335

Protenas G
y fosfolipasas
D
FERNANDO PICATOSTE Y ENRIQUE CLARO
Los fosfolpidos como precursores Los fosfolpidos como precursores Los fosfolpidos como precursores Los fosfolpidos como precursores Los fosfolpidos como precursores
de segundos mensajeros de segundos mensajeros de segundos mensajeros de segundos mensajeros de segundos mensajeros
esde que en los aos cincuenta Mabel y
Lowell Hokin mostraran que la acetilcolina
acelera el recambio metablico del fosfati-
dilinositol en clulas pancreticas (Hokin y Hokin, 1955), describiendo la pri-
mera evidencia de la participacin de lpidos en la transduccin de seales, el
trabajo de un buen nmero de laboratorios ha revelado la existencia de varios
enzimas efectores que generan segundos mensajeros a partir de los fosfolpidos
de membrana. stos incluyen las fosfolipasas C de fosfoinostidos (PLC), las
fosfolipasas D (PLD), las fosfolipasas A
2
(PLA
2
), las fosfoinostido 3-quinasas
y la esfingomielinasa. Entre los diversos productos a los que dan lugar, el ino-
sitol 1,4,5-trifosfato (Ins1,4,5P
3
), el inositol 1,3,4,5-tetrafosfato (Ins1,3,4,5P
4
), el
diacilglicerol (DAG), el cido fosfatdico (PtdOH), los lisofosfolpidos, el ci-
do araquidnico, el fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato, la ceramida y la esfingo-
sina 1-fosfato han mostrado ejercer algn papel en la transduccin de seales.
De los citados efectores, slo en el caso de algunas PLC se ha demos-
trado inequvocamente su activacin directa por protenas G heterotrimricas
acopladas a receptores de neurotransmisores. En el caso de las otras dos
fosfolipasas, aunque se ha descrito que las subunidades G de la transducina
pueden activar la PLA
2
y se ha propuesto que las protenas G
12,13
podran
mediar la activacin de la PLD en algunos sistemas, las principales vas de
336
Receptores para neurotransmisores
activacin son, como veremos, indirectas y secundarias a la estimulacin de
otros efectores como la PLC. De todo el amplio campo de mecanismos de
transduccin que implican transformaciones de lpidos, este captulo se centra
en la descripcin de aqullos en los que participan las fosfolipasas C, D y A
2
.
Fosfolipasa C de fosfoinostidos Fosfolipasa C de fosfoinostidos Fosfolipasa C de fosfoinostidos Fosfolipasa C de fosfoinostidos Fosfolipasa C de fosfoinostidos
Los fosfoinostidos son fosfoglicridos presentes en la membrana plas-
mtica, cuya cabeza polar est constituida por mio-inositol unido a uno o ms
grupos fosforilo. Los fosfoinostidos mayoritarios son el fosfatidilinositol
(PtdIns), el fosfatidilinositol 4-fosfato (PtdIns4P) y el fosfatidilinositol 4,5-
difosfato (PtdIns4,5P
2
), siendo el primero el ms abundante. Existe un segun-
do grupo de fosfoinostidos con funcin sealizadora que estn fosforilados en
la posicin 3 (PtdIns3P, PtdIns3,4P
2
y PtdIns3,4,5P
3
), generados por la fosfo-
inostido 3-quinasa, la cual se activa por estimulacin de receptores con ac-
tividad tirosina quinasa, aunque tambin puede ser activada por receptores
acoplados a protenas G (GPCR). Este grupo minoritario de fosfoinostidos in-
teracciona con diversas dianas proteicas, ejerciendo funciones sealizadoras en
varios procesos celulares (citoproteccin, proliferacin, etc.) cuya descripcin
escapa del alcance de este captulo, pero que el lector puede encontrar en al-
guna revisin reciente (Vanhaesebroeck et al., 2001).
Un gran nmero de agonistas, incluyendo hormonas, neurotransmi-
sores y factores de crecimiento, activan la PLC promoviendo la hidrlisis de
PtdIns4,5P
2
, lo que da lugar a Ins1,4,5P
3
y DAG (fig. 1). Esta respuesta pue-
de ser mediada por GPCR, de los que se hace un listado en la tabla 1, pero
Muscarnicos de la acetilcolina (M
1,3,5
)
Adrenrgicos (
1A,1B,1D
)
Serotoninrgicos (5HT
2A,2B,2C
)
Histaminrgicos (H
1
)
Glutamatrgicos (mGLU-R
1,5
)
Receptores de endotelina (ET
A,B
)
Purinrgicos (P2Y
1,2,4,6,11
)
Receptores de prostanoides (FP, TP, EP
1,3
)
Receptores de leucotrienos (BLT, CysLT
1,2
)
Receptores de lisofosfolpidos (edg
3,4,5,7
)
Receptores activados por proteasa (PAR1)
Receptores de pptidos:
Angiotensina (AT
1
),
Bombesina (BB
1,2
),
Bradiquinina (B
1,2
),
Calcitonina, CGRP
Colecistoquinina (CCK
A,B
),
Eledoisina, neurotensina,
Pptido liberador de gastrina, GRH,
Oxitocina, TRH,
Sustancia P/neuroquininas (NK
1,2,3
),
Vasopresina (V
1A,1B
)
Tabla 1 Receptores que activan el sistema protena G
q
fosfolipasa C
337
Protenas G y fosfolipasas
tambin por receptores canal y receptores con actividad tirosina quinasa por
mecanismos que comentaremos ms adelante. Tanto Ins1,4,5P
3
como DAG
actan como segundos mensajeros, el primero movilizando Ca
2+
intracelular
y el segundo activando la protena quinasa C (PKC) y, a travs de estas accio-
nes, regulan diversas funciones celulares. Revisaremos seguidamente los di-
ferentes aspectos de este ubicuo y extensamente estudiado mecanismo de
transduccin.
Metabolismo de los fosfoinostidos y los inositol fosfatos
La biosntesis de novo del PtdIns tiene lugar en el retculo endoplsmico
y, en la membrana plasmtica, es fosforilado secuencialmente por la PtdIns
4-quinasa y la PtdIns4P 5-quinasa para generar PtdIns4,5P
2
. Existen distintas
formas isoenzimticas de ambas quinasas, as como fosfatasas que liberan los
fosforilos introducidos por las primeras, desconocindose la utilidad funcional
de dicha diversidad. La hidrlisis de los fosfoinostidos por la PLC genera
DAG que puede ser recuperado para la resntesis de PtdIns tras su fosforilacin
por la DAG quinasa, la conversin del PtdOH resultante en CDP-DAG por
accin de la CTP-fosfatidato citidiltransferasa y la formacin de PtdIns a par-
tir de CDP-DAG e inositol por accin de la PtdIns sintasa (fig. 2).
Figura 1 Hidrlisis del PtdIns4,5P
2
por la PLC
H C-O-C-R
H C-O-C-R
O
O
2
2
1
1
H C-O-C-R
H C-O-C-R
O
O
2
2
2
2
H C-O
H C-OH
Ptdlns4,5P
2
2
2
P
P
P
PLC
DAG
Ins1,4,5P
3
P
P
P
338
Receptores para neurotransmisores
El otro producto de la hidrlisis de PtdIns4,5P
2
, el Ins1,4,5P
3
, se meta-
boliza para dar inositol, que puede ser reutilizado para la formacin de PtdIns,
siguiendo dos vas alternativas. Una de ellas consiste en su desfosforilacin
secuencial generando Ins1,4P
2
, Ins4P e inositol. La segunda implica su fosfo-
rilacin por una quinasa dependiente de Ca
+2
/calmodulina, dando lugar a
Ins1,3,4,5P
4
, el cual se transforma en Ins1,3,4P
3
que, a su vez, puede desfos-
forilarse hasta inositol por dos rutas alternativas (fig. 3). Un aspecto interesan-
te de este complejo metabolismo es el hecho de que el Li
+
acta como inhi-
bidor acompetitivo de la inositol polifosfato 1-fosfatasa (que desfosforila en la
posicin 1) y de la inositol monofosfatasa (que desfosforila Ins1P, Ins3P e
Ins4P), por lo que en su presencia se acumulan inositol monofosfatos y se
impide la formacin de inositol a partir de los mismos. Esto conduce, en mu-
chos tejidos, a la inhibicin de la resntesis de fosfoinostidos, alterando la
activacin por agonistas de la PLC. Estos efectos han sido considerados como
un posible mecanismo implicado en las acciones teraputicas del Li
+
en el tra-
PLC
1
2
3
4
5
Ins1,4,5P
3
Ins4,5P
Ins4P
Ins
Ins
CMP
P
P
PtdIns
PtdIns
PtdIns4P
PtdIns4,5P
2
CDP-DAG
PtdOH
DAG
P
P
P
Inositol
OH
P
Figura 2 Metabolismo de los fosfoinostidos. 1: InsP 4-quinasa; 2: Ins4P 5-quinasa; 3: DAG quinasa;
4: CTP-fosfatidato citidiltransferasa; 5: PtdIns sintasa
Figura 3 Metabolismo de los ino-
sitol fosfatos. 1: Ins1,4,5P
3
quinasa;
2: Inositol polifosfato 5-fosfatasa
(InsP
x
5-Pasa); 3: InsP
x
1-Pasa; 4: InsP
x
4-Pasa; 5: InsP
x
3-Pasa; 6: inositol
monofosfatasa. Se indican los pasos
inhibidos por Li
+
Ins1,4,5P
3
2
2
1
Ins1,4P
2
3
Ins4P
Inositol
Ins1,3,4P
3
3
Ins3,4P
2
4
Ins3P
Li
+
Li
+
Li
+
Li
+
Ins1,3,4,5P
4
PtdIns4,5P
2
4
Ins1,3P
2
5
6
6
6
Ins1P
PLC
339
Protenas G y fosfolipasas
tamiento del sndrome de depresin bipolar. Segn esta idea, y teniendo en
cuenta que los inhibidores acompetitivos producen mayor inhibicin cuanto
mayor es la actividad enzimtica, el efecto del Li
+
sera ms patente en siste-
mas de receptores con un exceso de actividad supuestamente asociado a la
mencionada patologa, el cual sera disminuido por el ion.
PLC: isoenzimas y mecanismos de activacin
Se han identificado 11 isoenzimas de la PLC que por sus caractersticas
de secuencia se han clasificado en cuatro grupos: PLC
1-4
, PLC
1,2
, PLC
1-4
y
PLC (fig. 4). Todos ellos son monmeros y poseen pesos moleculares de
aproximadamente 85 kDa (PLC), 150 kDa (PLC y PLC) y 255 kDa (PLC).
Todos presentan dos zonas de alta homologa denominadas X (aprox. 170
aminocidos) e Y (aprox. 260 aminocidos), que presentan una conformacin
en barril y que son necesarias para constituir el dominio cataltico. En las
PLC, PLC y PLC, estas zonas estn precedidas por un segmento de secuen-
cia variable de unos 300 aminocidos en el extremo N-terminal que contiene
un dominio PH, llamado as por su homologa con la protena de plaquetas
plecstrina, que interacciona con PtdIns4,5P
2
en la membrana. Esta interaccin
no implica hidrlisis del fosfolpido (ese trabajo lo realizan los dominios X e
Y sobre otra molcula de sustrato) sino que, al menos en las PLC y PLC,
cumple la funcin de unir la PLC a la membrana, donde estn sus sustratos.
Una funcin semejante parece cumplir un dominio C
2
, que muestra una con-
formacin en sandwich y que puede unir Ca
2+
y fosfolpidos de membrana,
presente en todos los isoenzimas de PLC en una zona prxima al C-terminal.
Figura 4 Isoenzimas de la
PLC: A) Disposicin de los do-
minios. B) Esquema de las
vas de activacin
Ras-GEF X C2 RA RA
PLC-d
PLC-g
PLC-
PLC- Y
1-4
1,2
1-4
PH X C2 Y
PH X C2 SH2 Y
PH
A)
X C2 Y
PH
SH2 SH3
PH
B)
Ras,
G ,Ca
Ca
PLCg
PLCd
Receptor
PLCe PLC
12
H
,
q
2+
2+
pTyr
Ca
2+
340
Receptores para neurotransmisores
En las PLC, no obstante, esta funcin de unin a la membrana no es realiza-
da por los citados dominios, sino por residuos cargados positivamente en su
zona C-terminal. En las PLC, los dominios X e Y estn separadas por un seg-
mento que contiene dominios PH y otros que son homlogos de regiones con-
servadas en tirosina quinasas de la familia Src y otras familias. Estos ltimos,
llamados SH
2
y SH
3
(de Src homology domains), constituyen lugares de reco-
nocimiento de fosfotirosinas y de zonas ricas en prolina de otras protenas,
respectivamente. Por su parte, la PLC, recientemente descrita, contiene dos
dominios llamados RA de interaccin con Ras-GTP (forma activada de la pro-
tena G monomrica Ras) en la zona C-terminal y un dominio con actividad
Ras-GEF (de guanine nucleotide exchange factor, actividad intercambiadora de
GDP por GTP en Ras) en la zona N-terminal. Puesto que Ras se asocia con la
membrana plasmtica, todos ellos permiten la interaccin de la PLC con la
misma y, como veremos, la fosfolipasa puede tanto activar Ras como ser activa-
da por ella. Finalmente, a diferencia de otros efectores como la adenililciclasa,
el anlisis hidroptico de las secuencias de las PLC no revela la presencia de
dominios hidrofbicos, por lo que las PLC no son protenas integrales de mem-
brana, habindose encontrado sus actividades tanto en el citosol como asocia-
das a la membrana.
Se conocen, al menos en parte, los mecanismos de activacin de las
PLC, PLC y PLC, habindose propuesto algunas posibles vas para la acti-
vacin de PLC (fig. 4). Las PLC son activadas por receptores de factores de
crecimiento que tienen actividad tirosina quinasa. En presencia de los agonis-
tas, estos receptores dimerizan y fosforilan tirosinas del propio receptor y de
otras protenas. Las fosfotirosinas formadas constituyen el lugar de interaccin
de los dominios SH
2
de las PLC que tambin se fosforilan en tirosinas, lo cual
favorece su interaccin, a travs de los dominios SH
3
, con elementos de actina
del citoesqueleto y determina su interaccin con la membrana plasmtica y su
activacin. Un mecanismo semejante parece implicado en su activacin por
otros receptores, como los de algunas inmunoglobulinas y citoquinas, que, sin
tener actividad enzimtica, estimulan otras tirosina quinasas. Por otra parte,
tambin algunos GPCR pueden estimular la PLC a travs de la activacin de
tirosina quinasas, tanto citoslicas, como las correspondientes a receptores de
factores de crecimiento. En el caso de las primeras, se ha descrito estimulacin
por receptores de angiotensina II, trombina y factor activador de plaquetas. En
el de las segundas, se ha caracterizado un proceso conocido como transactiva-
cin, comentado en el ltimo captulo de esta obra, en el que un GPCR indu-
ce, a travs de la estimulacin de tirosina quinasas solubles, la fosforilacin y
activacin de un receptor de factor de crecimiento en ausencia de los agonistas
de este ltimo. En todos los casos se ha propuesto la participacin de subuni-
341
Protenas G y fosfolipasas
dades G
q
o de subunidades G de las protenas G
i
. Finalmente, la PLC
tambin puede ser modulada en ausencia de fosforilacin de tirosinas, habin-
dose descrito activacin directa por PtdOH (formado por la PLD), cido
araquidnico (generado por la PLA
2
) y PtdIns3,4,5P
3
.
Por su parte, las PLC son activadas por protenas G. Por un lado, to-
das ellas son estimuladas por subunidades de la familia G
q
en presencia de
GTP o sus anlogos no hidrolizables, habindose demostrado activacin direc-
ta va G
q
en el caso de un buen nmero de receptores, incluyendo los musca-
rnicos de la acetilcolina. Esta interaccin directa G
q
-PLC es, adems, ne-
cesaria para desactivar de forma eficiente G
q
ya que PLC estimula su baja
actividad GTPasa. Por otra parte, todas las PLC, salvo la PLC
4
, son activa-
das tambin por los dmeros G de las protenas G, efecto en el que no pare-
ce haber selectividad de subtipos de subunidades G, salvo en el caso de
G
1

1
de la transducina, que muestra menor potencia. Ambas activaciones
muestran diferencias que pueden tener importancia funcional. La interaccin
de G
q
y G con las PLC tiene lugar en distintos sitios del enzima, ubica-
dos en las regiones C-terminal y N-terminal respectivamente, por lo que las
activaciones pueden ser aditivas. Adems, las sensibilidades de las distintas
PLC frente a las subunidades G o G tambin son diferentes. En el caso de
la activacin por G
q
la sensibilidad sigue el orden: PLC
1
> PLC
3
> PLC
4
> PLC
2
, mientras que para las subunidades G, el orden es: PLC
3
> PLC
2
> PLC
1
. Finalmente, las protenas G de las que proceden ambos tipos de
subunidades son probablemente distintas, pues las concentraciones de G re-
queridas para la activacin de la PLC son mayores que las de G
q
y diversas
evidencias experimentales indican que las G se originan por disociacin de
protenas G
i
o G
o
. Este hecho puede explicar la existencia, repetidamente des-
crita, de activaciones de la PLC insensibles a la toxina pertussis (que no inter-
fiere con las protenas G
q
, pero cataliza la ADP-ribosilacin de las G
i
y G
o
,
bloqueando su activacin por receptores), que seran mediadas por G
q
, y de
otras inhibidas por la toxina, que seran mediadas por G. Los datos dispo-
nibles indican que la activacin por uno u otro tipo de subunidades depende-
r, en cada tejido, de la expresin de los diferentes isoenzimas de la PLC y
de los distintos tipos de protena G, as como de la capacidad de los recepto-
res para interaccionar con ellos.
En cuanto a las PLC, sus mecanismos de activacin fueron desconoci-
dos hasta que la caracterizacin de su estructura tridimensional y la posibili-
dad de su estudio in vitro, permiti comenzar a estudiar directamente los fac-
tores que la regulan. La PLC puede ser estimulada por la protena G
h
, cuya
subunidad se distingue de las dems por tener un mayor tamao (aprox.
80 kDa) al poseer un dominio adicional con actividad transglutaminasa, y que
342
Receptores para neurotransmisores
puede ser activada por receptores
1
adrenrgicos. Por otro lado, la PLC es
el isoenzima que muestra ms sensibilidad al Ca
2+
, pudiendo ser activada por
concentraciones de Ca
2+
relativamente bajas, similares a las presentes en el
citosol de clulas estimuladas con agentes que inducen la entrada de Ca
2+
extracelular o la movilizacin del Ca
2+
intracelular. Por ello, los agonistas que
interaccionan con receptores que son canales de cationes, que causan despo-
larizacin en clulas con canales de Ca
2+
dependientes de voltaje o que acti-
van canales de Ca
2+
por algn otro mecanismo, as como los que activan otros
isoenzimas de la PLC, pueden estimular la PLC de forma secundaria a la
entrada o movilizacin del ion.
Finalmente, el conocimiento de los mecanismos de activacin de la
PLC es an limitado, dado que este isoenzima ha sido descubierto muy re-
cientemente. Se ha propuesto que podra ser activado in vivo por Ras, ya que
un mutante constitutivamente activo de esta protena G monomrica estimula
la fosfolipasa in vitro y que este efecto desaparece por deleccin de los domi-
nios RA. Asimismo, su dominio Ras-GEF acta como activador de Ras y de
la va de las protena quinasas activadas por mitgenos (MAPK), efecto que
es independiente de su capacidad para hidrolizar PtdIns4,5P
2
. Por otra parte,
tambin se ha observado activacin por un mutante constitutivamente activo
de la subunidad de la protena G
12
, por lo que podra ser un efector de esta
familia de protenas G. No obstante, desconocemos por ahora los receptores
que utilizan PLC como sistema efector y los procesos celulares en los que
participa la estimulacin de este isoenzima.
Ins(1,4,5)P
3
y movilizacin de Ca
2+
Como ya se ha comentado, los dos productos de la hidrlisis del PtdIns4,5P
2
por las PLC, Ins1,4,5P
3
y DAG, actan como segundos mensajeros. Describi-
remos en primer lugar las acciones del Ins1,4,5P
3
en la movilizacin de Ca
2+
en el contexto general del papel de este ion en la transduccin de seales.
El Ca
2+
participa en la regulacin de muchas funciones celulares impor-
tantes modulando la actividad de protenas, tanto directamente, como a tra-
vs de protenas reguladoras como la calmodulina. Dado que altos niveles de
Ca
2+
tienen efectos deletreos para la clula, su concentracin en el citosol se
mantiene baja (aproximadamente 100 nM), gracias a la actividad del inter-
cambiador Na
+
/Ca
2+
de la membrana plasmtica y a diversas Ca
2+
-ATPasas
que bombean el ion fuera del compartimiento citoslico. Muchas seales
extracelulares, entre las que se cuentan los agonistas que activan las PLC, ejer-
cen su accin promoviendo una elevacin transitoria de la concentracin de
Ca
2+
intracelular. sta se puede producir de dos formas distintas: por un lado,
las seales pueden activar la entrada de Ca
2+
desde el medio extracelular, don-
343
Protenas G y fosfolipasas
de su concentracin es mucho mayor, a travs de alguno de los mltiples ca-
nales de Ca
2+
presentes en la membrana y, por otro, pueden movilizar Ca
2+
almacenado en depsitos intracelulares. Ambos mecanismos estn presentes en
los efectos de los agonistas de receptores metabotrpicos que activan las PLC.
stos inducen, en general, una elevacin de la concentracin de Ca
2+
intrace-
lular en la que se puede distinguir un primer pico transitorio de aumento, se-
guido de un perodo ms prolongado en el que la concentracin de Ca
2+
se
mantiene por encima del nivel basal. Dado que la segunda fase, pero no el pico
inicial, depende de la presencia de Ca
2+
extracelular, la primera fase se debe a
movilizacin de Ca
2+
intracelular y en la segunda participa la entrada de Ca
2+
extracelular.
El responsable de la movilizacin de Ca
2+
intracelular es el Ins1,4,5P
3
,
como fue mostrado inicialmente en clulas pancreticas permeabilizadas y
verificado despus en muchos sistemas. El Ca
2+
se libera de depsitos presen-
tes en el retculo endoplsmico a travs de un canal ubicado en su membrana,
que constituye el receptor de Ins1,4,5P
3
. Este receptor es un tetrmero consti-
tuido por cuatro subunidades iguales, de unos 310 kDa, de las que existen
variantes muy similares generadas por diversidad gnica (se conocen cuatro
genes de las mismas) y por splicing alternativo del mRNA. Cada subunidad
tiene cuatro segmentos transmembrana en el extremo C-terminal, con los que
se fija a la membrana del retculo endoplsmico, y un largo dominio citoslico,
en cuya regin N-terminal se encuentra el lugar de unin del Ins1,4,5P
3
, que es
rico en aminocidos bsicos. El Ins1,4,5P
3
eleva normalmente la concentracin
citoslica de Ca
2+
hasta aproximadamente 1 M y su accin es muy rpida. Se
ha observado variabilidad en la sensibilidad del receptor de Ins1,4,5P
3
, que se
ha atribuido a diferencias en el nivel de Ca
2+
en los depsitos intracelulares y
a diversidad de subtipos del receptor. Finalmente, el propio Ca
2+
modula el
efecto del Ins1,4,5P
3
, potencindolo a concentraciones bajas e inhibindolo a
concentraciones altas.
En la segunda fase de la seal, los agonistas activan la entrada de Ca
2+
extracelular, lo cual prolonga la elevacin de Ca
2+
citoslico y permite el re-
lleno de sus depsitos intracelulares. Desconocemos todava la identidad de los
canales responsables de esta entrada. Se ha propuesto que algunos podran
estar activados por Ins1,4,5P
3
o Ins1,3,4,5P
4
(fig. 5), ya que se ha descrito la
presencia de receptores del primero en la membrana plasmtica de linfocitos
y la activacin por el segundo de la entrada de Ca
2+
en clulas lacrimales y
endoteliales. No obstante, se ignora si los receptores de Ins1,4,5P
3
de la mem-
brana plasmtica son canales de Ca
2+
, as como la presencia y contribucin a
la entrada del ion de los canales sensibles a Ins1,3,4,5P
4
en otros tipos celula-
res. Por otra parte, se ha establecido la existencia de canales activados por la
344
Receptores para neurotransmisores
liberacin de Ca
2+
intracelular llamados CRAC (de calcium release activated
channels, fig. 5), cuya estimulacin puede llevarse a cabo, en ausencia de
agonistas, por agentes que depletan los depsitos intracelulares del ion, como
la ionomicina o los inhibidores de la Ca
2+
-ATPasa del retculo endoplsmico.
Aunque se han caracterizado algunas corrientes de Ca
2+
de este tipo, la co-
nexin entre el vaciado del retculo endoplsmico y los CRAC es an motivo
de especulacin. Partiendo del mecanismo de movilizacin de Ca
2+
en el aco-
plamiento excitacincontraccin en el tejido muscular, en el que existe co-
nexin fsica entre los receptores de rianodina del retculo sarcoplsmico y
canales de Ca
2+
dependientes de voltaje, se ha propuesto que existe interaccin
entre el receptor del Ins1,4,5P
3
y los canales de Ca
2+
de la membrana plasm-
tica. Un cambio de conformacin del primero, consecuencia de la deplecin de
Ca
2+
, activara los segundos, en un proceso que podra requerir la presencia de
Ins1,3,4,5P
4
. Por otro lado, algunos autores han mostrado inhibicin por
GTPS de la entrada de Ca
2+
inducida por su liberacin, sugiriendo la parti-
cipacin de protenas G monomricas (SmG, fig. 5), quiz de la familia Rab,
que para su activacin requieren no slo la unin del GTP sino tambin su
hidrlisis. Finalmente, se ha descrito la formacin de un factor que activa la
entrada de Ca
2+
(CIF, fig. 5) que es producido por deplecin intracelular del
ion en clulas Jurkat-T. Se trata de un compuesto fosforilado de bajo peso
molecular y parcialmente lipoflico, que podra ser liberado del retculo
endoplsmico tras la liberacin de Ca
2+
. A la espera de establecer la identidad
qumica de este factor y su formacin en otras clulas, los datos disponibles
sugieren que podra haber diversos mecanismos ms o menos simultneos en
la activacin de los CRAC tras la movilizacin del Ca
2+
intracelular por el
Ins1,4,5P
3
.
Figura 5 Movilizacin
intracelular y entrada de
Ca
2+
activadas por esti-
mulacin de la PLC. SMOC:
canales de Ca
2+
activados
por segundos mensajeros;
CRAC: canales de Ca
2+
activados por liberacin
de Ca
2+
intracelular; R.E.:
retculo endoplsmico;
SmG: protena G mono-
mrica; CIF: factor activa-
dor de la entrada de Ca
2+
345
Protenas G y fosfolipasas
DAG y activacin de la PKC
El DAG formado por la hidrlisis del PtdIns4,5P
2
permanece en la
membrana y activa la PKC, una protena quinasa dependiente de fosfolpidos
que fosforila protenas en restos serina y treonina. La activacin de la PKC
implica su traslocacin del citosol a la membrana, proceso que es favorecido
por la elevacin de la concentracin de Ca
2+
citoslico. En la membrana, la
PKC interacciona con lpidos, particularmente fosfatidilserina, y es activada
por DAG, el cual aumenta la afinidad de la quinasa por el Ca
2+
. La interaccin
de la PKC con la membrana parece ms compleja que la mera unin del enzi-
ma con algn lpido de la misma, habindose descrito la existencia de prote-
nas que se unen a la quinasa de forma dependiente de fosfolpidos, llamadas
RACK (de receptors for activated C-kinase), las cuales podran mediar la
interaccin, proporcionando especificidad a la misma.
La activacin de la PKC presenta diversidad debido a la existencia de
diferentes isoenzimas con distintas caractersticas. Se conocen varios isoen-
zimas de la PKC agrupados en tres familias: c (clsicos: , I, II, ), n (nue-
vos: , , , ) y a (atpicos: , ). Todos son monmeros con pesos molecu-
lares calculados entre 68 y 84 kDa y presentan dos dominios, uno cataltico
en la regin C-terminal y otro regulador en la N-terminal. En la estructura de
las PKC se han identificado cuatro regiones de secuencia constante, dos de
ellas, C
1
y C
2
, ubicadas en el dominio regulador y las otras dos, C
3
y C
4
, en
el cataltico. Esta ltimas estn presentes en todos los isoenzimas y correspon-
den a los lugares de unin del ATP y la protena sustrato, respectivamente. La
regin C
2
slo est presente en los isoenzimas c y es un dominio de unin de
Ca
2+
y fosfolpidos que est implicado en el mecanismo de traslocacin del
enzima. La regin C
1
, presente en los isoenzimas c y n, contiene motivos ri-
cos en cistena que constituyen el lugar de unin del DAG y de los steres de
forbol, anlogos del DAG que activan irreversiblemente y desensibilizan la
PKC y que han sido de gran utilidad en su estudio. Esta regin contiene tam-
bin una secuencia seudosustrato con una alanina en el lugar que debera ocu-
par la serina fosforilable, que bloquea el centro cataltico de la PKC en ausen-
cia de estimulacin y que se libera cuando el enzima es activado.
No se conocen todos los factores que regulan los distintos isoenzimas,
pero sabemos que las PKCc son activadas por Ca
2+
, DAG, cidos grasos
insaturados y lisofosfolpidos, que las PKCn no requieren Ca
2+
(no tienen el
dominio C
2
) y se activan por DAG y cidos grasos, y que las PKCa no se ac-
tivan por Ca
2+
o DAG pero s por cidos grasos. De acuerdo con estas carac-
tersticas, la activacin de las isoformas c y n podr ser consecuencia de la
estimulacin de la PLC, que genera DAG y promueve la movilizacin de Ca
2+
,
pero tambin de la estimulacin de otras fosfolipasas que igualmente pueden
346
Receptores para neurotransmisores
dar lugar a DAG o producir liberacin de cidos grasos y lisofosfolpidos.
Revisaremos, en los dos ltimos apartados, las caractersticas de la activacin
por agonistas de otras dos fosfolipasas cuyos productos son capaces de estimu-
lar isoenzimas de la PKC: PLD y PLA
2
.
Fosfolipasa D
En algunos sistemas, el curso temporal de formacin de DAG estimu-
lada por agonistas presenta dos fases. La primera es rpida y transitoria, co-
incide con la seal de Ins1,4,5P
3
y el DAG formado tiene una composicin en
cidos grasos similar a la del PtdIns4,5P
2
, por lo que parece generarse por
hidrlisis de este fosfolpido catalizada por la PLC. La segunda es ms lenta y
prolongada y la composicin del DAG difiere de la de los fosfoinostidos, por
lo que se forma a partir de otros fosfolpidos, muy probablemente de fosfati-
dilcolina (PtdCho). Dos son las rutas posibles: hidrlisis por una PLC dando
lugar a DAG y fosfocolina o hidrlisis por una actividad PLD generando co-
lina y PtdOH y posterior desfosforilacin de ste por la fosfatidato fosfohidro-
lasa para dar DAG. La formacin de PtdOH y DAG en preparaciones estimu-
ladas en ausencia de ATP (que sera requerido para la formacin de PtdOH a
partir de DAG si la ruta fuera la primera), indica que la segunda fase de la
seal de DAG se debe a la estimulacin de la PLD.
La PLD fue descrita por primera vez en un tejido de mamferos en los
aos setenta y, posteriormente, diversas evidencias experimentales han condu-
cido a proponer su inclusin entre los enzimas efectores con funcin en la
transduccin de seales, aunque sus caractersticas y rutas de activacin an
no se han caracterizado completamente. La hidrlisis de PtdCho por la PLD
genera PtdOH que, adems de ser precursor del DAG responsable de la acti-
vacin prolongada de la PKC, tambin puede generar, por desacilacin,
lisofosfatidato, que es un importante mediador con actividad mitognica y que
acta interaccionando con GPCR especficos. El PtdOH puede actuar tambin
como segundo mensajero, habindose descrito que activa tanto protena
quinasas, como las PKC y , como quinasas de lpidos, como la PtdIns4P
5-quinasa, y que recluta protenas citoslicas a la membrana plasmtica, como
es el caso de la protena quinasa RAF-1 que forma parte de la cascada de las
quinasas mitognicas (va de las MAPK). La PLD tambin puede utilizar alco-
holes primarios como nuclefilos en lugar de agua dando lugar a fosfatidil-
alcohol. Esta reaccin, llamada transfosfatidilacin, slo es catalizada por la
PLD, por lo que es de gran utilidad en la determinacin de su actividad, que
se realiza habitualmente por separacin cromatogrfica y cuantificacin del
347
Protenas G y fosfolipasas
fosfatidilalcohol formado a partir de fosfolpidos marcados y alcohol.
Se han clonado varias PLD de plantas y levadura y, recientemente, dos
isoenzimas de la especie humana, hPLD1 y hPLD2 de 1074 y 933 aminocidos
respectivamente, que presentan 55 % de homologa de secuencia (fig. 6). Los
isoenzimas humanos presentan, en la zona N-terminal, dominios PH y otros
denominados PX que permiten a la PLD participar en procesos de trfico
vesicular. Adems, todos los isoenzimas poseen cuatro zonas de secuencia con-
servada (I-IV) que son exclusivas de las PLD y que son requeridas para la ac-
tividad cataltica.
La PLD es activada por algunos receptores con actividad tirosina
quinasa y por un buen nmero de GPCR, siendo, con frecuencia, estimulada
por los mismos agonistas que activan la PLC. En el tejido nervioso (tejido ce-
rebral, cultivos primarios y lneas celulares) se ha descrito la activacin de la
PLD por diversos receptores como los adrenrgicos
1,
metabotrpicos del
glutamato (mGluR1 y mGluR5), H
1
-histaminrgicos, muscarnicos (M1 y M3)
y purinrgicos, as como de endotelina y otros pptidos. Por lo que conocemos
hasta ahora, los mecanismos de activacin difieren hasta cierto punto entre los
dos isoenzimas (fig. 6). La PLD1 tiene baja actividad basal y es estimulada por
PKC, PtdIns4,5P
2
, y protenas G monomricas de las familias Rho y Arf
(de ADP-rybosylating factor, llamado as por ser requerido para la ADP-
ribosilacin de la protena G
s
por la toxina colrica), que forman parte de la
Figura 6 Isoenzimas de la PLD:
A Disposicin de los dominios.
B Vas de activacin y acciones
del fosfatidato
hPLD1a PX
A)
I PH II III IV
hPLD2 PX I PH II III IV
B)
PLD1
2

ARF
Rho
PtdIns4,5P
PKC
PLD2
Oleato
ARF
Fosfatidato
Traslocacin a
membranas de
protenas citoslicas
(Ej.: RAF-1)
Precursor de
mediadores lipdicos:
DAG, lisofosfatidato
Activacin de protena quinasas
y quinasas de lpidos
(Ej.: PtdIns4P 5-quinasa)
348
Receptores para neurotransmisores
superfamilia Ras. En cuanto a la PLD2, si bien los experimentos iniciales
mostraron que in vitro tena alta actividad basal que no era incrementada por
PKC o protenas G monomricas, trabajos ms recientes indican que, en con-
diciones celulares, esta isoforma es activada por PKCa, PtdIns4,5P
2
, oleato y,
posiblemente, tambin por Arf. La activacin va PKC es indicada por la ca-
pacidad de los steres de forbol para estimular la PLD, efecto que es bloquea-
do por inhibidores de la quinasa y que se pierde tras desensibilizacin de la
PKC por tratamiento prolongado con los citados agentes. Desconocemos si el
efecto de la PKC implica fosforilacin de la PLD, ya que en algunos casos se
observa activacin por steres de forbol en ausencia de condiciones fosfori-
lantes. Finalmente, estudios detallados han mostrado que el isoenzima impli-
cado en la activacin es PKC y que su lugar de interaccin en la PLD se si-
ta en los dominios de la zona N-terminal. Por su parte, el PtdIns4,5P
2
, que
como hemos visto en apartados anteriores es el sustrato de las PLC, activa in
vitro las dos isoformas de la PLD, habiendo sido propuesto como cofactor de
las mismas. En cuanto a las protenas G, su participacin es deducida de la
activacin de la PLD por anlogos no hidrolizables del GTP en clulas permea-
bilizadas y preparaciones de membranas. Las primeras evidencias directas se
obtuvieron en granulocitos, donde el efecto de los nucletidos de guanina es
mediado por Arf. Este factor, del que se conocen seis isoformas, participa en
los procesos de trfico intracelular de membranas y, como las dems prote-
nas G, muestra actividad GTPasa que lo desactiva, la cual slo se pone en
funcionamiento en presencia de una protena activadora (Arf-GAP). Una pro-
piedad notable de la protena Arf-GAP es que es altamente dependiente de
PtdIns4,5P
2
, de modo que este fosfoinostido es requerido tanto para la acti-
vacin de la PLD como para la inactivacin del Arf. Por otro lado, las prote-
nas Rho, que participan en la dinmica de los filamentos de actina (formacin
de fibras de estrs, filopodia y lamellipodia) activan selectivamente la PLD1,
interaccionando con ella en su zona C-terminal.
Siendo evidente que la activacin de las PLD va PKC puede ser secun-
daria a la estimulacin de PLC, aun no conocemos la conexin entre la
estimulacin de receptores y la activacin de Arf o Rho por sus correspondien-
tes GEF. En este contexto, se ha propuesto que los dos GEF conocidos para
Rho (P115-Rho-GEF y PDZ-Rho-GEF) podran ser activados por GPCR va
las subunidades de las protenas G
12
y recientemente se ha descrito que la
protena RhoA puede ser activada por G
q
. A la espera de la completa identi-
ficacin de las distintas isoformas de la PLD y de la caracterizacin de sus
mecanismos de regulacin, parece razonable suponer, en analoga con otros
enzimas efectores como la adenililciclasa y la PLC, que existen diferentes ru-
tas de activacin, las cuales podran ser especficas de los distintos isoenzimas.
349
Protenas G y fosfolipasas
Fosfolipasa A
2
Como ya se ha mencionado, los cidos grasos insaturados y los liso-
fosfolpidos activan diversos isoenzimas de la PKC. Estos compuestos se for-
man por accin de la PLA
2
, que hidroliza el enlace ster de la posicin 2 del
glicerol en los fosfolpidos. Dicha posicin se encuentra, en una proporcin
importante, esterificada con cidos grasos insaturados, entre ellos el cido
araquidnico. La importancia de este cido graso radica en que, adems de
ser activador de varios isoenzimas de la PKC y de la PLC, es el sustrato
de las cicloxigenasas, que inician la va de formacin de prostaglandinas y
tromboxanos, la lipooxigenasa, que genera leucotrienos y la citocromo P450/
epoxigenasa que da lugar a cidos epoxieicosatrienoicos (fig. 7). Estos com-
puestos regulan mltiples respuestas celulares actuando sobre dianas intra-
celulares y sobre GPCR y su formacin depende, fundamentalmente, de la dis-
ponibilidad de su precursor. Dado que en las clulas no estimuladas apenas
existe cido araquidnico libre, la formacin de los citados icosanoides viene
determinada por la actividad PLA
2
, que libera el cido graso, y por los facto-
res que la regulan. La PLA
2
es estimulada por diversos agonistas, entre los que
se encuentran varios neurotransmisores, cuyos receptores son, en muchos sis-
temas, los mismos que median la activacin de la PLC, aunque ambas activa-
ciones pueden ser independientes. Por ello, y en consideracin al papel funcio-
nal de los productos que genera, la PLA
2
se incluye entre los sistemas efectores
que forman mensajeros activos en la transduccin de seales.
Se han identificado ms de una docena de isoenzimas de PLA
2
que se han
clasificado en tres grupos. El primero corresponde a isoformas extracelulares
llamadas sPLA
2
(PLA
2
secretorias), de bajo peso molecular (14-18 kDa) y que
requieren para su actividad concentraciones de Ca
2+
del orden milimolar. El
segundo son las llamadas iPLA
2
(PLA
2
independientes de Ca
2+
), de mayor peso
LisoPtdCho
cPLA
PtdCho
Ca , MAPK
+
cido
araquidnico
Prostaglandinas
Tromboxanos
2
2+
Leucotrienos
Lipoxinas
Lipoxigenasa
Epoxigenasa Cicloxigenasas
PKC, PLCg
+
Figura 7
Fosfolipasa A
2
350
Receptores para neurotransmisores
molecular (29-85 kDa), que se encuentran tanto en el citosol como ligadas a
membrana. Ambos grupos son inespecficos respecto al cido graso que libe-
ran y no participan en la transduccin de seales. El tercer grupo son las
cPLA
2
(PLA
2
citoslicas), de 85-100 kDa, que requieren concentraciones de
Ca
2+
del orden micromolar, son especficas para fosfolpidos (sobre todo
fosfatidilcolina) que poseen cido araquidnico en la posicin 2 del glicerol y
son las activadas por agonistas. Se han clonado tres de ellas (cPLA
2
, cPLA
2
,
cPLA
2
), habindose caracterizado la estructura y mecanismos de regulacin
sobre todo en el caso de cPLA
2
. Esta fosfolipasa est constituida por una
cadena polipeptdica que no muestra segmentos transmembrana y que posee,
en la zona C-terminal, un dominio cataltico con dos regiones homlogas que
contribuyen a la formacin del centro activo. Adems, en la zona N-terminal,
presenta un dominio de fijacin de Ca
2+
anlogo al C
2
de las PKC, implicado
en su interaccin con los fosfolpidos de la membrana. Esta interaccin es pro-
movida por concentraciones submicromolares de Ca
2+
y forma parte del pro-
ceso de activacin, que implica su translocacin a membranas, especialmente
en la regin perinuclear de la clula.
Hoy es comnmente aceptado que el mecanismo de activacin de la
cPLA
2
implica su translocacin a membranas, especialmente en la regin
perinuclear, y su fosforilacin por serina/treonina quinasas. La primera es pro-
movida por concentraciones submicromolares de Ca
2+
que son el resultado de
la activacin por agonistas de la entrada y/o movilizacin de Ca
2+
, mientras
que la segunda es consecuencia de la activacin de la va de las MAPK,
especficamente de ERK (de extracellular signal regulated kinase) (fig. 7). La
cPLA
2
tambin es sustrato de la PKC, pero esta fosforilacin no parece ser
importante en el mecanismo de activacin. No obstante, la PKC tambin pue-
de contribuir a la activacin de la cPLA
2
, dado que es uno de los factores que
puede activar la va de las MAPK. De acuerdo con todo esto, los mecanismos
de activacin de la cPLA
2
pueden ser puestos en marcha tanto por receptores
con actividad tirosina quinasa, que activan tanto la va MAPK como la PLC,
lo que conducir a la movilizacin de Ca
2+
, como por GPCR que inducen la
movilizacin de Ca
2+
va PLC/Ins1,4,5P
3
y tambin pueden activar la va de
las MAPK, bien va PLC/DAG/PKC o, como ya hemos mencionado, por
transactivacin de receptores de factores de crecimiento. Es evidente, segn
este esquema, que la participacin de las protenas G heterotrimricas en la
activacin de la cPLA
2
se lleva a cabo a travs de su papel en la estimulacin
de la va PLC/PKC, si bien algunos datos indican que puede haber mecanismos
adicionales. As, en la retina, la activacin de la protena G transducina por
la luz y GTPS estimula la PLA
2
, habindose establecido que son las subuni-
dades las responsables del efecto. Aunque no disponemos de otras eviden-
351
Protenas G y fosfolipasas
cias de interaccin directa entre subunidades de las protena G y cPLA
2
, no
podemos descartar la posibilidad de que la cPLA
2
pueda ser un efector direc-
to de las protenas G en otros sistemas.
El estudio de la transduccin de seales a travs de las tres fosfolipasas
descritas aqu revela un importante grado de interaccin entre los tres siste-
mas. Hemos visto que las tres pueden ser activadas por seales que son reco-
nocidas por receptores acoplados a protenas G, as como por otros tipos de
receptores y que promueven respuestas celulares tanto rpidas como lentas.
Las primeras pueden ser el resultado de la movilizacin de Ca
2+
y activacin
rpida de la PKC por los segundos mensajeros generados por la PLC y las se-
gundas de la activacin de la PKC por el DAG formado por la PLD. Los pro-
ductos de la PLA
2
tambin son activadores de la PKC y pueden participar en
la aparicin de ambos tipos de respuestas. Adems, la modulacin de algunas
de las fosfolipasas puede ser el resultado de la activacin de otras, ya que to-
das pueden son reguladas directa o indirectamente por la PKC: la PLD y la
PLA
2
pueden ser, como hemos visto, activadas por la quinasa, mientras que la
activacin por agonistas de la PLC es bloqueada. Finalmente, el PtdIns4,5P
2
,
sustrato de la PLC, es cofactor de la PLD, por lo que la actividad de esta lti-
ma puede depender del consumo de dicho lpido por la primera. La importan-
cia de estos efectos depender, en cada tejido, de la clase de receptores impli-
cados, as como de la presencia de isoformas especficas de las fosfolipasas, de
las protenas G y de las PKC. La existencia de interacciones entre las tres
fosfolipasas, condiciona la interpretacin de muchos resultados y revela un
notable grado de complejidad en los sistemas de transduccin que usan los
fosfolpidos como fuente para la formacin de segundos mensajeros.
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