Mtodos para el diagnstico de

EMS/AHPND en camarones


Dr. Jorge Cullar-Anjel


Guatemala, junio 4-7 de 2014
Pasos para el Diagnstico
Anamnesis (historial, informacin local)
Examen clnico
Diagnstico presuntivo
Exmenes complementarios (histologa y PCR)
Diagnstico definitivo (confirmatorio)
Plan de manejo (tratamiento, profilaxis, control,
erradicacin, despoblacin)
Tamao de muestra al azar
Poblacin Tamao de muestra requerida segn la prevalencia esperada
2% 5% 10% 20% 30% 40% 50%
50 50 35 20 10 7 5 2
100 75 45 23 11 9 7 6
250 110 50 25 10 9 8 7
500 130 55 26 10 9 8 7
1,000 140 55 27 10 9 9 8
1,500 140 55 27 10 9 9 8
2,000 145 60 27 10 9 9 8
4,000 145 60 27 10 9 9 8
10,000 145 60 27 10 9 9 8
>/=100,000 150 60 30 10 9 9 8
Modificado de Amos, 1985.
Tamao de muestra
seleccionando enfermos
Modificado de Amos, 1985.
5 a 10 camarones mnimo,
con signos clnicos evidentes!
EXAMEN CLNICO
Visita de campo
Historial (anamnesis)
Chequeo poblacional representativo
Examen fsico
Examen del entorno intra y extra-acutico
Remisin de muestras al laboratorio
HISTOLOGA
Estudio de tejidos mediante cortes de 3 micras
de espesor
Tincin con Hematoxilina y Eosina
Diagnstico confirmatorio
Complementario con PCR para EMS/AHPND

Muestreo de camarones
para histopatologa
Los camarones deben estar vivos antes de la fijacin: un
camarn muerto no sirve para estudio histopatolgico
Es preferible llevar Davidson y elementos de fijacin al
estanque y hacer el procedimiento in situ
Si es necesario, mantener los camarones en cubos con
aireacin en el laboratorio antes de la fijacin
Nunca mantener en hielo o congelar camarones antes de fijar

Fijador para histopatologa
Davidson AFA (Alcohol Formalina - cido
actico): solucin fijadora de rutina
Ventajas
Penetra rpidamente
La fijacin es rpida
Descalcifica el exoesqueleto
Desventajas
Produce algunos artefactos
Interfiere con las propiedades de tincin de algunas
sustancias
Fijador Davidson AFA
Etanol 95% 330 mL
Fornaldehdo 37% * 220 mL
cido actico glacial ** 115 mL
Agua corriente 335 mL

________________________________
_____
* No usar formalina al 10%
** No usar otros cidos ya que interfieren con el
procesamiento de los tejidos, tincin y con algunas
pruebas moleculares

Preparacin para hacer una
correcta fijacin
Preparar anteriormente la solucin de Davidson
Tener jeringas y agujas de tamao apropiado
Disponer de lpiz y etiquetas apropiadas
Utilizar gafas protectoras
Utilizar siempre guantes desechables y
reemplazarlos si se rompen durante la fijacin;
descartar guantes ya utilizados
Contar con buena ventilacin
Disponer de recipientes de tamao apropiado

Pasos para fijar camarones
adultos y juveniles (>0.5 g)
Elegir camarones vivos moribundos con signos de
enfermedad
Inyectar y sumergir en Davidson utilizando aprox.
10X el volumen del animal (proporcin 10:1)
La fijacin rpida del hepatopncreas es crtica
para minimizar la autolisis
La inyeccin de Davidson causar un rpido
cambio de color (naranja) indicando que se estn
fijando los tejidos

Pasos para fijar camarones
adultos y juveniles (>0.5 g)
Sumergir la muestra fijada en Davidson (10:1)
Preparar etiqueta con papel y lpiz (no pluma) que
incluya: fecha, estanque, especie, signos clnicos,
edad, finca, zona y pas
Dejar el camarn en Davidson entre 24 y 72 h
segn talla
Pasar luego la muestra a etanol 70%, cambiarla a
las 24 h y a los 15 das en caso de que no se haya
procesado antes
Duracin de la fijacin
Duracin en Davidson AFA:
12-24 h Pls
24 h Juveniles y subadultos
48 h Adultos
72 h - Reproductores
Despus de cumplido el tiempo de fijacin en
AFA:
Pasar a etanol 70%
Reemplazar el etanol 70% a las 24 h
Reemplazar el etanol 70% a los 15 d

PCR
(reaccin en cadena de la polimerasa)
Deteccin genmica
Requiere extraccin de DNA
Amplificacin con primers especficos
Determinacin de bandas positivas
Confirmacin de Dx junto con histologa

Muestreo de camarones en
los estanques
Muestreo para PCR:
Llevar etanol 95% y elementos de fijacin al estanque y
hacer el procedimiento in situ
Mantener los camarones en cubos con aireacin en el
laboratorio antes de la fijacin
Los camarones se pueden enhielar o congelar a la orilla
del estanque para su transporte hasta el laboratorio

Amplificacin
Termocicladores
Electroforesis
Transiluminador
de UV
Gel de agarosa con bandas positivas
MICROBIOLOGA
Aislamiento y recuento bacteriano del HP
Identificacin bioqumica o molecular de la
cepa causante del EMS/AHPND
Antibiograma
Concentracin mnima inhibitoria (MIC)
Pruebas de patogenicidad (bioensayos)

V. parahaemolyticus
Janice Carr - Centers for Disease Control and Prevention's Public Health
Dra. Trinidad Sabalete
MIC en agar
Meller Hinton
MIC en
agar TSA
BIOENSAYOS
Microscopa electrnica de
transmisin

(TEM)
Fijacin con
Glutaraldehdo
El Glutaraldehdo es el fijador de rutina
para TEM
Ventajas:
No produce distorcin de los tejidos
Desventajas:
Penetra lentamente los tejidos
No descalcifica el exoesqueleto
TEM
El Glutaraldehdo es el fijador de rutina para TEM
Se usa TEM para determinar ultraestructura de
microorganismos
Hay muchos fijadores y amortiguadores para TEM
segn el agente de inters
Variables que determinan la calidad de la fijacin:
temperatura, pH y tiempo de fijacin
Ejemplos de fijadores para TEM: Glutaraldehdo,
paraformaldehdo-glutaraldehdo, Zamboni (cido
pcrico - paraformaldehdo), Tetraxido de Osmio
(fijador secundario)
TEM
Empaque de muestras para envo
al laboratorio
La seguridad debe ser una prioridad
Los requerimientos varan segn el servicio de
mensajera del pas
Los requerimientos oficiales son definidos por la
International Air Transport Association (IATA)
Los lineamientos cambian con cierta frecuencia,
por lo que se deben confirmar con la empresa de
mensajera
Reglamentos actuales de la IATA
Las muestras de camarn se consideran exentas
(Exempt Animal Specimens = EAS)
Debern ser empacadas en contenbedores con tapas
antifuga
Los contenedores debern ser empacados en un
segundo contenedor con sistema antiderrames
Debe incluirse suficiente material absorbente entre el
contenedir primario y el secundario capaz de retener el
total de un posible derrame
Deben tener proteccin externa de tamao y resistencia
adecuados



Envo de muestras para histologa
Luego de 1 h en etanol 70%, envolver los
camarones en papel toalla haciendo un rollo
Poner los rollos en una bolsa plstica sellable con
etanol 70% para mantener hmedo el papel toalla
Ubicar etiqueta de papel anotando a lpiz #ID e
historia dentro de la bolsa plstica
Sellar la primera bolsa y meterla en una segunda
bolsa sellable, esta a su vez en una tercera bolsa
Poner el paquete en una caja maciza, slida y fuerte
Enviar por sistema certificado de mensajera
IMPORTANTE!!
NUNCA enviar muestras en frascos de vidrio
No enviar grandes volmenes de lquido ($ y peligroso)
Preparar las etiquetas utilizando papel fuerte y un lpiz
Incluir una carta suministrando informacin sobre la
muestra: fecha de fijacin, tipo de fijador usado, tipo de
anlisis requerido (histologa, hibridacin in situ),
especie, origen, historial del estanque y datos de
contacto para enviar el informe y la factura
Muchas gracias!!