CINETICA DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA Y EFECTO DE LA

TEMPERATURA EN EL PROCESO DE ELABORACION DE ALCOHOL

Laboratorio de alimentos fermentados
Profesora: Elvia Hernndez Hernndez
Equipo 2
Contreras Rizo Gustavo
Duran Espinosa Sandra Erandi
Lino Len Cipa!tli
"art#nez Cruz "ar#a Guadalupe
"orales Carrillo $ioleta
RES%"E&:
En esta prctica evaluamos el efecto de la temperatura en la fermentacin alcohlica para
esto utilizamos como inoculo la levadura Saccharomyces cerevisiae. Y un medio de cultivo a
base de glucosa con pH 4.5 esto se coloco en un fermentador que se esterilizo a 11 !"
durante 15 minutos al igual que los medios # se les realizo una prueba de esterilidad para
evitar cualquier contaminacin # que esto alterara nuestros resultados dando negativa esta
prueba se procedido a colocar el medio con el inoculo en condiciones est$riles en el
fermentador.
%e coloco el fermentador en un un ba&o mar'a con una temperatura de ()* que fue a la que
le toco traba+ar a nuestro equipo pero a otros equipos les asignaron otra temperatura que
son las dos que com,nmente se ocupan en la produccin de etanol a nivel industrial para
producir bebidas alcohlicas
-a fermentacin se llevo a cabo por . horas a partir del tiempo cero se empezaron a tomar
muestras cada 4h/ a las cuales se les realizo pruebas con el fin de conocer la concentracin
de levaduras/ de etanol # azucares reductores.
'&(R)D%CC')&:
-a levadura de cerveza 0Saccharomyces cerevisiae) es un hongo unicelular/ un tipo de
levadura utilizado industrialmente en la fabricacin de pan/ cerveza # vino. El ciclo de vida de
las levaduras alterna dos formas/ una haploide # otra diploide. 1mbas formas se reproducen
de forma ase2ual por gemacin. En condiciones mu# determinadas la forma diploide es capaz
de reproducirse se2ualmente. En estos casos se produce la meiosis en la c$lula formndose
un asca que contiene cuatro ascosporas haploides. S. cerevisiae es uno de los modelos ms
adecuados para el estudio de problemas biolgicos. Es un sistema eucariota/ con una
comple+idad slo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas
de sus venta+as t$cnicas. 1dems de su rpido crecimiento/ la dispersin de las c$lulas # la
facilidad con que se replican cultivos # a'slan mutantes/ destaca por un sencillo # verstil
sistema de transformacin de 134. 5or otro lado/ la ausencia de patogenicidad permite su
manipulacin con las m'nimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema gen$tico que/ a
diferencia de la ma#or'a de los otros microorganismos/ presenta dos fases biolgicas
estables6 haploide # diploide. -a fase haploide permite generar/ aislar # caracterizar mutantes
con mucha facilidad/ mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de
complementacin. -as utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la
produccin de cerveza/ pan # vino/ gracias a su capacidad de generar di2ido de carbono #
etanol durante el proceso de fermentacin. 7sicamente este proceso se lleva a cabo cuando
esta levadura se encuentra en un medio mu# rico en az,cares 0como la 38glucosa9. En
condiciones de escasez de nutrientes/ la levadura utiliza otras rutas metablicas que le
permiten obtener un ma#or rendimiento energ$tico/ # por tanto no realiza la fermentacin.
3esde el punto de vista cient'fico/ este microorganismo se ha empleado como modelo simple
de la c$lula eucariota. Esto se debe a una serie de venta+as como su facilidad de cultivo # su
velocidad de divisin celular 0apro2imadamente dos horas9. -as fuentes de carbono utilizadas
por las levaduras var'an desde los carbohidratos hasta los aminocidos. Entre los az,cares
que puede utilizar estn monosacridos como la glucosa/ fructosa/ manosa # galactosa/ entre
otros. :ambi$n son capaces de utilizar disacridos como la maltosa # la sacarosa #
trisacridos como la rafinosa. ;no de los az,cares que no puede metabolizar es la lactosa.
0es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)
-a fermenac!"n alc#$"l!ca 0denominada tambi$n como fermenac!"n del ean#l o
incluso fermenac!"n e%l!ca9 es un proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de
aire 0o2'geno 8 <9/ originado por la actividad de algunos microorganismos que procesan los
hidratos de carbono 0por regla general az,cares6 como pueden ser por e+emplo la glucosa/ la
fructosa/ la sacarosa/ el almidn/ etc.9 para obtener como productos finales6 un alcohol en
forma de etanol 0cu#a frmula qu'mica es6 "H(8"H8<H9/ di2ido de carbono 0"<9 en forma
de gas # unas mol$culas de 1:5 que consumen los propios microorganismos en su
metabolismo celular energ$tico anaerbico. El etanol resultante se emplea en la elaboracin
de algunas bebidas alcohlicas/ tales como el vino/ la cerveza/ la sidra/ etc.
=>
1unque en la
actualidad se empieza a sintetizar tambi$n etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a
gran escala para ser empleado como biocombustible.
=>=>
-a fermentacin alcohlica tiene como
finalidad biolgica proporcionar energ'a anaerbica a los microorganismos unicelulares
0levaduras9 en ausencia de o2'geno para ello disocian las mol$culas de glucosa # obtienen la
energ'a necesaria para sobrevivir/ produciendo el alcohol # "< como desechos consecuencia
de la fermentacin.
=>
;na de las principales caracter'sticas de estos microorganismos es que
viven en ambientes completamente carentes de o2'geno 0<9/ m2ime durante la reaccin
qu'mica/ por esta razn se dice que la fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico.
%17<;?1;38 1@1?.
Aedio utilizado para el aislamiento/ identificacin # conservacin de hongos patgenos #
saprfitos. :ambi$n es ,til para el cultivo de levaduras.
Bundamento6
Aedio de cultivo recomendado para el aislamiento # desarrollo de hongos/ particularmente los
asociados con infecciones cutneas 0piel/ pelo/ etc.9.
En el medio de cultivo/ la pluripeptona # la glucosa/ son los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El alto contenido de glucosa/ la presencia de cloranfenicol # el pH cido/
favorecen el crecimiento de hongos por sobre el de bacterias.
1dems/ al medio de cultivo/ pueden agregarse otros agentes selectivos de crecimiento.
DETERMINACION POR GRADO ALCOHOLICO
El dicromato de potasio oxida al etanol a cido actico! este procedimiento es de
"ran #tilidad. El prod#cto de la oxidaci$n del etanol con dicromato de potasio! en
presencia de cido s#l%&rico! es el acido actico'
(Cr(O) * +C(H,OH * -.H /Cr * + CH+COOH * -- H(O
Para oxidar completamente el etanol a cido actico se re0#iere #na adec#ada
concentraci$n de iones 1idr$"eno. 2i sta no es s#%iciente! el alco1ol se oxida a
acetalde13do o #na me4cla de acetalde13do 5 cido actico. El dicromato en
exceso se determina red#ciendo con #na disol#ci$n 6alorada de s#l%ato %erroso
amoniacal'
Cr(O) * . 7e * -/ H (CR * . 7e * ) H(O
El p#nto %inal de la 6aloraci$n no es m#5 de%inido 6is#almente por lo 0#e se #tili4a
la -!-8o%enantrolina! como indicador redox.
DETERMINACION DE A9:CARE2 RED:CTORE2
Bundamento6 El acido (/5 dinitrosalicilico en presencia de calor reduce el cido (8amino85
nitrosalicilico por los azucares reductores presentes/ desarrollndose un color amarillo caf$ el
cual es estable hasta por 4 horas. -a lectura se realiza a 5.5 nm. Este m$todo permite medir
las unidades reductoras presentes en los azucares.0Ailler9 -os az,cares reductores pueden
reducir al cido (/5dinitrosalic'lico 034%9 ba+o determinadas condiciones. 5reparar el reactivo
34%6 1))ml de solucin 34% mA en 4a<H )/4 # 5)ml de solucin de tartrato de sodio #
potasio 4hidrato /1A. Aezclar ambas soluciones # se llevar a 5))ml.
%i la muestra contiene prote'nas $stas pueden producir falsos negativos/ para evitarlos
desproteinizar 5ml de leche a&adiendo 1 ml de cido ac$tico 14C centrifugar a 4.))) 2 g
durante 1) minutos. %i en la muestra es posible la presencia de di/ tri o polisacridos con ms
de un componente reductor/ neutralizar con 4a<H 14 para evitar una posterior hidrlisis cida
0se sobre estimar'a la cantidad del sacrido9.1&adir 4/4.5ml de agua destilada # 5ml de
muestra 5))Dl de reactivo 34%. Aantener la mezcla en ba&o de agua hirviendo durante 5
minutos # medir a continuacin absorbancia a 54)nm/ interpolando el valor obtenido con los
valores calculados para soluciones de sacrido de concentracin conocida.
1E;- 3E AE:F-E4< 1- ).5 G 0"onteo diferencial de levaduras9.
-as coloraciones de acuerdo a la comple+idad se subdividen en tipos que son la
:F4"FH4 %FA5-E # la :F4"FH4 3FBE?E4"F1-.
:F4"F<4 %FA5-E se emplea un solo colorante/ que puede ser azul de metileno/ cristal violeta
o carbol fucsina. Y en ella la c$lula se ti&e uniformemente 0aunque en algunos casos puede
distinguirse grnulos en el interior de la c$lula te&idos con ma#or intensidad/ lo que indica la
presencia de entidades qu'micas activas9.
"on este tipo de tincin se crea un contraste con el medio donde se est haciendo el frotis o
tincin # se puede observar la morfolog'a # la disposicin bacteriana. -a importancia est en
que es mu# fcil de aplicar.
;n e+emplo de uso de tincin simple es cuando se utiliza azul de metileno de esta forma se
pueden ver levaduras # diferenciar las vivas de las muertas. -as levaduras muertas se ti&en
en su interior # se ven del mismo color del tinte que se aplico/ debido a los enlaces que forma
el azul de metileno 0base9 con las cargas que estn dentro de la c$lula como prote'nas. -as
levaduras vivas no se ti&en por dentro debido a los enlaces que forma el colorante con la
membrana celular # de esta manera no entra el colorante al interior de la c$lula.
)*+E('$)S:
Anali4ar el e%ecto de la temperat#ra en la %ermentaci$n de #n mosto con
Saccharomyces Serevisiae
Est#diar los %actores 0#e inter6ienen en #na %ermentaci$n alco1$lica
O;ser6ar c$mo in%l#5e el O
(
en la prod#cci$n de <iomasa
RES%L(,D)S:
C#adro -. Condiciones de c#lti6o
Tiemp
o
1oras
Contenid
o
alco1$lic
o =mL de
s#l%ato
%erroso
Al3c#ota
"rado
alco1$li
co
A4#cares
red#ctores
=a;sor;an
cia>
Dil#cione
s
Le6ad#r
as
6ia;les
=?>
Le6ad#r
as no
6ia;les=
?>
Le6ad#r
as
totales
=?>
Dil#ci$n
O ,@.( , mL 8.(// =(A-88>
=(A-(>
+./Bx-8
-8
/.Bx-8
@
+.@.x-8
-8
=-A,>
=-A(>
(/ -B.( + mL 8.-@,, =(A-88>
=(A-8>
@x-8
-8
,x-8
@
@.,x-8
-
8
=-A-8>
=-A(>
/B B + mL 8.-B8, =(A-88>
=(A.>
-.,x-8
-
-
-.,x-8
-
8
-.,x-8
-
-
=-A-,>
=-A(>
)( 8 + mL 8.8), -A-88 -..x-8
-
-
-.)/x-8
--
-.)/x-8
--
=-A(8>
=-A(>

Ec#aci$n de la recta' CD..,B+x-8E/FE8.8/@/
r
(
D8.@@
DespeGando la ec#aci$n de la recta para calc#lar las concentraciones de a4&cares
en el mosto de ac#erdo a la a;sor;ancia.
FDC*8.8/@/..,B+x-8E/
Para o;tener los 6alores de ,zu!ares redu!tores =H pA6>! s#stit#imos los 6alores
de C en la ec#aci$n anterior! el res#ltado se m#ltiplica por el %actor de dil#ci$n! se
pasa a "ramos 5 se o;tiene el promedio.

FD8.(//*8.8/@/..,B+x-8E/D//,..@I"AmL=+88>-888888D8.-++)8x-88D-+.+)H

FD8.-@,,*8.8/@/..,B+x-8E/D+)(.8- I"AmL=(,8>-888888D8.@+88(x-88D@.+8H

FD8.-B8,*8.8/@/..,B+x-8E/D+/@.(+ I"AmL=-,8>-888888D8.,(+B/x-88D,.(+H
Concentraci$n
de Gl#cosa
="AmL>
A;sor;anci
a ,/8 nm
8 8
+88 8.8@-
.88 8.++/
@88 8.,/
-(88 8.).+

FD8.8),*8.8/@/..,B+x-8E/D-BB.@)I"AmL=-88>-888888D8.8-BB@x-88D-.BBH
Para o;tener el Contenido al!o-li!o =H 6A6> #tili4amos la si"#iente %orm#la
Contenido alco1$licoD=(,E=(,-B.(mLJ,).@+mLD,.)-H
Contenido alco1$licoD=(,E=(,B.(mLJ,).@+mLD).-,H
Contenido alco1$licoD=(,E=(,8mLJ,).@+mLDB.++H
GR./'C,S:
Gra%ica -. Por c#lti6o a +8KC
Gra%ica -a. Por c#lti6o (/KC
DISCUSI&N'
3e acuerdo al cuadro 1 observamos que hubo crecimiento de Saccharomyces cerevisiae
debido a que la cuenta de levadura tiende a aumentar conforme pasa el tiempo/ de tal forma
que las 4 horas de incubacin #a se encuentra en la fase e2ponencial # para las . horas
empieza la fase estacionaria/ esto se debe a que la temperatura ptima es de ()*" para el
crecimiento de $sta levadura.
%i observamos la figura 1 se aprecia en la curva de crecimiento un aumento de la
concentracin de biomasa/ tambi$n encontramos la fase e2ponencial que es de gran
importancia/ debido a que en esta se forma etanol que es un metabolito primarioC la curva de
contenido de az,cares decrece debido a que la levadura la utiliza para la produccin de
etanol/ por tal motivo el contenido de etanol va en aumento.
En la figura tenemos el crecimiento microbiano a dos temperaturas de acuerdo a la
bibliograf'a la temperatura ptima de crecimiento para %accharom#ces cerevisiae es de ()*"
por $sta razon a la temperatura de 4*" el crecimiento es lento # se observa con ma#or
amplitud la fase de latencia/ mientras que a la temperatura de ()*" su crecimiento es ms
rpido # llega antes a la fase e2ponencial.
En la figura 4 observamos que la concentracin de az,cares conforme pasa el tiempo
disminu#e debido a que la poblacin de levaduras va en aumento # el consumo del sustrato
0az,cares9 es ma#or/ principalmente a la temperatura de ()*". 5ara la temperatura de 4*"
ha# una disminucin de la concentracin de az,cares sin embargo no se nota tan
pronunciada porque esos resultados estn mal calculadosC corrigi$ndolos se obtiene la figura
4a en donde tambi$n se aprecia la disminucin de la concentracin de az,cares #
observamos que no ha# gran diferencia en la produccin de az,cares reductores a diferentes
temperaturas.
@rfica ( tenemos el contenido alcohlico para la temperatura de ()*" que va en aumento
conforme pasa el tiempo debido a que tenemos una fase e2ponencial en el crecimiento # es
ah' en donde se forman los metabolitos primarios/ en este caso el etanol para la temperatura
de 4*" los resultados var'an demasiado/ obteniendo una curva que disminu#e con respecto
al tiempo/ esto podr'a significar una titulacin inadecuada una mala manipulacin de la
muestra/ o simplemente un descuido para hacer los clculos por parte del equipo (/ con
qui$nes comparamos resultados.
C)&CL%S'0&:
%e analizo que en efecto/ la temperatura influ#e en el rendimiento # en la velocidad con la que
se produce etanol. %e traba+o con 4*" # ()*"/ la temperatura optima de crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae es de ()*" # 4)*" para su m2ima produccin de etanol.
%e estudio que la produccin de etanol en una fermentacin depende del inoculo/ de la
composicin del medio de cultivo/ de las condiciones ambientales/ del crecimiento microbiano/
etc.
En esta prctica se analiz lo importante que es controlar los factores como temperatura/ pH/
agitacin/ cantidad de o2igeno/ concentracin de sustrato # la adicin de micronutrientes al
medioC #a que al variar alguno de estos factores el resultado podr'a no ser el deseado.
%eg,n los resultados obtenidos durante la prctica/ la fermentacin alcohlica puede
realizarse en las siguientes condiciones6 :emperatura6 ()!"/ pH6 4.5 en ausencia de o2'geno/
dado que ba+o estas condiciones se obtuvo un ma#or rendimiento/ lo cual es coherente #a que
la literatura reporta que una fermentacin alcohlica debe realizarse a un pH entre (.585.5 #
una temperatura de ()!" #a que es la temperatura optima de Saccharomyces cerevisiae.
;na fermentacin alcohlica debe llevarse a cabo en condiciones as$pticas para evitar el
crecimiento de microorganismos indeseables # que se desarrolle el proceso en e2celentes
condiciones. 1dems de tener mucho cuidado durante la fermentacin/ tambi$n se debe tener
cuidado al determinar azucares/ alcohol/ levaduras viables # no viables #a que estas
determinaciones son la prueba de que la fermentacin se llevo a cabo correctamente.
-a fermentacin alcohlica es de suma importancia a nivel industrial tanto en bebidas
alcohlicas como en la produccin de biocombustibles.
REFERENCIAS'
0es.wikipedia.org/wiki/Saccharomyces_cerevisiae)
http6IIJJJ.britanialab.com.arIespIproductosIb)Isabouraudgluagar.htm
,&E1)S:

Im"enes =I40 5
Der.>
7ermentador al
tiempo ceroL el
medio de c#lti6o
m#estra poca
t#r;ide4 5
a#sencia de

Im"enes'
7ermentador
desp#s de
(/1 =Der> 5 /B1
=I40>L el medio
de c#lti6o
m#estra ms
t#r;ide4 5
a;#ndancia de
esp#ma
=prod#cci$n de
CO
(
> con%orme
transc#rre el
tiempo.

O;ser6aci$n al microscopio de la
le6ad#ra Saccharomyces
cerevisiae.
Determinaci$n de a4&cares
red#ctores' Dil#ci$n de ac#erdo al
c#adro de la preparaci$n de las


Determinaci$n de a4&cares
red#ctores' D#plicado de la dil#ci$n de
ac#erdo al c#adro de la preparaci$n de
las m#estras de
Determinaci$n del "rado
alco1$lico por oxidaci$n de
dicromato.
Color 6erde ;otella! l#e"o aMadir la
sol#ci$n de s#l%ato %erroso amoniacal.
Determinaci$n del "rado alco1$lico por
oxidaci$n de dicromato. Esta toma %#
1ec1a con ms exposici$n a la l#4.