AISLAMIENTO DEL ADN EN EL BAZO DE

CERDO.
Universidad Autnoma de Chiriqu-Facultad de
Ciencias Naturales y Exactas.
Escuela de Qumica- Bioqumica.

Senz, Eduardo
1
, Vega, Miguel.
2


RESUMEN
El primer paso en cualquier anlisis gentico es el
aislamiento del material gentico. Los mtodos de
extraccin de ADN se remontan a 1869 cuando
Miescher consigui extraer del esperma de salmn
o de los leucocitos humanos lo que entonces
denomino nuclena y que hoy sabemos que es el
ADN.
Para aislar el ADN de una muestra de bazo de
cerdo procedimos a licuar una muestra de bazo
para facilitar la extraccin, luego con una solucin
hipotnica de NaCl se lisa la clula para que el
ADN quede expuesto, por ultimo con una mezcla
se cloroformo/alcohol amlico se purifica y se
precipita con etanol absoluto.
Este es un mtodo seguro para la extraccin de
ADN sin modificar la estructura de las molculas ya
que todas las variables que pueden romper o daar
la molcula son eliminadas como la enzima
desoxirribonucleasa.
OBJETIVOS

Llevar a cabo la extraccin de ADN a partir
del bazo de cerdo.
Reconocer las etapas del proceso de
extraccin de ADN.
MARCO TEORICO

La mayora de clulas contienen ADN en sus
ncleos celulares (excepto las anucleadas como
los eritrocitos y plaquetas), sin embargo tambin se
puede encontrar ADN dentro de otros
compartimientos celulares como las mitocondrias y
los cloroplastos (clulas vegetales). Hans B,
Wolfgang W, 1987
El ADN se encuentra en las clulas. En el caso de
las clulas procariotas, como las bacterias, est en
el citoplasma en forma de molcula circular. En las
clulas eucariotas podemos diferenciar dos tipos
de ADN segn su localizacin: el ADN del ncleo
formado por varias molculas lineales
(dependiendo de la especie), y el ADN
mitocondrial, formado por algunos miles de copias
de ADN circular. Mathews, C; Van Holde, Ahern K;
2002
Para seleccionar un tejido como fuente de ADN
debe reunir 2 condiciones: contener gran cantidad
de material gentico y poseer baja actividad de
DNAasa. Un ejemplo de tejido muy utilizado para
ello es el tejido linfoide (bazo y timo)
Despus de ser extrado el ADN es
desnaturalizado y por lo tanto se debe ser muy
cuidadoso en su remocin, aislamiento y
purificacin con el fin de obtener un producto que
conserve la identidad e integridad estructural y el
estrs o tensin mecnica deber ser evitada, as
como el asegurar tener las nucleasas inhibidas.
Factores como los iones Calcio y magnesio son
importantes para la actividad de las DNAsas, as
que se debe impedir la accin de estos.

MATERIALES
Licuadora (Oster), tubo Eppendorf, esptula,
probeta 50mL (Kimax), centrifugadora (Orto),
Vasos qumicos 50mL (Glassco), policial, tubos de
centrifuga (SuperClean).
REACTIVOS
reactivo concentracin Toxicidad
NaCl 0,015M y 2M No es txico.
Masa molar: 58,4
Punto de fusin:
1C
Punto de ebullicin:
1465C.
Citrato de
Sodio
0,015M Evtese el contacto
con los ojos y la
piel. No respirar el
polvo. Lvese bien
despus de
manipularlo.
Aspecto: Polvo
blanco
pH: Solucin
acuosa ~8
Solubilidad:
soluble en agua.
Cloroformo A temperatura
ambiente es un
lquido voltil,
incoloro de olor
penetrante.
Produce depresin
respiratoria y
nauseas.
No es miscible en
agua.
Punto de
ebullicin: 61C
Punto de Fusin: -
64C
Alcohol
Amlico
Inflamable. Nocivo
por inhalacin. Irrita
las vas
respiratorias. La
exposicin repetida
puede provocar
sequedad o
formacin de
grietas en la piel.
lquido incoloro
Punto de fusin: -
79C
Punto de
ebullicin: 138C
Etanol 95% Lquido incoloro,
voltil con un olor
caracterstico y
sabor picante.
Punto de ebullicin:
78,4C
Masa molar:
46,07g/mol
Punto de fusin: -
114C

METODOLOGA
Cortamos 7,8g de bazo de cerdo, se mezcl
con 20mL de amortiguador salino y se licu
por 1min.
Posteriormente se centrifug el licuado por
15min a 5000 rpm. Al precipitado obtenido
se le adicion 20mL amortiguador salino y
se centrifug por 10min a 5000 rpm
Al precipitado obtenido se le adicion 20mL
de NaCl 2M, homogenizamos y
centrifugamos por 15min.
Al decantado le adicionamos igual volumen
de agua destilada fra ms 10mL de NaCl
2M y 10mL de la mezcla cloroformo/alcohol
amlico.
Esta mezcla se llev al refrigerador,
homogenizndola cada 10 minutos durante
30 minutos. Posteriormente la
centrifugamos por 15min.
A la fase acuosa le adicionamos doble
volumen de etanol al 95%, y dejamos
reposar en fro por 10min.
Finalmente guardamos en fro el ADN en
los tubos eppendof.
RESULTADOS
Preparaciones
Peso del Tejido: 7,8g
NaCl 2M:
g=58

x 0.1 L x 2 M
g=11.62 gramos
Cloroformo/Alcohol amlico: 43mL/7mL
Tabla 1. Resultados del aislamiento de ADN
Reactivo Funcin
Amortiguador Salino
Su funcin es
mantener un pH
estable para evitar
cambios en la
estructura del ADN.
Citrato de Sodio
Su funcin es inhibir la
accin de la ADNasa
ya que extrae los
cationes activadores
de la enzima.
NaCl 2M
Su funcin es crear un
medio hipotnico que
causa la ruptura de la
clula para dejar
expuesto el ADN.
Cloroformo/alcohol
amlico (6:1)
La funcin de esta
mezcla es
desnaturalizar las
protenas y
coagularlas, adems
disuelve los lpidos
para su eliminacin.
Etanol 95%
Su funcin es precipitar
el ADN en forma de un
material fibroso.




Figura 2. ADN coagulado con etanol

DISCUSION
El aislamiento y extraccin de ADN del bazo de
cerdo lleva una serie de protocolos rigurosos para
poder obtener el ADN sin daarlo, se necesita
tomar en cuanta condiciones como la temperatura,
pH y factores como la presencia de la enzima
dexoxirribonucleasa que reduce el ADN en
nucletidos.
Para evitar alterar el ADN se debe trabajar con
disoluciones fras, con una solucin salina tampn
evitamos cambios bruscos de pH. La accin de la
ADNasa la inhibimos al adicionar una disolucin de
citrato de sodio que acta sobre los cofactores
Mg
+
, Fe
+
, Mn
+
; al intentar extraer ADN de un tejido
no solamente se encuentra el ADN en este,
tambin se encuentran lpidos, protenas y las
mismas fibras del tejido.
Las protenas se desnaturalizan y coagulan con
una mezcla de clroformo:alcohol amlico, debido a
que los lpidos son solubles en cloroformo tambin
se extraen de la fase acuosa y quedan en la fase
orgnica formada por la mezcla y se separan por
filtracin. Para precipitar el ADN se utiliza etanol
absoluto que es adicionado a la fase acuosa, en
esta fase se encuentran el ADN y nucleoprotena.
El ADN precipita con etanol sin embargo, la
nucleoprotena no por esto la gel obtenida solo
contiene ADN.
CONCLUSIONES
Concluimos que para la extraccin de ADN del
bazo de cerdo, es necesaria la adicin de una
solucin salina de baja fuerza inica, ya que
favorece la estabilidad de la ribonucleoprotena
(RNP) y la desoxirribonucleoprotena (dRNP) y
disuelve a la mayor parte de las molculas que se
encuentran presentes en el bazo.
Determinamos que el citrato de sodio es importante
en el aislamiento de ADN, ya que extrae del medio
sustancias que producen la degradacin de los
cidos nucleicos, como lo son los cationes Mg
+2

que favorecen la liberacin de las nucleasas.
Concluimos que la adicin de etanol es importante
ya que precipita al ADN, debido a que es insoluble
en el mismo, lo que permite separarlo de otras
macromolculas que coagulan de una manera no
fibrosa, como por ejemplo el RNA y las protenas.
Thomas Peter Bennett, 1982
CITAS BIBLIOGRAFICAS
Carolina Villafae y Duina Posso Duque.
Protocolos de extraccin de ADN total de animales
mtodo de Salting Out. Protocolos de laboratorio
UEG (http://www.ivic.gob.ve/ecologia/ueg/). 2009.
Instituto Venezolano de Investigaciones Cientficas,
Altos de Pipe- Venezuela.
Mathews, C; Van Holde, Ahern K; 2002;
Bioqumica; 3ra. Edicin; Pearson Education;
Madrid.
Hans B, Wolfgang W, 1987, Manual de
BIOQUIMICA, editorial Reverte. (visitada en la
web: 25-8-2014)
Thomas Peter Bennett, 1982, Bioqumica, Editorial
Reverte.
Figura 1. ADN extrado despus de
la precipitacin con etanol