NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS
1 BIODIVERSIDAD DE MICROORGANISMOS BENFICOS EN SISTEMAS AGROECOLGICOS Biodiversidad Global Miriam Estela Memenza Zegarra I. INTRODUCCIN El suelo constituye la parte ms externa de la corteza terrestre, resultante de la meteorizacin de las rocas subyacentes y con caractersticas claramente diferenciadas entre s. Podemos considerar el suelo como un sistema de interaccin entre tres fases bien definidas: una fase slida, constituida por materia mineral y orgnica, una fase lquida, y una fase gaseosa o atmsfera del suelo. El tipo y composicin de la materia mineral viene dado por las caractersticas de las rocas del subsuelo, as como de los procesos edficos que hayan tenido lugar en su formacin. La porcin inorgnica es muy importante por su influencia en la disponibilidad de nutrientes, aireacin, retencin de agua, etc. La materia orgnica procede de la actividad de los distintos organismos vivos del suelo y su composicin y cantidad es variable, principalmente en funcin del tipo de cubierta vegetal. El resto del volumen del suelo est prcticamente constituido por espacios porosos, que a su vez estn ocupados por agua y los gases que constituyen la atmsfera edfica. La porosidad (cantidad y tamao de los poros) depende de la textura, determinada por la cantidad de arena, limo y arcilla, la estructura y el contenido en materia orgnica. Todos estos factores determinan a su vez el movimiento y capacidad de retencin de agua del suelo y la composicin gaseosa de su atmsfera. Mucho tiempo ha prevalecido la tendencia de considerar al suelo slo como un sustrato receptor de insumos para que las plantas que en l se cultivan nos proporcionen una buena cosecha. Ahora, ms all de la funcin del suelo como sustrato de los cultivos agrcolas y forestales, el concepto de suelo ha cambiado y es considerado como un ente vivo que nace, crece y muere, cuya existencia y funcionamiento depende de la vida que alberga y de las funciones fsicas, qumicas y biolgicas que cumplen para la sostenibilidad de los agroecosistemas, si es manejado con un enfoque no meramente fsico y qumico, sino entendiendo su biologa y la importancia de las mltiples relaciones dinmicas que se establecen entre los organismos a lo largo y ancho del planeta. Un gramo de suelo contiene millones de organismos de gran diversidad, que cumplen la funcin de reciclar la materia, haciendo del suelo un recurso natural capaz de mantener vida y, a la vez, de mantenerse vivo. Casi no tendramos ni bosques ni pastizales naturales si no fuera por esta vida del suelo, porque prcticamente todo el nitrgeno de nuestros suelos naturales viene de la descomposicin de la materia UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 2 orgnica o de la fijacin del nitrgeno, pues los dos son procesos que dependen totalmente de los microorganismos. Aunque el proceso natural de formacin del suelo toma varios aos, un manejo inadecuado y la contaminacin pueden perderlo en menor tiempo del que tom en formarlo. En el proceso de conservacin de un suelo vivo, varios autores destacan el papel de la materia orgnica y la importancia de propiciar la mayor produccin de biomasa, como lo menciona R. Bunch (2008) en las cinco reglas para cumplir con la alimentacin del suelo, que no son ms que un intento de reproducir lo que ha sucedido por milenios en los bosques tropicales. Otros autores enfatizan la importancia de mantener un suelo saludable por su alto contenido de materia orgnica que permita una alta actividad entre los diferentes organismos como garanta de fertilidad y, por ende, de plantas saludables (Nicholls y Altieri, 2003). Otros autores han destacado la eficiencia econmica que se logra al mantener un suelo manejado con principios ecolgicos. Cabe destacar aqu la importancia de la relacin entre cultivo y ganadera para la fertilizacin de los campos de cultivos y pastos, as como para la produccin de hortalizas (Funes, 2008). Tambin los cultivos de cobertura se sealan como importante medio para conservar las condiciones de humedad y proteccin necesarias para garantizar la eficiencia productiva, adems de ser fuente de forraje, hospedaje de insectos benficos y abono para los cultivos (Pulleman y otros, 2008). El presente trabajo se realiza con la finalidad de conocer la biodiversidad de microorganismos benficos presentes en los suelos utilizados en sistemas agroecolgicos de climas tropicales.
II. REVISIN BIBLIOGRFICA
A) PROPIEDADES FSICAS Y QUMICAS DE LOS SUELOS El suelo no es simplemente una masa de residuos inertes, resultado de la erosin fsica y qumica de las rocas y restos de plantas y animales, sino ms bien una masa llena de vida, y por lo tanto forma un proceso complejo y dinmico donde los factores fsicos, qumicos y biolgicos interactan continuamente bajo la influencia de diversos factores climticos (McDonald, 1994). El suelo es considerado como un sistema de interaccin entre tres fases bien definidas: fase slida, lquida y gaseosa o atmsfera. Fase Slida La parte slida del suelo est compuesta de material mineral y orgnico. El material mineral tiene tamao y composicin variable, est compuesta de pequeos fragmentos de rocas y minerales de diversos tipos, derivados de la fragmentacin progresiva y de la descomposicin de los minerales que forman la corteza de la tierra. UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 3 Los minerales que tienen la misma composicin qumica que las rocas, constituyen los minerales primarios y forman en el suelo las fracciones de arena y parte del limo. El mineral secundario, material que presenta diferente estructura y composicin a las rocas que las originaron, est formado por la meteorizacin de los minerales menos resistentes durante el proceso de formacin del suelo y constituyen la fraccin de arcilla y limo. Las partculas orgnicas, procedentes de la actividad de los distintos organismos vivos cuya composicin y cantidad son variables, y los minerales que componen la fase slida y que forma la matriz del suelo, quedan permeadas por la presencia de pequeos o grandes poros. En estos espacios ocurre la proliferacin de microorganismos que pueden ser benficos o patgenos para la planta (Liddell, 1997). El espacio poroso del suelo es la porcin ocupado por aire y agua, siendo determinado por la agregacin del suelo, es decir, por su estructura. Comnmente, hay dos tipos de espacios poroso: los macroporos que permiten la libre circulacin de aire y del agua de percolacin y, los microporos, que impiden el movimiento del aire y dificultan el movimiento del agua, reteniendo de este modo ms agua que los macroporos (Fageria, 1989). La naturaleza de porosidad del suelo, por lo tanto, determina un mayor o menor grado de aireacin, as mismo, la disponibilidad de agua, que influye directamente en la actividad de los microorganismos presentes (Liddell, 1997; Tsai et al., 1992). El ndice de proporcin de arena, limo y arcilla determina las caractersticas especficas del suelo. En general, suelos con altos niveles de materia orgnica y arcilla presentan mejor estructura que aquellos con altos niveles de limo y arena y poca materia orgnica (Wheeler y Rush, 2001). Por lo tanto, las propiedades fsicas de los suelos (textura, estructura, porosidad, textura, temperatura, color, etc.) son factores que afectan significativamente la disponibilidad de nutrientes y agua. La composicin volumtrica de un suelo de estructura media, una condicin ideal para el crecimiento de las plantas, presenta 25% de agua, 25% de aire, 45% de minerales y de 1 a 5% de materia orgnica (Brady, 1974). Los diferentes suelos tienen diferentes composiciones volumtricas de los componentes. La composicin de un mismo suelo vara con la profundidad, por ejemplo, la materia orgnica normalmente disminuye con la profundidad, mientras que la arcilla normalmente aumenta con la profundidad. Fase Lquida La porcin lquida del suelo consiste en una solucin de sales minerales y componentes orgnicos disueltos en el agua. La infiltracin del agua en el suelo est dirigida por la capilaridad y por fuerzas de absorcin de los poros del suelo, as como, por la presin hidrosttica y accin de la fuerza gravitacional que acta sobre la masa de agua. Sin embargo, la cantidad de agua retenida en el suelo, que se define como la capacidad de campo, est en funcin de la textura, el volumen y tamao de los poros del suelo. UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 4 La humedad es uno de los factores ms importantes en el crecimiento microbiano y est implicada en muchas de las etapas del desarrollo de los microorganismos y las plantas. El agua puede encontrarse en el suelo de dos maneras: libre o gravitacional, que influye en la aireacin y, como partculas adsorbidas, utilizada parcialmente por los microorganismos (Liddell, 1997; McDonald 1994; Tsai et. Al, 1992). Fase Gaseosa Los componentes lquidos y gaseosos del suelo coexisten entre los poros permeables o matriz del suelo. Sin embargo, la aireacin y la humedad del suelo estn inversamente relacionados, es decir, cuanto mayor es la aireacin menor es la humedad y viceversa (Tsai et al., 1992). La parte gaseosa del suelo est constituido por el aire, con una composicin diferente a la atmsfera en varios aspectos: a) La atmsfera presenta una composicin bastante continua, mientras que la parte gaseosa que ocupa los poros del suelo, presenta una composicin que vara de un lugar a otro; b) El aire del suelo tiene una humedad relativa casi siempre cerca de 100% (de saturacin) en condiciones normales de humedad del suelo; c) En general, la cantidad de O 2 se reduce, en algunos casos, incluso menos del 10%, en comparacin con el 20% de la atmsfera normal, mientras que, al mismo tiempo, la concentracin de CO 2 a menudo aumenta muchas veces en comparacin a los 0,03%, llegando a ser 10 a 100 veces ms alto que en la atmsfera de la superficie. Este hecho es una consecuencia de la actividad biolgica (la respiracin de los microorganismos y races) que se producen en el suelo. Los principales gases que estn presentes en el suelo son N 2 , O 2 , CO 2 y vapor de agua, sin embargo, sus concentraciones en la matriz del suelo pueden ser muy diferentes. El aire del suelo es una mezcla compleja de gases ms dinmicos que en la atmsfera de la superficie, debido a la dificultad de penetracin del aire, consumo y la liberacin de componentes gaseosos por microorganismos (dinmica de microbiota), etc. (Liddell, 1997).
B) TCNICAS EN EL ESTUDIO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO Las tcnicas para el estudio de la biodiversidad de microorganismo presentes en el suelo se pueden clasificar en pruebas microbiolgicas y moleculares.
Pruebas Microbiolgicas Las pruebas microbiolgicas incluyen el uso de medios de cultivos especficos que favorezcan el crecimiento de las estructuras morfolgicas (vegetativas y reproductivas como esporas) de los microorganismos bajo condiciones de laboratorio crecidos a temperaturas adecuadas. As tambin, involucra el estudio fisiolgico de la actividad UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 5 metablica mediante el uso de pruebas bioqumicas que se caracterizan por ser ampliamente diversa en el caso de las bacterias; as, se detecta la presencia de determinas enzimas que le permiten utilizar como fuente de energa diferentes carbohidratos, la capacidad de utilizar como aceptor final de electrones diferentes sustancias reductoras, la produccin de acidez bajo diferentes sustratos, si crecen bajo condiciones aerbicas, anaerbicas o sus estados intermedios, entre otros. El conjunto de pruebas permite finalmente establecer una data tanto de la parte morfolgica y fisiolgica de los microorganismos que permitan introducirlos en claves para su ubicacin como gnero y especie en la sistemtica de Bergeys para el caso de las bacterias. En el caso de los hongos, la gama de medios de cultivos no es tan variada como en identificacin de bacterias; sin embargo, la identificacin de gneros y especies involucra reconocer una gran variedad de estructuras morfolgicas caractersticas a cada grupo especificado en claves taxonmicas especializadas tales como Hongos Imperfectos (Barnett), Coleomycetes (Sutton) y Hypomycetes (Ellis).
Pruebas Moleculares Tradicionalmente nuestra visin acerca de la diversidad de los microorganismos edficos estaba basada en la obtencin de cultivos de laboratorio, en medios especialmente formulados para ello. Bacterias gram positivas esporuladas (Bacillus y Clostridium) y actinomicetos (Streptomyces) eran considerados procariotas tpicos del suelo, junto con bacterias gran negativas hetertrofas tales como Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium, etc (Liesack, et al., 1997). Sin embargo, la comparacin de recuentos microscpicos directos de clulas con los obtenidos en placas de cultivo, puso de manifiesto que al menos el 99% de los procariotas presentes en el suelo eran incapaces de crecer en medios de cultivo (Roszak, et al., 1987; Torsvik, et al., 1990). Por lo tanto, la mayor parte de la diversidad procariota que integraba el suelo quedaba fuera del alcance de los mtodos tradicionales de estudio, por mencionar a los hongos y protozoos, mucho ms difciles de cultivarlos en el laboratorio. A partir de la dcada de los ochenta se produjo una revolucin espectacular en el conocimiento de la diversidad microbiana de los suelos, debido a la incorporacin de novedosas y potentes tcnicas de estudio, que no requieren del cultivo previo de los microorganismos (Insam, 2001; Kirk et al., 2004). Estas tcnicas se basan en el anlisis de marcadores moleculares como los cidos grasos presentes en los fosfolpidos (PLFA) y los cidos nucleicos (DNA y RNA). Ambos tipos de marcadores se encuentran presentes en todas las clulas, se pueden extraer directamente de muestras de suelo sin necesidad de realizar cultivos previos y adems permiten diferenciar distintos grupos de microorganismos. Utilizando estos marcadores, no slo se puede determinar la composicin de las comunidades microbianas, sino que tambin, se puede cuantificar la abundancia de microorganismos especficos. UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 6 La utilizacin de cidos nucleicos aplicada al estudio de comunidades microbianas se ha impuesto rpidamente debido a la gran cantidad de informacin que proporciona y a la relativa facilidad metodolgica que implican los anlisis de estos compuestos, especialmente tras el gran desarrollo tecnolgico que ha experimentado la biologa molecular durante los ltimos veinte aos. Son importantes dos factores en la extraccin de cidos nucleicos de suelo: (1) Eficiencia en la extraccin que se realiza mediante procesos fsicos, qumicos y enzimticos que aseguren la rotura de las estructuras celulares resistentes caractersticos de algunos microorganismos del suelo o de las esporas y; (2) La eliminacin de sustancias contaminantes (por ejemplo, los cidos hmicos) que se extraen conjuntamente con los cidos nucleicos y que interfieren en los anlisis moleculares posteriores (O'Donell, et al., 1999). Muchas de estas dificultades tcnicas se han resuelto satisfactoriamente y en la actualidad se dispone incluso de mtodos comerciales de extraccin de DNA de suelos, que resultan altamente eficaces en la mayora de los casos aunque no existe un mtodo universal para la extraccin de cidos nucleicos que sea aplicable a todos los tipos de suelos.
En el caso del RNA ribosmico, su utilizacin en la descripcin de los microorganismos presentes en muestras de suelo experiment un gran avance, en particular el gen que codifica para la subunidad menor del ribosoma bacteriano, 16S rRNA (y su equivalente en eucariotas, 18S rRNA). Este marcador molecular presenta una serie de ventajas: (1) est presente en todos los organismos y tiene la misma funcin en todos ellos; (2) debido a restricciones estructurales, diferentes regiones de la molcula presentan distinto grado de variabilidad en secuencia, lo que permite realizar comparaciones con diferente nivel de resolucin; (3) su transmisin es principalmente vertical ya que se considera que no est sujeto a transferencia gnica horizontal entre microorganismos; (4) la longitud de su secuencia tiene un tamao adecuado como para proporcionar suficiente informacin, con un coste asumible y, (5) el anlisis de la secuencia nos permite realizar reconstrucciones filogenticas de los microorganismos.
Los anlisis moleculares basados en la utilizacin de genes ribosmicos mostraron la gran diversidad de microorganismos existente en el suelo en funcin de la profundidad del suelo, estructura y dinmica de comunidades microbianas. As mismo, evidenciaron que algunos grupos microbianos se encontraban presentes de forma ubicua, tratndose en ocasiones de grupos descritos en otros ambientes pero cuya presencia en suelos no era sospechada (Liesack, et al., 1992; Rheims, et al., 1996). Entre los ejemplos de estos grupos podran mencionarse los Planctomycetes, que se haban descrito previamente exclusivamente en ambientes acuticos (Neef, et al., 1998), o UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 7 microorganismos del dominio Archaea (Ueda, et al., 1995; Bintrim, et al., 1997; Buckley, et al., 1998), que tan slo se haban descrito en ambientes extremos o nichos ecolgicos particulares (ejemplo, termfilos, halfilos extremos, ambientes sulfurosos y metangenos). Otra de las novedades que aport la utilizacin de tcnicas basadas en la secuenciacin de 16S rRNA en el campo de la microbiologa edfica fue el descubrimiento de nuevos grupos bacterianos, desconocidos hasta el momento, sin embargo, se han detectado en mltiples estudios de diversidad en suelos de todo el mundo. Esto hace suponer la importancia de estos nuevos grupos en la funcionalidad de la comunidad microbiana del suelo. El ejemplo ms apasionante lo constituye la constatacin de la importancia de un nuevo filum bacteriano, denominado Acidobacteria (Kuske, et al., 1997; Ludwig, et al., 1997), detectado en todos los suelos estudiados con tcnicas moleculares. Desde el punto de vista filogentico se trata de un grupo extremadamente diverso, pero se dispone tan slo de tres gneros (con una especie cada uno) en cultivo de laboratorio y caracterizados taxonmicamente. Las capacidades metablicas de estas tres especies son muy diferentes con lo que es difcil inferir el posible papel de las bacterias del filum Acidobacteria en suelos. Actualmente se conoce que toda la informacin generada en estos aproximadamente veinticinco aos de aplicacin de la biologa molecular a la microbiologa del suelo es tan slo una pequea parte de la que se est obteniendo desde hace unos pocos aos con la aplicacin de tcnicas de secuenciacin y anlisis de genomas. El estudio global de los genomas de todos los microorganismos presentes en una comunidad se denomina metagenmica y ya ha sido realizado con xito en comunidades microbianas de suelo (Rondon, et al., 2000). Si recordamos que las estimaciones ms conservadoras acerca de la complejidad gentica de comunidades microbianas de suelos indican la presencia de entre 6.000 y 10.000 genomas diferentes (equivalentes en tamao al de la bacteria Escherichia coli) en suelos orgnicos no perturbados y un nmero menor (entre 350 y 1.500) en suelos agrcolas o contaminados con metales pesados (Torsvik, et al., 1998), nos podemos hacer una idea de la magnitud de la informacin nueva que se est generando. En el campo de la microbiologa de suelos hasta el momento los estudios metagenmicos se han centrado en la caracterizacin de genomas de microorganismos no cultivados como Acidobacterium o arqueas del suelo (Quaiser, et al., 2002; Quaiser, et al., 2003) que contribuirn a determinar el papel de estos microorganismos en el ecosistema edfico. Las posibilidades que genera la metagenmica y las dems tcnicas moleculares mencionadas anteriormente son mltiples por lo que podemos esperar importantes avances en el conocimiento del funcionamiento de las comunidades microbianas de suelo.
UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 8 C) MICROORGANISMOS BENFICOS HABITANTES DEL SUELO Los microorganismos que componen la biota del suelo son variados en relacin con las especies, funciones, interacciones, hbitat, fisiologa y nutricin, entre otros. Sin embargo, la caracterstica ms llamativa de los microbios del suelo es su gran diversidad, que se presenta con mayor intensidad en condiciones tropicales. En los trpicos, varias especies de microorganismos se distribuyen en forma general, encontrndose en todas las muestras de suelo; mientras que, otros estn restringidas en ambientes especficos, por ejemplo, los hongos que predominan en condiciones de pH cido, algunas bacterias filamentosas (actinomicetos) prefieren suelos orgnicos con pH neutro a ligeramente alcalino, algunas bacterias fijadoras de nitrgeno como Azotobacter slo habita suelos con pH superior a 6,0, por lo general se encuentra en las regiones ridas y semi-ridas, mientras que otros, Beijerinckia, solo han sido aislados en suelos hmedos tropicales, y se ven favorecidos por la presencia de hierro soluble y aluminio.
La comunidad microbiana del suelo se encuentra en continua interaccin entre las especies, ocurriendo condiciones de sinergismo, antagonismo, mutualismo, en la mayora de los casos y en ocasiones con parasitismo y saprofitismo. De acuerdo con el hbitat, se encontr que los microorganismos indgenas actan intensamente contra los zimgenos, y rara vez permiten que las especies introducidas ganen la competencia y por lo tanto se desarrollen en diferentes nichos ecolgicos y por esta razn, por lo general la microflora del suelo presenta una gran diversidad de microorganismos.
A continuacin se presenta los grupos de microorganismos que componen el suelo atendiendo en mayor grado a los que habitan en suelos de zonas con climas tropicales. - Bacterias Las bacterias del suelo constituyen el grupo ms numeroso e importante, pues ellos adems de promover enfermedades en plantas y animales, son responsables de numerosas transformaciones relacionadas con la fertilidad del suelo, tales como, descomposicin y sntesis de materia orgnica, mineralizacin e inmovilizacin nutrientes, fijacin biolgica de nitrgeno atmosfrico (dinitrgeno), nitrificacin y desnitrificacin, reduccin y oxidacin de los elementos minerales, recuperacin de suelos salinos / alcalinos, formacin de compuestos gaseosos (metano, dixido de carbono, sulfuro de hidrgeno entre otros).
Normalmente, la poblacin bacteriana en el suelo se estima entre 10 8 y 10 9 unidades formadoras de colonias por gramo de suelo (ufc / g), cantidades que varan dependiendo del suelo y del manejo del mismo (Brandao, 1992). Las bacterias, con mayor atencin en microbiologa del suelo, pertenecen a los UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 9 gneros: Agrobacterium, Arthrobacter, Azotobacter, Azospirillum, Bacillus, Beijerinckia, Clostridium, Derxia, Micrococcus, Nitrosomonas, Nitrobacter, Pseudomonas, Ralstonia, Rhizobium y Thiobacillus. En el grupo de bacterias habitantes del suelo encontramos que se diferencian en sub grupos de acuerdo a la morfologa y funcin que desempean, as tenemos: 1. Actinomicetos Actinomicetos es el nombre genrico dado a un grupo de bacterias que pertenecen al orden Actinomicetales, cuya caracterstica comn es la formacin de filamentos en alguna etapa de su desarrollo (Dietz, 1986). Estos microorganismos son considerados importantes por causar enfermedades en plantas y animales, y principalmente por promover la fertilidad del suelo al realizar funciones como: descomposicin de la materia orgnica, principalmente compuestos complejos, solubilizacin de fosfatos, fijacin de dinitrgeno en leguminosas (plantas actinorrcicas) y por ser el principal productor de antibiticos en la proteccin de las plantas contra los patgenos (Drautz y Zahner, 1986; Schippers et al 1987). Los gneros de actinomicetos ms frecuentes e importantes en la microbiologa del suelo son: Micromonospora, Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Streptosporangium y Thermoactinomyces. Entre estos, Streptomyces es el gnero ampliamente distribuido, con una poblacin de 10 4 a 10 7 ufc / g de suelo, con mayor presencia como esporas e hifas vegetativas (Lechevalier, 1981). 2. Bacterias simbiticas Rizobio - leguminosa Entre los numerosos e importantes procesos biolgicos realizados en los suelos, el ms estudiado corresponde la fijacin del nitrgeno realizado por la asociacin simbitica rizobio leguminosa. La clasificacin de bacterias fijadoras de nitrgeno en las leguminosas est restringida al gnero Rhizobium, presentando a penas 7 especies. Actualmente la clasificacin presenta las siguientes especies de bacterias: Bradyrhizobium japonicum, B. elkani, B. liaoningense, Rhizobium loti, R. leguminosarum biovar trifolii, R. leguminosarum biovar phaseoli, R. leguminosarum biovar viceae, R. galegae, R. tropici, R. huakuii, R. etli, R. ciceri, R. thianhanenses, R. mediterraneum, Azorhizobium caulinodans, Sinorhizobium fredii, S. sinjiangensis, S. saheli, S. teranga e S. meliloti. Actualmente, los gneros que realizan el proceso de simbiosis con las leguminosas (Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium e Azorhizobium) son colectivamente denominados Rizobio. La asociacin simbitica Rizobio leguminosa involucra una compatibilidad mutua en todos los sentidos de interaccin, posibilitando el proceso de invasin radicular y finalmente permitiendo la fijacin de N2, de tal manera que se satisfaga en un tiempo suficiente la necesidad de la planta (Thies et al., 1991). UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 10 Entre los factores del suelo que interfieren el desenvolvimiento de un simbionte eficiente, la temperatura, acidez y alcalinidad pueden ser citaos como los principales para las regiones tropicales. El nmero de ndulos formados es marcadamente afectado por la temperatura del suelo, de tal manera, la temperatura ptima de crecimiento est normalmente entre los 25 a 35 C (Siqueira & Franco, 1988); sin embargo, algunas cepas de rizobio pueden ser tolerantes a temperaturas que oscilan entre los 40 a 42 C (Stamford & Santos, 1985; Stamford et al., 1995). 3. Bacterias Diazotrficas asociaciones con plantas no leguminosas La ocurrencia de asociaciones microbianas con plantas no leguminosas, especialmente las gramneas, est ampliamente relacionado con genotipos y plantas cultivadas en regiones tropicales y subtropicales (Dobereiner, 1997), donde la temperatura, humedad, presencia de alumino y hierro condicionan de manera especial el proceso microbiano. Estas asociaciones pueden ser realizadas por bacterias estrictamente aerbicas (Azotobacter paspali asociada a la gramnea Paspalum notatum; Beijerinckia con arroz o caa de azcar) y microaerfilas (Azospirillum brasilense, A. lipoferum, A.amazonense e A. halopraeferans). Otras bacterias han sido detectadas en races de migo, sorgo, trigo y caa de azcar (Herbaspirillum seropedicae, Bacillus azotofixans e Acetobacter diazotrophicus) cuyas caractersticas fueron descritas por Dobereiner (1992). La inoculacin de bacterias diazotrficas puede tener suceso cuando la planta favorece el desenvolvimiento de estas en su rizosfera, a costo de otros grupos de microorganismos. Tales efectos fueron observados en caa de arroz (Dobereiner & Ruschel, 1961) y caa de azcar (Dobereiner, 1992). Las asociaciones con las gramneas parecen ser tambin especficas, como lo observado en las leguminosas, principalmente considerando a Azotobacter paspali, que solo est presente en races de Paspalum notatum cv. batatais; Acetobacter diazotrophicus, observada en caa de azcar; y Azospirillum halopraeferans aislada de Kallar grass, una gramnea que crece muy bien en suelos alcalinos (Tilak et al., 1982). En la asociacin de A. paspali con P. notatum, la cantidad de nitrgeno fijado vara entre 20 a 50 kg / ha / ao (Dbereiner, 1997). Azospirillum Tambin ha proporcionado un aumento en la produccin de cereales en el orden del 10 al 30 % (Okon, 1985).
4. Rizobacterias Representan las bacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGRP). En este grupo encontramos a los gneros Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium, Acetobacter y Actinomiceto, entre otros, comportndose como colonizadores agresivos de las races y promoviendo el incremento del crecimiento de las plantas. Cumplen la funcin de UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 11 solubilizar con eficiencia el fsforo presente en el suelo, producir factores de crecimiento vegetal y la produccin de antibiticos y siderforos. Muchos microorganismos habitantes del suelo son capaces de actuar en la liberacin o solubilizacin de elementos minerales y diversos compuestos, siendo conocidas las bacterias Thiobacillus, Mycobacterium, Micrococcus, Flavobacterium, Enterobacter, Arthrobacter, Pseudomonas, Nitrobacter, Escherichia, Agrobacterium, Achromobacter, Pectobacterium e Brevibacterium; y en caso de los hongos, Aspergillus, Penicilium, Rhizopus, Sclerotium, Candida, Oidiodendron, Trichoderma, Chaetomium, Fusarium, Cunninghamella, Thielaviopsis e Mucor (Eira, 1992). Por otro lado, la accin solubilizadora de los microorganismos quimiolitotrficos Thiobacillus ferrooxidans y T. thioxidans es ms intensa y plenamente comprobada en la prctica agrcola en la liberacin de fsforo de potasio. El conocimiento de las acciones microbianas es crucial para entender los procesos de establecimiento y manutencin de la rizosfera, favoreciendo el crecimiento y salud de las plantas. Las interacciones microbianas son numerosas en los suelos y algunos microorganismos como Streptomyces pueden actuar produciendo sustancias difusibles que estimulan el crecimiento micorrtico, y estas sustancias pueden ser antagonistas a hongos fitopatgenos como Fusarium y Verticillium (Siqueira et al., 1999). - Hongos Los hongos, son organismos formados por clulas eucariotas, pueden estar formados por una sola clula, tales como levaduras, o ser multicelulares como los hongos filamentosos. Los hongos se caracterizan por ser aclorofilados, quimiorganotrficos y aerbicos, y por esta razn estos organismos se encuentran en mayor cantidad en las capas superficiales del suelo, debido al alto contenido orgnico y mayor aireacin (Malavolta, 1980). Los hongos se encuentran en el suelo variando desde 104 hasta 106 ufc / g de suelo (Alexander, 1977), predominan en suelos cidos, donde sufren una menor competencia por bacterias y actinomicetos, adoptados por lo general a suelos con pH neutros a pH alcalinos, aunque los hongos pueden ser encontrados en suelos con un pH que va desde 3,0 hasta 9,0 (Brando, 1992). Adems de la gran importancia como responsable de la mayora de las enfermedades en las plantas, realizan funciones importantes tales como: inmovilizacin, acidificacin de materia orgnica, solubilizacin de nutrientes (Micorrizas), agregacin del suelo (estructura) y accin depredatoria capturando parsitos, amebas y nematodos (Cardoso & Freitas, 1992).
Los hongos comnmente encontrados en el suelo son los gneros: Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Helminthosporium, Mucor, Penicillium, Phytophthora, UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 12 Pythium, Plasmodiophora, Rhizopus, Sclerotium, Scopulariopsis, Thielaviopsis y Trichoderma. 1. Hongos Micorrticos Los hongos micorrticos se presentan como uno de los procesos simbiticos de mayor importancia, principalmente para las regiones tropicales y, en general, muestran interacciones positivas como en otras asociaciones planta microorganismo, como los simbiontes en las leguminosas y en la fijacin con bacterias diazotrficas. Las micorrizas son clasificadas, en base a su estructura y morfologa, en dos grandes grupos, ectomicorrizas y endomicorrizas, siendo las primeras caracterizadas por presentar desenvolvimiento intercelular del hongo en el interior de la corteza, dando un asepcto de red; en cuanto a las endomicorrizas, los hongos no se desenvuelven en el interior de la corteza, formando estructuras caractersticas con forma de arbsculos. El papel de los microorganismos en la recuperacin de reas degradadas es fundamental, siendo los hongos micorrticos muy importantes por su accin directa en el aumento de la disponibilidad de nutrientes esenciales. As tambin, los hongos micorrticos son componentes claves en la microbiota del suelo al realizar interacciones relacionadas con la actividad de microorganismos fitopatognicos en el suelo. - Algas La mayor parte de las algas son fotolitotrficas, con algunas especies utilizando azcares o cidos orgnicos en ausencia de luz para sintetizar sus compuestos orgnicos. Las algas, como los hongos, se producen en mayor cantidad en las capas superficiales del suelo, pero se pueden encontrar en horizontes ms profundos.
Por lo general, se encuentran en el rango de 10 3 a 10 4 ufc / g, alcanzando, en condiciones especficas 10 8 ufc / g de suelo. En la formacin inicial del suelo, las algas son muy importantes por llevar a cabo la fotosntesis, contribuyendo as a la formacin de la materia orgnica, especialmente cuando se asocian con hongos para formar lquenes. Las algas verde-azules, actualmente clasificadas como cianobacterias, son importantes en el suelo por realizar el proceso de fijacin de dinitrgeno y su presencia es casi limitada a suelos tropicales. Los gneros Anabaena, Nostoc y Talypotrix son los gneros ms representativos (Siqueira y Franco, 1988). - Microfauna La microfauna del suelo se compone de animales microscpicos, representado por protozoos, nematodos y rotferos. Los protozoos son protistas eucariontes que se presentan como clulas aisladas o colonias de clulas. Se estima un nmero de 45.000 UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 13 especies de protozoos, con alrededor de 20.000 especies fsiles, 18.000 formas de vida libre y 7000 parasitas (Sleigh, 1973). Los protozoos son aerbicos y se puede encontrar en diferentes intervalos de pH en el rango de 3,5 a 9,0; sin embargo, el intervalo de pH ptimo para su mxima actividad metablica corresponde entre 6,0 a 8,0 (Pelczar et. Al, 1980). La mayora de protozoos requieren para su desarrollo la presencia de temperaturas ptimas entre 16 - 25 C, siendo el lmite mximo entre 36 y 40 C. La locomocin es un criterio muy importante en la diferenciacin de grupos de protozoos, por ejemplo, Amoeba proteus se mueve por expansin de sus citoplasma, miembros del grupo Ciliophora se mueven por medio de cilios; mientras que, gneros como Crithidio sp. se mueven en un medio lquido por apndices filiformes o flagelos. La forma flagelada es el grupo ms numeroso del suelo y representa un factor importante en el control de las poblaciones bacterianas. Las poblaciones de protozoos presentes en el suelo estn en el rango de 10 4 a 10 5 microorganismos por gramo de suelo. El mtodo ms utilizado para este estudio es la dilucin y el nmero ms probable (NMP), utilizando la tcnica de enriquecimiento en un medio lquido o slido (Alexander, 1977).
Despus de los protozoos, los nematodos son los ms numerosos, se encuentran ubicados alrededor de 10 cm de profundidad del suelo y en cantidades del orden de 10 6 individuos por m 2 . Los nematodos, agentes saprofitos, son importantes descomponedores de la materia orgnica en el suelo y se limitan a determinados tipos de suelos, tales como, suelos orgnicos y pastos. La importancia de la accin de la microfauna es en la descomposicin de la materia orgnica, el equilibrio microbiolgico travs de la depredacin y como agentes patgenos de plantas y animales. D. DISTRIBUCIN DE LOS MICROORGANISMOS BENFICOS EN EL SUELO La presencia de un determinado microorganismos en el suelo est en funcin de su reaccin a las condiciones ambientales dominantes, dentro de los lmites de su contenido gentico, que permite su sobrevivencia en su forma inactivada (dormancia inherente o impuesta por las condiciones ambientales) o activada, en nmero y tipo de una comunidad que depende, adems del ambiente, de la constitucin gentica de cada especie que la compone, resultante de mutacin, hibridacin o heterocariosis, parasexualidad y herencia citoplasmtica en la fase activa del organismo. La densidad poblacional, activa y sobreviviente, de los diferentes grupos de microorganismos de una comunidad dependen (Siquiera y Franco, 1988): a) De la estructura de sobrevivencia de dormancia y de su ciclo de vida en el suelo; b) De las condiciones que afectan la sobrevivencia de las estructuras antes y despus de la germinacin o el crecimiento de los propgulos; c) De los factores que controlan o afectan la produccin de tales estructuras; UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 14 d) De la estructura y organizacin del microhabitat de sobrevivencia y actividad; e) De su diversidad fisiolgica, eficiencia en la utilizacin de sustratos o numerosos hospedantes en el caso de de simbiontes; f) De su competitividad y grado de saprofiticidad; g) De las fluctuaciones poblacionales y estrategias de sobrevivencia; La distribucin (relacin espacial) de los microorganismos en el suelo ha trado la atencin de numerosos estudios. La observacin in situ utilizando microscopia electrnica, permite una mejor observacin de su distribucin, entre los componentes inertes del sistema del suelo, y revelan su interaccin con arcilla y sustancias hmicas. Estos estudios muestran que los microorganismos ocupan, generalmente, menos que el 0.5% del espacio poroso del suelo. El usos de estos mtodos microscpicos asociados a pruebas bioqumicas, demostraron que apenas algunas clulas microbianas, entre el 15 30% de bacterias y el 2 10% de hongos del suelo, estn fisiolgicamente activas, estando la mayora en estado dormante o muestras, evidenciando condiciones de estrs en el suelo. Los microorganismos no se encuentran libres en las soluciones del suelo. Generalmente, las bacterias se concentran dentro o prximas a los excrementos fecales de la pedofauna, en las partes remanentes de la pared celular de las races, embebidas en un muclago o en colonias, los pequeos espacios vacos formados entre las partculas del suelo, en los agregados arcilla materia orgnica. Los hongos predominan en la rizosfera y en los poros del suelo prximo a las races y, los protozoos, principales representantes de la microfauna, estn presentes en la rizosfera. Los agregados, las bacterias esporulantes, actinomicetos y hongos predominan en la superficie, en cuanto a las bacterias Gram negativas predominan en su interior (Siqueira & Franco, 1988). E. DISTURBIO DE BIODIVERSIDAD POR ACCIN DE PRCTICAS CULTURALES Los suelos agrcolas altamente degradados causado por la deforestacin, aunada a prcticas tales como el monocultivo, la mecanizacin de las labores culturales y el uso excesivo de los agroqumicos han contribuido a niveles decrecientes de los contenidos de materia orgnica en el suelo, y por lo tanto, la reduccin de la estabilidad de su estructura y del contenido de nutrientes con la desaparicin de suelos frtiles. As tambin, prdida de biodiversidad microbiana, contaminacin de suelos, cuerpos de agua y suelos, prdida en la capacidad de retencin del agua y, la aparicin de plagas y enfermedades resistentes a los tratamientos comnmente realizados.
F. CONSERVACIN DE LA BIODIVERSIDAD DE MICROORGANISMOS BENFICOS En la conservacin de la biodiversidad de microorganismos benficos presentes en el suelo existen diferentes estrategias conocidas tanto a nivel IN SITU y EX SITU. UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 15 Las estrategias IN SITU estn ligadas a las prcticas agrcolas y pecuarias realizas en el campo, especialmente bajo un sistema de produccin de agricultura orgnica sustentable. As, tenemos las siguientes actividades: - Junto a la preservacin de la agrodiversidad, el uso eficiente del agua, la energa y otros recursos disponibles, un adecuado balance de nutrientes y vida en el suelo son condiciones importantes para garantizar la sostenibilidad de los sistemas agrcolas. La diversificacin e integracin de la actividad agrcola con la ganadera es una estrategia eficiente para lograr un manejo adecuado de los nutrientes y la fertilidad de los suelos en conjunto, as como para aprovechar los recursos naturales disponibles de manera eficiente. Esto es, porque donde hay materiales orgnicos depositados se incrementa el movimiento de varios organismos que podemos distinguir a simple vista y de otros, que sin poder ser vistos, comen y viven de esos materiales, enriqueciendo al suelo, incrementando las poblaciones de organismos que son descomponedores de modo se forman cadenas alimenticias con efectos de una liberacin masiva de nutrientes que las plantas absorben con facilidad.
- La utilizacin de los residuos de cosechas para elaborar compost, que luego se incorpora al suelo en forma de abono orgnico. El abono orgnico es mucho ms eficaz debido a que ya la materia est lista para ser utilizada los microorganismos y por las plantas. El incremento de la diversidad de especies cultivadas y de las variedades de estas permite el rotar los cultivos y contribuye a la reduccin del impacto de las plagas, lo cual contribuye tambin a conservar y enriquecer el suelo.
- Siembra de cultivos de cobertura, es decir, cultivos adicionales que se integran junto con el cultivo principal, o para cubrir la tierra cuando se la deja en barbecho, a fin de proteger al suelo de los efectos erosivos del viento, la lluvia y las altas temperaturas. De manera similar, los abonos verdes son cultivos de cobertura cuyo fin es mantener o incrementar el contenido de materia orgnica del suelo y por ende favorecer la presencia de una gran diversidad de microorganismos cuyas actividades elevan el nivel general de fertilidad de los suelos. Estas son especies de crecimiento rpido que se cortan y entierran en el mismo lugar en el que crecen, antes de florecer, lo que desviara la concentracin de nutrientes a las semillas o el fruto. Los cultivos de cobertura y los abonos verdes tienen ventajas similares y complementarias, incluyendo: proteger el suelo de la erosin y de que se seque, mejorando los niveles de humedad y la circulacin del agua; impedir el desarrollo de malas hierbas, ya sea directamente (al bloquear la luz) o indirectamente (se sabe que algunas especies actan como herbicidas); enriquecer el suelo con nitrgeno (abonos verdes de plantas leguminosas) y otros nutrientes; crear hbitats para los microorganismos benficos; UNIVERSIDAD DOCTORADO NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CIENCIAS E INGENIERIA BIOLGICAS 16 contribuir a mejorar la estructura del suelo como resultado de su mayor actividad biolgica y de la accin mecnica de las races; contribuir a acrecentar el contenido orgnico y el humus del suelo, activando su fauna y microorganismos; y proporcionar un entorno ms hmedo que contribuya a degradar los rastrojos resistentes tales como la paja en los cultivares de cereales, balanceando la proporcin entre carbn y nitrgeno.
- La rotacin, el abonamiento y la variabilidad de los cultivos estn orientados tambin a conservar la vida y regenerar la fertilidad del suelo. Al rotar el terreno se permite que en los tres aos de descanso (caso Labraco) el terreno se regenere naturalmente. El descanso no reemplaza la incorporacin de materia orgnica; en cada turno se abona. As, la diversidad de cultivos y la variabilidad dentro de cada cultivo, en una sola parcela, en un solo ao agrcola, son determinantes para el mantenimiento de la fertilidad de los suelos. En el caso de la asociacin de cultivos, cada uno de ellos tiene un requerimiento diferente de nutrientes, tanto en el tipo como en la proporcin requerida. Cada variedad tiene un requerimiento distinto para cada nutriente del suelo. Al final del ao agrcola, el suelo de los terrenos cultivados en mezcla no ha sufrido una extraccin de nutrientes homognea.
Por otro lado, las estrategias EX SITU promueven la conservacin de cepas identificadas y mantenidas bajo condiciones de laboratorio. Para lo cual, se utiliza la tcnica del cepario para el caso de las bacterias; y, micoteca, para lo hongos. En ambos casos, cepario y micoteca, constituyen grandes colecciones de microorganismos crecidos en medios de cultivos artificiales o en medios lquidos debidamente esterilizados mantenidos bajo condiciones adecuadas de temperatura y humedad. Ests tcnicas son fciles de establecer en los laboratorios dedicados a esta actividad; sin embargo, la perdida de actividad fisiolgica con el tiempo y con el traspase del microorganismos a medios de cultivo nuevos, convierten un aislamiento totalmente diferente al que fue inicialmente cambiando por ltimo las caractersticas morfolgicas del microorganismo dificultando su correcta caracterizacin.
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