Mthodes dtude Fractionnement, cytomtrie de flux

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Cours 2 - Fractionnement Cytomtrie de fu!
Pr Magnan
Avertissement : il y a 2 ans les 2 cours de cette matire taient inverss, je vous conseille donc de prendre les 2
lorsque vous irez en cours, cela vous vitera une mauvaise surprise si le Pr Magnan dcide de changer nou-
veau lordre cette anne !"
#e document est un support de cours datant de l$anne 2%&2-2%&' disponi(le sur )))*tsp+*net "
I. Fractionnement cellulaire
A. Principe de la technique
1. La dissociation
2. La centrifugation
3. Rcolte des diffrents culots
B. entrifugation sur gradient de densit
II. !tomtrie de flu"
A. Principe
1. Rappels d#optique
2. Principe de la c!tomtrie de flu"
B. Applications de c!tomtrie
1. $paration des l!mphoc!tes
2. Identification de la phase du c!cle cellulaire
3. %ri et caractrisation de sous&population de cellules &pancratiques
Mthodes dtude Fractionnement, cytomtrie de flux
I. FRA%I'(()*)(% )LL+LAIR)
Cest une mthode dont le but est de s#arer des constituants en soution, et notamment les organites cel-
lulaires ainsi que les membranes, selon leur poids, ou plutt leur coefficient de sdimentation.
$% &rinci#e de a tec'ni(ue
La technique est base sur le fait que les organites cellulaires ont une masse ainsi quune densit diffrentes.
On peut distinguer 4 tapes dans le fractionnement :
"% Dissocier et dtruire es ceues (lyse cellulaire)
2% Centrifu)ations ,sparation des di--rents organites, tape cl"
*% +ecueiir es diffrents cuots
,% $nayser es cuots #our identifier es or)anites (mesure dactivit, immunoblot, etc.)
1. a dissociation
!emple dun protocole disolement de mitochondries " partir de tubercules de pommes de terre :
#plucher les pommes de terre $ les la%er " leau distille froide $ couper le matriel en petits cubes et le
mettre dans un mi!eur, a&outer un miieu de -roya)e 'liquide($ bro)er 'dure varia(le selon l$lment (royer(
puis filtrer le bro)at $ enfin .rifier e #H et le ra&uster %entuellement, car des organites ,comme les lyso-
somes" ont pu clater et diminuer le p* en librant leur milieu intrieur.
Le milieu de bro)age est tr+s important car il permet la destruction de int)rit ceuaire mais il #rot/)e
int)rit des or)anites. ,l contient tou&ours :
une soution tam#on maintenant un p* stable ---- ,physiologique.+*/( comme le tris-*Cl,
un in'i-iteur des #rotases comme l./0, a)ant pour but, comme la solution tampon, demp1-
cher laltration des organites et des protines dintr1t
une soution concentre pro%oquant un choc osmotique qui fait clater les cellules.
!. a centrifu"ation
lle repose sur le principe selon lequel accration #ousse es #articues .ers e fond du tu-e. n ef-
fet, toute particule plonge dans un liquide subit 2 forces opposes qui e!pliquent la rpartition htrog+ne
des organites dans le tube :
3( 4on #oids qui est dirig %ers le bas ,-orce gravitationnelle laquelle la particule est soumise"
2( La #ousse d$rc'im/de dirige %ers le haut 0ie 1 a nature du i(uide2miieu3
4elon la densit de la particule, gale, suprieure ou infrieure au milieu liquide, elle remontera ou descendra
dans le liquide, &usqu" atteindre un ni.eau d(uii-re ,. sdimentation"*
/oute molcule peut se dfinir en fonction de son coefficient de sdi-
mentation S ,ou 0ved(erg" :
1oyau 2 3irus 2 Mitochondrie 2 4ysosome 2 Mem(ranes 2 5i(osome
,l faut comprendre que #us S est e. et #us ment .a plonger au
fond du tube, se rapprocher du culot et sdimenter ra#idement.
n biologie on utilise des centrifugeuses quon distingue en 5 t)pes :
Centrifu)euses de ta-e: Les mod+les les plus simples per-
mettent d6atteindre de faibles acclrations ,& %%% 2 %%% g" " des %itesses de rotation relati%ement
basses ,moins de & %%% rotations par minute ,rpm", permettant par e6emple de sparer les cellules du
sang comme les glo(ules rouges des glo(ules (lancs
Centrifu)euses au so: lles permettent d6obtenir des %itesses de rotation de l6ordre de 27 777 rpm ,
partir de cette valeur on parle d$ultracentrifu"ation", donnant pour les plus petits rotors des acclra-
tions d6en%iron 27 777 g.
Utracentrifu)euses: Ce sont des appareils comple!es qui permettent d6atteindre des acclrations
tr+s le%es ,jusqu '%% %%% g" en faisant tourner des rotors tr+s rapidement ,2%-+/ %%% rpm"*
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#. $colte des diffrents culots
La centrifugation peut 1tre rpte plusieurs fois
pour dissocier tous les constituants. On centrifuge
alors uniquement le surnageant a%ec une %itesse rota-
ti%e et une dure plus forte pour a%oir dans le culot
des lments de plus en plus lger. On trou.e tou4ours
5ment e #us ourd dans e cuot. Lordre habituel
de sparation des organites par coefficient de sdime n-
tation est no)au! 8 mitochondries et l)sosomes 8
membranes plasmiques et microsomes ,. organites ar-
te-actuels correspondant des petits (outs de rticu-
lums et de l$appareil de 7olgi" 8 ribosomes 88 mol-
cules '0.9(.
6a .itesse de sdimentation #ermet e cassement
+E6$T7F des mocues%
8% Centrifu)ation sur )radient de densit
Les centrifugations prcdentes seffectuaient dans un
tube a%ec une seule phase. :ne technique suprieure est de
crer #usieurs #'ases en empilant des couc'es de i(uides de
moins en moins denses. On ralise alors un )radient de densi-
t a%ec du saccharose ,sucrose(, du chlorure de csium 'pour
0.9(; La %itesse de sdimentation d6une particule ,organite,
macromolcule, etc*" est fonction de a diffrence entre sa
densit et cee du miieu am-iant. La particule s6l+%e ou des-
cend dans le tube &usqu6" ce qu6elle atteigne une densit du mi-
lieu ambiant identique " la sienne 'elle peut ventuellement
-lotter". Cette technique est surtout utilise pour dissocier des
mocues 1 fai-e coefficient de sdimentation9 par e!emple
pour les molcules d0.9 sur un gradient de sucrose.
&our identifier es diffrents fra)-
ments9 i faut dis#oser dun mar(ueur
s#cifi(ue% On anal)se le culot %ia im-
muno'istoc'imie9 :estern -ot ou
test dune acti.it en;ymati(ue. On
peut effectuer un contrle ngatif en
%rifiant que la molcule identifie du
culot nest pas dans le surnageant.
<ais il faut garder " lesprit quun cu-
lot nest 4amais #ur 1 "<<=%
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86emple :
9nalyse de -ragments de mem(ranes plas-
miques d$entrocytes ,cellules de l$intestin"
aprs centri-ugation sur gradient de sucrose*
:n ralise un )estern (lot de 1a;<-9=Pase
,marqueur de la mem(rane (asale", Pep=&
,marqueur de la mem(rane apicale" et 74>=2*
74>= 2 sem(le plus prsent au p?le apical
car il est prsent l o@ Pep=&, le marqueur, est
prsent*
9utre e6emple : distri(ution des protines entre di--rents organites de cellule vgtale
II. ,%'*-%RI) .) FL+/
$% &rinci#e
1. $a%%els do%ti&ue
6a diffraction est le comportement des ondes lorsqu6elles rencontrent un o-stace qui ne leur est pas
compl+tement transparent. Lorsqu6un faisceau lumineu! rencontre un tel obstacle, il = s6ou%re > on dit
(u>i su-it une diffraction ou qu6il est diffract :
La diffraction de la lumi+re est dpendante de la taille de la cellule ou de la structure ,-orme, granulosit, com-
position mem(ranaireA"
6 a diffusion est simplement la umi/re rmise #ar un o-4et, la lumi+re prenant alors la couleur de
lob&et. 9ous %o)ons les ob&ets qui nous entourent par leur lumi+re diffus
6 a fuorescence est une umi/re mise par un = fluorochrome > ,un colorant -luorescent" lorsque ce-
lui-ci est e!cit #ar un rayon umineu!. La fr(uence du rayon mis est diffrente de cee du rayon
incident%
!. 'rinci%e de la cytomtrie en flux
La c)tomtrie de flu! est une mt'ode d>anayse automatique de ceues indi.iduees entra?nes par un
flu! liquide. lle permet >tude #rcise de ceues isoes.
Les molcules ou cellules passent une 1 une, " grande %itesse dans e faisceau d>un aser. C6est la umi/re
rmise '%ar diffusion ou fluorescence( qui permet de casser a #o#uation sui%ant plusieurs crit+res 'taille,
granulosit( et de es trier.
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5emarque : on peut recueillir des populations de cellules
en -onction de leur intensit lectrique ,tape '"*
La umi/re diffracte par les cellules est mesure #ar
des ca#teurs qui transmettent linformation " un ordinateur
,tape B(. .es capteurs spcifiques mesurent la fluorescence
des colorants 'fluorochromes( que lon a %entuellement in-
troduits " la surface ou " lintrieur des cellules tudies.
La diffraction de la lumi+re (uantifie surtout a taie de
la cellule ,et un peu sa structure" et a diffusion (uantifie a
structure ,-orme, granulosit, composition mem(ranaireA"
et a coueur gr@ce au! %entuelles fluorescences.
Aour la fluorescence : soit on utilise une = auto fuores-
cence > prsente dans les cellules 'par e!emple F$D9 ?$DH
sont des composs qui = auto fluorescent >( $ soit on ralise a%ant le tri un mar(ua)e mem-ranaire dune #ro-
tine ci-e a.ec un anticor#s fuorescent rouge, %ert; On pourra ainsi sparer les cellules en fonction de la
fluorescence, ce qui affine la sparation.
8% $##ications de cytomtries
1. (%aration des lym%hocytes
Le 3
er
graphique spare les l)mphoc)tes en fonction de leur taille '44C( et de leur
structureBforme 'C4C(.
On peut aussi les sparer en fonction de marqueurs de surfaces gr@ce " des anti-
corps fluorescents, dans le!emple sui%ant on tudie la prsence de C.D et de p<*C
qui est spcifique au! l)mphoc)tes / :
Les cellules dintr1t peu%ent 1tre rcupres apr+s c)tomtrie, et peu%ent passer " nou%eau dans le c)to-
m+tre pour affiner la slection et enle%er les erreurs de premier passage, mais attention le laser ab?me partiel -
lement les cellules, plusieurs c)tomtries " la suite pour affiner une slection endommagent lchantillon.
!. )dentification de la %hase du cycle cellulaire
La composition 'qualitative et quantitative" en 0.9 peut 1tre aussi un crit+re
pour identifier les cellules et les trier. La diffraction de la lumi+re sera diff-
rente en fonction de la structure et la quantit de l0.9.
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#. *ri et caractrisation de sous+%o%ulations de cellules , %ancrati&ues
(auto+fluorescence)
On cherche " sparer les cellules E secrtant linsuline du reste des cellules du pancras, ) compris des cellules
F secrtant le glucagon prsentes au sein des ?lots de Langerhans. ,l e!iste un mo)en simple de les distinguer,
seules les cellules E poss+dent du C0. ,en grande quantit"* .e plus nous %oulons aussi trier les cellules E selon
leur quantit de A40-9C0<.
La collagnase dig+re la matrice e!tracellulaire et permet la sparation des cellules du pancras et des ?lots
de Langerhans. La tr)psine dig+re quant " elle la membrane entre les cellules alpha et b1ta.
On les passe ensuite au c)tom+tre en tudiant 2 facteurs, la fluorescence lie " la ph)cor)thrine 'spci-
fique de certaines cellules G gr@ce " A40-9C0<( et celle lie au C0. 'commune mais --- cheH les G( :
On spare donc les cellules F des cellules E
en fonction de lauto fluorescence puis les 2
sous-populations de cellules E en fonction de
la prsence plus ou moins importante de A40-
9C0< " leur surface.
Aour terminer ltude, on mesure la scr-
tion d6insuline stimule par le glucose des cel-
lules E tries : le graphe obtenu nous permet
de dduire que les ceues &S$-?C$MA sont
meieures scrtrices (ue es &S$-?C$M-%
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Avertissement: ce document est un support de cours datant de l$anne 2%&2-2%&'* 0eul le cours dispens en amphithCtre -ait -oi pour le concours*
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CCMs dentraDnement E Concours 2<"<-2<""2$nnaes du Tutorat
3( Un or)anite a une constante de sdimentation de "<<S et un autre a une constante de sdimenta-
tion de F<<<S% On .eut es s#arer #ar centrifu)ation diffrentiee 0une seue r#onse e!acte3 E
0. Lors de cette centrifugation, l6organite de D7774 sdimentera le premier.
I. Lors de la premi+re centrifugation, les deu! organites se retrou%eront dans le premier culot.
C. J 36 issue de la premi+re centrifugation, il faudra = reprendre > le culot 3 et le centrifuger "
nou%eau pour rcuprer l6organite de 3774.
.. La premi+re centrifugation peut s6effectuer " 377KC.
2( On effectue une centrifu)ation sur )radient de densit #our s#arer des fra)ments de mem-ranes
#asmi(ues 0a#ica9 atra ou -asa3 0coc'er a ou es r#onses e!actes3 E
0. Aour identifier les diffrents fragments, il faut disposer d6un marqueur spcifique.
I. :n marqueur spcifique doit 1tre commun " deu! t)pes de fragments 'apical et basal par
e!emple( pour 1tre %alide.
C. Aour identifier les diffrents fragments, on teste la prsence du marqueur dans ces frag-
ments.
.. Aour identifier les diffrents fragments, on peut tester la prsence de l0L9m du marqueur
dans ces fragments.
. Les diffrents fragments de membranes plasmiques ne sont pas sparables par centrifuga-
tion sur gradient de densit.
5( Coc'er a #ro#osition e!acte E
0. La c)tomtrie de flu! permet gr@ce " un laser de classer les cellules en fonction de leur taille.
I. Aour aller plus %ite, les cellules peu%ent passer deu! par deu! dans le faisceau du laser : les
rsultats obtenus ne seront pas tr+s diffrents de ceu! obtenus si elles passent une par une.
C. La composition en 0.9 ne peut pas 1tre un crit+re pour trier les cellules car la diffraction de
la lumi+re ne change pas a%ec les modifications de l0.9
.. ,l est impossible de trier les l)mphoc)tes I des l)mphoc)tes / car ils ont la m1me morpholo-
gie.
. 0ucune des rponses prcdentes n6est e!acte.
Corrections
"3 +#onse $
I. Cau! : <1me apr+s une seule centrifugation, la diffrence importante entre les deu! organites les sparent :
le plus lourd 'D774( %a se retrou%er dans le culot, ce qui nest pas le cas du plus lger '3774(.
C. Cau! : lorganite de 377 4 nest pas dans le culot apr+s la premi+re centrifugation.
.. Cau!: :ne telle temprature est nfaste pour les deu! organites qui ne peu%ent pas garder leur intgrit.
23 +#onses $C
0. Mrai : 4ans marqueur spcifique, impossible didentifier la molcule recherche.
I. Cau! : Aar dfinition, si le marqueur est commun " deu! fragments, il ne lui est plus spcifique N
C. Mrai
.. Cau! : La prsence du marqueur ne nous intresse pas, cest celle du fragment recherch qui nous intresse.
. Cau! : Les diffrents fragments de membrane plasmique sont sparables sur centrifugation par gradient de
densit.
*3 +#onse E $
I. Cau! : .ans la cytomtrie de flux, les ceues doi.ent #asser une 1 une de.ant e aser sinon les rsultats ne
sont pas interprtables.
C. Cau! : La composition en 0.9 peut Gtre un crit/re pour identifier les cellules et les trier.
.. Cau! : On peut trier es ym#'ocytes 8 et T gr@ce " des anticor%s s%cifi&ues de leurs mar&ueurs de sur+
face 'qui sont diffrents cheH les L/ et les LI(.
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