Efecto antiulcerogenico y toxicidad aguda de un extracto

hidroetanlico de las hojas de anacardo ( Anacardium occidentale L.)

Nzi Andr Konan ,
Elfriede Marianne Bacchi
,

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DOI: 10.1016 / j.jep.2007.03.003
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Resumen
El efecto de un extracto antiulcerogenico hidroetanlico de Anacardium occidentale L. de sus
hojas se investig. El extracto inhibe las lesiones gstricas inducidas por HCl / etanol en ratas
hembra. Un estudio efecto dosis-respuesta mostr que la DE50 era kg de peso corporal dosis 150
mg / extract superior a 100 mg / kg de peso corporal fueron ms eficaces que 30 mg / kg de
lansoprazol en la inhibicin de las lesiones gstricas. Una fraccin metanlica (257,12 mg / kg) que
redujo la lesin gstrica en 88,20% es probable que contenga el principio activo del efecto
antiulceroso. No se observaron signos de toxicidad aguda cuando los ratones fueron tratados con
el extracto de la dosis hasta 2000 mg / kg de peso corporal Un anlisis qumico del extracto
permitieron la identificacin de compuestos fenlicos como los componentes principales.Quercetina
glicosilada, derivado amentoflavona y un tetrmero de proantocianidina se identificaron mediante
cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas. El nivel de fenoles totales en el
extracto se evalu en 35,5% y el contenido de flavonoides fue de 2,58%.
Palabras clave
Anacardium occidentale (Anacardiaceae) ;
LC / ESI-MS ;
Los polifenoles ;
Actividad anti-lcera ;
Toxicidad aguda ;
ED50

1. Introduccin
Anacardo ( Anacardium occidentale L.) (Anacardiaceae), un rbol originario de Brasil, actualmente
se cultiva en muchas regiones del mundo. Varias partes del rbol se han sometido a exmenes
qumicos y farmacolgicos. Estudios anteriores con una variedad de Senegal, mostraron la
presencia de quercetina-glucsidos, taninos condensados y cidos fenlicos ( Laurens et al.,
1982 ). Una mezcla de taninos condensados y hidrolizables se ha aislado de una variedad
brasilea, que mostr que la actividad anti-inflamatoria positivo ( Mota et al., 1985 ). Fruta del
anacardo tambin exhibi anti- Helicobacter pylori efecto debido a los compuestos fenlicos cuyas
estructuras se han descrito ( Kubo et al., 1999 ). La medicina popular en Amrica del Sur utiliza
hojas de anacardo en forma de t para varias enfermedades, incluyendo las lceras ( Taylor,
2005 ). En la literatura, se conocen los efectos sobre algn tipo de lceras utilizando material
vegetal recolectados de anacardo. lcera de la piel ha sido inhibida por un extracto de la corteza
del anacardo, que puede ser debido a la presencia de taninos y flavonoides ( Franca et al., 1996 ).
Varios estudios informaron funcionalidades fisiolgicas de los compuestos fenlicos ( Frankel et al.,
1993 ).Aqu, se presenta el efecto de un extracto fenlico-rica del anacardo deja sobre las lesiones
gstricas inducidas en ratas. Estudio de la toxicidad aguda, as como una proyeccin qumica
tambin se ha llevado a cabo.
2. Materiales y mtodos
2.1. El material vegetal
Anacardo Clone CCP-76 hojas fueron recolectadas en el campo experimental EMBRAPA situado a
50 km de la ciudad de Fortaleza (Brasil). Bono especmenes fueron depositados en el herbario del
Instituto de Biociencias de la Universidad de So Paulo (no. SPF 376982).
2.2. Extraccin y caracterizacin de los principales grupos qumicos
Las hojas se secaron en un horno con circulacin forzada de aire a 40 C durante 24 h y en polvo
en un cuchillo y molino de martillos. El polvo seco se extrajo por percolacin con etanol al 70%. El
1 L de etanol al 70% se utiliz para extraer 100 g de polvo. Despus de la extraccin, el etanol se
evapor a baja presin y el extracto liofilizado. El extracto etanlico produjo 26,11% de lyophylizate
en relacin con el polvo de hoja seco usado. El extracto crudo obtenido se denomin: extracto
etanlico de Anacardium occidentale(EEAO). El EEAO se ensay para la presencia de flavonoides,
taninos, alcaloides, cumarinas, saponinas y esteroides como se describe en Gonzlez y Di Stasi
(2001) .
2.3. Identificacin de polifenoles por LC / ESI-MS
El EEAO fue sometido a cromatografa lquida acoplada a espectrometra de masas en un
espectrmetro de Esquire 3000 plus trampa de iones equipado con ionizacin por electrospray
(Bruker Daltonics, Billerica, MA, EE.UU.). Anlisis HPLC-UV se realizaron utilizando un instrumento
Shimadzu modelo SPD-M10Avp (Shimadzu Co., Kyoto, Japn) con un detector de red de diodos
(DAD). La columna analtica usada fue una C18 Spherisorb ODS2 (250 x 4 mm, 5 micras) con la
columna de temperatura de horno mantenido a 40 C. El sistema disolvente se compone de cido
actico al 1% (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B). El gradiente de disolvente lineal comenz
en una fase mvil inicial de 12% de disolvente B en disolvente A (0-5 min), seguido de 12 a 20% de
B en A (5-8 min), el 20% de B en A (8 -28 min); 20-50% de B en A (28-38 min);50-65% de B en A
(38-48 min). Tasa de flujo fue de 0,8 ml min
-1
, el volumen inyectado fue de 20 mL.Longitud de
onda de deteccin se fij en 280 y 352 nm. Los espectros UV 200 a 400 nm se registr para la
caracterizacin de pico. Condiciones de funcionamiento de espectrometra de masas fueron
optimizados para lograr valores mximos de sensibilidad: temperatura del gas en el espectrmetro
fue de 350 C a un caudal de 7,0 L min
-1
, la presin del nebulizador 30 psi, voltaje capilar 4.500 V
para el modo de ion positivo y 4.000 V para modo de ion negativo.
2.4. Compuestos fenlicos totales en el extracto hidroetanlico de las hojas de anacardo
El contenido fenlico total se determin colorimtricamente por el mtodo de Folin-Denis ( Shahidi
y Naczsk, 2004 ). El cido glico (Merck, Whitehouse) se utiliz como estndar.
2.5. Flavonoides totales
Flavonoides totales se cuantificaron como se ha descrito previamente en Woisky y Salatino
(1998) . La quercetina (Merck) fue utilizado como un estndar.
2.6. Ensayo anti-lcera
Ratas Wistar albinas se mantuvieron a 22 C. Los animales fueron alimentados con una dieta
estndar de Nutrivital Nutrientes (Colombo / PR, Brasil) y permiti el libre acceso al agua.
La actividad anti-lcera se evalu mediante el / etanol inducida por lesiones gstricas en ratas
modelo de HCl ( Matsumoto y Yamada, 1991 ). Cinco grupos de ocho ratas hembras (125-150 g)
se formaron en el experimento. Los animales se mantuvieron en ayunas durante 24 h. Los
animales fueron tratados con 100, 200, 400 o 800 mg / kg de peso corporal (pc) EEAO. Animales
de control negativos recibieron agua, y los animales de control positivo fueron tratados con
lansoprazol (30 mg / kg de peso corporal). Despus de 30 min, todos los grupos fueron tratados
por va oral con una solucin de etanol HCl 0,3 M / 60% para inducir lceras gstricas. Las ratas se
sacrificaron 1 h despus de la administracin de HCl / etanol y se extirparon los estmagos a lo
largo de la curvatura mayor y se fijaron entre dos placas de vidrio. Cada placa estmago se
escane en un escner HP Scanjet. Un software (Image Proplus) se utiliz para medir cada punto
(mm lesin
2
). Los resultados se expresaron como el rea total de la lesin (mm
2
) y el rea de
lesin con respecto al rea del estmago total (%). La actividad inhibidora del extracto sobre la
formacin de la lesin se calcula teniendo en cuenta el tamao de la zona de la lesin. La dosis
efectiva 50% (ED50) se evalu mediante la aplicacin de una curva de regresin ( Toma et al.,
2002 ).
2.7. El fraccionamiento del extracto crudo de anacardo para actividad antiulcerosa
Un extracto hidroetanlico liofilizada de la anacardo (70 g) se lav inicialmente con ter de petrleo
y despus se extrajo sucesivamente con diclorometano y metanol, produciendo respectivamente,
0,69 g (0,98%) y 45 g (64,28%) despus de evaporacin del disolvente. Las fracciones de
diclorometano y metanol, a una dosis proporcional al rendimiento, 3,92 y 257,12 mg / kg,
considerando 400 mg / kg de extracto hidroetanlico, fueron probados por su actividad anti-lcera
usando ratas hembra Wistar (125-150 g).
2.8. Toxicidad aguda en ratones
Masculino suizo y en ratones hembra (25-35 g) se obtuvieron de las instalaciones de animales de
la Facultad de Ciencias Farmacuticas. Los animales fueron alojados en jaulas a 22 C. Antes de
los experimentos, que se mueren de inanicin durante la noche con libre acceso al agua. Se
formaron dos grupos de 10 animales (control y grupo de prueba) cada nmero igual que contiene
de hombres y mujeres. Un lmite de dosis a 2000 mg / kg de peso corporal EEAO disuelto en agua
se administr por va intragstrica a los animales del grupo de prueba. Los animales en el grupo de
control recibieron agua. En cada caso el volumen administrado fue de 10 ml / kg. Tras la
administracin del producto, los animales fueron observados de cerca durante las primeras 3 h, y
de vez en cuando, a partir de entonces, durante 14 das, para los sntomas de toxicidad o la
muerte. Se midi el peso de cada animal para acceder a la prdida de peso corporal o
ganancia. Despus de un perodo experimental de 14 das, los ratones fueron sacrificados y los
rganos vitales se observaron macroscpicamente.
2.9. El anlisis estadstico
Los valores de antiulcerosa y pruebas de toxicidad aguda se expresaron como media SEM La
significacin estadstica de cada grupo de ensayo en relacin al control se calcul usando ANOVA
seguido por el test de Student-Newman-Keuls. A p valor <0,05 fue considerado como una
respuesta significativa.
3. Resultados
3.1. El anlisis qumico
La presencia de compuestos fenlicos se caracteriz por pruebas de reaccin qumicas, as como
LC / MS.Como se muestra en la Tabla 1 , estos compuestos fenlicos incluyen dos clases:
flavonoides y taninos condensados. Los picos que contienen iones m / z 301 espectros UV
generalmente exhibido con dos bandas de absorcin alrededor de 270 y 360 nm. Dos bandas de
absorcin UV (240-285; 304-400 nm) tambin se observ en el espectro UV del pico cuyo espectro
de masas contiene iones de m / z 537. Las pruebas fueron negativas para alcaloides, cumarinas,
anthraderivates, esteroides y taninos hidrolizables.Anlisis fitoqumico tambin permiti identificar
la presencia de saponinas. Fenoles totales en el extracto crudo (EEAO) se evalu en 35,5% por el
mtodo de Folin-Denis. El contenido total de flavonoides en el extracto crudo fue de 2,58%.
Table 1.
Liquid chromatography coupled to mass spectrometry analysis of the hydroethanolic extract of Anacardium
occidentaleleaves
Ion
Mode
Rt
(min)
ESI-ITMS, [M + H]
+
or
[M H]

m/z
Product ions (m/z) Hypothetical
polyphenol
Positive 13.9 652 149, 205, 301, 279, 476, 508, 520
(100%), 608
Glycosylated
quercetin
16.7 652 (100%) 149, 205, 318, 453, 520, 564 Glycosylated
myricetin
18.0 696 (100%) 149, 205, 301, 340, 538, 564, 608, 652 Glycosylated
quercetin
19.6 740 149 (100%), 205, 301, 370, 535, 564,
608, 652
Glycosylated
quercetin
34.5 784 149, 205, 229, 301, 476, 520, 564, 608
(100%) 652, 696, 740
Glycosylated
quercetin
39.7 910 149, 301, 442, 690, 734, 778 (100%),
822, 866
Glycosylated
quercetin
41.8 940 149, 301, 391, 501, 520, 594, 608, 676,
720 (100%), 764, 808, 852, 896
Glycosylated
quercetin
Negative 12.4 1153.2 160.4, 202, 244.6, 288.6 (100%), 378.6,
579.0
Proanthocyanidin
tetramer
41.8 1075.1 537.0 (100%) Amentoflavone
derivate
Table options
3.2. Anti-ulcer assay
Fig. 1 and Table 2 show the results obtained from the effect of cashew crude extract and fraction on
gastric ulcer induced in female rats. All the extract doses (100, 200, 400 and 800 mg/kg b.w.)
exhibited better gastric lesions inhibition than lansoprazol. Even the lowest dose (100 mg/kg b.w.)
significantly reduced gastric lesions (p < 0.001). When 800mg/kg.b.w. was administered, gastric
lesions were completely inhibited. The ED50 value was 150 mg/kg b.w. The methanolic fraction
inhibited the formation of lesions by 88.21% in relation to the control group and the dichloromethane
fraction reduced the level of lesions by 17.85% in relation to control.

Fig. 1.
Effect of doses of the hydroethanolic extract of Anacardium occidentale leaves on gastric lesions induced in
rat by HCl/ethanol 60%. Lan: Lasoprazol, Cont: control, TLA: total lesion area, RLA: relative lesion area.
Opciones Figura
Tabla 2.
Efecto del 70% Anacardium occidentale extracto de hoja de hidroetanlico en HCl / etanol indujo lesiones
gstricas en ratas hembras
Experimentos Tratamientos Nmero
de ratas
rea de la
lesin total
(mm
2
)
rea de la
lesin relativa
(%)
La inhibicin de la lesin
en relacin con el control
(%)
un
efecto de dosis Control de 8 30.33 18.59 3,06 1,75 -
Lansoprazol (30
mg / kg)
8 9,82 6,21
*
1,07 0,68
*
65.03
b
100 mg / kg 8 9,26 8,71
*
0,95 0,93
*
68.95
b
200 mg / kg 8 8,41 7,60
*
0,89 0,73
*
70.91
b
400 mg / kg 8 6,3 8,82
*
0,64 0,79
*
79.08
b
800 mg / kg 8 0
*
0
*
100
un
ensayo con
fracciones
Control de 8 29.69 30.45 2,80 2,79 -
El diclorometano 8 21.42 8.79 2,30 0,89 17.85
(3,92 mg / kg)
Metanol 8 3,49 3,49
*
0,33 0,32
*
88.21
(257,12 mg / kg)
*
Significativos en relacin con el control ( p <0,05 respecto al control).
un
Pesos corporales de los animales eran de 125-150 g.
b
La dosis de extracto de hidroetanlico anacardo.
Table options
3.3. Toxicidad aguda
Inicialmente, la toxicidad aguda de una dosis nica de EEAO en ratones dio lugar a la muerte de
una hembra de ratn. No hay sntomas txicos o muerte ocurrieron en los otros animales y vivieron
hasta 14 das.Autopsia del animal que muri y resultados de la necropsia en los animales
supervivientes al final del perodo experimental no revel cambios aparentes en los rganos. Por lo
tanto, la dosis letal mnima aguda para EEAO para ratones Swiss fue superior a 2000 mg / kg de
peso corporal en los animales de control, el peso corporal aument de 30,36 3,17 a 33,42 2,86
g mientras que en el grupo tratado, hubo un aumento en el peso de 30,12 3,12 a 33,69 5,53 g.
4. Discussion
El anlisis qumico mostr que EEAO es rico en compuestos fenlicos. El cromatograma de iones
totales (TIC) en modo positivo mostr picos cuyo espectro de masas contiene un ion
quercetina m / z 301. Estos picos son probable que corresponden a la quercetina glicosilada, como
los espectros de UV exhibi dos bandas de absorcin alrededor de 270 y 360 nm. Segn Zuanazzi
(2002) , los flavonoides presentan generalmente dos bandas de absorcin en UV, 240-285 nm
(banda II) y 304-400 (banda I). Otro espectro de masas con el ion ( m / z Tambin se observ 318),
y es probable que corresponden a un myricitin glicosilada.En consecuencia, Arya et
al. (1989) aislado de anacardo deja la flavonoides, quercetina, la quercetina-3- O -rhamnoside,
miricetina, y miricetina-3- O -rhamnoside. Con el TIC en modo negativo, se observ un pico cuyo
espectro de masas contiene una molcula desprotonado [MH]
-
( m / z 289) y otros iones con
masas correspondientes a 579, 1153 y m / z 244. Estos iones se pueden atribuir respectivamente a
(epi) catequina, un dmero de proantocianidina, un tetrmero de proantocianidina y (epi) catequina
in ( m / z 288) ( Fig. 2 ) que perdi su CH 2 grupo CHOH resultando en un de iones cuya masa es
de m / z 244, segn lo descrito porSnchez-Rabaneda et al. (2003) y Gu et al. (2003) .

Higo. 2.
Agliconas de flavonoides y taninos condensados del extracto hidroetanlico de Anacardium
occidentale hojas.
Opciones Figura
Otro pico TIC cuyo espectro de masas contiene un ion m / z 537 tambin se observ. Este pico
mostr una abundancia relativa del 100% para el ion m / z 537, dos bandas de absorcin UV (240
a 285; 304 a 400 nm), y por lo tanto puede estar asociada con un derivado de la amentoflavona
biflavonoid ( m / z 537) ( Zuanazzi, 2002 ). Amentoflavona ( Fig. 2 ) fue aislado previamente a partir
de hojas de anacardo ( Arya et al., 1989 ).
Los resultados obtenidos en ratones mostraron que el extracto crudo de Anacardium
occidentale exhibi una toxicidad aguda moderada ( Soiefer y Rauckman, 2001 ) y la dosis letal
50% (LD50) se ha estimado a ser mayores que 2000 mg / kg.bw
EEAO y su fraccin metanlica fueron eficaces en la prevencin de la lcera. La naturaleza de las
molculas activas en la fraccin metanlica es desconocida, pero desde el metanol es un mal
disolvente para taninos ( Bruneton, 1993 y Waterman y Mole, 1994 ), se especula que los
componentes activos es probable que sean sustancias distintas de los taninos.
Las lceras ppticas son a menudo tratados con anti-secretores gstricos o protectores de la
mucosa gstrica. El primer grupo incluye medicamentos tales como cimetidina o lansoprazol. La
cimetidina, un anti-H 2 puede estimular la secrecin del pptido gstrico que inhibe la produccin de
cido gstrico ( Havsteen, 2002 ). Anti-histamnicos H 2 frmacos son inhibidores competitivos de la
histamina sobre las clulas parietales H 2 receptor mediante el establecimiento de una unin entre
su ncleo heterocclico y su cadena lateral larga ( Korolkovas, 2003 ). Los frmacos inhibidores de
la bomba de protones tales como lansoprazol pueden conectar a la bomba de protones y el bloque
H
+
secrecin de iones en la glndula gstrica. A travs de este mecanismo de estos frmacos
pueden inhibir la secrecin gstrica en un 90% ( Delfosse, 2000 ).Otra clase de compuestos anti-
lcera consiste en molculas tales como el derivado sinttico de la prostaglandina E 1 , misoprostol,
que inhibe la secrecin de cido actuando directamente sobre las clulas parietales que suscitan
un efecto protector sobre la mucosa gstrica (Korlkovas, 2003). Se han propuesto diferentes
mecanismos para explicar el efecto gastroprotector de flavonoides, incluyendo un aumento en el
contenido de prostaglandina de la mucosa y una disminucin en la secrecin de histamina de los
mastocitos por la inhibicin de la descarboxilasa de histidina. Los flavonoides son eliminadores de
radicales libres que se sabe que juegan un papel importante en la lesin ulcerosa y erosiva del
tracto gastrointestinal ( Borrelli y Izzo, 2000 ).
Como se inform en pruebas fitoqumicas, hojas de caj contienen varios flavonoides, quercetina
principalmente glucsidos. La quercetina se ha encontrado para evitar lesiones de la mucosa
gstricas inducidas por diversos modelos (estrs por fro moderacin, ploro-ligacin, etanol o
etanol acidificado) (Martin et al., 1993 , Izzo et al., 1994 y Di Carlo et al., 1999 ) . Por ejemplo, la
quercetina podra aumentar la cantidad de glicoprotenas neutras, las protenas ms importantes
de la mucosa gstrica ( Di Carlo et al., 1999 ), que a su vez puede facilitar la defensa contra una
accin agresiva ( Delfosse, 2000 ). La quercetina tambin estimula la sntesis de la ciclooxigenasa
y de la prostaglandina local ( Marti-Bonmati et al., 1980 ).Se han propuesto otros mecanismos y
stos incluyen la inhibicin de la bomba de protones gstrica, de la va de la lipoxigenasa, o la
inhibicin de la peroxidacin lipdica ( Di Carlo et al., 1999 , Moroney et al., 1988 y De La Lastra et
al., 1994 ) .
El anlisis fitoqumico de EEAO tambin mostr la presencia de saponinas. Se han encontrado
varias plantas que contienen saponinas que poseen actividad anti-lcera inducida en modelos
experimentales de lcera-( Matsuda et al., 1998 , Houng et al., 1998 y Yesilada y Takaishi, 1999 ).
Suponemos que el componente activo de la fraccin metanlica es una sustancia distinta de
tanino. Vale la pena notar, sin embargo, que se report un efecto anti-lcera de taninos
condensados aisladas con diferentes estructuras (monmeros, dmeros, trmeros y tetrmeros)
( Ezaki et al., 1985 ).
Finalmente, los resultados obtenidos en este estudio sugieren que una nueva terapia antiulcerosa
usando la fraccin metanlica de anacardo puede ser prometedor. Los estudios futuros de
subfracciones EEAO en ensayos de actividad anti-ulcerognicos guiada permitirn la elucidacin
de los componentes activos antiulcerosos.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la CAPES / Brasil. Los autores agradecen especialmente Joo
Rodrigues de Paiva en busca de ayuda en la recoleccin de material vegetal.