Agrobiotecnologa.

Curso 2011
Micropropagacin comercial
La micropropagacin masiva en la prctica comercial
Transparencias 3-22
En los ltimos 20 aos, el conocimiento sobre cmo propagar plantas creci en orma
consi!erable. "in embargo, no se #an encontra!o to!a$a m%to!os !e pro!uccin a
gran escala para la propagacin masi$a !e plantas !ierentes al m%to!o cl&sico !e
!i$isin !e $&stagos a'ilares. En la ma(ora !e las especies, esta t%cnica re)uiere una
intensa labor !e mano !e obra en to!os los esta!ios !el culti$o !e te*i!os,
especialmente en las etapas )ue re)uieren ma(or manipulacin+ las etapas !e
iniciacin !el culti$o in vitro ,Etapa -. ( !e la !i$isin !e macollos e intro!uccin !e los
plantines en recipientes con me!io !e culti$o semisli!o ,Etapa --.. Estas tareas
originan altos costos !e mano !e obra ( #acen !e la micropropagacin masi$a un
proceso relati$amente caro. A pesar !e ello, las plantas micropropaga!as siguen
tenien!o $enta*as. Estas son+ a. generacin !e $&stagos pe)ueos a partir !e
pe)ueas porciones !e te*i!o $egetal ,lo )ue economi/a espacio sico.0 b. obtencin
!e plantas libres !e microorganismos contaminantes0 c. clona!o !e especies !iciles
!e propagar $egetati$amente0 !. pro!uccin continua !urante to!o el ao. 1a ma(or
!es$enta*a son los altos costos implica!os en establecer rutinariamente una operati$a
ptima !e multiplicacin en ca!a una !e las especies ( $arie!a!es !e inter%s. 2no !e
los ma(ores riesgos !el proceso se locali/a en la etapa !e aclimatacin ( rusticacin
!e los plantines )ue pro$ienen !el culti$o in vitro.
3o e'isten muc#as empresas !e!ica!as a la micropropagacin comercial, (a )ue
resulta m&s econmico repro!ucir plantas por semilla bot&nica o por propagacin
$egetati$a ,4macropropagacin5.. 1a posibili!a! !e utili/ar micropropagacin se $e
muc#as $eces limita!a por los costos asocia!os a esta t%cnica. Algunas estimaciones
in!ican )ue, si se lograse un 607 !e re!uccin en los costos, la micropropagacin
masi$a po!ra e'pan!irse 10 $eces respecto !el $olumen actual. "i la re!uccin !e
costos alcan/ara un 807, el merca!o potencial se tornara 1.000 $eces ma(or
respecto !el actual. Actualmente, la micropropagacin masi$a se ocali/a en las
especies )ue presentan !iiculta!es para su propagacin por t%cnicas con$encionales,
(a sea por su $eloci!a! !e crecimiento, por ser susceptibles a contaminaciones
microbianas o ngicas, por re)uerir la eliminacin !e contaminaciones $irales o por la
necesi!a! !e obtener una gran canti!a! !e plantas #omog%neas en un corto pero!o
!e tiempo.
Antes !e empren!er la clonacin masi$a, se !eben consi!erar minuciosamente las
caractersticas !el material $egetal inicial ,plantas ma!re0 transparencia 9.. Este !ebe
ser ptimo, tanto !es!e el punto !e $ista enotpico como sanitario. 2n primer paso
obligatorio es establecer e#acientemente la ausencia !e patgenos. "i no se pu!iese
!isponer !e plantas ma!res sanas, e'isten $arias estrategias eecti$as para eliminar
las enerme!a!es ( lograr iniciar la micropropagacin a partir !e e'plantos sanos. 1as
caractersticas !el e'planto ,meristemas, segmentos interno!ales, (emas,
organog%nesis, embriog%nesis. se !eci!ir&n !e acuer!o con la especie en cuestin (
segn los ob*eti$os !e la micropropagacin. :eber& constatarse el aspecto
morolgico !e los $&stagos regenerantes, as como ausencia !e contaminantes en el
me!io !e culti$o. 2na $e/ estableci!a la estrategia !e clonacin, se proce!er& a
obtener plantnes completos, implementan!o la etapa !e enrai/amiento. Esta pue!e
eectuarse in vitro o ex vitro.
;uras#ige, proesor !e la 2ni$ersi!a! !e Caliornia ,<i$ersi!e. !eini inicialmente las
tres etapas principales ,Etapas - a ---. !e la multiplicacin in $itro !e plantas
,transparencia =.. Esta !einicin se #a a!opta!o ampliamente tanto en in$estigacin
como en los laboratorios comerciales !e culti$o !e te*i!os, (a )ue no slo !escriben
los pasos !el proce!imiento sino )ue tambi%n !einen los puntos en )ue !ebe ser
mo!iica!o el me!io !e culti$o. :eberg ( ;aene propusieron )ue el tratamiento (
preparacin !e las plantas ma!res sea consi!era!o una etapa separa!a ( )ue por lo
tanto sea llama!a Etapa 0. ;&s tar!e se !eini la Etapa ->, en la cual las plantas son
transeri!as al ambiente e' $itro. "i bien las etapas sir$en como gua general, no son
aplica!as !e manera rgi!a.
"i el ob*eti$o es repro!ucir plantas i!%nticas a las selecciona!as, lo i!eal es iniciar el
proceso con un te*i!o !ierencia!o como el meristema, los &pices caulinares o
segmentos interno!ales ,transparencia ?.. En la me!i!a !e lo posible, se trata !e no
permitir la !es!ierenciacin !e los te*i!os, (a )ue ello aumenta la posibili!a! !e
$ariantes somaclonales. "e pue!e partir !el meristema propiamente !ic#o ,2-3 mm. o
aislar el meristema *unto con los primor!ios oliares. "i solamente se cuenta con
plantas ma!res inecta!as, es posible sanearlas me!iante e'posicin !e los
meristemas a altas temperaturas, o a sucesi$os tratamientos con concentraciones
crecientes !e agentes !esinectantes. Estos proce!imientos pue!en resultar letales
para porciones !e te*i!o pe)ueas, por lo )ue es con$eniente reali/arlos en paralelo
con segmentos m&s gran!es ,meristema m&s primor!ios oliares.. "i se parte !e una
planta sana actible !e ser propaga!a por segmentos no!ales, %stos se e'traen (, se
e'ponen a agentes !esinectantes. 1uego se culti$a el material in vitro ( se proce!e a
su establecimiento ( a su pasa*e a la Etapa --.
1a transparencia 8 muestra meristemas !e caa !e a/car en crecimiento culti$a!os
en rascos separa!os para e$itar la propagacin !e contaminaciones. :e esta manera,
si algn e'planto no #a si!o correctamente !esinecta!o en la etapa inicial, se e$ita
)ue la contaminacin alcance a otros e'plantos limpios. 1as caractersticas !e la
!esineccin inicial implican una solucin !e compromiso entre lograr la eliminacin !e
to!os los microorganismos e'ternos ( no !aar apreciablemente el e'planto con el
agente !esinectante. El nmero i!eal !e e'plantos iniciales $ara segn la especie !e
)ue se trate. "e tiene en cuenta la e'posicin a contaminantes, la super$i$encia !e los
te*i!os a la !esineccin ( la tasa !e multiplicacin. "e parte !e un nmero inicial
basa!o en la canti!a! !e plantines $iables )ue )uieran obtenerse en las etapas
posteriores. Tambi%n #a !e consi!erarse el esta!o isiolgico !e la planta !e la )ue se
e'trae el te*i!o inicial.
"e pue!e consi!erar )ue el culti$o se #a estableci!o in vitro si se obser$a crecimiento
!e tallos ( !e #o*as. En este punto, la planta #a completa!o su !esarrollo ( es apta
para ser transplanta!a al me!io !e prolieracin ,Etapa --.. En esta etapa, pue!en
reunirse los plantines en recipientes comunes, aun)ue to!a$a es posible )ue aloren
contaminaciones tar!as. @or lo tanto, con$iene agrupar los plantines en nmeros
pe)ueos e ir incrementan!o las canti!a!es en los pasa*es sucesi$os. 1a
transparencia 10 muestra un plantn !e ar&n!ano (a !esarrolla!o a los 30 !as !e
crecimiento in vitro.
1a sub!i$isin ,Etapa --. resulta sencilla para a)uellas especies )ue pue!en
micropropagarse me!iante segmentos no!ales, pero orece cierto gra!o !e !iiculta!
en a)uellas especies )ue crecen me!iante regeneracin a!$enticia !e $&stagos. En
este caso, la sub!i$isin !ebe ser reali/a!a con criterio, !e*an!o $&stagos no mu(
pe)ueos, capaces !e !ar origen a nue$os $&stagos en el me!io !e culti$o !on!e $an
a ser implanta!os. 2n plantn separa!o !e su macollo ( !e tamao !emasia!o
pe)ueo, corre el riesgo !e no prolierar ( morir. Es en esta etapa )ue !eben a*ustarse
al m&'imo los tiempos !e crecimiento ( las tasas prolierati$as !e los plantines para
po!er establecer un es)uema pro!ucti$o organi/a!o. Este es)uema !ebe satisacer,
las necesi!a!es !el cliente en t%rminos !e canti!a! ( tiempos calen!arios. Cabe
remarcar la importancia !e los recau!os )ue se toman para asegurar con!iciones
as%pticas !e traba*o, tanto !es!e el punto !e $ista ambiental como !e los operarios
)ue reali/a las sub!i$isiones. El incremento !e la canti!a! !e plantines es geom%trico
( un mnimo !escui!o en estos par&metros pue!e ec#ar a per!er to!a una pro!uccin.
El escala!o !e la propagacin !ebe reali/arse en con!iciones !e absoluta esterili!a!
,transparencia 11.. 1os $&stagos o plantines en crecimiento son !i$i!i!os para ormar
$&stagos in!i$i!uales, )ue ser&n sembra!os en un nue$o me!io !e culti$o. En la oto
!e la transparencia se muestra la sub!i$isin !e $&stagos !e ar&n!ano, una especie
)ue se propaga por segmentos interno!ales. Esto acilita una r&pi!a multiplicacin (
generalmente trae apare*a!a una alta pro!ucti$i!a!.
Es comn emplear t%cnicas !e micropropagacin para multiplicar muc#as especies
ornamentales, como el "(ngonium rosa!o )ue se obser$a en la transparencia 12. Ello
se !ebe a )ue+ a. permite eliminar bacterias en!genas !e las plantas ma!res, lo )ue
acilita la propagacin por macollos reali/a!a #abitualmente por los $i$eristas0 b.
permite abastecer incrementos !e la !eman!a, pro!ucien!o una gran canti!a! !e
plantas #omog%neas en un pero!o !e tiempo relati$amente corto0 c. permite la
obtencin !e plantas m&s $igorosas. Esto se !ebe a la aparicin !e $&stagos
a!$enticios )ue se $an orman!o en ca!a nue$o subculti$o por la accin !e las
cito)uininas.
A!em&s !e una buena tasa prolierati$a, se busca lograr cali!a! ( #omogenei!a! en el
aspecto !e los plantines )ue est&n sien!o multiplica!os ,transparencia 13.. Esto
pue!e reali/arse me!iante una obser$acin minuciosa !e to!os los plantines en
crecimiento. "i el nmero !e subculti$os in vitro es ele$a!o, la obser$acin $isual
pue!e acompaarse por un muestreo al a/ar !e plantines transeri!os a con!icin ex
vitro para reali/ar obser$aciones enotpicas ( comparaciones con los par&metros
caractersticos !e las plantas ma!re. 1a situacin pue!e ser mu( !ierente para ca!a
especie. @or e*emplo, en el caso !e la caa !e a/car, los subculti$os no pue!en
superar los 9 =, (a )ue es recuente la aparicin !e $ariantes somaclonales en
culti$o in vitro.
1a transparencia 1A muestra otras $as !e obtencin !e plantines completos a partir !e
te*i!os !ierentes !e los meristemas, (emas apicales o (emas a'ilares. Esto pue!e
ocurrir a tra$%s !e !os $as morog%neticas+ la morog%nesis !irecta o in!irecta. En la
morog%nesis !irecta, el crecimiento !el nue$o $&stago se inicia !es!e segmentos !e
#o*a o pecolos sin pasar pre$iamente por un esta!io !e callo ,c%lulas in!ierencia!as..
Esto acarrea beneicios en t%rminos !e !isminuir la aparicin !e $ariantes
somaclonales. Esta estrategia !e clona!o pue!e emplearse en !istintas especies, !e
acuer!o con su morologa ( siempre )ue la planta se encuentre en buen esta!o
itosanitario. En la morog%nesis in!irecta, se orma primero un agrupamiento !e
c%lulas sin !ierenciacin ,llama!o comnmente callo., )ue es pre$io a la ormacin
!el $&stago. Tanto la concentracin como el tipo !e regula!or !e crecimiento presente
en el me!io !e culti$o, aectan el gra!o !e aparicin !e $ariantes entre los
regenerantes. 2na concentracin ele$a!a !e au'inas sint%ticas, como el 2-A:, o su
uso prolonga!o en el tiempo, pue!e originar $ariantes gen%ticas.
1a transparencia 16 muestra un es)uema !e la $a morogen%tica !irecta, por me!io
!e la cual los plantines se !esarrollan sin )ue el te*i!o pase pre$iamente por el esta!io
!e callo. 2n e*emplo !e esta $a es el !esarrollo !e $&stagos a partir !e ner$a!uras !e
#o*a. Esto genera una canti!a! !e plantines ma(or a la )ue se obtiene por crecimiento
!e (emas a!$enticias, lo cual permite acortar los tiempos !el proceso !e
multiplicacin. 1a actibili!a! !e esta t%cnica !epen!e !e la morologa !e la especie
en cuestin. 1a embriog%nesis !irecta ,o embriog%nesis som&tica., permite obtener
plantines completos me!iante un proceso similar al !e la ormacin !e embriones en
las semillas. Esta $a !e morog%nesis ocurre ma(oritariamente cuan!o se utili/an
e'plantos !eri$a!os !el gametoito emenino. 1a ten!encia !e estos te*i!os a generar
embriones som&ticos a!$enticios es alta en a)uellas plantas en )ue ocurre
naturalmente poli-embriona, como es el caso !e muc#as $arie!a!es !e Citrus ( otros
g%neros cercanamente relaciona!os. En el culti$o !e anteras, !on!e el ob*eti$o es la
obtencin !e plantas #aploi!es, %stas pue!en obtenerse !irectamente a partir !el
polen por embriog%nesis som&tica. 1a transparencia 19 muestra plantines !e Begonia
rex obteni!os me!iante morog%nesis !irecta. 1os plantines se !esarrollan a partir !e
las ner$a!uras !e las #o*as, generan!o una gran canti!a! !e nue$os $&stagos, sin
)ue el te*i!o #a(a pasa!o pre$iamente por un esta!io !e callo.
En la morog%nesis in!irecta, como se graica en la transparencia 1=, las c%lulas
!ierencia!as !e un e'planto, son in!uci!as a !i$i!irse como un agrupamiento
in!ierencia!o para luego reprogramarse #acia la ormacin !e un rgano. A partir !e
este callo, pue!en originarse (emas a!$enticias )ue !ar&n origen al plantn completo.
2n me!io subptimo pue!e prolongar la !uracin !e la ase callosa antes !e la
regeneracin, ( probablemente perturbe la mitosis en las c%lulas !el callo para !ar
origen a $ariantes. Esto po!ra ser una alternati$a a utili/ar en el caso en )ue se !esee
obtener $ariantes somaclonales. En algunas especies, como Daucus carota, se
a$orece el crecimiento !es!ierencia!o culti$an!o las c%lulas en me!io l)ui!o. Este
tipo !e culti$os se !enominan culti$os en suspensin. A continuacin, se pue!e in!ucir
la ormacin !e embriones som&ticos mo!iican!o los regula!ores !e crecimiento o
intro!ucien!o cambios sicos ,lu/Boscuri!a!.. 1os embriones som&ticos son
estructuras bipolares )ue tienen un polo !e crecimiento !e $&stago ( otro !e ra/. 1os
embriones pue!en originarse !e una sola c%lula sin cone'in $ascular con los te*i!os
maternos, o !e una masa globular !e te*i!o, !an!o origen luego a un plantn completo.
1os m%to!os )ue permiten la regeneracin !e plantas completas constitu(en un
complemento in!ispensable !e los m%to!os !e transormacin gen%tica. :ebi!o a )ue
la eiciencia !e regeneracin a partir !e embriones som&ticos es mu( alta, esta $a es
utili/a!a mu( recuentemente en especies en )ue este proceso es ineiciente por otras
$as. 1a eiciencia !e la etapa !e regeneracin inci!e !irectamente sobre el nmero !e
plantas transg%nicas )ue pue!en recuperarse ( tiene uerte inci!encia sobre la
$iabili!a! ( repro!ucibili!a! !e un protocolo !e transormacin. E*emplos tpicos !e
especies )ue #an si!o transorma!as siguien!o esta $a !e regeneracin son el ma/,
la so*a ( la caa !e a/car. 1a transparencia 1? muestra el crecimiento !ierencial en
me!io selecti$o !e callos embriog%nicos !e caa !e a/car )ue #an si!o
transorma!os por t%cnicas !e biobalstica. El !esarrollo !e callos en este me!io es
uertemente in!icati$o !e la presencia !e callos transg%nicos. El te*i!o pasar& luego
por la etapa !e !esarrollo !e embriones som&ticos a partir !e los cuales se
regenerar&n plantines completos.
1a transparencia 18 muestra un callo embriog%nico !e una especie !icotile!nea
,alala., inician!o la regeneracin. @ara las !icotile!neas, los pasos en la ormacin
!e embriones som&ticos son m&s marca!os )ue para las monocotili!neas, en las
cuales el callo embriog%nico no siempre a!)uiere un aspecto )ue permita !istinguirlo
rente al callo !e crecimiento en masa no embriog%nico. @ara las !icotile!neas, los
pasos en la ormacin !e embriones som&ticos compren!en+ a. ormacin !e pro-
embriones !e 9-? c%lulas0 b. esta!io globular, orma!o por c%lulas )ue an carecen !e
caractersticas embrionarias0 c. esta!io !e cora/n, en )ue el aspecto !el embrin es
trilobula!o ( los inicios cotile!onares se separan !el polo ra!icular0 !. esta!io !e
torpe!o, !on!e se elonga el esta!io anterior0 e. embrin con clara !ierenciacin !e
$&stago ( ra/. 1os callos embriog%nicos se !esarrollan en un me!io sin conteni!o !e
au'inas. "in embargo, la in!uccin !e la embriog%nesis re)uiere un me!io !e culti$o
con au'inas, pues estos regula!ores estimulan la !i$isin celular ( la ormacin !e
embriones.
En la transparencia 20 se es)uemati/a la Etapa --- !el proceso !e micropropagacin,
en la )ue se inicia el enrai/amiento ( se muestran los !istintos caminos )ue pue!en
seguirse en la transicin !e in vitro a ex vitro. Ca( especies )ue enra/an
espont&neamente in vitro, como es el caso !e muc#as ornamentales ,por e*emplo,
begonias, Syngonium, Spathyphillum, Aloe )ue se obser$a en la transparencia 21.,
mientras )ue otras !eben ser in!uci!as a enrai/ar in vitro, con me!ios especiales !e
enrai/amiento, para luego ser transeri!as a rusticacin e' >itro en sustrato ,por
e*emplo, esp&rragos, caa !e a/car.. Dtras especies pue!en no ser in!uci!as a
enrai/amiento in vitro ( lle$arse sin ra/ a con!icin ex vitro e in!ucir ormacin
ra!icular (a en el sustrato ,por e*emplo, ar&n!ano.. 1a in!uccin !el enrai/amiento
implica generalmente el uso !e au'inas.
1a rusticacin-aclimatacin !e la planta ,Etapa ->. es tal $e/ la etapa m&s crtica. El
!esarrollo in vitro (a #a inali/a!o, como $emos en la transparencia 22, ( a#ora !eben
procurarse con!iciones a!ecua!as para la a!aptacin gra!ual a las con!iciones ex
vitro. 1as instalaciones re)ueri!as para ello no implican costos ele$a!os, pero es
un!amental el a*uste !e las con!iciones ambientales para )ue los plantines continen
su crecimiento en una atmsera no controla!a. En algunas plantas ,por e*emplo,
Malus, Prunus. los estomas !e las #o*as orma!as in vitro comien/an a a!)uirir una
uncin normal !urante la aclimatacin en in$ern&culo. En otras plantas ,por e*emplo,
Brassica. las #o*as )ue no #an !esarrolla!o mecanismos eecti$os !e cierre !e
estomas no logran recuperarse en la aclimatacin. <especto al !esarrollo !e races,
una buena in!uccin ra!icular contribu(e a la aclimatacin !el plantn. @ara establecer
un calen!ario apropia!o !e entregas !e material, se !eben establecer los tiempos
necesarios para )ue las plantas alcancen un tamao comercial. Esto a su $e/
!etermina el resto !el es)uema !e pro!uccin, inclu(en!o las %pocas con$enientes !e
plantacin.

Costos versus productividad
Transparencias 23-32
1os costos !e micropropagacin est&n aecta!os por los siguientes actores+ a. los
costos !e instalacin !el laboratorio0 b. los costos !e mano !e obra0 c. los costos !e
materiales e insumos0 !. las caractersticas !e la planta in vitro0 e. las p%r!i!as
ocasionales )ue ocurran en las !istintas etapas !el proceso !e pro!uccin ,p%r!i!as
por contaminacin, por #iper#i!rici!a! irre$ersible0 por alta !e enrai/amiento, por
muerte !urante la aclimatacin.. Entre las caractersticas propias !e la planta, se !ebe
consi!erar su acili!a! para multiplicarse a lo largo !el tiempo en con!iciones !e
culti$o. En el caso !e plantas leosas, se re)uiere un tiempo para re*u$enecer
parcialmente el culti$o ( obtener as un crecimiento suicientemente r&pi!o para
encarar la multiplicacin. A su $e/, la recuencia con )ue pue!e ser multiplica!o un
culti$o !epen!er& !el nmero !e nue$os $&stagos pro!uci!os en ca!a subculti$o, as
como !el inter$alo !e tiempo entre ca!a subculti$o. Dtra caracterstica a consi!erar es
si los $&stagos necesitan ser enrai/a!os in vitro o pue!en #acerlo ex vitro.
El laboratorio !e micropropagacin a escala comercial implica una estructura
pro!ucti$a mnima, con instalaciones )ue permitan el mane*o !e al menos unos 10.000
plantines !iarios, una capaci!a! !e albergar 1.000.000 !e plantines por ao en
c&maras !e crecimiento ( sistemas automati/a!os !e control !e otopero!o,
temperatura ( #ume!a! ,transparencia 2A.. Estas instalaciones !eben estar !isea!as
consi!eran!o la gran canti!a! !e recipientes contene!ores !e plantines )ue lu(en por
el laboratorio+ esto implica pasillos aptos para !espla/ar carros ( estantes con
me!i!as a*usta!as para la ubicacin !e canastos )ue contengan los recipientes con
plantines. Es importante consi!erar )ue ca!a mo$imiento implica un tiempo ( un
!etermina!o riesgo !e manipulacin ( )ue la cali!a! !e las instalaciones contribu(e a
un !esarrollo m&s eiciente, m&s #igi%nico ( menos costoso !e la acti$i!a!. 2na buena
!isposicin !e los recipientes en las c&maras !e crecimiento para )ue pue!an ser
peri!icamente re$isa!os por el personal a cargo tambi%n resulta in!ispensable. En el
&rea !estina!a a los lu*os laminares, es importante contar con suiciente espacio para
el ingreso !e carros con plantines. Entre el instrumental necesario para la
micropropagacin, es con$eniente !isponer !e esterili/a!ores el%ctricos, lo cual e$ita
los riesgos !e incen!io asocia!os la utili/acin !e mec#eros ( !e alco#ol.
1a tarea !e sub!i$i!ir los plantines en orma manual es la m&s costosa. 2n elemento
cla$e para lograr cali!a! ( rapi!e/ es el entrenamiento !el personal. 2n operario bien
capacita!o pue!e reali/ar en una *orna!a !e traba*o entre 1.900 ( 2.?00 plantines
!iarios, !epen!ien!o !e la especie )ue est% sien!o micropropaga!a. @ese a los
intentos !e automati/acin ( !e incorporacin !e nue$as tecnologas, la
micropropagacin por !i$isin manual !e $&stagos a'ilares sigue sien!o #asta el
presente el m%to!o por e'celencia !e micropropagacin masi$a. 1a inraestructura ( el
instrumental !eben apo(ar ( #acer m&s eiciente la labor manual. @or e*emplo, es
importante lle$ar un registro !etalla!o !e los procesos )ue se reali/an. Esto permite
#acer seguimientos !etalla!os en los casos en )ue se registran !esarrollos anmalos
en las plantas micropropaga!as.
:entro !e los ob*eti$os !e pro!uccin, es cla$e+ a. la cali!a! !e la !i$isin !e los
plantines, !e orma tal )ue to!os tengan potenciali!a! !e crecimiento ( prolieracin.
Como se mencion anteriormente, una especie )ue pue!a sub!i$i!irse por segmentos
no!ales, ser& m&s pro!ucti$a ,se pro!ucen m&s plantinesB#ora. )ue otra cu(a !i$isin
re)uiera separacin !e macollos ( $&stagos a!$enticios0 b. la manipulacin !e las
plantas en total esterili!a!, e$itan!o contaminaciones acci!entales )ue sean
arrastra!as en siguientes subculti$os. 1a transparencia 29 ilustra el proceso !e
sub!i$isin !e plantines en un &rea est%ril.
@ara elaboracin a gran escala !e me!ios !e culti$o, un laboratorio necesita contar
con aparatos )ue permitan el procesamiento !e gran!es $olmenes !e l)ui!os. 1as
soluciones ma!res )ue sir$en para suplementar los me!ios con !istintos
micronutrientes ( $itaminas pue!en preparase en concentraciones !e 10, 100 ( 1000'.
Entre el instrumental necesario para la elaboracin ( mane*o ,transparencia 2=., se
cuentan contene!ores !e 6, 10 ( 20 1, agita!ores magn%ticos, #ornos !e microon!as
para acilitar la solubili!a! !e algunos compuestos, balan/a ( un me!i!or !e pC. 1as
autocla$es !eber&n tener una capaci!a! suiciente para ingresar los gran!es
$olmenes a ser esterili/a!os ( un registro !e los tiempos ( temperaturas alcan/a!as.
1os recipientes utili/a!os para el crecimiento in vitro !e plantines pue!en ser !e
ormatos $ariables.
1os recipientes contene!ores !e plantines, son una eleccin )ue a simple $ista pue!e
ser consi!era!a tri$ial, pero )ue sin embargo re)uiere cui!a!osa atencin. 1as
preerencias !e los laboratorios !iieren en esto0 algunos utili/an recipientes gran!es
capaces !e contener un alto nmero !e plantines ,lo )ue incrementa la rapi!e/ !e las
tareas manuales.. Dtros preieren utili/ar recipientes pe)ueos con poca canti!a! !e
plantas ,lo )ue !isminu(e los riesgos !e contaminacin.. 2n recipiente gran!e permite
menor acumulacin !e etileno, lo )ue !isminu(e la aparicin !e enmenos !e
senescencia ( acilita la prolieracin en algunas especies. 1os recipientes !eben ser
traslci!os para $isuali/ar a simple $ista la aparicin e$entual !e contaminaciones. "u
!iseo !ebe permitir )ue el manipuleo se realice con acili!a! ( rapi!e/ ,transparencia
28.. En caso !e no ser !escartables, !eben po!er ser esterili/a!os por algn m%to!o
)ue asegure esterili!a! total ,calor, ra!iacin, gases..
1a transparencia 28 muestra un e*emplo !e recipiente circular !e pl&stico !escartable.
Este mo!elo se encuentra m&s &cilmente en el merca!o. Tambi%n e'isten recipientes
rectangulares, traslci!os, altos ( con buen cierre !e tapa, pero no se encuentran tan
&cilmente !isponibles. 1a $enta*a !e %stos ltimos es )ue resultan m&s apropia!os
para su or!enamiento ( para la manipulacin por parte !el operario.
1a transparencia 30 muestra un &rea !e traba*o apta para )ue el opera!or pue!a
reali/ar su tarea con m&'ima eiciencia. 1os siguientes elementos !eben estar
&cilmente !isponibles+ a. carro con recipientes contenien!o las plantas a ser
sub!i$i!i!as ( recipientes con los me!ios rescos para recibir los nue$os $&stagos0 b.
alco#ol ( gasa est%ril para limpiar los recipientes a ser intro!uci!os al &rea !e lu*os
laminares0 c. pin/as ( bistures0 !. soporte !on!e ser&n sub!i$i!i!os los plantines0 e.
esterili/a!or el%ctrico ,en lo posible, e$itar mec#eros a gas ( alco#ol para re!ucir los
riesgos !e incen!io..
1a transparencia 31 muestra las con!iciones !e rusticacin necesarias para la
aclimatacin gra!ual !e los plantines obteni!os in vitro. Esta !ebe reali/arse en
con!iciones controla!as, particularmente !e temperatura ( #ume!a!. Es importante
!e!icar un tiempo a rotular las nue$as plantas )ue ingresan. :ic#os rtulos !eber&n
permitir la tra/abili!a! !e los plantines )ue est&n sien!o procesa!os en su etapa inal.
A!em&s, para preser$ar la sani!a! obteni!a me!iante el proceso in vitro, !ebe
restringirse el acceso !e cual)uier planta no testea!a en su con!icin itosanitaria al
ambiente en )ue se reali/a la rusticacin.
"i bien en la etapa !e laboratorio se consi!era )ue un plantn est& completo cuan!o
#a !esarrolla!o su parte ra!icular, en t%rminos comerciales el plantn 4completo5 es
a)uel )ue cumple las e'pectati$as !el solicitante. 2n e*emplo tpico )ue ilustra este
punto es el !e las plantas ruti-#ortcolas. "e consi!eran )ue %stas est&n listas para la
comerciali/acin cuan!o #an alcan/a!o un buen crecimiento ( son aptas para su
!esarrollo en las con!iciones ambientales naturales. En la transparencia 32 se
obser$a la ltima ase !e in$ern&culo, !on!e las plantas est&n ba*o me!ia sombra, en
su etapa inal, pre$io a ser entrega!as.
Control fitosanitario y varietal
Transparencias 33-39
El control itosanitario es esencial en to!as las etapas !e la micropropagacin, (a )ue
cual)uier agente ineccioso se repro!ucir& en orma e'ponencial con*untamente con el
aumento !el nmero !e plantines ,transparencia 3A.. El material contamina!o se !ebe
eliminar lo m&s temprano posible !el stock !e plantas a micropropagar para e$itar
incurrir en gra$es p%r!i!as econmicas. 1as contaminaciones bacterianas o ngicas
suelen !etectarse me!iante simples obser$aciones $isuales. 1as mismas son m&s
recuentes en las primeras etapas !e la micropropagacin, ( se originan en los
microorganismos )ue no #an si!o elimina!os en la etapa !e !esineccin. @or otra
parte, e'isten bacterias en!genas )ue permanecen latentes !entro !e la planta (
aloran en subculti$os a$an/a!os. "egn cmo las mismas aecten al crecimiento !e
la planta ( a la intensi!a! !e su aparicin, pue!e tratarse al culti$o con algn
compuesto antibacteriano para eliminar o re!ucir su crecimiento. <especto !e las
contaminaciones $irales, el !iagnstico se reali/a en las plantas ma!res, antes !e
intro!ucirlas en el culti$o in vitro. Eeneralmente, se reali/an ensa(os
inmunoen/im&ticos ,E1-"A. o con plantas in!ica!oras para !etectar presencia o
ausencia !e micoplasmas o $irus conoci!os en ca!a culti$o particular. 1os m%to!os !e
@C< son m&s aptos para !etectar canti!a!es mnimas !e estos agentes inecciosos.
Cuan!o slo se !ispone !e plantas inecta!as para iniciar un proceso !e
micropropagacin, una estrategia eica/ ( relati$amente inocua es tratar a la planta
ma!re o a los meristemas (a e'tra!os con incubaciones a alta temperatura. 1uego !e
!ic#o tratamiento ( !e la !esineccin inicial para intro!ucir el material en el culti$o in
vitro, los meristemas en crecimiento se anali/ar&n nue$amente para !etectar
presenciaBausencia !e $irosis. :epen!ien!o !el gra!o !e ineccin !e la planta ma!re,
siempre ser& posible eliminar un cierto porcenta*e !e los agentes inecciosos en los
meristemas trata!os. 3o !eben escatimarse cui!a!os para establecer la sani!a! !el
stock material inicial. El criterio principal en esta etapa es asegurarse )ue el material
)ue sir$e como base a to!o el proceso !e micropropagacin es sano por to!os los
criterios !isponibles.
Antes !e iniciar un proceso !e micropropagacin masi$a, es un!amental constatar la
i!enti!a! !e las plantas ma!res con patrones $arietales bien estableci!os. Como es
ob$io, la intro!uccin !e material poco caracteri/a!o al comien/o !e la
micropropagacin pue!e tener gra$es consecuencias econmicas en la me!i!a )ue se
a$an/a en la multiplicacin. 1os proce!imientos m&s emplea!os en la actuali!a!
#acen uso !e !istintos tipos !e marca!ores moleculares, tales como <A@:s, AF1@s (
""<s. En la transparencia 39 $emos un gel !e poliacrilami!a mostran!o ban!as
obteni!as por microsat%lites )ue permiten !ierenciar $arie!a!es !e ar&n!anos.
1a caracteri/acin !e $arie!a!es por t%cnicas !e biologa molecular garanti/a un
control interno eica/ sobre la uniormi!a! !el material $egetal )ue se est&
pro!ucien!o. E'isten !i$ersos m%to!os con !istintas $enta*as ( !es$enta*as segn la
acili!a! !e su implementacin0 su repro!ucibili!a! ( los costos in$olucra!os.
Gestin productiva
Transparencias 3=-A2
@ara lle$ar a!elante un plan !e micropropagacin masi$a, es un!amental optimi/ar la
gestin en to!as las etapas ( coor!inar las mismas en orma precisa ,transparencia
3?. "e !eben consi!erar par&metros como+ a. las tasas !e prolieracin !e las plantas0
b. la posibili!a! !e !ecaimiento !e las tasas prolierati$as0 c. las %pocas !e
multiplicacin !e las !istintas especies para mantener una labor continua!a0 !. el
re)uerimiento !e mano !e obra para la multiplicacin !e ca!a $arie!a!Bespecie.
<esulta cla$e la obser$acin constante !el esta!o !e los plantines para po!er pre!ecir
cambios en las tasas !e prolieracin ( $isuali/ar la aparicin !e contaminaciones. En
base a las mismas, se po!r&n anticipar cambios en los ren!imientos espera!os (
mo!iicar anticipa!amente los pero!os !e multiplicacin para a*ustar la pro!uccin.
Asimismo, el conocimiento !e tasas ( !e ren!imientos permite pre$er la canti!a! !e
me!io !e culti$o a elaborar. Es con$eniente contar siempre con me!io !e culti$o listo
para anticipar e$entuales incrementos en la tasa prolierati$a, o para el caso !e )ue se
a!elante la multiplicacin !e algn culti$o )ue presente buen crecimiento. "in
embargo, no con$iene tener me!ios en stock por m&s !e 30 ! sin ser utili/a!os. 1as
consi!eraciones sobre la etapa !e enrai/amiento !epen!en !el tipo !e planta ( !e si el
mismo se reali/ar& in vitro o ex vitro. El enrai/amiento ex vitro es siempre m&s
con$eniente, (a )ue implica un paso menos !e culti$o in vitro ( menos utili/acin !e
c&maras !e crecimiento. Finalmente, una gestin eica/ !e la aclimatacin es crtica
para lograr un plantn completo bien termina!o.
1a intro!uccin !e alternati$as al culti$o en me!io semisli!o en alguna etapa !el
proceso !e micropropagacin pue!e incrementar la pro!ucti$i!a! ( la cali!a! !e las
plantas. 1os biorreactores )ue permiten inmersin temporaria, acilitan la o'igenacin
!e los culti$os, as como la !ilucin !e compuestos t'icos )ue pue!an acumularse
alre!e!or !el plantn en crecimiento en un me!io semisli!o. 1a transparencia 38
muestra un con*unto !e biorreactores !e tipo <-TA en el )ue se culti$an plantines !e
caa !e a/car. El lu*o !e me!io ( la aireacin son controla!os por un tempori/a!or.
:urante el seguimiento !e la micropropagacin pue!en implementarse cambios )ue
tien!an a una me*ora en la cali!a! !e las plantas o un incremento en la pro!ucti$i!a!.
Algunos e*emplos est&n menciona!os en la transparencia A0. 2tili/ar un agrega!o !e
me!io !e culti$o l)ui!o sobre la base !e un me!io semisli!o implica una reposicin
!e nutrientes para los plantines sin )ue ello re)uiera un subculti$o a me!io resco, con
el consiguiente a#orro !e mano !e obra. Tambi%n pue!en alternarse los me!ios !e
culti$o, me!iante mo!iicaciones en la composicin !e regula!ores !e crecimiento u
otros componentes !el me!io. :ebe consi!erarse )ue una prolonga!a e'posicin a un
nico me!io !e culti$o pue!e pro!ucir un acostumbramiento o agotamiento !e los
plantines a los regula!ores !e crecimiento emplea!os. Tambi%n pue!en contribuir a
incrementar el crecimiento los cambios en la aireacin !e los recipientes o en la
intensi!a! lumnica.
El calen!ario !e pro!uccin !ebe a*ustarse a los re)uerimientos !e los pro!uctores o
!e los $i$eristas, )uienes generalmente re)uieren las plantas en una !etermina!a
%poca !el ao ,transparencia A1.. Tanto la preparacin !e las plantas como la
e'pe!icin !e las mismas, !eben ser con!uci!as con sumo cui!a!o. El cliente !ebe
recibir las plantas encarga!as en e'celente esta!o. Es importante reali/ar un
seguimiento post-$enta !el material $egetal entrega!o, lo )ue permitir& obtener un
ma(or conocimiento !el merca!o ( !e sus posibles alcances. @ue!e ocurrir )ue el
cliente solicite e'clusi$i!a! en cuanto a la propagacin !e un !etermina!o material
$egetal proporciona!o por %l mismo. En este caso, si las canti!a!es permiten i*ar
costos ra/onables, se reali/an contratos e'clusi$os !e propagacin.
1a micropropagacin comercial, #a teni!o proun!o impacto social en muc#as
regiones !e 1atinoam%rica ,transparencia A2.. @or e*emplo, en la locali!a! !e "imoca,
situa!a a 90 Gm !e "an ;iguel !e Tucum&n, un grupo !e pe)ueos pro!uctores
caeros miniun!istas !eci!ieron cambiar su estrategia pro!ucti$a ( se $olcaron al
culti$o !el ar&n!ano. "e re)uieren como mnimo 6 #a !e este culti$o para tener una
pro!uccin rentable. 1a micropropagacin !e material sano ( !e cali!a! comercial les
permiti $incularse con el merca!o !e e'portacin a los pases !el #emiserio norte,
con el consiguiente incremento !e sus beneicios econmicos. Asociaciones como
est& pue!en organi/arse en el caso !e muc#as otras pro!ucciones especiali/a!as
,rutcolas, #ortcolas, ornamentales ( orestales. en )ue la pro$isin !e materiales
propagati$os !e cali!a! certiica!a constitu(e un re)uerimiento pro!ucti$o importante.
Como es ob$io, el impacto social ( regional !e este tipo !e e'periencia es,
potencialmente, mu( gran!e.
Otras aplicaciones de la micropropagacin
Transparencias A3-60
1as transparencias A6 a 60 muestran otras aplicaciones en )ue se pue!e utili/ar la
micropropagacin masi$a como un instrumento au'iliar !e otros proce!imientos. 2no
!e los e*emplos se relaciona con la utili/acin !e la t%cnica !e micropropagacin
$incula!a al caso !e una planta transg%nica ,en este caso, plantas !e papa resistentes
al $irus @>H.. @ara po!er e$aluar !ic#a planta ( #acer selecciones ( ensa(os a
campo, se necesita multiplicar la lnea transg%nica en canti!a!es suicientes ( obtener
plantas en i!%nticas con!iciones para su e$aluacin a campo en !ierentes locali!a!es
( ba*o !istintas con!iciones ambientales. Estos ensa(os son imprescin!ibles para
satisacer las e'igencias !e los organismos responsables !e la e$aluacin ( liberacin
!e DE;s al me!io ambiente ,transparencia A8..