Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona.

Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


1

Resumen En el presente documento se explica de manera
detallada el proceso de separacin de protenas por medio de SDS
Page, con el fin de obtener una aproximacin a la clasificacin
filogentica de las bacterias Escherichia coli B, E. coli K12, E. coli
C-600, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhi y Proteus sp.. Para
la realizacin de dichos rboles se utiliz el mtodo Unweighted
Pair Group Method using arithmetic Averages (UPGMA) y el
mtodo Neighbord-Joining (NJ). Aunque no se obtuvieron los
resultados esperados se explican las posibles fallas que se pueden
presentar en el procedimiento.


Trminos Claves Electroforesis, Tincin, Buffer de
Muestra
I. INTRODUCCIN
AS protenas son macromolculas orgnicas que
determinan la funcin y la forma de una clula viva,
adems es de suma importancia en la gentica dado que
son la base principal de los aminocidos que conforman el
ADN. En la biologa molecular el anlisis de protenas permite
desarrollar un estudio acerca de la funcin de un ser vivo, que
lo componen y los efectos que esta clula pueda tener sobre
otras.

Para el anlisis existen varios mtodos, uno de ellos es el
SDS Page. El SDS Page lo conforman 3 pasos: extraccin,
electroforesis y tincin. El principio de este mtodo consiste
en la separacin de protena nicamente por las diferencias de
pesos que existen entre estas. El SDS (sodio dodecil sulfato)
funciona como un denaturante; que vuelve las estructuras de
las protenas en primarias con el fin que, al estar cargadas
negativamente por accin del detergente (SDS), en la
electroforesis se separan por el tamao de la protena;
quedando las de mayor tamao en la parte superior de un gel
de poliacrilamida y las de menor tamao en la parte inferior.
(Departamento del Laboratorio de Biologia Molecular, 2013).

Finalizado el proceso de SDS PAGE, se realiza un proceso
de anlisis, es este caso existen dos mtodos, uno es el
Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages
(UPGMA) y el otro mtodo es el Neighbord-Joining (NJ). La


funcin de estos dos mtodos es el de a travs del programa
computacional PAUP dar una matriz de 0, 1 y con el fin de
relacionar las protenas mediante similitudes filogenticas.
Con esto se puede dar un anlisis ms a fondo de las
diferencias que pueden tener bacterias del mismo gnero pero
de diferente composicin gentica, (Rojas, et al).

El objetivo principal es el de realizar un anlisis de
protenas bacterianas por medio de SDS PAGE; en donde se
explicara de manera detalla cada uno de los procesos que se
realiz. Al final se discutirn los resultados donde se espera
que de las 4 bacterias que se van a trabajar, se muestre que 3
de estas tiene una relacin filogentica similar entre ellas.

II. EXTRACCIN DE PROTENAS BACTERIANAS

Como preparacin inicial se debe poner en crecimiento
Over Night en caldo LP a 250 rpm las bacterias de estudio; en
este caso 3 de la especie Escherichia coli (K12, C600 y B) y
una bacteria del grupo Proteus sp. adems de Yersinia sp. y
Salmonella sp..

Para el proceso de extraccin se toma 1ml de cada cultivo y
se aade a un eppendorf previamente diferenciado para cada
una de las bacterias. Se centrifugan los eppendorf por 5
minutos a 1500 rpm. Se extrae 80% del sobrenadante y se
deposita en hipoclorito y se vuelve a resuspender la solucin.

Se agregan 1% de una solucin de buffer de muestra que
contiene detergente SDS, glicerol y azul de bromofenol a cada
uno de los eppendorfs, y luego se colocan en bao trmico
a100C por 5 minutos con las tapas de estos abiertas. El SDS
acta en la lisis de la protena y en la reduccin de lpidos en
la solucion; el glicerol evita que se formen cristales, a bajas
temperaturas, que daan las protenas y adicionalmente crea
un gradiente de densidad dentro del eppendorf; por ltimo el
azul de bromofenol permite que se visualice el frente de
corrido a la hora de la electroforesis, (Hernandez, 2013).

Despus de que se calientan los eppendorf, se vuelven a
centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos. En cada uno de los
eppendorf al final se forma una especie de moco, el cual se
Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
Electroforesis en gel de poliacrilamida con
Dodecilsulfato sdico

Bolvar C., Juan Carlos., Munera P., Diana Catalina., Reyes G., Mara Alejandra., Villabona B., Daniel
Universidad de los Andes


L
Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


2
extrae dejando en el eppendorf nicamente las protenas
bacterianas que se quieren analizar.


III. PROCEDIMIENTOS PARA LA ELECTROFORESIS
DE PROTENAS
A. Ensamblaje de la cmara de Electroforsis

El procedimiento para el ensamblaje de la cmara de
electroforesis vara de acuerdo al modelo del equipo, en
consecuencia se deber seguir las instrucciones que
recomienda el fabricante.

Debido a que la mayora de las cmaras de electroforesis
parten del mismo principio tcnico, a continuacin se
representa grficamente un modelo que permite orientar el
ensamblaje de este equipo (Figuras 1, 2, 3 y 4).

En general, una cmara de electroforesis vertical puede
tener los siguientes componentes:

Dos placas de vidrio del mismo grosor y anchura, de
acuerdo al fabricante. En algunos modelos, la altitud de los
vidrios es diferente (uno con mayor altitud que el otro). En
general, el tamao de los vidrios es variable, dependiendo de
la dimensin de la cmara.

Dos espaciadores, que son dos placas largas de iguales
dimensiones hechas de un material flexible pero resistente
(generalmente poliestireno o tefln). La funcin de los
espaciadores es determinar el grosor del gel.

Un peine, cuyos dientes pueden variar en nmero, tamao y
grosor. Tiene el mismo grosor de los espaciadores y est
confeccionado del mismo material. Sirve para moldear los


Fig. 1 Componentes de una cmara de electroforesis vertical



Figura 2: Modo de ensamblar los vidrios y los espaciadores de una cmara de
electroforesis vertical



Fig. 3 Procedimiento para el ensamblaje de un modelo de cmara de
electroforesis vertical.





Fig. 4 Sistema de electroforesis vertical ensamblado

Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


3
pozos donde se colocarn las muestras.

Un soporte o base: dispositivo que sirve para permitir el
ensamblaje de los vidrios con los espaciadores, a travs de una
serie de prensas que ejercen presin y mantiene fijo todo el
sistema.

El tanque de electroforesis: recipiente que contiene el buffer
de corrida superior e inferior. En algunos sistemas, este tanque
contiene electrodos permanentes a lo largo de sus bases listas
para ser conectados. En otras cmaras existe una tapa que
contiene los electrodos, de tal manera que no se tenga contacto
directo con el buffer durante el proceso de electroforesis.

Fuente de poder: aparato que tiene por funcin proveer de
energa elctrica a la cmara de electroforesis. El voltaje, el
amperaje y el tiempo, pueden ser regulados de acuerdo a las
necesidades del procedimiento.

Es importante sealar que la cmara de electroforesis ya
ensamblada deber estar ubicada sobre una superficie
totalmente plana y nivelada. Este paso es importante en el
momento en el que se vierte la solucin del gel dentro de la
cmara, ya que se evita el derrame de la solucin y la
generacin de matriz desnivelada. Esta ltima podra generar
la distorsin del perfil de las bandas de las protenas al final de
la electroforesis.

B. Preparacin de los geles de poliacrilamida

La electroforesis de protenas descrito en este artculo
corresponde al sistema discontinuo denaturante.

Es discontinuo porque est conformado por dos geles de
poliacrilamida de resolucin y empacamiento que presentan
diferente concentracin, composicin y pH. Ambos geles se
encuentran unidos pero limitados por una fase de separacin
visible al trasluz. Debido a que en estado lquido ambos geles
pueden mezclarse fcilmente, deben ser preparados por
separado esperando la total polimerizacin del primero para
continuar con la polimerizacin del otro. El gel de
empacamiento generalmente se localiza en la parte superior
del sistema formando los pozos donde se depositarn las
muestras. El gel de resolucin por su parte forma el cuerpo del
gel por donde migrarn y se separarn las protenas.
C. Preparacin del gel de resolucin

Marcar el lmite hasta donde la matriz de acrilamida ser
vertida, trazando una lnea horizontal en el vidrio con un
marcador indeleble. Para saber la ubicacin exacta de la lnea,
colocar el peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco
centmetros (dependiendo del tamao de la cmara) por debajo
de los dientes del peine (Figura 2).

Realizar la preparacin del gel de resolucin a una
concentracin de acuerdo a las necesidades, para este
documento se realizara la preparacin de un gel al 10%, para
la separacin de protenas de 16 a 70 kDa.

Aproximadamente 5 mL de solucin debern ser preparados
en caso de trabajar con geles pequeos de aproximadamente 8
- 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 -
0,8 mm. En 38% de Agua bidestilada agregar un 34% de
acrilamida/bisacrilamida al 30%, posteriormente adicionar un
26% de Tris 1.5m pH 8.8 y un 1% de SDS al 10%, finalizando
con la adicin de 0.5% de Persulfato de Amonio al 10% y
0.05% de TEMED.

Una vez finalizada la preparacin de la solucin, aadir los
catalizadores APS y TEMED uno por uno, tratando de
mezclar cada reactivo de manera uniforme en todo el
volumen. Agregar un volumen de la solucin de
poliacrilamida entre las placas de vidrio hasta la lnea trazada.
Posteriormente, aadir una capa de butanol-agua sobre la
solucin de poliacrilamida para evitar el ingreso de molculas
de oxgeno que retarden la polimerizacin. Dejar polimerizar a
temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, usando como
control de polimerizacin la solucin de poliacrilamida
remanente.

Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar
la parte superior del gel varias veces con agua destilada hasta
eliminar completamente los restos de acrilamida no
polimerizada y butanol.

D. Preparacin del gel de empacamiento

De acuerdo a las dimensiones del gel trabajado que prepara
un 50% acrilamida/bisacrilamida al 30% agregndolo a un
22% de agua bidestilada, en seguida se aade un 26% de Tris
1.5m, finalmente se prepara y adiciona 1% de SDS al 10%,
0.5% de Persulfato de Amonio al 10% y 0.05% de TEMED,
para una solucin final de 3mL

Una vez finalizada la preparacin de la solucin, agitar
moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el
TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el
volumen de la solucin.

Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cmara y
sobre el gel de resolucin ya polimerizado. Inmediatamente
despus, colocar el peine entre ambos vidrios secando con
papel toalla los restos de poliacrilamida que lleguen a
derramarse. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura
ambiente por 15 a 30 minutos usando como control de la
polimerizacin la solucin de poliacrilamida que qued
remanente en el tubo.

Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y
Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


4
lavar todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua
destilada.

E. Preparacin de la muestra biolgica

Mezclar la protena con el buffer de la muestra concentrada
por cuatro veces (4x) en proporcin 3:1 (tres partes de la
muestra y una de buffer).

Asegurar la tapa de los tubos con lmina extensible de
parafina y someter la muestra a una temperatura de 100C
durante 5 minutos. Para tal efecto colocar los viales en una
gradilla para microtubos dentro de un recipiente o vaso de
precipitacin con agua hirviendo. Controlar la temperatura con
un termmetro adecuado.

Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de
precipitacin y centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm.
Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un
recipiente con hielo hasta proceso de electroforesis.

F. Electroforesis

Sumergir el sistema con los geles polimerizados en un
tanque, el cual contiene buffer de electroforesis o de
resolucin para protenas 1X. Dicho tanque lleva dos
electrodos: uno positivo y otro negativo (frecuentemente
representados por colores rojo y negro, respectivamente) que
sern conectados a una fuente de poder (Figuras 1 y 5).

Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse
que los pozos del gel estn totalmente cubiertos por el buffer.

Se procede a depositar cuidadosamente la muestra en los
pozos evitando la contaminacin del pozo contiguo.

Considerar el uso de un marcador estndar de protenas para
la medicin del peso molecular de la muestra. Dicho marcador
debe ser sometido a los mismos tratamientos de la protena,
excepto cuando se trate de un marcador previamente teido en
el que se obviar el uso del buffer de la muestra.

Una vez finalizada la colocacin de las protenas en cada
pozo del gel, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables
correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.
Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje
y amperaje correspondientes. Para el clculo del voltaje es
importante conocer la distancia en centmetros del gel desde la
parte superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia
multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitir determinar el
voltaje total. El voltaje ptimo depender de la naturaleza de
la molcula de ADN que se piensa separar, en consecuencia,
se recomienda estandarizar este procedimiento.

El valor del amperaje o corriente elctrica (medida en
amperios o miliamperios) depender de la fuerza inica del
buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-Glicina 1X el
valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.

Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida
(visualizado como una lnea azul por el colorante del buffer)
haya llegado a los lmites de la parte inferior del gel.

Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del
equipo empezando con la desconexin de los electrodos de la
fuente de poder ya apagada y removiendo el sistema que
contiene el gel de poliacrilamida.

Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera
que se vaya realizando la separacin de los vidrios que
contienen el gel.

Separar el gel de empacamiento del gel de resolucin
realizando un corte transversal.

Hacer una pequea muesca en una de las esquinas del gel, a
fin de que sirva de orientacin para ubicar el orden en que
fueron cargadas las muestras.

Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de
mucho cuidado pues el gel es muy frgil y puede romperse
con facilidad especialmente cuando se seca o es de baja
concentracin. Para desprender el gel del vidrio remojarlo
nuevamente con buffer de electroforesis o agua destilada y
usar uno de los espaciadores a manera de esptula para
levantarlo por una de las puntas. Coger el gel cuidadosamente
(usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el
colorante azul brillante de coomasie.

El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco
original para su posterior uso, pudiendo ser reciclado hasta

Fig. 5 Interior de una cmara de electroforesis vertical en operacin: a)
Durante la colocacin de la muestra en el pocillo del gel, b) Despus de
aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de
las protenas, c, d y e) las protenas migran hacia el nodo y se distribuyen en
el gel a manera de bandas. (e-)= electrones

Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


5
cinco veces, despus de los cuales se deber preparar una
nueva solucin dado que puede afectar el tiempo de corrida de
la prueba.

Los vidrios, los espaciadores y el tanque debern ser
lavados con abundante agua y detergentes especiales que
puedan ser fcilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos
con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una
estufa a 37C.
IV. TINCIN CON AZUL DE COOMASSIE (BIORAD
COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250)

A. Fijado

Una vez realizada la electroforesis se realiz el proceso de
fijado. Para el cual se prepar una solucin de fijado en una
botella de vidrio y en campana de extraccin, con 50% de
etanol, 10% de cido actico y 40% de agua ionizada en este
orden especifico. Seguidamente se verti la solucin de fijado
en la cubeta de tincin suministrada por el kit de tincin de
plata utilizado para este procedimiento y luego se deposit el
gel en esta solucin. La cubeta se guard en una bolsa ziplock
a 4C por una semana.

B. Tincin

A la semana se retir la solucin de fijado, se adiciono agua
desionizada y se coloc en agitacin por 5 minutos a 50 rpm.
Luego se retir el agua desionizada y se prepar la solucin de
tincin. Al igual que la solucin de fijado se prepar en una
botella de vidrio con tapa y en campana de extraccin y se le
agregaron los siguientes reactivos en orden: 50% de metanol,
10% de cido actico, 40% de agua ionizada y 0.05% de azul
de Coomassie (BioRadCoomassie Brilliant blue R-250). Se
le agrego esta solucin al gel y se dej en agitacin a 50 rpm
durante 45 min.

C. Destincin

Para este procedimiento se utiliz la solucin BioRad
Destain Coomassie R-250 IX solution. Como primer paso se
descart la solucin de tincin en un recipiente de vidrio con
tapa teniendo especial cuidado de no botar el gel.
Posteriormente se le hizo un lavado al gel con agua
desionizada la cual tambien fue descartada. Seguidamente se
adicion la solucin de desteido y se dej en agitacin por
aproximadamente 5 minutos a 50 rpm revisndola
peridicamente. Debido a que se tena una gran cantidad de
background se tuvo que reemplazar la solucin de destincin
varias veces hasta que se obtuvo una buena intensidad en las
bandas.

D. Secado

Al obtener el bandeado esperado, el proceso de secado del
gel se realiz por un periodo de dos das. Para este
procedimiento se realiz el siguiente montaje: en una bandeja
se coloc papel celofn estirado, luego el gel, sobre este otra
capa de papel celofn, el cual se fij con un marco y ganchos.
Para posteriormente ser llevado a un horno.

V. RESULTADOS

Despus de la preparacin del gel de poliacrilamida se llev
a cabo la siembra usarondo 6 taxa (Escherichia coli B, E. coli
K12, E. coli C-600, Yersinia enterocolitica, Salmonella typhi).
Luego se sembraron en cada uno de los pozos de los geles
como ilustra la figura 6.







Fig. 6 Gel 1




Fig. 7 Gel 2

Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


6
TABLA I MATRIZ DE CARACTERES

En el Gel 1 (Fig. 6) en carril 1 y 2 se sembr E. coli C600,
en el carril 3 y 4 E. coli B, 5 y 6 E. coli K 12, finalmente 7 y 8
Proteus sp.

En el Gel 2 (Fig. 7) se sembr: carril 1 y 2 Yersinia sp.,
carril 3 y 4 Salmonella sp., 5 Proteus, y 6 y 7 E. coli C600.

Teniendo en cuenta estos resultados se realiza la matriz de
la Tabla I de 25 caracteres siendo presentes (1), ausentes (0) y
no es claro (?), pues en algunos casos la banda no est bien
marcada en el gel o el color se encuentra difuminado.

A partir de la Tabla I se realizan dos rboles filogenticos
bajo dos mtodos el primero Neighbord-Joining (NJ), este
mtodo fue creado por Saitou & Nei (1987) y consiste en
generar un nico rbol filogentico final, el cual, segn los
autores, no necesariamente ser el rbol verdadero. En el
paso inicial se unen los dos neighbors (secuencias) que tengan
la menor distancia gentica. Luego, estepar inicial se
considera como una sola entidad, y se busca el siguiente
terminal que tenga la menor distancia gentica con este. El
proceso contina hasta unir todos los terminales, (Pea, 2011).
Obtenindose los resultados ilustrados en la figura 8.

El segundo mtodo utilizado fue Unweighted Pair Group
Method using arithmetic Averages (UPGMA). Dicho mtodo
consiste en el clculo de matriz de distancia, en la cual se lleva
a cabo la bsqueda de la distancia ms pequea que se haya
generado para as relacionar los do grupos de especies ms
cercanos, (Krane & Raymer, 2003). Como se muestra en la
figura 9.

Como se muestra en la Fig. 8 es evidente el parentesco entre
las especies pues tienen un ancestro comn por tanto son un
grupo monofiletico. E. coli C600 es el outgroup de este rbol y
todas las dems taxa estn dentro de un grupo hermano.
Mientras que en la Fig. 9 no existe un outgroup solo son un
grupo monofiletico.




Fig. 8 rbol filogentico por mtodo NJ




Fig. 9 rbol filognetico por mtodo UPGMA


Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


7
VI. DISCUSIN

Mediante la extraccin de protenas de las Bacterias
(Escherichia coli B, E. coli K12, E. coli C-600, Yersinia
enterocolitica, Salmonella typhi y Proteus sp.) se puede
concluir que los resultados obtenidos no son los esperados. Lo
anterior se evidencia con las especies Salmonella sp. y
Yersinia sp., puesto que al realizar el rbol filogentico
utilizando el mtodo UPGMA estas especies no se
encuentran en el mismo clado. Por otra parte en los arboles
filogenticos realizados para Escherichia coli por los mtodos
UPGMA y NJ, los resultados tampoco son los esperados.

En el mtodo UPGMA E. coli K12 se encuentra en una
rama opuesta a la de las otras dos especies de E. coli, se
esperaba que las tres especies de esta bacteria se encontraran
en el mismo clado ya que comparten varias sinapomorfias
nombradas en la literatura. Por otra parte en el mtodo NJ el
rbol obtenido no concuerda con lo establecido en la literatura
debido a que las tres especies de E. coli se encuentran en
diferentes clados. Finalmente los resultados de similitud
obtenidos para Proteus sp. Respecto a las otras bacterias
observados en los dos rboles filogenticos, no se esperaban.
Esta bacteria solo debera compartir el ancestro comn y
pertenecer a una rama aparte de las dems, pero en los
resultados se encuentra compartiendo sinapomorfias con las
dems bacterias.

La obtencin de los resultados anteriores puede deberse a la
cantidad de pasos a seguir para llegar a el resultado final.
Debido a que cada uno de los procedimientos es esencial para
la realizacin de todo el proceso, un pequeo error en
cualquier paso puede generar resultados no muy claros. Para
nuestro caso en el momento de leer las bandas de los dos geles
no se tena total certeza de que bandas tomar para realizar la
matriz, lo cual con seguridad afecto los resultados obtenidos
en los arboles filogenticos.

En relacin al experimento, se puede decir que cada paso es
fundamental a la hora de obtener resultados claros; un error
dentro del proceso puede determinar que no sea claro el
resultado final o que se dae todo el proceso.

Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de
evitar la degradacin de las molculas por la accin de las
proteasas presentes en la mano.

A la hora de preparar el gel de electroforesis es importante
tener claro que la composicin de los geles que lo conforman
son fsicamente iguales pero qumicamente diferentes;
haciendo que la relacin que se guardan entre ellos sea
diferente lo que al final pueda producir lo que se muestra en la
figura 10.

En el desarrollo del protocolo se presentan diferentes que
afectan una correcta obtencin e interpretacin de los datos,
entre los principales se tiene

Fuerza del campo elctrico (E)

Es la fuerza que determina el movimiento o migracin de la
protena a travs del campo elctrico. Su unidad de medicin
es voltios/cm y es por esa razn que la tasa de migracin de
una protena puede ser alterada cambiando tanto la distancia
comprendida entre los electrodos (cm) como el potencial
elctrico del sistema (Voltaje). Del mismo modo, los valores
de E dependen de la fuerza direccional (Fa) y de la carga neta
de la molcula (Q). Puede ser calculada a travs de la
siguiente frmula:

E = Fa/Q
E= v/d
Donde:
Fa = Fuerza direccional.
v = voltios.
d = distancia de los electrodos (en centmetros)
Q = carga en (coulomb)

Tamao y forma de la molcula

Las protenas tienen caractersticas moleculares que actan
como factores intrnsecos durante la electroforesis alterando su
migracin y generando bandas de diferentes tamaos, que no
necesariamente van acorde al peso molecular real del
polipptido. Ciertas modificaciones postraduccionales,
multimerizacin y formacin de complejos con otro tipo de
molculas generan modificaciones en el tamao de la protena
dando pesos moleculares aparentes en el momento del anlisis.

Debido a la dificultad de reconocer la naturaleza bioqumica
de una protena no caracterizada, previamente deber
estandarizarse diversas condiciones experimentales a fin de
optimizar el anlisis de la protena por electroforesis.





Figura 10: Error en la preparacin del gel de poliacrilamida

Universidad de los Andes. Bolvar, Munera, Reyes y Villabona. Relacin filogentica de cepas bacterianas, mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida dodecilsulfato sdico.


8
Carga neta de la molcula

La presencia de aminocidos de diferentes grupos
bioqumicos otorga a una determinada protena una carga neta
totalmente diferente a otra, compuesta por diferentes grupos
de aminocidos. Debido a que en la electroforesis, las
muestras son sometidas a un determinado campo elctrico, la
migracin de las protenas en el gel depender bsicamente de
su carga y no de su peso molecular. Para evitar este efecto, es
importante igualar la carga neta de todas las protenas
aprovechando sus propiedades anfotricas. En ese sentido, el
SDS evita el efecto de diferencias de carga entre las protenas,
a fin de favorecer la separacin de sta nicamente por su peso
molecular.

Temperatura

Depende bsicamente del voltaje de la electroforesis, la
concentracin de sales (poder de conductancia) del buffer y
del pH. Un aumento en la temperatura del buffer genera el
efecto "sonrisa" o smiling.
REFERENCIAS

[1] Departamento del Laboratorio de Biologia Molecular.
(2013). SicuaPlus. Retrieved Septiembre 27, 2013, from
https://sicuaplus.uniandes.edu.co/webapps/portal/frameset
.jsp?tab_group=courses&url=%2Fwebapps%2Fblackboar
d%2Fexecute%2Fcontent%2Ffile%3Fcmd%3Dview%26c
ontent_id%3D_683752_1%26course_id%3D_36906_1%
26framesetWrapped%3Dtrue
[2] Hernndez, Andrs. (2013). Practica 3: Extraccin de
protenas bacteriana [diapositivas en PowerPoint].
Recuperado del sitio web de la Universidad de los Andes:
https://sicuaplus.uniandes.edu.co/webapps/portal/frameset
.jsp?tab_group=courses&url=%2Fwebapps%2Fblackboar
d%2Fexecute%2Fcontent%2Ffile%3Fcmd%3Dview%26c
ontent_id%3D_694074_1%26course_id%3D_36906_1%
26framesetWrapped%3Dtrue.
[3] J. G. Kreifeldt, An analysis of surface-detected EMG as
an amplitude-modulated noise, presented at the 1989 Int.
Conf. Medicine and Biological Engineering, Chicago, IL.
[4] J. Williams, Narrow-band analyzer (Thesis or
Dissertation style), Ph.D. dissertation, Dept. Elect. Eng.,
Harvard Univ., Cambridge, MA, 1993.
[5] KRANE, D. E., RAYMER, M. L. 2003. Fundamental
concepts of bioinformatics. University of Michigan.
[6] PEA, C. 2011. Mtodos de indiferencia filogentica.
Rev. Peru. Biol.18(2): 265 267.
[7] R. W. Lucky, Automatic equalization for digital
communication, Bell Syst. Tech. J., vol. 44, no. 4, pp.
547588, Apr. 1965.
[8] Rojas, D., Correa, C., Hurtado, V., Urbina, D.,
Avellaneda, L., & Perez, I. (n.d.). Gua para hacer
fenogramas en PAUP* 4.0 y edicin en FigTree v1.3.1.
Retrieved Octubre 01, 2013, from
https://sicuaplus.uniandes.edu.co/webapps/blackboard/exe
cute/content/file?cmd=view&content_id=_701357_1&co
urse_id=_36906_1
[9] SAITOU, N & m. Nei. 1987. The Neighbor-Joinin
method: a new method for reconstructing phylogenetic
tres. Molecular Biology and Evolution, 4, 406 425.
[10] S. P. Bingulac, On the compatibility of adaptive
controllers (Published Conference Proceedings style), in
Proc. 4th Annu. Allerton Conf. Circuits and Systems
Theory, New York, 1994, pp. 816.
[11] S. Chen, B. Mulgrew, and P. M. Grant, A clustering
technique for digital communications channel
equalization using radial basis function networks, IEEE
Trans. Neural Networks, vol. 4, pp. 570578, July 1993.






Figura 11 Gel de electroforesis en SDS-PAGE para protenas mostrando el
efecto "sonrisa" o smiling.