1

G
GGE
EEN
NN
M
MMI
IIC
CCA
AA
(Una gua de lectura introductoria al tema)


La genmica es el campo de la gentica que intenta comprender el contenido, la
organizacin, la funcin y la evolucin de la informacin gentica contenidos en el genoma
completo. Su principal objetivo de estudio es la caracterizacin molecular de los genomas
completos.
La genmica integra las disciplinas tradicionales: citologa, gentica mendeliana,
cuantitativa, molecular, de poblaciones y nuevas disciplinas como la bioinformtica.
!ara identificar y cartografiar de manera sistemtica todos los genes del genoma de un
organismo se procedi a:

"dentificar mutaciones espontneas o generar colecciones de mutantes usando agentes
qumicos o fsicos.
#enerar mapas genticos mediante anlisis de ligamiento utilizando las cepas mutantes.












$urante la dcada de %&'( los genetistas comenzaron a utilizar la tecnologa del )$*
recombinante como una apro+imacin al anlisis gentico, cartografiando secuencias de )$*
clonadas en cromosomas especficos. La mayor parte de estas secuencias no eran genes, sino
marcadores como polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin ,-.L!/, polimorfismo de
un 0nico nucletido ,S*!/ y otros. 1na vez asignados a un cromosoma, estos marcadores se
utilizaban en rboles genealgicos para establecer un ligamiento entre los marcadores y
enfermedades genticas. 2ste mtodo denominado clonacin posicional se utiliz para
cartografiar, aislar, clonar y secuenciar los genes de distintas enfermedades.
1 11 1 2 22 2
3 33 3
4 44 4
5 55 5

.igura %. 3rganismos modelo utilizados
para identificar mutaciones y generar
mapas genticos: %. 4az, 5. $rosop6ila,
7. E. coli, 8. -atn y 9. Levadura.

2

) mediados de %&'( ya se 6aban asignado ms de 7.9(( genes y marcadores a
cromosomas 6umanos. )ctualmente se 6an secuenciado centenares de genomas de procariotas
y eucariotas, y 6ay ms de mil proyectos en ejecucin.

a Genmica incluye diversos campos

Genmica Estructural
Genmica !uncional
Genmica Comparativa

La Genmica Estructural incluye la construccin de los datos de la secuencia del genoma,
el descubrimiento de los genes y su localizacin y la construccin de mapas genticos.
La Genmica !uncional estudia la funcin biolgica de los genes, su regulacin y sus
productos.
La Genmica Comparativa compara secuencias de genes y protenas de diferentes
genomas para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas.



















3

La "rotemica es una e+tensin de la #enmica y su objetivo es el estudio de las protenas
presentes en una clula, en un tejido, en un fluido en un momento dado bajo determinadas
condiciones. $efine el con#unto completo de prote$nas codificadas por un genoma. "ncluye:
"dentificacin de todas las protenas e+presadas en una clula bajo determinadas
condiciones.
La naturaleza y el alcance de cualquier modificacin pos:traduccional de las protenas.
Las interacciones protena:protena.
La localizacin subcelular de las protenas.
4

GENMICA E%&'(C&('A

La #enmica estructural se ocupa de la secuenciacin y la comprensin del contenido
del genoma. ) menudo, uno de los primeros pasos en la caracterizacin de un genoma es
preparar mapas genticos y f$sicos de sus cromosomas. 2stos mapas proporcionan informacin
sobre las localizaciones relativas de genes, los marcadores moleculares y los segmentos
cromosmicos, que suelen ser esenciales para posicionar los segmentos cromosmicos y alinear
tramos del )$* secuenciado en una secuencia del genoma completo.

MA"A% GEN)&IC*%

Los mapas genticos ,mapas de ligamiento/ proporcionan una apro+imacin a grandes
rasgos de las localizaciones de los genes en relacin con las de otros genes conocidos.
2stos mapas se ,asan en la funcin gentica de recom,inacin. !ara la construccin de
los mapas se cruzan individuos 6eterocigotos en dos o ms loci genticos y se determina la
frecuencia de recombinacin mediante el e+amen de la progenie. Si la frecuencia de
recombinacin entre dos loci es del 9(;, entonces los loci estn ubicados en cromosomas
diferentes o estn muy separados en el mismo cromosoma. Si la frecuencia de recombinacin es
menos del 9(;, los loci estn localizados muy pr+imos en el mismo cromosoma ,pertenecen al
mismo grupo de ligamiento/. !ara los genes ligados, la frecuencia de recom,inacin es
proporcional a la distancia f$sica entre los loci.















as distancias en los mapas
genticos son medidas en
porcenta#e de recom,inacin
-centimorgans, cM. o unidades
de mapa -um..
Marcadores de ADN
Distancia en un
mapa gentico
.igura 5. Los mapas
genticos se basan
en la frecuencia de
recombinacin.

5

$urante muc6os a<os, los genes podan detectarse slo observando su influencia en un
rasgo ,fenotipo/ y la construccin de mapas genticos estaba limitada por la disponibilidad de
rasgos de un locus individual que podran e+aminarse por la evidencia de la recombinacin. )l
final, esta limitacin se super con el desarrollo de tcnicas moleculares, como el anlisis de
polimorfismos de la longitud del fragmento de restriccin, la reaccin en cadena de la polimerasa
,!=-/ y la secuenciacin de )$*, mejorando los mapas genticos.
Los mapas genticos tienen varias limitaciones, la primera es la ,a#a resolucin o el detalle.
Segundo, no siempre se corresponden con precisin a las distancias f$sicas entre los genes. Los
mapas genticos se basan en las frecuencias de entrecruzamiento o recombinacin, que varan
de un cromosoma a otro, de modo que las distancias de un mapa gentico son slo
apro+imaciones de distancias fsicas reales a lo largo de un cromosoma. ) pesar de estas
limitaciones, los mapas genticos /an sido fundamentales para el desarrollo de los mapas f$sicos y
la secuenciacin de genomas completos0

MA"A% CI&*GEN)&IC*%






















Los mapas citogenticos o
cromosmicos constituyen una etapa
intermedia entre los mapas genticos y
los mapas fsicos.

.igura 7. =omparacin del mapa citogentico del
cromosoma % del b0falo ,>>1%/ a la izquierda y la
alineacin con la secuencia de montaje del
cromosoma % y 5? del bovino ,>@)% >@)5?/ a la
derec6a. Los marcadores comunes a ambos estn
unidos por una lnea slida de color negro
o una lnea roja slida ,circulo/. Las lneas rojas
indican los marcadores que se orientan de forma
secuencial pero invertida.

6

=on el avance de las tcnicas de bandeo cromosmico, la citogentica cuenta con una
6erramienta de mayor precisin en la individualizacin de los cromosomas, facilitando su
agrupamiento y clasificacin morfolgica.
2l estudio citogentico en animales domsticos se 6a desarrollado rpidamente en los
0ltimos a<os. Aoy en da es utilizado como elemento de diagnstico que permiten detectar un
gran n0mero de patologas. ) su vez el bandeo cromosmico, 6a permitido precisar la
localizacin de genes aportando informacin al mapa gentico. !or otro lado permiten realizar
estudios evolutivos de especies relacionadas entre s.
a construccin de los mapas citogenticos o cromosmicos se realizan utilizando tcnicas
que no incluyen la reproduccin se+ual ,meiosis/ y, por lo tanto, asignan una localizacin seg0n las
regiones citogenticas ,adems, estos mapas presentan la ventaja de no requerir del uso de
marcadores polimrficos/. 2sas tcnicas son:
1i,ridacin in situ,
1$,ridos de clulas som2ticas
1$,ridos de radiacin0

1i,ridacin In Situ0

=uando una secuencia de )$*, en este caso referida como una BsondaC de )$* ,en
ingls, probe/, es marcada con istopos radioactivos o fluorescencia, podemos /i,ridarla con su
secuencia complementaria en el )$* genmico de un cromosoma especfico y observar la
marca directamente sobre el e+tendido cromosmico con un microscopio ptico. Las clulas
deben estar fijas y los cromosomas esparcidos en un portaobjetos y e+puestos a una solucin de
pA elevado para romper el apareamiento de bases y permitir el acceso a las sondas. a
/i,ridacin in situ fluorescente -!I%1. es una tcnica muy sensible siempre que se cuente con
sondas lo suficientemente grandes ,y 6omlogas/ y que se suprima la fluorescencia de fondo. La
sensibilidad de esta variante de la tcnica de 6ibridacin in situ es que permite localizar una
secuencia con una precisin de 6asta 7( 4b y de detectar anormalidades cariotpicas en
cromosomas metafsicos tanto como interfsicos. Los fluorocromos ms empleados son:
fluoresce$na ,."@=/, rodamina ,D-"@=/ y &e+as 'ed.








La 6ibridacin in situ es la tcnica de eleccin
para la localizacin r2pida de los transgenes.
.igura 8. =romosoma 8 que presenta una duplicacin de
la banda q5% detectado con la tcnica ."SA
7

!i,ro,lasto /umano Clula tumoral
del ratn
Los fibroblastos
6umanos y las clulas
tumorales de ratn se
mezclaron en presencia
de polietilenglicol
Ey dan origen a
clulas 6bridas
denominadas
6eterocarion
1eterocarion
Clula /$,rida
con n3cleos
fusionados
$neas celulares
.igura 9. La 6ibridacin
de clulas somticas
puede utilizarse para
determinar cul es el
cromosoma que
contiene el gen de
inters.
!or 0ltimo, el pintado de cromosomas ,del ingls c6romosome painting/ es una variante del
."SA que emplea una mezcla de sondas de A4N derivada de un cromosoma entero o de una
regin cromosmica de inters. Se utiliza para obtener patrones de regiones 6omlogas entre
diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de rearreglos que se
produjeron entre dos especies en el curso de la evolucin.

1$,ridos de Clulas %om2ticas

!ara esta tcnica se utilizan
clulas /$,ridas -via,les. derivadas
de la fusin in vitro de clulas
som2ticas de especies diferentes
de mam$feros. )unque se
desconoce la razn, se observa
que los cromosomas que se van
perdiendo en las clulas 6bridas
pertenecen e+clusivamente a uno
de los conjuntos parentales. !or
ejemplo, los 6bridos
6umanoFroedor tienden a perder
,a travs de los sucesivos cultivos y
en forma preferencial/ los
cromosomas 6umanos y quedarse
con una mayora de cromosomas
de roedor. $ebido a esto, es
posible derivar un panel de clulas
6bridas que representen cada cromosoma 6umano en forma 0nica, sobre un conjunto de
cromosomas de roedor. !or lo tanto, todos los genes de origen roedor son retenidos ,y se e+presan
normalmente/, mientras que slo los genes presentes en el 0nico cromosoma 6umano que qued
retenido en ese 6brido podrn ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el
anlisis de e+presin. $e esta manera, detectando patrones de presencia o ausencia de
marcadores ,o e+presin de genes/ y correlacionando con los cromosomas presentes en el
6brido, se puede asignar un gen 6umano a un cromosoma en particular. Los 6bridos de clulas
somticas 6umanoFratn, con un complemento limitado de cromosomas 6umanos ,intactos/, 6an
sido muy usados para localizar genes 6umanos en los 0ltimos 5( a<os, a pesar de ser muy
inestables.


8

1$,ridos de 'adiacin -1'.

3tra tcnica desarrollada para obtener mapas de alta resolucin son los paneles de
/$,ridos de radiacin -'adiation 1y,rid 5'1., enfoque descripto por #oss y Aarris en %&?9. Las dos
grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse marcadores o genes no polimrficos
,se eval0a slo la presencia o ausencia de un marcador/ y que se logra una resolucin mayor que
con los mapas de ligamiento, constituyendo un puente entre stos y los mapas fsicos. 2stos
paneles de clulas 6bridas se construyen a partir de clulas donantes ,de la especie a ser
mapeada/ que 6an sido irradiadas letalmente ,ya sea con rayos g o D/ para causar la
fragmentacin de sus cromosomas ,por roturas de doble cadena/. Las clulas as irradiadas son
fusionadas con lneas celulares receptoras deficientes para un marcador de seleccin, como ser
la timidina quinasa ,@G
H
/ o la 6ipo+antina fosforibosil transferasa ,A!-@
H
/. 1sando condiciones de
seleccin con medios apropiados, sobrevivirn slo aquellas clulas que contengan, por lo menos,
alg0n fragmento cromosmico proveniente de las clulas dadoras.
2l concepto terico es que aquellos loci 6ue se encuentran muy pr+imos unos de otros
ser2n retenidos en el mismo fragmento cromosmico despus de la radiacin0 2sta caracterstica
es similar al principio de ligamiento gentico que 6emos visto en los mapas meiticos. =omo en los
paneles de )$* obtenidos con cruzas de animales, la informacin de los paneles A- es
acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento ,de alta resolucin/ de regiones no
polimrficas o no separables por los mapas de ligamiento.













.igura I. Abridos de radiacin. =onstruccin de clones de 6bridos de radiacin ,A-/ a partir de clulas
donantes con un 0nico cromosoma 6umano ,6brido mono:cromosmico/ y clulas receptoras de 6mster.
=ada clon ,abajo/ presenta una coleccin diferente ,al azar/ de fragmentos del cromosoma 6umano
original. Los I loci 6ipotticos ,) a ./ se marcan como J ,presencia/ o : ,ausencia/, dando una idea del
ordenamiento en el cromosoma original
9


=uando se eval0a un marcador ,por Sout6ern blot, ."SA o !=-/, el patrn de presencia ,J/
o ausencia ,H/ a travs del panel, define el emplazamiento del mismo: aquellos marcadores con el
mismo patrn de J y H estarn localizados en el mismo BbinC o posicin. 2stos estudios se conocen
como Bpatrones de retencin de marcadoresC y nos ayudan a determinar la ubicacin de un gen
o marcador. 2n estos casos, la unidad para medir la distancia en el mapa es el 'ay o el centi'ay
-c'.0

MA"A% !7%IC*%

Los mapas fsicos estn ,asados en el an2lisis directo del A4N y ponen los genes respecto
a distancias medidas en el n3mero de pares de ,ases, 8ilo,ases o mega,ases0 1n tipo com0n de
mapa fsico es el que conecta piezas aisladas de )$* genmico que fue clonado en bacterias o
levaduras. 1na de las ventajas es que, por lo general, los mapas fsicos tienen resolucin mayor y
son ms e+actos que los mapas genticos.














Aay varias tcnicas para crear mapas fsicos, entre las que se incluyen el mapeo de
restriccin, que determina las posiciones de sitios de restriccin en el )$*K el mapeo del sitio de
secuencia especfica ,sequence-tagged site, S@S/, que localiza las posiciones de secuencias
cortas 0nicas de )$* en un cromosomaK la 6ibridacin in situ fluorescente ,fluorescent in situ
hybridization, ."SA/, por el cual pueden mapearse los marcadores visualmente en sus
localizaciones cromosmicas y la secuenciacin de )$*.
Mapa gentico
Secuencia de
ADN
Mapa fsico
Cromosoma
Clones de ADN
alineados
.igura ?. Los
mapas fsicos a
menudo se utilizan
para ordenar los
fragmentos de
)$* clonados.

10

9I%(AI:ACI*N 4E *% !'AGMEN&*% 4E A4N

"ara la visualizacin de fragmentos de A4N se encuentran disponibles numerosas tcnicas, entre
las que se pueden mencionar:

;0 a electroforesis es una tcnica bioqumica estndar para la separacin de molculas sobre la
base del tama<o y la carga elctrica. Aay varios tipos. Se prepara un gel poroso de agarosa que
se funde en una solucin buffer. )l enfriarse se solidifica. 2n uno de los e+tremos del gel se realizan
indentaciones ,pocillos/ para contener las soluciones con fragmentos de )$* y se somete a una
corriente elctrica que pasa a travs del gel. $ado que el grupo fosfato del )$* tiene carga
negativa, los fragmentos de )$* migran 6acia el e+tremo positivo del gel. La distancia que
recorre cada fragmento depende de su tama<o. Luego se produce la tincin del gel con un
colorante especfico como bromuro de etidio.
La electroforesis es muy utilizada en la tecnologa de )$* recombinante.

<0 3tra tcnica es la %out/ern ,lot, sirve para transferir los fragmentos desnaturalizados
monocatenarios provenientes de un gel a un medio slido delgado. 2stos fragmentos son cortados
por una o ms enzimas de restriccin. Se puede identificar que clones de una biblioteca
contienen una determinada secuencia de )$* y para caracterizar el tama<o de los fragmentos.
@ambin se puede utilizar para determinar si un clon contiene todo un gen o solo parte de el.
Los fragmentos se separan por electroforesis en gel, lo que produce una serie de bandas.
Se ti<e el )$* en el gel con bromuro de etidio y se fotografa o escanea para determinar el
n0mero y peso molecular de los fragmentos. 2l )$* se debe desnaturalizar en fragmentos de
cadena sencilla con un tratamiento alcalino. Se cubre el gel con una membrana de nitrocelulosa.
Los fragmentos de )$* del gel se transfieren a la membrana colocando la membrana y el gel
sobre un pabilo ,esponja/ sumergida parcialmente en una solucin tampn. Se colocan varias
capas de papel de celulosa secante. La accin capilar arrastra el tampn por el gel y de esta
manera se transfieren los fragmentos de )$* del gel al filtro de nitrocelulosa. $espus de la
transferencia al gel se coloca en una solucin de 6ibridacin de una sonda marcada en forma
radiactiva o qumica. La sonda se unir a todos los fragmentos de )$* en la membrana que
posee secuencias complementarias. Luego se lava la membrana para sacar la sonda no unida y
la sonda unida se detecta por autorradiografa u otro mtodo para sondas marcadas.


11

=0 2l Not/ern ,lot es la transferencia de )-* tambin de un gel a un soporte slido mediante un
proceso denominado. La 6ibridacin puede revelar el tama<o de una molcula de )-*
mensajero particular, su abundancia o los tejidos en los que se transcribe.

>0 2l ?estern ,lot es la transferencia de la protena de un gel a una membrana. La sonda puede
ser un anticuerpo, utilizado para determinar el tama<o de una protena y el patrn de e+presin.

@0 1i,ridacin in situ ,e+plicada anteriormente/

A0 !ootprinting del A4N
4uc6as secuencias del )$* act0an como sitios de fijacin para protenas por ej. las
secuencias consenso en promotores que son los sitios a menudo sitios de fijacin para los factores
de transcripcin. 2sta tcnica se utiliza para determinar las secuencias de )$* fijadas a estas
protenas.

B0 Mutagnesis
1na manera muy eficaz para estudiar los genes es provocar mutagnesis y estudiar los efectos
en el organismo.

.igura '. @cnica de Sout6ern blot
para transferir los fragmentos
desnaturalizados monocatenarios
provenientes de un gel a un
medio slido delgado.
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C0 Animales transgnicos
2n ratones y otros mamferos el ovocito es lo
suficientemente grande como para inyectar el )$*
de manera directa. 2n el estado de dos pron0cleos
antes de la fecundacin. )ntes de la fecundacin se
puede inyectar el )$* en uno de ellos y as unas
copias de )$* son inyectadas y se integran al azar
mediante un proceso denominado recom,inacin
no /omloga. Los embriones se implantan luego en
una 6embra seudopre<ada, madre sustituta.

.igura &. )nimales transgnicos. Los animales alterados son
transgnicos y el )$* aportado e+tra<o se denomina
transgen.







D0 'atones con desactivacin gnica EFnoc8GoutE
2s una variante que consiste en producir ratones en los
que se les desactiva un gen normal. Sus fenotipos ratones
con desactivacin permiten determinar la funcin de un
gen. La manera 6abitual es insertar un gen neo que
confiere resistencia al antibitico #8%'. La insercin
rompe el gen blanco y proporciona un marcador
conveniente para 6allar copias del gen desactivado.
$espus de transferir el gen desactivado a las clulas
embrionarias se seleccionan mediante el agregado del
antibitico #8%'. Solo sobrevivirn las clulas con el gen
desactivado.

.igura %(. GnocL:out. $entro del ratn la copia normal del gen
puede intercambiarse con la desactivada a travs de la
recombinacin.


13

'eaccin en Cadena de la "olimerasa para amplificar el A4N -"C'.

!ermite amplificar los fragmentos de )$* miles a millones de veces en el transcurso de
unas pocas 6oras. !uede utilizarse con cantidades peque<as de )$* original incluso una sola
molcula. La !=- 6a revolucionado la biologa molecular y es 6oy una de las tcnicas
moleculares ms utilizadas.
La base de la !=- es la replicacin catalizada por una )$* polimerasa, que tiene dos
requisitos esenciales: un molde de )$* monocatenario a partir del cual puede copiarse una
nueva cadena de )$* y un cebador al que pueden agregarse los nuevos nucletidos. $ebido a
que una molcula de )$* consta de 5 cadenas de nucletidos cada una puede servir como
molde para producir una nueva molcula de )$*, la cantidad de )$* se duplica con cada
replicacin. 2l punto de partida de la sntesis de )$* en el molde es determinado por la eleccin
de los cebadores. Los cebadores utilizados en la !=- son los fragmentos cortos de )$*, de
manera tpica de %? a 59 nucletidos de longitud, que son complementarios a las secuencias
conocidas en el molde. !ara cada cadena se utiliza un cebador diferente.

!ara llevar a cabo la !=- se comienza con:
una solucin que incluye el )$* blanco ,)$* por ser amplificado/,
la )$* polimerasa,
los cuatro deso+irribonuclesidos trifosfatos
los cebadores que son complementarios a las secuencias cortas en cada cadena
de )$* blanco
los iones magnesio y otras sustancias que son necesarias para que se produzca la
reaccin.
(na reaccin en cadena de la polimerasa incluye = pasosH
!aso %: una solucin de )$* se calienta entre &(M= y %((M= para romper los puentes de
6idrgeno entre las dos cadenas de nucletidos y producir as los moldes monocatenarios
necesarios. La mezcla de la reaccin se mantiene a esta temperatura durante slo uno o
dos minutos.
!aso 5: la solucin de )$* se enfra con rapidez a una temperatura entre 7(M= y I9M= y se
mantiene as durante un minuto o menos. Los cebadores se ad6ieren a sus secuencias
complementarias en las cadenas molde.
!aso 7: la solucin se calienta entre I(M= y ?(M=, temperatura a la cual la )$* polimerasa
puede sintetizar cadenas nuevas de )$* mediante el agregado de nucletidos a los
cebadores. 2n el transcurso de unos pocos minutos se producen dos molculas nuevas de
)$* bicatenario por cada molcula original de )$*.
Luego se repite cada ciclo completo. =on cada ciclo, la cantidad de )$* se duplicaK de
modo que ste aumenta en forma geomtrica. 1na molcula de )$* aumenta a ms de %(.(((
14

molculas en %( ciclos de !=-, a ms de un milln de molculas en 5( ciclos y a ms de mil
millones de molculas en 7( ciclos. =ada ciclo se completa en el trmino de unos pocos minutosK
por tanto, en unas pocas 6oras se obtiene una amplificacin grande de )$*.



















.igura %%. !asos de la !=-

$os innovaciones importantes facilitaron el uso de la !=-:
2l descubrimiento de la )$* polimerasa que es estable a las temperaturas elevadas
,polimerasa @aq/.
2l desarrollo de cicladores trmicos automatizados, es decir, mquinas que provocan los
cambios de temperaturas rpidos requeridos para los diferentes pasos de la !=-.

2n la actualidad la !=- se utiliza con frecuencia en lugar de la clonacin gnica, pero
tiene varias limitaciones. 2l uso de !=- requiere el conocimiento previo de parte de la secuencia
del A4N para permitir la construccin de cebadores. 3tra limitacin es que el tamaIo de los
fragmentos que pueden amplificarse por la polimerasa @aq estndar suele ser menor de 5((( pb.
) pesar de sus limitaciones la !=- se utiliza 6abitualmente en una amplia gama de aplicaciones
moleculares.


15

%EC(ENCIACI*N

%EC(ENCIACIN 4E A4N

2n cierto sentido, un )$* clonado o no, no est
completamente caracterizado 6asta que se conoce su
secuencia nucleotdica. a capacidad de secuenciar A4N /a permitido grandes avances en el
conocimiento de la organizacin del genoma y de los genes, incluyendo su estructura, funcin y
mecanismos de regulacin.
Los primeros mtodos para la secuenciacin rpida de )$* se desarrollaron entre %&?9 y
%&??. .redericL Sanger y col. crearon el mtodo de secuenciacin dideo+i ,asado en la
elongacin del A4NJ )llan 4a+am y Nalter #ilbert desarrollaron un
segundo mtodo basado en la degradacin qumica del )$*. 2l
mtodo de Sanger se convirti con rapidez en el procedimiento
estndar para la secuenciacin de cualquier fragmento purificado
de )$*.

Mtodo 6u$mico de Ma+am y Gil,ert

1n fragmento de )$* se marca radioactivamente en sus e+tremos con gamma 75!
gamma 75S d)@! por accin de la polinucletido quinasa. La tcnica consiste en romper estas
molculas marcadas con reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro bases.
=uatro alcuotas de la misma muestra se tratan bajo condiciones distintas, posteriormente el
tratamiento con piperidina rompe la molcula de )$* a nivel de la base modificada.
Los productos de estas cuatro reacciones se resuelven en funcin de su tama<o en geles
de poliacrilamida donde la secuencia puede leerse en base al patrn de bandas radioactivas
obtenidas. 2sta tcnica permite la lectura de unas %(( bases de secuencia.
16

Base nitrogenada






.igura %5. 4todo qumico de
4a+am y #ilbert.














Mtodo enzim2tico de %anger

2n este mtodo se utilizan pocos reactivos t+icos y cantidades menores de radioactividad
que en el mtodo de 4a+am:#ilbert, y su caracterstica particular es el uso de
dideso+inucletidos trifosfato -ddN&"s. como
terminadores de la cadena de )$*. Los dd*@!s
son deso+inucletidos de los 8 nucletidos
diferentes ,d)@!,d@@!, d=@! y d#@!/ que carecen
de uno de los grupos /idro+ilo, de manera que
cuando uno de estos nucletidos se incorpora a
una cadena de )$* en crecimiento, esta
cadena no puede continuar elong2ndose ya 6ue la enzima A4N polimerasa necesita un e+tremo
7O 3A para a<adir el siguiente nucletido, y el dd*@!, marcado en forma radioactiva o 6u$mica,
incorporado carece de este grupo 6idro+ilo. )l terminar la elongacin de la cadena, se producen
varios fragmentos de A4N de longitud varia,le, los cuales son desnaturalizados por calor y
separados por tama<o ,con una resolucin de un solo nucletido/ mediante electroforesis en gel
17

de poliacrilamida : urea. =ada una de las cuatro reacciones de sntesis se corre en calles
individuales ,), @, # y =/ y se visualizan las bandas de )$* mediante autorradiografa o luz
ultravioleta. as ,andas o,tenidas en el gel corresponden a los fragmentos de A4N de diferentes
longitudes


























1na banda en una calle indica un fragmento de )$* que es el resultado de una
terminacin de la cadena tras la incorporacin de un dideso+inucletido ,dd)@!, dd#@!, dd=@! o
dd@@!/. 2l nucletido terminal puede ser identificado de acuerdo al dideso+inucletido que se
a<adi en la reaccin que dio lugar a esa banda. Las posiciones relativas entre las cuatro calles
se utilizan entonces para leer la secuencia de )$*.


)$*
monocatenario que
debe ser
secuenciado
Los cuatro
dd*@!
Secuencia de la cadena
obtenida complementaria
Secuencia de la cadena
molde original
Autorradiograma de
la electroforesis en
gel
.igura %7. 2l mtodo de
dideso+i de secuenciacin
de )$* se basa en la
terminacin de la sntesis de
)$*.
18

%ecuenciacin autom2tica de %anger

$urante muc6os a<os, la secuenciacin del )$* se realiz sobre todo en forma manual y
era una tcnica laboriosa y costosa. 2n la actualidad, la secuenciacin se lleva a cabo mediante
aparatos automatizados que utilizan colorantes fluorescente y escneres de lser para los miles de
secuencias de pares de bases en unas pocas 6oras.

















.igura %8. 2squema de la secuenciacin por el mtodo automtico de electroforesis capilar con la secuencia
obtenida.

Los dd*@! utilizados en la reaccin automatizada se marcan cada uno con un colorante
fluorescente distinto. Las cuatro reacciones pueden tener lugar en el mismo tubo de ensayo y
pueden colocarse en el mismo pocillo durante la electroforesis, dado que cada d*@! se marca en
forma distintiva. Los aparatos de secuenciacin recin desarrollados llevan a cabo la electroforesis
en tubos capilares que contienen gel. Los fragmentos de diferentes tama<os producidos por la
reaccin de secuenciacin se separan dentro de un tubo y al migrar pasan por delante de un 6az
de lser y un detector.
=uando los fragmentos pasan por el lser, sus colorantes fluorescentes se activan y la
fluorescencia resultante se detecta por un escner ptico. =ada colorante emite fluorescencia de
una longitud de onda caracterstica que se lee en el escner ptico. !ara la interpretacin, la
informacin ingresa en una computadora y los resultados se imprimen como un conjunto de picos
19

en un grfico ,.ig. %8/. Los aparatos de secuenciacin automatizados pueden contener &I tubos
capilares o ms, lo que permite leer secuencias de 9(.((( a I(.((( pb en unas pocas 6oras.

%ecuenciacin autom2tica en geles desnaturalizantes de acrilamidaK,isacrilamida

La secuenciacin automtica mediante geles desnaturalizantes, se realiza polimerizando
un gel de acrilamidaFbisacrilamida entre dos cristales montados adecuadamente sobre el
cassette que sirve de soporte para los mismos y que posteriormente se acoplar en el
secuenciador automtico para proceder a la carga de la muestras.
2l n0mero de muestras que podemos cargar en cada gel, viene determinado por el
n0mero de pocillos que posee el peine ,de dientes de tiburn/ que utilicemos. Aay peines de
cuatro tama<os distintos: de 7I, 8', I8 y &I pocillos.
La electroforesis se desarrolla durante ? 6oras, y se puede realizar una lectura de unos
?((pb apro+imadamente, dependiendo siempre de la calidad del )$*, de la correcta
cuantificacin del mismo, de la utilizacin del BprimerC adecuado, y de la polimerizacin correcta
del gel de acrilamidaFbis principalmente.
=uando las muestras a secuenciar tienen una longitud no superior a 8((pb, podemos
disminuir el tiempo de la electroforesis a 7.9 6oras, aumentando la velocidad de barrido del laser, y
el resultado es igualmente optimo.

.igura %9. 2squema de los geles desnaturalizantes.










%ecuenciadores autom2ticos capilares

2+isten instrumentos de electroforesis capilar que proporcionan una alternativa al sistema
basado en geles de acrilamidaFbisacrilamida donde el soporte 6a sido sustituido por un polmero
que se inyecta de forma automtica en un capilar antes de cargar la muestra a secuenciarK las
muestras se van analizando una a una. 2ste tipo de secuenciadores se utiliza para lecturas no
superiores a unos 89(pb.
20

2l equipo funciona de forma completamente automtica inyectando las muestras ,que se
preparan e+actamente igual que durante la secuenciacin en geles y se colocan en una placa
de &I pocillos/, en un capilar previamente cargado con un cierto polmero que funciona como lo
6ace la matriz de acrilamida:bisacrilamida:urea de los geles de secuencia, permitiendo resolver
fragmentos de )$* de cadena sencilla que se diferencian en una 0nica base.
) una altura determinada el laser detecta la fluorescencia emitida por cada cadena
sencilla de )$* fluorescente y traduce esta emisin de fluorescencia en la secuencia
correspondiente. 1na vez desarrollada la electroforesis de la primera muestra, el capilar se vaca
rellenndose nuevamente con polmero fresco. Se inyecta a continuacin una segunda muestra,
se procede a desarrollar nuevamente la electroforesis y as sucesivamente.

.igura %I. Secuenciador )>" !rism 7%(




A% "'INCI"AE% 9EN&ALA% 4E E%&*% N(E9*% EM(I"*% %*NH
)utomatizacin completa de todo el proceso, no siendo necesaria siquiera la presencia
de un tcnico que cargue las muestras en los diferentes capilares del equipo.
-apidez en el anlisis de cada muestra: dado el peque<o dimetro de los capilares, se
pueden aplicar voltajes mayores que en los geles de acrilamida:bisacrilamida:urea, por lo
que pueden leerse del orden de 89( nucletidos en el plazo de una 6ora mientras que esta
misma longitud de secuencia necesita unas 5:8 6oras en un secuenciador en gel.
2l tiempo necesario del proceso es, para la polimerizacin del mismo, unas dos 6oras y
para la preelectroforesis, una 6ora apro+imadamente.

21

Corte de A4N
con enzima de
restriccin
Introduccin del
pl2smido
recom,inante a
la ,acteria
%EC(ENCIACIN 4E &*4*% *% GENE% 4E GEN*MA

2l genoma o secuencia completa de )$* de un organismo constituye la informacin
gentica 6eredable de un organismo.
%ecuenciar es determinar el orden en 6ue se enlazan las ,ases de dic/a secuencia. 2se
trozo de )$* puede corresponder a un gen, un genoma, o a una parte de ellos. Los avances de
las tcnicas de secuenciacin del )$* permiten 6oy en da leer el )$* a gran velocidad lo que
6a llevado a abordar proyectos a gran escala como el !royecto #enoma Aumano. )dems se
dispone ya de la secuencia completa de )$* de muc6os genomas de animales, plantas y
microorganismos.
Se usan dos mtodos diferentes para secuenciar genomas:
AG Mtodo clon a clon
NG Mtodo 1ierarc/ical %/otgun %e6uencing -secuenciacin de la perdigonada #er2r6uica. y
%/otgun %e6uencing -secuenciacin de la perdigonada.0

AG Mtodo clon a clonH
Se realiza la construccin de una biblioteca con fragmentos clonados que incluyen el )$* de
todo el genoma de un organismo, que luego se ensamblan en mapas genticos y fsicos.


.igura %?. 2strategia general para clonar un gen.
1n trozo de )$* es manipulado con enzimas de
restriccin e introducido en un plsmido el cual a
su vez es introducido en una bacteria. )l cultivar la
bacteria se obtienen m0ltiples copias del )$* de
inters.
2l clonado se realiza con distintos tipos
de enzimas de restriccin y vectores: Las
enzimas de restriccin son protenas aisladas
de bacterias cuya funcin es cortar )$*.
=ada enzima reconoce un sitio particular del
)$*, es decir que reconoce una secuencia
particular de nucletidos. 2sa secuencia
especfica se denomina Bsitio de restriccinC.
1na vez que la enzima reconoce estos sitios,
se posiciona sobre la molcula de )$* y
corta dentro o en torno de esa secuencia.

22

Cortes con e+tremos romos Cortes con e+tremos co/esivos



.igura %'. Las enzimas seg0n el
corte se clasifican en: 2nzimas que
generan Be+tremos romosC y
2nzimas que generan Be+tremos
co6esivosC.


Los vectores son molculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos
de )$* que llevan insertados. !ara que sirva de vector, una molcula debe ser capaz de
replicarse junto con el fragmento de )$* que transporta. @ambin tiene que tener secuencias de
reconocimiento que permitan la insercin del fragmento de )$* a clonar.
!ara insertar un fragmento de )$* al vector, se utiliza una enzima de restriccin, y se
mezcla con fragmentos de )$* producidos con la misma enzima.
Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores
recom,inantes0
Aay muc6os vectores de clonacin, que es una molcula de )$* replicante y estable a la
cual puede ad6erirse un fragmento de )$* e+tra<o para la introduccin en una clula. $ifieren
en la especificidad de la clula 6usped, el tama<o de los insertos que pueden transportar y en el
n0mero de copias que producen y el n0mero y tipo de genes marcadores que contienen.

&ipos de 9ectoresH
9ectores procariotasH
;0 "l2smidosH ,)$* epismico/. !ara secuencias cortas de %(.((( bases ,%( Gb/. Son circulares y
e+isten naturalmente en las bacterias. =ontienen orgenes de replicacin y pueden por eso
replicarse independientemente del cromosoma bacteriano.

.igura %&. p(C;D vector plsmido tpico de clonacin.

2l mtodo de insercin ms sencillo es a
travs de las enzimas de restriccin.
(n segundo mtodo para insertar )$* en un
plsmido es mediante una cola /omopolimrica o
tailing donde se crean e+tremos co6esivos
complementarios sobre las piezas del )$* con
23

e+tremos romos. !rimero, se corta el plsmido y el )$* e+tra<o con una enzima de restriccin. Si la
enzima de restriccin produce e+tremos co6esivos, estos se eliminan por una enzima que digiere el
)$* monocatenario. $e manera alternativa el plsmido y el )$* e+tra<o pueden cortarse por
una enzima de restriccin que produce e+tremos romos. 1na vez que el plsmido y el )$* e+tra<o
tienen e+tremos romos, los e+tremos co6esivos monocatenarios son agregados por una enzima
transferasa terminal.
(n tercer mtodo de insercin de fragmentos consiste en utilizar la enzima ligasa @8, capaz
de conectar dos piezas cualquiera de e+tremos romos de )$* y se denomina clonacin
mediante el uso de conectores.
1na vez insertado el plsmido debe introducirse en las clulas bacterianas. 2sta tarea suele
cumplirse mediante la transformacin y que es la capacidad de las bacterias de captar el )$*
del ambiente e+terno. 4uc6as veces la transformacin es un proceso natural, y otros deben
tratarse en forma qumica o fsica previamente. Los plsmidos dentro de la clula se replican y
multiplican.

<0 NacterifagosH ,gran capacidad para invadir bacterias, se utiliza para )$* complementario y
genmico/. 3frecen ciertas ventajas y el ms com0n es el bacterifago que infecta E. Coli. 1na
de sus ventajas es la elevada eficiencia para transferir el )$* a las bacterias. 1na segunda
ventaja es que cerca de la tercera parte del genoma P no es esencial para la infeccin ni para la
reproduccin. 2stos genes no esenciales que comprenden alrededor de %9 Gb pueden ser
reemplazados por 6asta 57 Gb de )$* e+tra<o. 2l )$* e+tra<o cortado con EcoRI tendr
e+tremos co6esivos que son complementarios con los de los e+tremos de los genes P esenciales, a
los cuales puede conectarse mediante la ligasa. 2l cromosoma P posee e+tremos monocatenarios
cortos denominados sitios cos, necesarios para empaquetar en )$* P dentro de la cabeza de un
fago. Los cromosomas del fago recombinante pueden entonces empaquetarse en la cubierta
proteica y agregarse a E. coli. Los fagos inyectan su )$* recombinante dentro de la clula,
donde se replicar. Slo los fragmentos de )$* de tama<o adecuado y que contienen genes
esenciales se empaquetarn en las cubiertas del fago.

=0 CsmidosH Los csmicos combinan las propiedades de los vectores plsmidos y los fagos. Los
fragmentos de )$* grandes de 88 Gb pueden clonarse en csmicos.
Los csmicos son plsmidos peque<os que contienen los sitios cos del fago PK pueden
empaquetarse con las cubiertas virales y transferirse a las bacterias por infeccin viral. $ado que
se pierden todos los sitios virales menos los sitios cos, un csmico puede tener ms del doble del
)$* e+tra<o que puede transportar el fago vector.
24

2l )$* e+tra<o es insertado en los csmicos del mismo modo que se introduce en los plsmidos.



.igura 5(. Qector csmido.














>0 9ectores de e+presinH 4uc6as veces es interesante no solo replicar el gen si no tambin
producir la prote$na 6ue codifica. 1no de los primeros productos comerciales elaborados por
tecnologa recombinante fue la protena insulina. La e+presin e+itosa es un tema difcil sobre todo
las secuencias que regulan la trascripcin y la traduccin son diferentes en las bacterias y en los
eucariontes. !ara solucionar este problema suele insertarse un gen e+tra<o en un vector de
e+presin que, adems del origen de replicacin, los marcadores seleccionables y los sitios de
restriccin, contienen secuencias requeridas para los procesos mencionados.








9ectores eucariotasH



.igura 5%. !uede insertarse
un gen e+tra<o en un vector
de e+presinK en este
ejemplo un vector de
e+presin E. coli.
25

;0 OACsH ,cromosoma artificial de levadura.0 2s un material bastante inestable. !ara secuencias
de 6asta % 4b ,%((( Gb o % milln de bases/. Son molculas de )$* con un origen de replicacin
de levadura, que permite que se replique, un par de telmeros que garantizan estabilidad dentro
de la clula y un centrmero.



.igura 55. Qector R)=
















<0 NACH Cromosoma artificial de ,acterias0 Se utilizan para clonar segmentos grandes desde %((
a 9(( Gb ,%((.((( bases a 9((.((( bases/.



.igura 57. Qector >)=. =romosoma artificial de
bacteria con distintos sitios de corte de enzimas
de restriccin.






2l )$* clonado en los >)=s es por lo general ms peque<o que los R)=s. Sin embargo, los
>)=s ofrecen ventajas importantes como por ejemplo, son ms manipulables para ciertos tipos de
26

1na ,i,lioteca genmica es un
conjunto de clones, cada uno de los
cuales contiene un fragmento de un
genoma de un organismo dado.
Las bibliotecas genmicas se
consiguen clonando los fragmentos
en vectores0
estudios en el laboratorio. Los >)=s se usan a gran escala para construir mapas fsicos de alta
resolucin de los cromosomas, con el fin de establecer la secuencia completa del genoma.

"A"E 4E A C*NACIN G)NICA

La manipulacin y el anlisis de los genes con tecnologa de )$* recombinante requiere
copias m0ltiples de las secuencias de )$* utilizadas. La clonacin fue un requisito previo para
muc6os mtodos moleculares, 2n la actualidad los mtodos de amplificacin del )$* 6an
obviado la necesidad de la clonacin, aunque sigue siendo muy utilizada para crear secuencias
de genes novedosos y para otras manipulaciones.
PComo encontrar la secuencia de A4N para ser clonadaQ
$ado que en una clula puede 6aber millones de pares de bases de )$* es necesario
clonar para encontrar un gen. 2ste enfoque clonar primero y buscar despus, se denomina
clonacin de fragmentos escogidos al azar -%/otgun.. !rimero se clona un n0mero grande de
fragmentos en conocimiento de que uno o ms tienen el )$* de inters y entonces se busca el
fragmento entre los clones. La coleccin de clones que
contiene todos los fragmentos de )$* provenientes de
una fuente se denomina genoteca o ,i,lioteca
genmica0
!ara crear una genoteca genmica se recolectan
las clulas y se rompen. )s se produce la liberacin de
)$*. 2ste se puede aislar por diferentes mtodos. 1no de
ellos utiliza fenol. 1na vez e+trado el )$* se corta el )$*
con enzimas de restriccin y debido a que los sitios de corte son al azar las molculas de )$* se
cortan en lugares diferentes y se producirn fragmentos superpuestos. 2stos se unen a vectores
que pueden transferirse a las bacterias. 2sta tcnica produce un conjunto de clulas bacterianas
o bacterifagos que contienen los fragmentos genmicos superpuestos. 1na genoteca puede
contener un n0mero importante de clones para garantizar que todas las secuencias de )$* estn
representadas.

NG Mtodo 1ierarc/ical %/otgun %e6uencing -secuenciacin de la perdigonada
#er2r6uica. y %/otgun %e6uencing -secuenciacin de la perdigonada.

2l mtodo de Aierarc6ical S6otgun Sequencing fue propuesto por Sames Natson y .rancis
=ollins, entre otros, contando con la mayor parte de la financiacin p0blica.
2sta metodologa resulta la ms compleja, con un conocimiento ms e+6austivo del
genoma. >sicamente consiste en secuenciar el genoma completo, cromosoma a cromosoma de
27

;
<
un e+tremo al otro. Se 6acen 5 o 7 fragmentos del )$* ,fragmentos cortos de 5 Gb, fragmentos de
%9:5( Gb y tambin se pueden 6acer fragmentos de 5((:7(( Gb/.
Luego se construye una ,i,lioteca genmica con cada preparacin con la utilizacin de
vectores >)=. Se seleccionan y secuencian clones al azar de estas bibliotecas. Luego se utiliza un
programa para ensamblar y superponer largos tramos de secuencia a partir de los fragmentos
cortos, usando las secuencias de los clones ms largos como marco de referencia.

.igura 58. -epresentacin esquemtica de la estrategia de secuenciacin utilizado por %. 2l !royecto
#enoma Aumano financiado con fondos p0blicos y 5. !or =elera genomics.

2l mtodo de S6otgun Sequencing desarrollado por =raig Qenter bajo la financiacin de
B=elera #enomicsC y otras compa<as biotecnolgicas privadas, emplearan una segunda
tcnica, ms prctica. =onsistira en la secuenciacin de Egenes e+presadosE en las clulas
diferenciadas en las 6ue se encuentran activos, partiendo de los A'Nm resultantes de su
traduccin0
2l mtodo S6otgun Sequencing es ms rpido y menos costoso, pero es ms propenso a los
errores debidos a un montaje incorrecto de la secuencia final.









1asta el momento se /an secuenciado ;CR eucariotas -;B mam$feros, = especies
de aves, < anfi,ios, > especies de peces, <> especies de insectos, plantas, etc0. y
;B est2n en proyecto ,orrador0 &am,in se /an secuenciado <;>D ,acterias0
-Informacin Marzo <R;=.
!uente /ttpHKKSSS0genome0#pK8eggKcatalogKorgTlist0/tml0
28

&a,la ;0 E#emplos de genomas completos o de ,orradores de secuencias pu,licadas0
29

N(E9*% M)&*4*% 4E %EC(ENCIACIN
%EC(ENCIACIN 4E A&* 'EN4IMIEN&*

La elevada demanda de secuenciacin de bajo costo 6a dado lugar a las distintas
tecnologas de secuenciacin de alto rendimiento. 2stos esfuerzos 6an sido financiados por
instituciones p0blicas y privadas as como desarrolladas y comercializadas dentro de la empresa
privada por las compa<as de biotecnologa. Se pretende que las tecnologas de secuenciacin
de alto rendimiento disminuyan los costos de secuenciacin de las bibliotecas de )$* ms all de
lo que se puede 6acer con el mtodo corriente del terminador marcado basado en la separacin
del )$* por electroforesis capilar. 4uc6os de los nuevos mtodos de alto rendimiento usan
mtodos que paralelizan el proceso de secuenciacin, produciendo miles o millones de
secuencias a la vez.



















.igura 59. 2volucin de las tecnologas de alto rendimiento. )>":7?7( de )pplied >iosystems, posiblemente el
ms utilizado en la secuenciacin del genoma Aumano, con una capacidad de % 4b por da ,1n milln de
bases/. 2l )>:S3L"$ actual, en menos de %( a<os 6a multiplicado por %((( la capacidad de secuenciacin.




30

Amplificacin clonal in vitro

Ra que los mtodos de deteccin molecular frecuentemente no son lo suficientemente
sensibles para la secuenciacin de una sola molcula, la mayora de los mtodos utilizan un paso
con clonacin in vitro para generar muc6as copias de cada molcula individual. 1no de los
mtodos es la !=- de emulsin, en la que se aslan las molculas individuales de )$* junto con
microesferas recubiertas con cebadores en burbujas acuosas dentro de una fase oleosa.
!osteriormente una !=- recubre cada microesfera con copias clonales de la biblioteca de
molculas aisladas y seguidamente se inmovilizan para ser ms tarde secuenciadas. La "C' de
emulsin ,.ig. 5I/ se usa en los mtodos publicados por 4argulis y colaboradores ,comercializado
por 898 Life Sciences, adquirido por -oc6e/, S6endure y !orreca et al. ,conocido como
Tsecuenciacin polony T, trmino formado por polimerasa TpolT y colonia TcolonyT/, y la
secuenciacin S3Li$ ,desarrollada por )gencourt y adquirida por )pplied >iosystems/. 3tro
mtodo para la amplificacin clonal in vitro es la U"C' de puenteU, en la que los fragmentos se
amplifican a partir de los cebadores unidos a una superficie slida, desarrollados y usados por
Sole+a ,de la que a6ora es propietaria la empresa "llumina/ ,.ig. 5?/. 2stos mtodos producen
ambos muc6as localizaciones fsicamente aisladas que contienen cada una muc6as copias de un
solo fragmento. 2l mtodo con una 0nica molcula desarrollado por el laboratorio de Step6en
UuaLe ,y ms tarde comercializado por Aelicos/ se salta este paso de amplificacin, fijando
directamente las molculas de )$* a una superficie.

.igura 5I. 2mulsin de !=-. 1na molcula de )$* por perla. La amplificacin clonal de miles de copias se
produce en microrreactores en una emulsin.







31

;
<











.igura 5?. )mplificacin en fase slida. 1na molcula de )$* por =luster.

%ecuenciacin paralelizada

1na vez que las secuencias clonales de )$* se localizan fsicamente en posiciones
separadas de la superficie, se pueden utilizar varios mtodos de secuenciacin para determinar
las secuencias de )$* de todas las localizaciones en paralelo.
.igura 5'.@erminacin reversible. %. "lluminaFSole+aK 5. Aelicos >ioSciences.
32

La Tsecuenciacin por sntesisT, como en la popular secuenciacin electrofortica con
terminador marcado con colorante, usa el proceso de sntesis de )$* por )$* polimerasa para
identificar las bases presentes en la molcula complementaria de )$*. Los mtodos de
terminador reversible ,usados por "llumina y Aelicos/ utilizan versiones reversibles de terminadores
marcados con colorante, a<adiendo un nucletido cada vez, y detectando la fluorescencia
correspondiente a esa posicin y removiendo posteriormente el grupo de bloqueo para permitir la
polimerizacin de otro nucletido.

La "irosecuenciacin ,utilizada por
-oc6eF898/ tambin usa la polimerizacin
del )$* para a<adir nucletidos,
a<adiendo cada vez un tipo diferente y
despus detectando y cuantificando el
n0mero de nucletidos a<adidos a una
determinada localizacin a travs de la luz
emitida por la liberacin de los pirofosfatos
unidos a ellos.


.igura 5&. -oc6eF898. !irosecuenciacin.















La Usecuenciacin por ligacinU es otro mtodo enzimtico de secuenciacin que emplea
una )$* ligasa en lugar de una polimerasa para identificar la secuencia objetivo. Se usa en el
mtodo polony y en la tecnologa S3Li$ que ofrece )pplied >iosystems. 2ste mtodo utiliza un
33

reservorio de todos los oligonucletidos posibles de una longitud dada, marcados de acuerdo con
la posicin secuenciada. Los oligonucletidos se templan y liganK el ligamiento preferente de las
)$* ligasas por su secuencia especfica produce una se<al correspondiente a la secuencia
complementaria en esa posicin concreta. S6endure et al., usaron este mtodo para secuenciar
el genoma de E. coli 4#%I99.
































.igura 7(. LifeF)!#. Secuenciacin por Ligacin.





34

'eal &ime -%ecuenciacin en &iempo 'eal.

2s un nuevo mtodo de tecnologa que est llevando adenlante !acific >iosciences. 2n
esta tcnica, los nucletidos no detienen el procesos de sntesis de )$*. La secuenciacin en
tiempo real implica una imagen continua de la incorporacin de los nucletidos marcados
durante la sntesis de )$*.
2n la plataforma de !acific >iosciences molculas individuales de )$* polimerasa estn
unidos a la parte inferior de detectores individuales ,V4N detectors/ obteniendo informacin
mientras los nucletidos son fosforilados mientras el cebador va traduciendo.
3tros enfoques 6an propuesto mejorar la relacin de mediciones se<al:ruido en la
secuenciacin en tiempo real con esquemas de deteccin ms convencionales.
!or ejemplo, LifeFQisiten 6a dise<ado )$* polimerasas que se adjunta con un colorante
fluorescente para producir una se<al mejorada por la energa de resonancia de fluorescencia

.igura 7%. !acific >ioSciences. Secuenciacin en @iempo -eal.

Genoma de enri6uecimiento

) pesar de las reducciones de costes sustanciales asociados con tecnologas NG% -Ne+t
Generation %e6uencing. en comparacin con el mtodo automatizado de Sanger, la
secuenciacin del genoma completo es todava un esfuerzo costoso. 1na solucin provisional a
este problema puede ser el uso de plataformas de *#S para apuntar a regiones de inters
especficas. 2sta estrategia se puede utilizar para e+aminar todos los e+ones en el genoma, genes
especficos de las familias que constituyen dianas farmacolgicas conocidas o las regiones que
estn implicados en enfermedades o en efectos farmacogenticos.
35

2l concepto de focalizacin de regiones especficas del genoma est bien establecido,
con la !=- es el ms ampliamente utilizado, aunque en una escala peque<a. !=- acoplado con
secuenciacin de Sanger est adecuadamente emparejado para analizar unos cuantos
candidatos genes, pero el acoplamiento de la !=- con las plataformas *#S de alto rendimiento
no es prctico porque la preparacin de la muestra requerira el manejo de decenas de miles de
cebadores de forma individual o en grupos multiple+.
1n artculo de .razer y sus colegas en colaboracin con -ain$ance @ec6nologies ,5((&/
informaron la amplificacin simultnea de 7.&?I productos que utilizan tecnologas de microgotas
!=-.
La produccin de grandes cantidades a ,a#o costo /ace 6ue las plataformas de NG%
descritas anteriormente sean 3tiles para muc/as aplicaciones0 2stos incluyen el descubrimiento de
la variante por resecuenciacin de regiones especficas de inters o genomas en su totalidad, el
asamblado de novo de bacterias y de genomas eucariotas menores, la catalogacin de los
transcriptomas de clulas, tejidos y organismos ,)-*:seq/, los perfiles en todo el genoma de las
marcas epigenticas y la estructura de la cromatina usando mtodos basados en la seq ,=A"!:
seq, metil:seq y )$*sa:seq/ y la clasificacion de especies y el descubrimiento de genes pora
estudios de la metagenmica.
!or ejemplo, las plataformas "lluminaFSole+a y L"feF)!# son variantes muy adecuadas para
el descubrimiento de resecuenciacin de genomas 6umanos, porque se producen por ciclo
vol0menes gigantescos de bases de alta calidad.
)dems, la plataforma, Aelicos >ioSciences es muy adecuado para aplicaciones que
e+igen informacin cuantitativa de )-* o )-* seq.
2l rpido ritmo de los avances tecnolgicos en el campo podra cambiar esta informacin
en un futuro pr+imo.

Genomas individuales

Los estudios del genoma 6umano tienen por objeto un catlogo de S*QS ,variante de un
simple nucletido/ y la SQS ,variantes estructurales/ y su asociacin a diferencias fenotpica, con el
objetivo final de personalizar la genmica con fines mdicos. 2n 5((8, el =onsorcio "nternacional
de Secuenciacin del #enoma Aumano public la primera, y todava 0nica, referencia terminada
del genoma 6umano ,actualmente =entro *acional de >iotecnologa de la "nformacin: *=>"/. Su
costo fue estimado en 1S W7(( millones.
La genmica individual tambin est siendo aplicada al estudio de la enfermedad. !or
ejemplo, 4ardis et al., reportaron la secuencia de dos genomas del cncer de leucemia mieloide
agudo mediante la plataforma "lluminaFSole+a, y ambos estudios, identificaron mutaciones
somticas que pueden ser asociada con la enfermedad. #ibbs et al., describieron recientemente
36

la elucidacin de las dos variantes allicas en una familia con una forma recesiva de la
enfermedad de =6arcot:4arie:@oot6 utilizando la plataforma LifeF)!#.
Qarios proyectos destinados a la secuenciacin de ms individuos, incluyendo el B)tlas del
genoma del cncerC y B2l proyecto de %((( #enomasC, tambin estn utilizando las plataformas
"lluminaFSole+a y LifeF898 para secuenciar genomas enteros.
2n comparacin con la secuenciacin automatizada de Sanger, las plataformas de *#S
6an aumentado dramticamente el rendimiento y redujo sustancialmente los gastos, con varios
grupos presentando informes de costos de reactivos por debajo de W%((.(((. Sin embargo, e+iste
una gran variabilidad entre y dentro de plataformas *#S en trminos de tama<o del molde y
construccin, largo de lectura, rendimiento y la base y la cobertura del genoma, y dic6a
variabilidad 6ace que sea difcil evaluar la calidad ,es decir, la precisin de la cobertura del
genoma y continuidad del genoma/ de los genomas basado en consideraciones de costo.
2n junio de 5((&, "llumina anunci la secuenciacin del genoma individual por el precio de
1SW 8'.(((. =omplete #enomics ofrece un servicio similar a un precio de 1SW 9.(((. Sin embargo, el
logro del a6orro de los costos tambin puede venir con una disminucin de la calidad de la
informacin.
as tecnolog$as de NG% tienen una impresionante gama de aplicaciones, y actualmente se
est2n desarrollando a3n m2s0 )dems de las aplicaciones descritas anteriormente, las tecnologas
de *#S estn siendo utilizadas para caracterizar las relaciones evolutivas de genomas antiguos y
para dilucidar el papel de secuencias no codificantes en la salud y enfermedades. 2n un futuro no
muy lejano, es previsible que las tecnologas de *#S pudieran ser utilizadas para obtener datos de
alta calidad a partir de la secuencia un genoma aislado de una sola clula, lo que sera un
avance importante, sobre todo para la genmica del cncer. !ara que esto ocurra, sern
necesarios avances en las tcnicas, para aislar eficazmente largas molculas de )$* intactas, y
en los mtodos, para la lectura precisa de la secuencia. 2l campo del desarrollo de *#S y las
aplicaciones es un rea de rpido movimiento de la investigacin, que 6ace de este un momento
emocionante para los estudios genmicos.

An2lisis de las secuencias de A4N

)dems de la clonacin y amplificacin las tcnicas moleculares se utilizan para analizar
las molculas de )$* mediante la secuenciacin.
%ecuenciacin del A4N: una tcnica poderosa que surge de la tecnologa del )$* recombinante
es la capacidad de secuenciar con rapidez las molculas de )$*. La secuenciacin consiste en
determinar la secuencia de bases, permite leer la informacin brindando informacin acerca de
la estructura y funcin de los genes.


37

Aplicaciones de la tecnolog$a del A4N recom,inante

)dems de proporcionar informacin valiosa sobre los genes la @ecnologa del )$*
recombnate tiene numerosas aplicaciones como la elaboracin de productos farmacuticos
,insulina/, y otras sustancias, bacterias especializadas ,como produccin de etanol a partir de
plantas/, plantas y animales de granja dise<ados por ingeniera gentica y para corregir defectos
genticos 6umanos. )lgunos frmacos oligonucletidos ,secuencias cortas de )$* sinttico o de
)-* pueden utilizarse para tratar enfermedades ,terapia gnica/. Los oligonucletidos antisentido
son complementarios a los )-* no deseados, como el )-* viral. =uando se agrega a una clula,
estos )$* antisentido se unen al )-*m viral e in6iben su traduccin. Qarios frmacos 6an sido
probados para diferentes tratamientos para el cncer.
@ambin 6a permitido el desarrollo de sondas para detectar mutaciones causantes de
enfermedades. Se dispone de la comprobacin prenatal para varios centenares de
enfermedades genticas. !ara muc6as enfermedades genticas las 0nicas pruebas diagnsticas
disponibles son las que identifican una mutacin predisponerte en el )$*, pero muc6as
enfermedades genticas son provocadas por varias mutaciones diferentes y derivar en resultados
pueden ser falsos Salvo la completa secuenciacin del gen que es costosa no 6ay manera de
identificar a todos los individuos predispuestos.
2n la terapia gnica deban primero localizarse los genes causantes de enfermedades y
desarrollarse vectores. 1n mtodo de terapia consiste e+traer clulas del cuerpo agregar los virus
con los genes recombinantes e reintroducir las clulas en el cuerpo del paciente. 2n este caso los
vectores se introducen directamente.
.igura 75. 2volucin de proyectos y publicaciones
38

Generalidades del an2lisis genmico

Los proyectos genoma generan grandes cantidades de informacin sobre la secuencia
del )$*. 2stos datos son 0tiles slo cuando son analizados. !ara identificar y caracterizar las
regiones codificantes de los genes de las secuencias annimas de )$* se necesitan diversos tipos
de anlisis mediante la utilizacin de programas y bases de datos, como por ejemplo:
)segurar que la secuencia est completa y es precisa.
"dentificar los genes encontrando las pautas de lectura abiertas ,*'!H *pen 'eading
!rames/. 2mpiezan con una secuencia de iniciacin: )@# y terminan con una secuencia
de terminacin: @)), @)# o @#).
2ncontrar los sitios promotores de inicio de transcripcin y de traduccin.
2ncontrar los sitios de empalme, los intrones y los e+ones.
@raducir la secuencia de )$* en una secuencia proteica y compararla con otras protenas
conocidas.


.igura 77. Sitios de empalme,
intrones y e+ones.








!ara asegurar que la secuencia nucleotdica de un genoma est completa y no contiene
errores, el genoma se secuencia ms de una vez. 2ste proceso se denomina compilacin.
1na vez secuenciado, compilado y comprobado la e+actitud de un genoma, se realiza
una b0squeda de todos los genes que codifican productos ,protenas y )-*/ formados por una
pauta de lectura abierta, tripletes nucleotdicos que se pueden traducir en la secuencia
aminoacdica de una protena. 2ste es el primer paso de la anotacin, el proceso que identifica
los genes, sus secuencias reguladoras y su funcin o funciones. La anotacin tambin identifica los
genes que no codifican protenas y encuentra y caracteriza los elementos genticos mviles y las
familias de secuencias repetitivas.

El o,#etivo final del an2lisis de la secuencia es o,tener una descripcin funcional completa
de todos los genes del genoma de un organismo0
39

GENMICA !(NCI*NA

La Genmica !uncional clasifica los genes de las secuencias dilucidadas por la #enmica
2structural e identifica sus funciones.
)lgunos genes pueden tener funciones previamente asignadas mediante los mtodos
clsicos de mutagnesis y de cartografa de ligamientoK pero muc6os genes no tienen a0n una
funcin asignada.
La genmica funcional es el estudio simult2neo de todos los genes involucrados en un
estado fisiolgico determinado o en un te#ido en particular0
!ermite comprender la organizacin y los mecanismos genticos que en conjunto 6acen a
la fisiologa de un organismo.
a secuencia de nucletidos de un gen puede utilizarse para predecir la secuencia de
amino2cidos de la prote$na 6ue codifica0 2ntonces, la protena puede sintetizarse o aislarse y
estudiarse sus propiedades para determinar su funcin. Sin embargo, este enfo6ue ,io6u$mico
para la comprensin de la funcin gnica insume tiempo y es costoso0 1n objetivo fundamental
de la genmica funcional fue desarrollar mtodos informticos que permitan identificar la funcin
gnica a partir de la secuencia de )$* sola, evitando el proceso laborioso de aislar y caracterizar
las protenas individuales.
$espus de obtener una secuencia genmica, la siguiente tarea es asignar funciones a los
genes de la secuencia. )lgunos genes pueden tener funciones previamente asignadas mediante
los mtodos clsicos de mutagnesis y de cartografa de ligamientoK pero muc6os genes no
tienen una funcin bien dirigida asignada.
1na apro+imacin para asignar funciones a estos genes es la utilizacin de ,3s6ueda de
/omolog$a0 2ste anlisis tiene diversos componentes: b0squeda en bases de datos como #en>anL
para encontrar genes parecidos aislados en otros organismos, comparar la secuencia de un 3-.
con la de un gen bien caracterizado de otro organismo, rastrear el 3-. en busca de motivos
funcionales, regiones del )$* que codifican dominios proteicos como canales de iones, regiones
de unin a )$* o se<ales de secrecinFe+portacin.

Aplicaciones de la genmica funcional

=aracterizar transcriptomas especfico de tejidos.
$eterminar patrones de e+presin gnica asociados a procesos celulares tales como
diferenciacin, proliferacin y muerte celular.
2studiar las alteraciones en los perfiles de e+presin asociados a procesos patolgicos
,infeccionesK carcinognesis, etc./
2fectuar inferencias funcionales de genes escasamente caracterizados.
40

!redecir redes BsocialesC de genes estrec6amente relacionadas con procesos biolgicos
especficos.

$esde el advenimiento de la genmica moderna, se 6an desarrollado diversas tecnologas
de gran cantidad de datos que permiten a los investigadores analizar las interacciones genticas
de miles de genes simultneamente. 2stas tecnologas incluyen de )$* y de e+presin proteica,
mtodos automatizados para el aislamiento y la diseccin de grandes complejos proteicos y
b0squedas de alcance genmico de sitios de interaccin protena:$*). $ado que estas tcnicas
se basan en la abundancia de datos proporcionados por la terminacin de los proyectos de
secuenciacin del genoma, a menudo se denominan tcnicas de genmica funcional.

Mtodos de an2lisis de la Genmica !uncional o &ranscriptmica

*ort6ern >lot
!=- cuantitativa
Aibridacin substractiva
$ifferential display
4icroarrays ,4icroarreglos de )$*/
S)#2
DD:seq: -*):Seq, =6l:Seq, =Q*:Seq.

Nort/ern Nlot

2s una tcnica para
transferir fragmentos de A'N
desnaturalizados provenientes
de un gel a un medio slido. 2l
)-* es separado en un gel de
agarosa, y posteriormente
transferido a una membrana
de nylon. $espus de la
transferencia, se agrega una
sustancia marcada para
permitir la visualizacin de los
genes.

.igura 78. @cnica de *ort6ern >lot.

41

"C' cuantitativa o "C' en tiempo real

)l igual que la !=- convencional, se utiliza un molde de )$*, cebadores especficos, d*@!
y una )$* polimerasaK a esto se le adiciona una sustancia marcada con fluorforo.














La !=- cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de 6acer incidir sobre
cada muestra un 6az de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia
emitida por el fluorforo e+citado.

&a,la <0 4iferencias entre "C' convencional y "'C en tiempo real0

"C' en &iempo 'eal "C'
Sensibilidad )lta >aja
2specificidad )lta >aja
-esultados =uantitativos Si H .luorescentes especficos *o
4todo de deteccin .luorescencia
2lectroforesis en gel de
agarosa
-ango de deteccin )mplio rango !eque<o rango
@iempo de reaccin % 6s 7:9 6s
!asos !ost:!=- *o
2lectroforesis en gel de
agarosa
=ontaminacin *o Si


1i,ridacin %u,stractiva y 4ifferential 4isplay

@anto la 6ibridacin substractiva como el $ifferential $isplay son tcnicas comparativas
que no re6uieren conocimiento previo de los genes involucrados pero es necesario el clonado y
secuenciacin para la identificacin de los genes e+presados diferencialmente.

.igura 79. !=- en @iempo
-eal. ) diferencia de la
!=- convencional, los
ciclos se observan desde
el inicio.
42























Microarrays, Microarreglos o microordenaciones de A4N -c/ips de A4N.

Se utilizan para e+aminar la e+presin de miles de genes simult2neamente. Los
microarreglos de )$* son simplemente trozos de vidrio ,c6ips/ sobre los que se aplican nuestras de
)$* siguiendo un patrn ordenado, es decir, una ordenacin. ) menudo estas
microordenaciones son producidas por mquinas automticas que ponen gotas microscpicas
de muestras especficas de )$* en posiciones especficas del c6ip. Las muestras de )$* que se
pueden aplicar pueden ser cualquier tipo de )$* clonado, pero a menudo son oligonucletidos
cortos sintetizados in vitro.
2n un microarreglo de )$* se pueden aplicar ms de 7(.((( muestras diferentes, lo que
representa miles de genes distintos. @ericamente, todos los genes del genoma de un organismo
pueden estar presentes en un microarreglo, lo que permite el anlisis de la e+presin gentica de
todo el genoma.
Los microarreglos de )$* se pueden usar para comparar los patrones de e+presin
gentica en dos o ms tejidos diferentes, en un mismo tejido en dos momentos diferentes del
desarrollo, o en clulas normales respecto de enfermas.



; <
.igura 7I. E+presin diferencial de genes0
%:Aibridacin substractiva.
5. $ifferential $isplay. Se e+presan y comparan
como porcentaje muestras de m-*) en el rumen ,%/
y abomaso ,8/ a las 7 y %7 semanas de edad y
adultos ,%' : a 5( meses de edad/ en ganado
Aolstein.
43































An2lisis en %erie de la E+presin Gnica -%AGE.

!ermite conocer y cuantificar la e+presin de genes en la clula o tejido mediante la
medicin de los )-*m que estn presentes en un momento determinado. 2sto permite crear
perfiles de e+presin de cada clula o tejido en determinadas situaciones. $e esta manera se
pueden comparar estos perfiles y determinar que genes estn siendo apagados o activados y as
determinar cual puede ser la causa.
La base de esta tcnica esta en el uso de BtagsC de )$*c que son peque<os fragmentos
de )-*m que 6an sido transformadas a )$*c. Se parte de una muestra de )-*m y
.igura 7?. 4icroarrays.

=0 &ranscri,e el A'Nm en A4N
complementario m2s esta,le y aIade
eti6uetas fluorescentes verde a A4Nc
derivado de las clulas no tratadas, y de
color ro#o a los clulas tratadas0

>0 %e aplica la eti6ueta de A4Nc al c/ip,
la unin ocurre cuando se encuentra con
una secuencia complementaria de
,ases del c/ip0
@0 %e pone el c/ip en un esc2ner y
con c2lculos computacionales se
estiman las tasas de ro#o a verde0

A0 %e determina si alg3n gen respondi
fuertemente a la droga para promover o refle#ar
los daIos0
;0 %e construye o compra un
microarray o c/ip, 6ue contiene el
A4N de cadena simple 6ue
representa miles de genes
diferentes0

<0 %e o,tienen dos muestras de
clulas, luego de aplicar la droga a
una muestra y se recogen las
molculas de A'Nm0
44

aprovec6ando la caracterstica del )-*m de tener una cola de adeninas en el e+tremo 7X ,poli
)/, se utiliza un soporte con colas de timinas para provocar la unin de los )-*m al soporte. 2stas
timinas cumplen la funcin de primers para poder sintetizar )$*c a partir del )-*m por medio de
una transcriptasa inversa. Se corta el )$*c a una distancia determinada a partir del soporte de
timinas por medio de una enzima de restriccin, dejando e+tremos ad6esivos en el sitio de corte.
2n el e+tremo ad6esivo se une una molcula llamada BlinLerC que posee una enzima de
restriccin tipo "" que corta nuevamente el )$*c, esta vez dejando un e+tremo romo. )qu se
obtiene por primera vez un BtagC de )$* ,)-*m/, unido a las secuencias que 6an permitido
6ibridaciones. $os tag para formar un BditagC, es decir, dos tags junto a dos molculas linLers.
!osteriormente se procede a amplificar por !=- para obtener mayor cantidad de ditags y
favorecer la secuenciacin.
Los ditags se cortan con la primer enzima de restriccin para eliminar los linLers y dejar a los
ditags puros y con un e+tremo ad6esivo, permitiendo la unin de estos a una gran 6ebra de )$*c
,ditags/ o concatenado de )$*c. Yste concatenado se pasa luego a un vector de clonamiento
para obtener m0ltiples copias. !or 0ltimo se procede a secuenciar este concatenado de ditags,
identificando cuantos tags 6ay en total de cada )-*m, y se procede a identificar qu protena
codifican, mediante el uso de una base de datos.




















.igura 7'. S)#2. Luego de la obtencin de los ditaq se realiza clonado, secuenciacin y anlisis
bioinformtico.
45









.igura 7&. =omparacin de las secuencias de los @ag con bases de datos especficas como S)#2 #enie
donde ya se encuentran mapeados los tags con sus respectivos genes y permite la identificacin y
caracterizacin de los transcriptos

A'NG%e6
.igura 8(. )-*:Seq. Secuenciacin de 0ltima generacin aplicada al anlisis de transcriptomas.
46

2l )-*:Seq se refiere al uso de la secuenciacin de 0ltima generacin aplicada al anlisis
de transcriptomas. !uede realizarse utilizando distintas plataformas: "lumina, -oc6e, Solid.
"ndependientemente de la plataforma utilizada la informacin obtenida es la misma. !ermite
obtener informacin, por ejemplo, como lo diferentes alelos de un gen se e+presan, detectar
mutaciones post:trascriptacional o identificar las funciones de genes. )-*:Seq proporciona una
medicin muc6o mas precisa de los niveles de transcriptos y sus isoformas que otros mtodos.
La secuenciacin a gran escala llevada a cabo en los proyectos genoma constituye la
base de partida de la genmica funcional, que tiene como objetivo la caracterizacin del
proteoma, esto es el conjunto completo de genes que determinan protenas en un genoma, y la
caracterizacin de los patrones de e+presin gnica. 2n la actualidad se dispone de numerosas
estrategias para identificar el conjunto de genes funcionalmente activos como los microarreglos
de )$*, S)#2 y mas recientemente la secuenciacin de alto rendimiento.


47

GENMICA C*M"A'A&I9A

La #enmica =omparativa, un nuevo campo de la biologa que se desarrolla con rapidez,
compara directamente la informacin gentica de un organismo con la de otro. 2s un campo con
muc6as aplicaciones tanto en ciencia bsica como aplicada, incluyendo el descubrimiento de
genes, el desarrollo de organismos modelo para enfermedades 6umanas y animales, la
elucidacin de la 6istoria evolutiva entre los genes, genomas y especies, y la relacin entre los
organismos y su ambiente.
a Genmica Comparativa usa una amplia gama de tcnicas y recursos, incluyendo la
construccin y utilizacin de bases de datos que contengan secuencias nucleotdicas y
aminoacdicas, tcnicas citogenticas de cartografa gnica como /i,ridacin in situ fluorescente
-!I%1., y mtodos e+perimentales, como mutagnesis. La genmica comparativa utiliza estos
recursos para identificar las semejanzas y las diferencias genticas entre organismos, para
determinar como estas diferencias contribuyen a las diferencias fenotpicas, de ciclo vital, y para
verificar la 6istoria evolutiva de estas diferencias genticas.
2l anlisis de un n0mero cada vez mayor de secuencias genmicas confirma que todos los
seres vivos estn relacionados y descienden de un ancestro en com0n. @odos los organismos
utilizan grupos gnicos parecidos para realizar las funciones celulares bsicas, como la replicacin
del )$*, la transcripcin y la traduccin. ) partir de los organismos modelo se pueden comparar
estas funciones bsicas para estudiar enfermedades 6ereditarias y analizar la interaccin entre los
genes.
!ara estudiar las /omolog$as entre genomas de especies diferentes se usa el pintado
cromosmico comparativo que utiliza sondas marcadas con fluorescencia de una especie e
6ibridando sobre los cromosomas de otra especie.

.igura 8%. Los genes ortlogos son aquellos
que descienden de un gen ancestral com0n
que tienen la misma funcin en diferentes
especies. Las protenas que surgen a partir de
la duplicacin de un 0nico gen se
denominan parlogas.

$efinir el n0mero mnimo de
genes para la vida es una tarea que
implica mtodos comparativos y
e+perimentales. La apro+imacin
comparativa se basa en la premisa que
es probable que los genes compartidos
48

por organismos alejados sean esenciales para la vida. =omparando los conjuntos de genes
compartidos por organismos diferentes sera posible catalogar los compartidos y desarrollar una
lista de genes que se consideraran indispensables para la vida.
Los genes ortlogos son aquellos que descienden de un gen ancestral com0n que tienen la
misma funcin en diferentes especies. )s por ejemplo Mycoplasma genitalium comparte 58(
genes ortlogos con aemophilus influenzae adems se identificaron %I genes cuyas secuencias
son diferentes pero realizan la misma funcin. Mycoplasma genitalium tiene un genoma con 8'(
genes que codifican protena, lo que representa el genoma bacteriano mas peque<o de entre los
casi %9( genomas secuenciados 6asta la fec6a.
Los genes que pertenecen a familias multignicas comparten secuencias de )$* similares
pero no idnticas como resultado de una mutacin en linaje con un 0nico gen ancestral. Sus
productos a menudo son diferentes con funciones parecidas pero sus genes no siempre se
encuentran en una misma localizacin del cromosoma.
Las familias multignicas permiten aportan conocimientos sobre la evolucin del genoma.
as prote$nas 6ue surgen a partir de la duplicacin de un 3nico gen se denominan par2logas0 La
familia de la globina es un ejemplo de familia multignica parloga que surgi por duplicacin y
dispersin a diferentes sitios cromosmicos.
Las familias multignicas estn presentes en muc6os genomas. )dems de las amplias y
grandes mutaciones de los genes peque<os bloques de genes pueden duplicarse mediante
diversos mecanismos. La filogenia molecular 6a trazado el linaje y las relaciones entre los miembros
de las familias gnicas. 1no de los ejemplos mejor estudiados de divergencia es la superfamilia
gnica de las globinas. 2n esta familia 6ace '(( a<os se produjo la duplicacin de un gen
ancestral que codificaba a una protena de transporte de o+geno. $e los dos genes generados,
uno evolucion 6asta la mioglobina actual y el otro en el gen de la globina ancestral el que se
duplic y form los prototipos de las subfamilias gnicas de la y globina. 3tros patrones se
observan en otras familias gnicas las que son intensamente estudiadas en el genoma 6umano.
=omo se observa en la figura 85, en la regin media del cromosoma I bovino ,>@)I/ se
6an mapeado diferentes U@L asociados a rasgos fenotpicos como produccin de lec6e,
conformacin y rasgos funcionales en animales de tambo y composicin corporal y crecimiento
en animales de cra. 2n >@)I, la proporcin de los genes de la especie bovina que se 6an
asignado es relativamente peque<a y se distribuye de manera desigual. 2studios comparativos del
mapeo cromosmico de alta resolucin combinados con la informacin de las secuencias
nucleotdicas pueden ser utilizado para detectar la posicin y funcin, dentro de regiones del
cromosoma, de genes candidatos polimrficos que afectan variables fenotpicas de importancia
econmica y fisiolgica en bovinos. La alineacin comparativa de las secuencias de los
cromosomas ortlogos 6umanos, de ratn, de gallina y de perro con la secuencia bovina permiti
enriquecer mapas previos del cromosoma >@)I determinando loci nuevos. 1tilizando el anlisis de
-A, incluyeron un total de I7 nuevos genes y 2S@ con precisin en relacin con la posicin de los
49

loci conocidos, por lo tanto, aumentaron la densidad de los genes y 2S@s integrados en el mapa
de >@)I.
.igura 85. 4apeo comparativo entre cromosomas de pollo, bovino, 6umano, ratn y perro.


50

A "'*&EMICA

2sta rama se ocupa de Identificar y analizar las prote$nas de una clula0 2l !roteoma define
el con#unto completo de prote$nas codificadas por un genoma0
2n la mayora de los genomas secuenciados se desconoce la funcin de muc6os de los
genes recin descubiertos. 4uc6as veces se le asigna una funcin por su 6omologa con genes
conocidos. 2n E coli y ! cerevisiae se desconoce la mayor parte de la funcin de los genes
codificados al igual que en 6umanos.
) medida que se dispone de ms datos de las secuencias de los eucariotas se 6ace
evidente que su complejidad no esta necesariamente correlacionada con la cantidad de genes.
!or ejemplo $rosop6ila tiene menos genes que C. elegans pero no es menos complejo que el
nemtodo. La relacin entre gen y producto gnico es compleja. Los genes pueden tener sitios
m0ltiples de inicio de la transcripcin que produce varios transcriptos distintos. 2l corte y empalme
alternativo y la edicin de las molculas generan docenas de protenas diferentes a partir de un
0nico gen. 2n 6umanos se estima que el 8( H I(; producen ms de una protena por ese motivo.
2l anlisis de la funcin proteica se ve dificultado por el 6ec6o de que muc6as protenas trabajan
va interacciones protena H protena o como parte integrante de un gran complejo molecular.
a protemica se utiliza para reconciliar las diferencias entre el n3mero de genes de un
genoma y el n3mero de prote$nas ,producto final/ observadas en la clula. !roporciona
informacin sobre la funcin de las protenas, su estructura, las modificaciones post:
traduccionales, las interacciones protenicas sus variantes y las relaciones con otras protenas del
genoma.
La protemica utiliza tcnicas para separar e identificar las protenas aisladas. La
combinacin de tcnicas implica un gel de electroforesis bidimensional ,5$#2/ y espectrometra
de masas. 2n la primera las protenas e+tradas de una clula se cargan en un gel de
poliacrilamida y se separa seg0n su carga elctrica. 2l gel se rota &(M y las protenas se separan
seg0n su peso molecular. Las modernas tcnicas de espectrometra de masas permiten
determinar con precisin la masa de molculas. 1no de estos mtodos se denomina ionizacin
por lser asistida por matriz ,4)L$"/. Se pueden identificar cientos de protenas por da y los
bancos de espectrmetros pueden procesar cientos de muestras en un solo da. Nuevos
instrumentos se est2n desarrollando para el procesado de muestras con m2s rapidez, sensi,ilidad
y precisin0