Tecnolgico de Monterrey

Campus Guadalajara














PCR en tiempo real con sonda TaqMan











Claudia Del Toro Runzer A01222071
Sebastin Patio Valenzuela A01222331
Francisco Andrs Robles Escoto A01133410
Ricardo Hernndez Medina A01226072
Vicente Pal Armenta Prez A01112119
Ingeniera Gentica
Grupo 1
Dra. Clara Patricia Ros Ibarra
Introduccin
El mtodo de PCR fue desarrollado por Kary Mullis en 1980. Esta tcnica permite
generar millones de copias de un segmento especfico de DNA. Lo cual facilita la
manipulacin del DNA tanto en prcticas comunes como la clonacin como en
esfuerzos ambiciosos, como el Proyecto Genoma Humano. (Valasek y Repa, 2005).
En 1992, Higuchi y sus colaboradores de Roche Molecular Systems y Chiron
hicieron la primera demostracin de la PCR en tiempo real. Incluyeron un colorante
fluorescente, bromuro de etidio (BrEt), en la PCR realizada bajo luz UV. Desde 1966 se
saba que la fluorescencia del BrEt aumentaba al unirse a los cidos nucleicos, por lo
que su adicin permiti a los investigadores video grabar y visualizar por primera vez la
amplificacin en tiempo real. (Valasek y Repa, 2005; De Dios, Ibarra y Velasquillo,
2013).
En la PCR convencional es necesaria la preparacin de geles de agarosa para
visualizar los amplicones a travs de una electroforesis y saber si la reaccin transcurri
eficientemente. La PCR en tiempo real no solo omite este paso sino que permite una
deteccin y cuantificacin ms sensible de los cidos nucleicos. (De Dios, Ibarra y
Velasquillo, 2013). Los agentes intercalantes fueron sustituidos por nuevos mtodos
como las sondas TaqMan ya que detectaban acumulacin tanto de productos de PCR
especficos como no especficos, adems de poseer un gran poder mutagnico y
posiblemente ser cancergenos o teratgenos.
As pues, la PCR en tiempo real con sondas TaqMan proporcionan una
alternativa altamente especfica, rpida, sencilla y segura para cuantificar la cantidad de
material gentico amplificado. El mtodo y fundamento de esta tcnica se explica a
detalle ms adelante.


Diagrama de flujo




Diagrama 1. Proceso de PCR en tiempo real mediante sonda TaqMan



Glosario

apagador o
quencher
colorante que se une al extremo 3' de la sonda y absorbe la seal del
reportero cuando se sitan prximos entre s (Valasek y Repa, 2005)
Amplicn segmento corto de DNA que resulta de la amplificacin
cebador o
primer
secuencia de oligonucletidos complementaria a la secuencia que se
va a amplificar (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)
molde o
templado
cadena de DNA o cDNA que funciona como molde para la polimerasa
(De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)
PCR reaccin en cadena en la que se aprovecha una polimerasa de DNA
para amplificar durante varios ciclos una secuencia especfica de
DNA (De Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013)
PCR en tiempo
real (qPCR)
variante de la tcnica de PCR en la que se detecta y cuantifica en
tiempo real la amplificacin de cidos nucleicos gracias a la
incorporacin de fluorforos en la reaccin (De Dios, Ibarra y
Velasquillo, 2013)
Reportero colorante que se une al extremo 5' de la sonda y emite una seal de
fluorescencia cuando se separa del aceptor (Valasek y Repa, 2005)
sonda de
hidrlisis
cebador de DNA unido covalentemente a un fluorforo en cada uno
de sus extremos (Bookout y Mangelsdorf, 2003)
Taq
polimerasa
polimerasa de DNA proveniente del microorganismo
Thermusaquaticus, es una enzima termoestable que posee actividad
exonucleasa de 5' a 3' (Holland et al, 1991)
transferencia
de Frster
(FRET)
proceso de deslocalizacin de un estado de excitacin localizado
entre una molcula reportera o donadora y un aceptor (Knox, 2012)
Discusin
El principio se basa en la misma tcnica que una PCR convencional solo que la forma
en detectar y analizar los productos es diferente. TaqMan cuenta con una sonda, la
cual tiene dos tipos de fluorforos, cada uno colocado en un extremo de la misma. En el
extremo 5 se encuentra el reportero (usualmente un compuesto de onda larga, como
verde) y en el extremo 3, el apagador (usualmente un compuesto de longitud de onda
corta, como rojo). El apagador reduce la fluorescencia del reportero mientras sigan los
dos en la sonda. Esto lo logra gracias al fenmeno FRET (Fluorescence Resonance
Energy Transfer), el cual es una inhibicin de un tinte por otro sin emisin de un protn
(Pierce, 2003).
La sonda TaqMan est diseada para unirse a su seccin complementaria del
DNA desnaturalizado. Una vez que la sonda se ha unido, el reportero contina sin
fluorescencia ya que sigue unido al apagador. Ya que comienza la fase de
alineamiento, los primers dan paso a la actividad de la Taq polimerasa. La enzima
comienza a sintetizar DNA en direccin 5 3 hasta llegar al reportero, al cual corta
gracias a la actividad exonucleasa 5 3 de la polimerasa Taq. Esto separa al
reportero del apagador, por lo que el primero automticamente emite fluorescencia, la
cual es cuantificada por una computadora (Pierce, 2003).
Una vez que terminan los ciclos de la PCR de tiempo real y se obtienen las
curvas de fluorescencia correspondientes a cada uno de los ciclos se debe proceder a
interpretar los resultados obtenidos.
En la curva de resultados se observa cada uno de los ciclos de PCR asociado a
un valor correspondiente de fluorescencia. Se observa una lnea de base donde los
valores por debajo de esa lnea no emiten fluorescencia significativa y por lo tanto
corresponden a los valores basales. La lnea del umbral delimita los puntos en donde
los valores de fluorescencia son significativos y corresponde al crecimiento exponencial
de la grfica. El umbral es indispensable para calcular el ciclo umbral, el cual
corresponde al primer punto donde se supera el umbral. Este valor es el que se utiliza
para llevar a cabo la cuantificacin de material gnico. Normalmente la estimacin del
ciclo umbral (C
T
) se realiza por los equipos de PCR-TR.
Existen dos mtodos principales para realizar la cuantificacin de material
gentico a partir de los valores de los C
T
:
El primero de ellos consiste en realizar una curva de calibracin a partir de
muestras estndar de concentracin conocida y una vez construida la curva de
calibracin se extrapola el valor de C
T
experimental.
El segundo mtodo de cuantificacin es el de C
T
en donde se comparan los C
T

del gen testado y el de referencia para cada muestra y posteriormente se
comparan los C
T
de una muestra experimental y una muestra control (SGIker,
2014).
Algunas de las ventajas de este mtodo es que es altamente especfico, ya que la
seal fluorescente se genera slo cuando la sonda complementaria se une con su
secuencia blanco para despus liberar el colorante reportero por la actividad
exonucleasa. As mismo esta tcnica tiene capacidad de multiplexacin, las sondas
pueden etiquetarse con diferentes colorantes (con distintos espectros) en la seccin
reportera 5, por lo que es posible la amplificacin y deteccin de diferentes secuencias
en un mismo tubo de reaccin. Otra ventaja es su alta capacidad de reproducibilidad ya
que en la pgina de la empresa creadora y distribuidora de este producto, hay una
amplia base de productos TaqMan especficos para diferentes experimentos. Los
niveles de cuantificacin son altos y precisos adems no hay necesidad de llevar acabo
procesos pos-PCR lo cual reduce costos y tiempo. No obstante, la sntesis de distintas
sondas para diferentes secuencias hace que el diseo de las mismas sea complejo y
con un costo algo elevado (Life Technologies, 2014).
Existen mltiples aplicaciones de esta tcnica, puede ser til para la
investigacin del cncer, para el descubrimiento y desarrollo de nuevos medicamentos,
para estudios epigenticos, ciencia vegetal, por mencionar slo unas cuantas; sin
embargo este mtodo es una herramienta directa para realizar estudios sobre: cmo,
dnde y bajo qu condiciones ocurre la expresin gentica, qu la desencadena y qu
la detiene; permite realizar cuantificacin de DNA; realizar estudios CHIP
(inmunoprecipitacin de cromatina) los cuales son mtodos para el anlisis de las
modificaciones epigenticas y secuencias de DNA genmico unido a protenas
reguladoras especficas; permite cuantificar la cantidad de SNPs (polimorfismos de un
solo nucletido) por discriminacin allica; proporciona una herramienta para la rpida
deteccin de mutaciones, para el anlisis de protenas y es una novedosa tecnologa
para el estudio de microRNA y ncRNA (no codificante), la cual es una nueva rea en la
biologa molecular en la cual recientes experimentos demuestran su papel fundamental
en la regulacin del genoma, y cmo los rasgos se pasan o se eliminan de generacin
en generacin por factores ambientales (Life Technologies, 2014).


Referencias
Bookout, A. L. y Mangelsdorf, D. J. (2003). Quantitative real-time PCR protocol for analysis of
nuclear receptor signaling pathways. Nuclear Receptor Signaling, 1. doi: 10.1621/nrs.01012
De Dios, T., Ibarra, C. y Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigacin en discapacidad, 2(2): 70-78.
Holland, P. M., Abramson, R. D., Watson R. y Gelfand, D. H. (1991). Detection of specific
polymerase chain reaction product by utilizaing the 5' 3' exonuclease activity of
Thermusaquaticus DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, 88(16): 7276-7280.
INDRE. (2014, mayo 28). Departamento de Biologa Molecular y Validacin de Tcnicas.
Recuperado el 3 de septiembre de 2014 e
http://www.indre.salud.gob.mx/interior/coordinacion_diagnostico_molecular.html
Knox, R. S. (2012). Frster's resonance excitation transfer theory: not just a formula. Journal of
Biomedical Optics, 17(1). doi: 10.1117/1.JBO.17.1.011003
Life Technologies. (2014). TaqMan Chemistry. Recuperado de
http://www.lifetechnologies.com/mx/es/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-
education/taqman-assays-vs-sybr-green-dye-for-qpcr.html
Pierce, D. (2003). Real-Time PCR: the TaqMan Method. Biology Davidson College.
Recuperado el 4 de septiembre de 2014 de
http://www.bio.davidson.edu/courses/molbio/molstudents/spring2003/pierce/realtimepcr.htm
SGIker (2014). Anlisis de expresin gnica mediante PCR a tiempo real o q-pcr. Ehu.es.
Recuperado el 3 de septiembre de 2014 de http://www.ehu.es/SGIker/es/expresion_ge
Valasek, M. A. y Repa, J. J. (2005). The power of real-time PCR. Advances in Physiology
Education, 29(3). doi: 10.1152/advan.00019.2005