UNIVERSIDAD TCNICA DE MANAB

FACULTAD DE CIENCIAS MATEMTICAS, FSICAS Y QUMICAS

6
to
. NIVEL "E"

GRUPO # 4

AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE PROTENAS

BARREIRO CHRREZ JAIME
OREJUELA SUREZ RONNIE
SABANDO MOLINA CRISTINA
SALTOS GRACIA FABIN
SOLRZANO CHVEZ MARIELA


03/09/14
AISLAMIENTO DE PROTENAS
Las protenas constituyen una fraccin sustancial de la masa de todos los organismos.
Una protena particular, como la hemoglobina de los eritrocitos, puede ser la sustancia
dominante en un tejido. En cambio, una protena como el represor las de E. coli puede
estar representada en general por solo unas pocas molculas por clula. Para el
aislamiento y la purificacin y la purificacin de ambos tipos de protenas se utilizan
tcnicas similares, aunque, por lo comn, cuanto menor es la concentracin inicial de
una sustancia mayor es el esfuerzo requerido para aislarla en forma pura.
En esta consulta expondremos el cuidado y el manejo de las protenas, y delinearemos
la estrategia general para su purificacin. Para muchas protenas, los procedimientos de
aislamiento y purificacin son una rea que demanda das de esfuerzo para obtener solo
unos pocos miligramos, o menos, del producto deseado. Sin embargo, como veremos
ms adelante, las tcnicas analticas modernas permitieron un grado de sensibilidad tan
elevado que esa pequea cantidad de material suele ser suficiente para detallar en forma
extensiva a la protena.


A.SELECCIN DE LA FUENTE DE PROTENA
Distintos organismos pueden presentar protenas con idntica funcin. Por ejemplo, la
mayora de las enzimas que median los procesos metablicos bsicos o que estn
involucradas en la expresin y la transmisin de informacin genrica son comunes a
toda la vida celular. Por supuesto, suelo haber una variacin considerable en las
propiedades de una protena particular proveniente de fuentes diversas.
De hecho, en distintos tejidos de un mismo organismo o en distintos compartimiento de
una misma clula pueden hallarse distintas variantes de una protena determinada. Por
lo tanto, si existe la posibilidad de elegir, el aislamiento de una protena puede verse
muy simplificado por la eleccin juiciosa de la fuente proteica. Esa eleccin deber
basarse en criterios como la facilidad para la obtencin de cantidades suficientes del
tejido a partir del que se aislar la protena, la
cantidad de protena en ese tejido y las
propiedades peculiares de la protena en
cuestin que pueden ayudar en su
estabilizacin y aislamiento.
Con frecuencia se eligen tejidos de animales
domsticos, como pollos, vacas, cerdos,
ratas. Pueden ser fuentes alternativas los
microorganismos fciles de obtener, como E.
coli o la levadura de panadera
(Saccharinyces cerevisiae). No obstante,
veremos que se estudiaron protenas de una
amplia variedad de organismos.
Los mtodos de clonacin molecular se
volvieron tanto o ms importantes como tcnicas de produccin proteica. Casi todo gen
que codifique una protena puede aislarse de su organismo parental, alterado de manera
especfica por ingeniera gentica si se lo desea, y expresado en altos niveles (sobre
producido) en un organismo con el crecimiento conveniente, como E. coli o la levadura,
donde la protena puede constituir hasta el 30% de la masa total de protena de la clula.
Este alto nivel de produccin proteica
suele determinar que la protena clonada
sea mucho ms fcil de aislar que lo que
sera a partir de su clula parental (en la
que en condiciones normales se
encuentra en cantidades nfimas).


B. MTODOS DE SOLUBILIZACIN
El primer paso en el aislamiento de una protena, o cualquier otra molcula
biolgica, es tenerla en solucin. En algunos casos, como en el de las protenas
sricas, la naturaleza ya hizo esa tarea. Sin embargo, una protena por lo general
debe liberarse de las clulas que la contienen. El mtodo de eleccin para ese
procedimiento depende de las caractersticas mecnicas del tejido y la localizacin
de la protena en la clula.







Si la protena de inters se localiza en el citosol celular, su liberacin solo requiere
la ruptura (lisis) de la clula. El mtodo ms simple y suave para hacerlo, conocido
como lisis osmtica, considere en suspender las clulas en solucin hipotnica, esto
es, una solucin en la que la concentracin molar total de soluto es menor que la
hallada en el i interior de la clula en su estado fisiolgico normal. Bajo la influencia
de la fuerza osmtica, el agua se difunde hacia la solucin intracelular ms
concentrada, lo que hace que las clulas se hinchen y estallen. Este mtodo funciona
bien con clulas animales, pero suele ser inefectivo con las clulas provistas de
pared celular, como las de las bacterias o las plantas. En el caso de las bacterias
suele ser eficaz el uso de las
enzimas. Como la lisozima,
que degrada qumicamente
las paredes celulares
bacterianas. Los detergentes
o los solventes orgnicos,
como la acetona o el
tolueno, tambin son tiles
para lisar clulas, pero se los
debe utilizar con cuidado, ya
que pueden desnaturalizar la
protena de inters.

Muchas clulas requieren algn proceso de ruptura mecnica para que liberen su
contenido intracelular. Algunos de esos mtodos son la trituracin con arena o
almina, o el uso de un molinilo de alta velocidad (como las licuadoras de uso
casero), un homogeneizador (un implemento que aplasta el tejido entre en un pistn
y las paredes del tubo que lo contiene, una prensa french (un dispositivo que rompe
las clulas al hacerlas pasar a alta presin por un orificio pequeo), o un sonicador
(que rompe las clulas al someterla a vibraciones ultrasnicas). Una vez lograda la
lisis celular, el lisado crudo puede filtrarse o centrifugarse para eliminar restos
celulares particulados, con lo que la protena de inters queda en el sobrenadante.

Si la protena en cuestin es un componente de organelas subcelulares, como las
membranas o las mitocondrias, puede lograrse una purificacin considerable de la
protena si primero se separan esas organelas del resto del material celular. Esto
suele lograrse mediante centrifugacin diferencial, un proceso en el que el lisado
celular se centrifuga a una velocidad que solo elimina los componentes celulares
ms densos que la organela de inters; luego de ello se centrifuga a una velocidad
que asegure la sedimentacin de esa organela. La protena de inters suele
prepararse de esa fraccin
subcelular mediante extraccin
con soluciones salinas
concentradas o, en el caso de
las protenas ligadas con
firmeza a las membranas, con
el uso de detergentes o
solventes orgnicos, como
butanol, que solubilizan los
lpidos.

C.ESTABILIZACIN DE PROTENAS
Una vez que la protena se separ de su retorno natural queda expuesta a agentes que la
pueden daar en forma irreversible. Estos factores deben controlarse con cuidado en
todos los pasos de purificacin, ya que de no hacerlo puede reducirse en gran medida, o
incluso anularse, el rendimiento de protena purificada.
La integridad estructural de muchas protenas es sensible al pH, ya que estas molculas
poseen numerosos grupos cidos y bsicos. Para prevenir que el material biolgico se
dae por variaciones en pH, se lo suele disolver en soluciones amortiguadoras (buffers)
eficaces en el rango de pH en el que el material es estable.
Las temperaturas elevadas desnaturalizan las protenas con facilidad. Aunque la
estabilidad trmica de las protenas es muy variable, muchas de ellas se desnaturalizan
con lentitud por encima de los 25 C. Por lo tanto, la purificacin de las protenas suele
realizarse en temperaturas cercanas a 0 C. Sin embargo, hay numerosas protenas cuya
estabilidad requiere temperaturas menores, algunas inclusive por debajo de -100 C. Por
el contrario, ciertas protenas criolbiles se vuelven inestables por debajo de
temperaturas caractersticas.
La estabilidad trmica de una protena puede utilizarse en ocasiones para facilitar su
purificacin. Una protena termoestable en una mezcla cruda puede purificarse en gran
medida mediante el calentamiento breve de la mezcla, con lo que se desnaturalizan y
precipitan la mayora de las protenas contaminantes sin afectar la protena de inters.

Las clulas contienen proteasas (enzimas que catalizan la ruptura hidroltica de las
uniones peptdicas) y otras enzimas degradativas que, al producirse la lisis celular, se
liberan a la solucin junto con la protena de inters. Debe cuidarse que esas enzimas no
daen la protena. Con frecuencia, ciertas temperaturas y pH que no alteren la protena
pueden inactivar las enzimas degradativas. Como alternativa, estas enzimas suelen
inhibirse de manera especfica por accin de agentes qumicos que no afectan la
protena en estudio. A medida que la purificacin de la protena avanza, se reduce cada
vez mas el contenido de enzimas degradativas.

Algunas protenas son ms resistentes que otras a la degradacin proteoltica. Puede
lograrse la purificacin de una protena en particular resistente a proteasas si se
mantienen en la mezcla proteica cruda las condiciones para que las enzimas
proteolticas presentes estn activas. Esta tcnica, denominada autolisis, simplifica la
purificacin de la protena resistente, ya que por lo general es mucho mas fcil de
eliminar en forma selectiva los productos de degradacin de las protenas contaminantes
que a estas protenas de manera intacta.

Muchas protenas se desnaturalizan por el contacto con la interface aire-agua y, a bajas
concentraciones, puede perderse una fraccin significativa de la protena por la
adsorcin a superficies. Por lo tanto, las soluciones proteicas deben manipulase de
manera de minimizar la formacin de espuma y deben mantenerse relativamente
concentradas. Por supuesto, las protenas pueden ser sensibles a otros factores, como la
oxidacin de los residuos de cistena para formar puentes disulfuro, los metales pesados
contaminantes que pueden unirse en forma irreversibles a la protena, y la concentracin
salina y la polaridad de la solucin, que deben mantenerse dentro del rango de
estabilidad de protenas.








Adems, varios microorganismos pueden alimentarse de protenas, por lo que las
soluciones proteicas deben conservarse en condiciones que inhiban el crecimiento
microbiano (ejm, en heladera o con pequeas de una sustancias toxica que no reaccione
con las protenas, con las protenas, como la azida sdica. (NaN3)


Dos cistena
s unidas por
un puente
disulfuro
(SS) para
formar una
cistina.
D.ENSAYO DE PROTENAS
Para purificar una sustancia debe contarse con una manera de detectar su presencia de
manera cuantitativa. Rara vez una protena representa ms que un bajo porcentaje del
peso del tejido de origen, y por lo general se halla presente en cantidades mucho
menores. Adems, gran parte del material del que se la separa se parece en gran medida
a la protena de inters. Por ello, los ensayos de deteccin deben ser especficos para la
protena estudiada y muy sensible.
El ensayo debe ser fcil de realizar, ya que puede ser necesario repetirlo, con frecuencia
en cada paso del proceso de purificacin. Entre los ensayos proteicos ms directos se
incluyen los destinados a detectar enzimas que catalizan reacciones con productos
fciles de detectar. Una posibilidad es que el producto tenga un espectro de absorcin o
fluorescencia caracterstico que puede monitorizarse.
Como alternativa, puede suceder que la reaccin enzimtica consuma o genere acido,
con lo que puede ensayarse la presencia de la enzima mediante titulaciones acido-base.
Si el producto de la reaccin enzimtica no es fcil de cuantificar, puede revelarse su
presencia por tratamientos qumicos adicionales que generen un producto ms sencillo
de detectar.Esto suele realizarse mediante reacciones enzimticas acopladas, en las que
el producto de la reaccin catalizada por la enzima estudiada es conversial, mediante
una enzima agregada, en una sustancia detectable.
Las protenas que no son enzimas pueden detectarse por su capacidad de unirse a
sustancias especficas o mediante la observacin de sus efectos biolgicos.
Por ejemplo, las protenas que son receptores suelen detectarse luego de
incubarlas con una molcula radiactiva que se une a ellas en forma especfica.
Luego se pasa la mezcla por un filtro que retiene protenas y se mide la
radiactividad retenida en el filtro. La presencia de una hormona puede revelarse
por sus efectos sobre un tejido estndar o sobre un organismo entero.
Este ltimo tipo de ensayos suele demandar mucho tiempo, ya que la respuesta
esperada puede tardar das en producirse.
Adems, la reproducibilidad de estos ensayaos suele no ser satisfactoria debido al
comportamiento complejo de los organismos vivos. Por lo tanto, esos ensayos se usan
solo cuando no hay un procedimiento alternativo.
a. Las tcnicas inmunoqumicas permiten detectar con facilidad pequeas
cantidades de protenas especficas.
Los procedimientos inmunoqumicos son tcnicas de deteccin proteica de alta
sensibilidad y capacidad de discriminacin.
Estos mtodos emplean anticuerpos, protenas producidas por el sistema inmune de un
animal en respuesta al ingreso de una protena extraa, y que se unen de manera
especfica a esa protena.
Los anticuerpos extrados del suero sanguneo de una animal inmunizado contra una
protena particular son generados por muchas clulas productoras diferentes.
Por lo tanto, constituyen una mezcla heterognea de molculas, que pueden variar en
sus especificidades finas y en su afinidad de unin a la protena blanco.
Las clulas productoras de anticuerpos suelen morir luego de unas pocas divisiones
celulares, por lo que no es posible clonarlas para producir un solo tipo de anticuerpo en
cantidades apreciables.
Sin embargo, esos anticuerpos monoclonales pueden obtenerse mediante fusin de la
clula productora del anticuerpo de inters con una clula de un cncer del sistema
inmune denominado micloma (seccin 35-2B).
El hibridoma resultante tiene una capacidad de divisin ilimitada y cuando se lo
mantiene en cultivo celular, produce grandes cantidades de anticuerpo monoclonal.
Una protena puede detectarse en forma directa, o inclusive aislada, por medio de su
precipitacin con anticuerpos especficos.
Como alternativa, en un radioimnunoensayo, la protena puede detectarse en forma
indirecta al determinar cunto compite por la unin al anticuerpo con una sustancia
estndar marcada de manera radiactiva (seccin 1-1A).
En un ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA; fig. 6-1):
1. En un slido inerte, como el poliestireno, se inmoviliza un anticuerpo contra la
protena de inters.

2. La solucin en la que se quiere detectar la protena se coloca sobre la superficie
recubierta de anticuerpo, en condiciones que permitan la unin entre este y la
protena.

3. Al complejo protena-anticuerpo resultante se le agrega un segundo anticuerpo
especfico para la protena, que lleva acoplada una enzima detectable con
facilidad.

4. Luego de eliminar por lavado el segundo anticuerpo, se mide la actividad de la
enzima inmovilizada en el complejo anticuerpo-protena-segundo anticuerpo, lo
que indica la cantidad de protena presente.
Los radioinmunoensayos y los ELISA se utilizan con amplitud para detectar pequeas
cantidades de protenas especficas y otras sustancias biolgicas, tanto en aplicaciones
de laboratorio como en aplicaciones clnicas.
Por ejemplo, una prueba de embarazo de uso comn, que arroja resultados positivos
confiables a los pocos das de la concepcin, utiliza un ELISA para detectar la hormona
gonadotrofina corinica en la orina materna.



E. ESTRATEGIA GENERAL DE PURIFICACIN
PROTEICA
Recin en el ao de 1926, se acept ampliamente que las protenas son sustancias
bien definidas, cuando James Sumner cristalizo por primera vez una enzima, la
ureasa de las habas. Antes se crea que las masas moleculares elevadas de las
protenas se deban a la agregacin coloidal de sustancias misteriosas y muy poco
definidas de menor peso molecular. Una vez que se reconoci que es posible, en
principio, purificar protenas comenz seriamente el trabajo para lograr este
objetivo.
En la primera mitad del siglo XX los mtodos de purificacin proteica eran extremo
crudos comparados con los estndares de la actualidad. La purificacin de las
protenas era una tarea ardua que tenia tanto de arte como de ciencia. En general, el
desarrollo de un procedimiento satisfactorio de purificacin para una purificacin
para una protena determinada era cuestin de aos de trabajo con cantidades
enormes de material de partida. No obstante, para 1940 se haban obtenido en forma
pura unas 20 enzimas.
Desde entonces se purificaron y detallaron en distinto grado decenas de miles de
protenas. Las tcnicas modernas de separacin tienen tal grado de discriminacin
que uno puede obtener en cantidad una serie de protenas con propiedades tan
similares que hace muchos aos se considero una sustancia no pura.
METODOS GENERALES DE SEPARACIN
Inmunoprecipitacin
Proceso rpido y especfico de separacin proteica mediante precipitacin.
Requiere la utilizacin de anticuerpos contra esa protena, por lo que no suele ser
aplicable en la purificacin de protenas nuevas. La unin Ag-Ac causa la
precipitacin del complejo, separndolo del extracto crudo.


Purificacin de protenas asociadas a membrana
Protenas adheridas: se emplean altas concentraciones salinas, que
desestabilizan las uniones no covalentes.
Protenas asociadas a membrana: pueden liberarse mediante el empleo de
fosfatasas, aunque muy probablemente perderemos la actividad en la purificacin.
Para evitar esto podemos emplear detergentes, siendo complicada la purificacin
posterior.


SEPARACIN POR TCNICAS CROMATOGRAFICAS
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el que los compuestos a
separar se distribuyen entre dos fases:
Fase estacionaria, de gran rea superficial,
que puede ser slida o lquida, estando en
este caso dispuesta sobre un slido que le
sirva de soporte.
Fase mvil, fluido que pasa a travs de la
fase estacionaria. Puede ser liquida o
gaseosa.
Los compuestos eluidos (que han atravesado la fase estacionaria) son transportados por
la fase mvil a un detector que los registra en forma de curvas gausianas (forma de
campana). Se utiliza un detector UV seleccionado a 280 nm ya que las protenas poseen
un mximo de absorcin aproximadamente a esta longitud de onda debido a la presencia
de aminocidos aromticos (fundamentalmente Trp y Tyr). Dichas seales se
denominan picos y el conjunto de picos y lnea base registrado se denomina
cromatograma. Las fracciones eluidas se van recogiendo independientemente, ya que las
protenas que contienen son distintas.
Los picos dan informacin cualitativa y cuantitativa de la mezcla en cuestin.
Cualitativa: el tiempo de retencin T
R
es siempre constante bajo condiciones
cromatogrficas idnticas. Por tanto un pico puede ser identificado por comparacin de
tiempos de retencin. Cuantitativa: el rea de un pico es proporcional a la cantidad de
muestra inyectada.
En funcin de las fases estacionaria y mvil empleadas existen numerosos tipos de
cromatografa. A modo de ejemplo citaremos algunas clases de cromatografa lquida:

TIPOS DE CROMATOGRAFA
LQUIDA
SEPARACIN POR
De Exclusin Molecular (tambin
denominada de Filtracin en Gel)
Tamao
De Afinidad Unin a grupos funcionales
De Intercambio inico Carga elctrica





BIBLIOGRAFA
Libro de Bioqumica Escrito por Donald Voet,Judith G. Voet
Libro de Bioquimica 4ta edicin por Christopher K. Mathews
Libro qumica general por Ralph H. Petrucci
http://es.scribd.com/doc/70469812/Aislamiento-separacion-y-purificacion-de-
proteinas
http://microbiiologia.wordpress.com/2013/04/17/cultivo-de-microorganismo/
http://bifi.es/~jsancho/estructuramacromoleculas/8estabilidad/8estabilidad.htm
http://patentados.com/invento/metodo-para-aislamiento-de-proteinas-en-
condiciones-anoxicas.html