedades de plantas utilizando tcnicas de ingeniera gentica.
Los objetivos que se han de perseguir para la obtencin de estas plantas pueden ser
mltiples y van desde la obtencin de plantas con mejores caractersticas de inters
agronmico, hasta la utilizacin de las plantas como biofactoras, pasando por el diseo
de plantas con mejores valores nutricionales.

Cuando hablamos de plantas como biofactoras, nos referimos al cultivo a escala agrcola
de plantas superiores que han sido transformadas de modo que pasen a expresar
productos que no expresaban anteriormente (o que expresaban en cantidades muy
pequeas) y que poseen un elevado valor aadido. Pueden usarse plantas
tradicionalmente usadas para la obtencin de alimentos, piensos u otros productos como
fibras u otras especies.

La modificacin gentica de la planta da lugar a la expresin de una nueva protena que la
planta no posea. Esta protena puede ser el producto de inters que se desea obtener, o
bien puede ser una enzima que modifique una ruta metablica de la planta, y como
consecuencia sta pasa a expresar un nuevo compuesto que anteriormente no produca.
En el primer caso se habla de agricultura molecular y en el segundo de ingeniera
metablica.

La INGENIERIA METABOLICA se puede definir como la tecnologa que se ocupa de la
manipulacin del ADN que forma parte o regula las vas metablicas del organismo
estudiado, con el fin ltimo de manipular las vas metablicas del organismo.

Otras definiciones:

Manipulacin de los procesos metablicos mediante tecnologa recombinante con el
objetivo de mejorar las propiedades de los microorganismos.

Mejora dirigida de las propiedades celulares mediante I.G. para modificar o introducir
nuevas reacciones bioqumicas especficas.
Alteracin racional y dirigida de las rutas metablicas de un organismo para mejor
comprender y utilizar las rutas celulares en transformaciones (conversiones),
transduccin de energa y ensamblaje supramolecular.
Es un campo interdisciplinario que usa principios y tcnicas de varios mbitos: ciencias
computacionales, gentica, bioqumica, ciencia de los sistemas, biologa celular y
molecular, ingeniera bioqumica. El inters estriba en redirigir los flujos metablicos para
objetivos industriales y mdicos.

Incrementar productividad del proceso (ejemplo, produccin de antibiticos)

Incrementar la produccin de precursores biosintticos o polmeros

Ampliar capacidades metablicas aadiendo actividades extrnsecas.
El deseo de tener modelos detallados dinmicos (cinticos) del metabolismo elucidando el
comportamiento sistmico de las redes metablicas comienza a ser factible en la era
postgenmica. Ahora tenemos la perspectiva de elaborar catlogos de partes de los
componentes del metabolismo en razas concretas. A partir de esa informacin es posible
reconstruir redes metablicas a escala celular y recabar informacin sobre la estructura y
estequiometra de la red y de sus reacciones. Se pueden pues construir modelos
metablicos a escala genmica.
La fisiologa de las redes complejas como el metabolismo es una funcin de mltiples
componentes que interaccionan. Por lo tanto, para comprender la funcin del metabolismo
en tanto ligado a la fisiologa celular global se necesita un enfoque holstico del estudio del
metabolismo. Esa comprensin de la funcin sistmica de una red metablica es
obligatoria para el xito del campo de la ingeniera metablica.
El control del flujo metablico es el objetivo primario de la ingeniera metablica. El flujo
metablico se define como la tasa a la que el material se convierte va reacciones y rutas
metablicas. Para ello debemos comprender los factores que influyen en el flujo. Una vez
que uno entiende el flujo metablico, se ha dado un paso hacia la comprensin del
metabolismo celular, con lo que el ingeniero est en posicin de alterar el genotipo de la
clula en la esperanza de lograr el fenotipo deseado.
Objetivos:
1. Aumentar la produccin de metabolitos demasiado caros de obtener por sntesis
qumica o para introducir una nueva capacidad.
2. Organismos con nuevas capacidades catablicas, de gran inters en aplicaciones
ambientales o en microorganismos industriales que puedan crecer usando
sustratos diferentes y ms baratos para la obtencin de vitaminas, aminocidos,
antibiticos, etc.
3. Propiedades celulares que sean beneficiosas en el proceso industrial: evitacin de
productos txicos como el acetato y desvo hacia productos menos txicos (etanol,
acetolactato). Escherichia coli con compuestos portadores de oxgeno, lo que le
permite mejorar en condiciones de limitacin de oxgeno.
La ingeniera metablica ya se haca, pero se han logrado resultados inesperados cuando
las enzimas se sobreexpresan o se reprimen. Lo impredecible de la respuesta metablica
a las alteraciones genticas se debe a la naturaleza multignica de la funcin metablica.
Por lo tanto, no basta entender la funcin de una enzima o de una ruta aislada para
describir la respuesta holstica del sistema al cambio gentico. Por lo tanto, para que la
ingeniera metablica se beneficie de la ingeniera gentica, hace falta comprender las
funciones multignicas, y para ello necesitamos la genmica.
Tras terminar un proyecto genoma, hay que identificar los genes o las ORFs, mediante:

Bsqueda por contenido

Bsqueda por seales

Mtodos integrados
Con el subconjunto de genes que codifican las enzimas metablicas se puede construir
una red de reacciones metablicas. Se puede escribir un balance de flujo para cada
metabolito, y con el tiempo, en el estado estacionario, los flujos se deben equilibrar para
evitar una acumulacin significativa del metabolito en la red. La estequiometra de todas
las reacciones de la red se puede representar por una matriz estequiomtrica
Sv =0

S es la matriz estequiomtrica de m x n

m es el nmero total de metabolitos

n es el nmero de flujos metablicos)
v es el vector de n flujos metablicos
Tpicamente el sistema est indeterminado donde m>n. Pero bajo ciertas condiciones
algunas rutas no son operativas y se pueden obviar. El sistema se puede hacer
totalmente determinado o supradeterminado y se puede resolver junto con las medidas de
los flujos externos o internos. Los mtodos no invasivos de anlisis, como la RMN pueden
proporcionar tambin informacin sobre la estructura de la red.
Para determinar el estado metablico hay que resolver esa ecuacin para los flujos
metablicos (v), lo que entonces indicar el estado metablico de la clula bajo las
condiciones definidas. La matriz S es el componente clave del anlisis de flujo, y se puede
derivar de la informacin genmica.
El sistema indeterminado origina un rango infinito de soluciones a la ecuacin, pero las
reales residen en un subconjunto llamado el set factible. Este se puede definir como las
capacidades del genotipo metablico de un organismo, puesto que define todas las
distribuciones de flujo que se pueden lograr con un juego particular de genes metablicos.
El uso particular del genotipo metablico bajo unas condiciones concretas se puede
definir como fenotipo metablico desplegado en esas condiciones.
Estos modelos han tenido una gran aceptacin en microorganismos y para la
caracterizacin de las vas metablicas en plantas. Estos modelos comienzan con un
mapa metablico, donde los datos de entrada representan las medidas del tamao de los
pools de intermediarios y productos finales y las velocidades de flujos son calculadas a
partir de datos del marcaje isotpico in vivo. Lo ms importante de estos modelos consiste
en su potencial para predecir el impacto de una modificacin (por ejemplo. Insercin de un
transgenes en una etapa del mecanismo) sobre el flujo de la va metablica.
Por ejemplo: Se requiere estimular la sntesis de colina (metabolito secundario), y para
ello se estimula la sntesis de glicina-betana. Se hace el traspaso desde hojas de
espinaca (acumuladora de glicina betaina) hasta el tabaco (no acumuladora de glicina
betana).
Otro concepto empleado es la Ingeniera metablica inversa, definida por Bailey (1996).
La elucidacin de una estrategia de IMI pasa por las siguientes etapas:
1) Identificacin, construccin o clculo de un fenotipo deseado.
2) Determinacin de los factores ambientales o genticos que le confieren dicho
fenotipo.
3) Introduccin del fenotipo sobre otra cadena u organismo por manipulacin
ambiental o gentica dirigida.
En estos momentos no solo la escala celular es vlida en las transformaciones
metablicas, sino que tambin debe considerarse la protemica y de las tcnicas
metabolnicas (metaboln y canales metablicos), que nos permiten medidas
eficientes de muchos metabolitos.
La formacin del metaboln (sistema multienzimtico organizado) tpicamente incluye
interacciones especficas entre varias enzimas solubles que pueden ser unidas a una
membrana por enlaces membrana-protena estructural, que sirven como sitios nucleares
para la formacin del metaboln o por protenas unidas a membranas. Un ejemplo
particular es el empleo del citocromo P450s, que cataliza una o ms reacciones
secuenciales en el metabolismo secundario de las plantas. La bicapa lipdica del retculo
endoplasmtico de las plantas sirven de modelo para este estudio.
Usualmente las enzimas multimricas poseen una menor actividad o inactividad cuando
las subunidades constituyentes estn disociadas. La agregacin o disociacin de las
subunidades es normalmente inducida por enlazamiento de una molcula efectora de
pequea masa molar, pero puede tambin ser favorecido por modificacin covalente
reversible.
La microcompartimentacin de enzimas y mecanismos metablicos los cuales pueden
resultar a partir de determinadas interacciones, pueden aportar un importante significado
en la via de control metablica:
1) por transferencia directa o canalizacin de intermediarios entre enzimas
consecutivas.
2) Alterando propiedades cinticas de la enzima debido a cambios conformacionales
que existen durante el enlazamiento.
Ha sido sugerido, en consecuencia, que la activacin de vas metablicas tales como la
gliclisis puede existir no solamente por regulacin alostrica y modificacin covalente de
las enzimas claves, sino tambin por alteracin del fraccionamiento de enzimas desde la
fase soluble a la de enlazamiento. Varios estudios han aportado evidencias que hay una
directa canalizacin de sustratos entre las enzimas de la va pentosas-P en cloroplastos
iluminados y que dichas enzimas aparecen como un complejo proteico supramolecular el
cual puede asociarse reversiblemente con las membranas tilacoides en la luz.