MICROSCOPIO

1. Objetivo:
Conocer el manejo del microscopio ptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de microbiologa.
Reconocer a travs de la observacin microscpica la existencia de microorganismos en diversos
materiales biolgicos.
Reconocer la importancia del microscopio en el desarrollo de las ciencias biolgicas.
Identificar al microscopio diferentes morfologas bacterianas y sus caractersticas tintoriales.
2. Fundamento terico:
Durante mucho tiempo se sospech la existencia de organismos muy diminutos, que no podan ser
observados a simple vista, por ello su descubrimiento est relacionado con la invencin del
microscopio. Si bien es cierto que Robert Hooke observ clulas muertas (Observacin del corcho)
y Malpighi observ clulas vivas, el holands Antonie van Leeuwenhoek fue la primera persona que
vio microorganismos con detalle, utilizando microscopios simples de fabricacin propia, a pesar que
su equipo era bastante primitivo comparado con los actuales, fue capaz de ver microorganismos
tan pequeos como los procariotas, debido a su cuidadosa manipulacin y buen enfoque.
Leeuwenhoek es considerado fundador de la bacteriologa a pesar de no haber recibido ninguna
preparacin cientfica, describi sus observaciones en una serie de cartas dirigidas a la Royal
Society de Londres, publicada en ingles en 1684.





Existen
dos tipos
de
microscopios:

1. Microscopio ptico: Es
a). Microscopio de Antonie van Leeuwenhoek. b).Ciclo vital de la boruga dibujado por
Leeuwenhoek. c). Bacterias o animculos como las llam Leeuwenhoek . Cocos, espirilos, bacilos.
a
)
b
c
un instrumento cuyo funcionamiento se basa en las leyes de la ptica fsica y geomtrica. Este a
su vez comprende el microscopio simple, el cual slo utiliza una lente de aumento montada en
un soporte adecuado para su uso, y el microscopio compuesto el cual combina dos o ms
lentes para generar aumentos mayores, a lo largo del informe desarrollaremos ms sobre el
microscopio compuesto puesto que es el microscopio ms utilizado.

Las observaciones efectuadas por los microscopios se realizan por transparencias (la luz
atraviesa el objeto observado) y no por reflexin que es como estamos acostumbrados, por ello
las muestras a observar deben ser lminas lo suficientemente finas (10 m como mximo)
como para que la luz pueda atravesarlas. Para obtener estas lminas se utilizan unos aparatos
denominados micrtomos.

La materia viva es en general muy transparente a la luz visible, por lo que las imgenes
obtenidas ofrecen muy poco contraste. Con el objeto de aumentar el contraste de las
preparaciones microscpicas se utilizan tcnicas de tincin, que consisten en el uso de
diferentes colorantes que se fijan de manera selectiva a las diferentes estructuras celulares.

El poder de resolucin del microscopio ptico es en el mejor de los casos de unas 0,2 m, por
tanto si se quiere observas objetos ms pequeos se hace necesario el uso del microscopio
electrnico.

Microscopio compuesto: El microscopio compuesto se utiliza para examinar objetos muy
pequeos situados a distancias muy cortas. En su forma ms simple est formado por dos
lentes convergentes, para su explicacin nos ayudaremos del grfico: la lente ms cercana al
objeto (O
1
), denominada objetivo, forma una imagen real O
2
, invertida y mayor que el objeto.
La lente ms prxima al ojo, denominada ocular, se utiliza como una simple lupa para observar
la imagen O
2
formada por el objetivo. El ocular se coloca de tal forma que la imagen O
2
formada
por el objetivo caiga en el punto focal del ocular. En consecuencia, la luz emerge del ocular en
forma de haz paralelo como si procediese de un punto situado a una gran distancia delante de
la lente produciendo una imagen final O
3
, que aparece invertida con respecto al objeto O
1
y de
mucho mayor tamao.

























Los microscopios pticos, especficamente los microscopios compuestos cuentan con tres
sistemas: sistema mecnico, sistema ptico y sistema de iluminacin.

Sistema mecnico: Este sistema sostiene al sistema ptico y aloja los elementos
necesarios para la iluminacin y enfoque del preparado.

Pie base o soporte basal: Constituye la base
sobre la que se apoya el microscopio y tiene por
lo general forma de Y o bien es
rectangular, es maciza y pesada para asegurar
la estabilidad del aparato y servir de soporte a
sus dems partes.

Platina: Pieza metlica redonda o cuadrada
donde se colocan las preparaciones; tiene en
el centro una abertura circular por la que pasan
los rayos luminosos procedentes del sistema
de iluminacin.

Tubo: Tiene forma cilndrica y est ennegrecido internamente para evitar los reflejos
de la luz. En su extremidad superior se colocan los
oculares y en el extremo inferior el revlver de objetivos.
El tubo se encuentra unido a la parte superior de la
columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales
permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.

Revlver: Es una pieza giratoria provista de orificios
en los que se enroscan los objetivos. Al girar el
revlver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se
colocan en posicin de trabajo.


Columna o brazo: Tambin llamado soporte vertical, es una pieza en forma de C,
unida a la base por su parte inferior mediante una charnela, permitiendo la
inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan los espejos; y
sostiene el tubo en su porcin superior. Es la parte por la cual debe asirse el
microscopio para movilizarlo.

Carro o escuadra: Es un dispositivo que consta de dos tornillos y est colocado sobre
la platina, que permite deslizar la preparacin con movimiento ortogonal de adelante
hacia atrs y de derecha a izquierda.

Pinzas: Son dos piezas metlicas que sirven para sujetar la preparacin. Se encuentran
en la platina.

Tornillo macromtrico: Girando este tornillo el tubo del microscopio se desliza en
sentido vertical gracias a un mecanismo de
cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque
rpido de la preparacin.

Tornillo micromtrico: Mediante el ajuste fino con
movimiento casi imperceptible que produce al deslizar
el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y ntido
de la preparacin. Lleva acoplado un tambor
graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza
para precisar sus movimientos y puede medir el espesor
de los objetos.

Sistema ptico: Es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el
conjunto de lentes que lo componen.

Objetivos: Se disponen en una pieza giratoria
denominada revlver y producen el aumento
de las imgenes de los objetos y
organismos, se hallan cerca de la
preparacin que se examina. Los objetivos
utilizados corrientemente son de dos tipos:
objetivos secos y objetivos de
inmersin.

Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos
y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el
aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un
objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es
planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una
longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de
microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms
frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.

El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes.
Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de
cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en
contacto con el aceite de cedro. El aceite permite que entre ms luz al objetivo.
Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o
anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Oculares: Estn formadas por dos lentes
separadas por un diafragma, la lente
superior se llama ocular y la inferior lente
de campo, y se encuentra situado en la
parte superior del tubo. Su nombre se
debe a la cercana de la pieza con el ojo del
observador. Tiene como funcin aumentar la
imagen formada por el objetivo. Los oculares
son intercambiables y sus poderes de
aumento van desde 5X hasta 20X. Existen
oculares especiales de potencias
mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la
finalidad de medir el tamao del objeto observado.

Sistema de iluminacin: Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial
de tal manera que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio
de la manera adecuada.

Diafragma: Va montado bajo la platina y permite graduar la fuente luminosa; el ms
usado es el tipo iris accionable mediante manecilla lateral.

Condensador: Est formado por un sistema de
lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos
luminosos sobre el plano de la
preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del
objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es
generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la
preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliacin);
existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio
entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del
condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr
aprovechar todo su poder separador.

Espejo: Necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del
microscopio y ya alineada con el sistema ptico (como suele ocurrir en los
microscopios modernos). Presenta dos caras: una cncava y otra plana, la cara
cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial y la plana, para natural
(luz solar). Goza de movimientos en todas las direcciones.

Fuente de iluminacin: Se trata clsicamente de una lmpara incandescente de
tungsteno sobrevoltada.





2. Microscopio electrnico: La ley fsica nos dice que
no se pueden obtener imgenes de un objeto cuyo tamao sea inferior a la longitud de onda de
la radiacin electromagntica utilizada para generar dichas imgenes; por tanto, dado que el
microscopio ptico utiliza la luz del espectro visible, no cabe esperar que los avances
tecnolgicos permitan en el futuro disear microscopios pticos con un mayor poder
resolutivo. Estas consideraciones condujeron, en la dcada de los aos 30 del siglo XX, a la
invencin de un dispositivo, el microscopio electrnico, que en lugar de luz visible utiliza haces
de electrones acelerados. Los electrones llevan asociada una longitud de onda
considerablemente ms pequea que la de la luz visible, lo que permite obtener imgenes con
un poder de resolucin mucho mayor y discernir por lo tanto objetos mucho ms pequeos
(del orden de unos pocos nanometros).

Un microscopio electrnico, funciona con un haz de electrones generados por un can
electrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo
ello al alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la
muestra (debidamente deshidratada) y la amplificacin se produce por un conjunto de lentes
magnticas que forman una imagen sobre una placa fotogrfica o sobre una pantalla sensible al
impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los
microscopios electrnicos slo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz,
pero se le pueden dar colores en el ordenador.


















La observacin microscpica puede realizarse a partir de una muestra (examen directo) o bien a
partir de cultivos y segn como se haga la preparacin se pueden clasificar en:
Examen al Fresco (Microorganismos vivos). Se utiliza normalmente para ver movilidad de las
bacterias. En el caso de hongos y protozoos, permite determinar adems caractersticas
morfolgicas.

Frotis Fijado (microorganismos muertos). Este mtodo permite observar con mayor precisin
detalles morfolgicos y de agrupacin de los microorganismos.

En la preparacin de la muestra por frotis fijado, se presenta cierta dificulta puesto que muchas de
las bacterias son prcticamente incoloras debido a que no presentan suficiente contraste con el
medio acuoso donde se encuentran suspendidas, por ello se tien generando gran contraste con
respecto al medio que les rodea; las principales ventajas de las tcnicas de tincin son:

Observar ms adecuadamente su morfologa (observar la presencia de determinados
constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.)

Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo que permitir diferenciar
distintos tipos morfolgicos: cocos, bacilos, espirales, etc.

Establecer una informacin complementaria sobre sus estructuras internas y externas que no
podran ser observadas por examen en fresco.

Conocer sus caractersticas tintoriales orientndonos hacia un grupo taxonmico u otro de
clasificacin bacteriana.
3. Procedimiento:
Reconocer todas las partes importantes del microscopio mecnico.
Busque el objetivo de menor aumento, 10 X y pngalo en el tope del revolver; el objetivo har su
ruido caracterstico al estar en posicin correcta
Acomode la cara del espejo (plana para luz natural y cncava para luz artificial), a fin de iluminar la
totalidad del campo que se observa por el ocular.
Prepare el objeto que va observar (muestra en portaobjetos).
Ponga el portaobjetos sobre la abertura de la platina y centre el objeto que va a mirar.
Mirando por el costado baje el objetivo utilizando el tornillo macromtrico hasta que est muy
cerca de la lmina.
Mire a travs del microscopio y levante el objetivo usando siempre el tornillo macromtrico hasta
ver la imagen.
Use el tornillo micromtrico para enfocar con ms nitidez.
Abra o cierre el diafragma para mejorar la calidad de la imagen.
Para cambiar de aumento: centrar cuidadosamente la parte que va a ser examinada. Levante el
tubo porta lentes por medio del tornillo macromtrico, cambie el objetivo y luego es el mismo
procedimiento anterior.


4. Resultados:
Resultados del experimento con microscopio compuesto N9 cuyas caractersticas son: Ocular 10X y
objetivos de 10X, 43x y 100X.
Muestra: Cebolla
Ocular: 10X Ocular: 10X
Objetivo: 10x Objetivo: 43X
Aumento: 100X Aumento 430X


Muestra: Letra "e"
Ocular: 10X
Objetivo: 10x
Aumento: 100X








Muestra:
Ocular: 10X
Objetivo: 10x
Aumento: 100X



5. Conclusiones:
Se puede concluir que el microscopio ha llegado
ser de mayor utilidad por lo que permite la observacin y obtencin de imgenes aumentadas
de esos especmenes diminutos, atravez de sus distintas partes ya que ciertos organismos no se
pueden ver a simple vista. Como las muestras dadas en clase.
En La manera de utilizar un microscopio hay que ser cuidadosos y saberlo manejar por medio
de ciertas normas y procedimientos para as aprender de su estructura y que funcin cumple
cada una de sus partes.
Por medio de los lentes oculares y objetivos del microscopio se pudo resolver clculos de poder
de resolucin y magnificacin para as saber la capacidad que tiene cada lente objetivo como el
del lente ocular.
6. Recomendaciones:
compartimiento para trasladarlo de un lugar a otro, hgalo
cuidadosamente transportndolo con ambas manos; con la mano derecha tome firmemente el
brazo y ponga la mano izquierda debajo de la base. Debe mantener el microscopio siempre en
una posicin vertical.
Nunca lo coloque en la orilla de la mesa.
Cualquier dao debe ser informado de inmediato al asistente.
limpie con el pauelo o con los dedos, ya que podra rayar los lentes. Esto lo har antes y despus
de sus observaciones.


ar el microscopio.

7. Bibliografa:
http://www.bionova.org.es/biocast/tema10.htm ... (microscopio ptico)
http://www.ucm.es/info/Geofis/practicas/prac23.pdf ...(microscopio compuesto)
http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_compuesto ...(microscopia. compuesto)
http://www.slideshare.net/GuarinaMolina/el-microscopio-16275013

Muestra: Letra "e"
Ocular: 10X
Objetivo: 10x
Aumento: 100X


COLORACIN DE BACTERIAS
1. Objetivo:
Observar las caractersticas del crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo.
Realizar coloraciones ms utilizadas en el laboratorio de microbiologa a partir de
materiales biolgicos y explicar sus fundamentos.
Observar las caractersticas del crecimiento bacteriano en diferentes medios de cultivo
2. Fundamento terico:
Las tcnicas de tincin son imprescindibles para el estudio microbiolgico de las bacterias, siendo la
primera fase en dicho estudio, pues para llegar a completarse y conducir a la identificacin necesita
de otras tcnicas complementarias de identificacin, por ejemplo, las pruebas bioqumicas. Por ello
tener en cuenta que existen factores que pueden alterar los resultados de toda tcnica de tincin.
Factores que afectan a toda tcnica de tincin:
Pureza del colorante: A mayor grado de impurezas, mayor error, y menor calidad en la tincin.

Concentracin del colorante: Los valores ideales de concentracin oscilan entre 0.2 y 2%;
valores mayores o menores a stas producen mayor error en la tincin.

El pH del colorante: el pH del colorante es elemental para realizar una tincin adecuada, puesto
esto hace que el colorante se fije o no a determinadas estructuras del microorganismo,
permitindonos distinguir unos grmenes de otros.

Conservacin del colorante: se deber ubicar siempre en lugares frescos, secos y oscuros,
adecuadamente envasados y etiquetados.

Elaboracin: generalmente dicha elaboracin se lleva a cabo a travs de soluciones acuosas o
hidroalcohlicas a partir de polvo de colorante en las cantidades precisas que permitan su
solubilidad.

Tcnica empleada: se deber ser escrupulosos a la hora de realizar una tincin; los portaobjetos
y cubreobjetos debern estar siempre limpios y desengrasados, nunca se mezclaran unos
colorantes con otros, se seguir paso a paso cada tcnica de tincin.

Temperatura: se aplicar en cada tcnica segn se precise el colorante a la temperatura
adecuada. En algunos casos ser a temperatura ambiental y en otro se requerir temperaturas
ms altas para facilitar la penetracin del colorante a ciertas estructuras bacterianas.

Cantidad de muestra: deber ser representativa y homognea pero en ningn caso muy
grande, pues se apelotona y no se visualiza el microorganismo; ni tampoco demasiado pequea
porque se corre el riesgo de no observar nada.

Realizar correctamente el frotis: si se pretende visualizar una muestra ha de fijarse previamente
con calor, salvo algunas excepciones. De no fijarse bien los grmenes no quedan adheridos al
portaobjetos y a la hora de adicionar colorantes mordientes y decolorantes dichos
microorganismos son arrastrados y no se podrn visualizar.

Soluciones mordientes: en ciertas ocasiones es necesaria la presencia de ciertas sustancias que
no presentan capacidad tintorial, porque actan como fijadores y ayudan a que el colorante se
fije a las correspondientes estructuras microbianas.

Tiempos de tincin: cuando se adiciona el colorante, el mordiente, el decolorante que se
precisa en cada tincin, es necesario que todas estas sustancias se mantengan en la
preparacin un tiempo preciso, segn la tcnica de tincin usada.
No podemos dejar de mencionar a los diferentes tipos de colorantes, que los dividimos segn su
origen y su comportamiento qumico.
Segn su origen:

Colorantes naturales: son aquellos extrados de plantas y animales, entre estas tenemos:
hematoxilina, azul de ndigo, cochinilla.

Colorantes artificiales: son preparados artificiales que se obtienen en su mayor parte de
alquitrn de hulla, son colorantes de anilina y se distinguen colorantes cidos, bsicos y
neutro.

Segn su comportamiento qumico:

Colorantes cidos o aninicos: son aquellos donde la carga del radical colorante es
negativa, corresponden fundamentalmente a colorantes citoplasmticos, ya que los
citoplasmas de las clulas se consideran bsicos, captando muy bien los colorantes cidos.
Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida, el rojo Congo, las auraminas, etc.

Colorantes bsicos o catinicos: son aquellos donde la carga del in cromforo es positiva.
Correspondrn a colorantes que tien estructuras de carcter nuclear o similares que son
cidas o ligeramente cidas, es decir cargadas negativamente. Ejemplos de colorantes
catinicos son el azul de metileno, azul de toloudina, tioninas, el cristal violeta, la
safranina, fucsina bsica.

Colorantes neutros: un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante cido y un
colorante bsico, por ejemplo, el eosinato azul de metileno que en general posee
propiedades de colorantes cidos y bsicos.

Colorantes indiferentes: son colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol donde no
predomina la carga positiva ni la carga negativa, pero tampoco tiene un carcter neutro,
son los colorantes de los lpidos, por ejemplo, Sudn III, negro Sudn.
En el proceso de tincin se efecta una reaccin de intercambio de iones entre el colorante y los
sitios activos de la superficie o del interior de la clula, de tal forma que los iones teidos del
colorante reemplazan iones de los componentes celulares. Toda tcnica de tincin requerir los
siguientes pasos:
Realizacin de un frotis.
Coloracin, se utiliza generalmente colorantes bsicos como violeta de genciana, azul de
metileno, verde malaquita.
Decoloracin, despus de una coloracin se somete la muestra a la decoloracin a fin de poder
diferenciar si son capaces o no de perder dichas bacterias el colorante bajo la accin de
situaciones drsticas para la bacteria, permitindonos diferenciar distintos grupos bacterianos.
Lavado, siempre entre paso y paso se debe eliminar el exceso de producto (colorante,
mordiente o decolorante), para evitar interferencias entre un producto y otro que podran
inducir a error. Estos lavados se llevan a cabo con agua destilada preferentemente.
Coloracin de contraste, se emplean colorantes generalmente bsicos que teirn al final
aquellas estructuras que han sido decoloradas con el decolorantes, por lo tanto no han podido
ser teidas con el colorante inicial.
Observacin al microscopio, siempre se comenzar por el objetivo de pocos aumentos para
comprobar que la muestra est adecuadamente distribuida y no existen otros elemento
(cristales, restos de colorantes sin cristalizar, partculas de polvo). Posteriormente se ir
aumentando el objetivo hasta llegar al de inmersin con aceite de inmersin que nos permite
visualizar la muestra con gran exactitud si la tincin ha sido realizada correctamente.
Habamos mencionado que el realizar incorrectamente el frotis es un factor que afecta la tincin,
por tanto trataremos sobre:
Preparacin de un frotis: consiste en poner en un porta objetos previamente esterilizado, a travs
de un inoculador estril, cierta cantidad de microorganismo problema suspendido en medio lquido
estril, extendindolo adecuadamente hasta formar una fina pelcula homognea que
posteriormente se fijar generalmente con calor o segn como el mtodo lo indique (ejemplo:
fijacin con alcohol), cuando la muestra est seca. Esto es necesario para evitar que los colorantes y
decolorantes utilizados en la tincin arrastren los microorganismos. Esta fijacin se va producir por
la coagulacin rpida de las protenas que permite que el germen quede adherido al portaobjetos.
Diferenciamos los tipos de tinciones bacterianas en cuatro:
Tincin simple:
Objetivo:
Observar la morfologa de la bacteria.
Observar la agregacin o tipo de distribucin bacteriana

Fundamento: se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos componentes
celulares, ya que las clulas bacterianas en medios de pH neutros suelen presentar una
dbil carga negativa. As pues, la bacteria cargada negativamente se combinar con los
iones positivos de los colorantes bsicos. Esto explica porqu en las tinciones simples los
colorantes utilizados suelen ser de tipo bsico.
Resultados: los microorganismos visualizados aparecern teidos de color azul en el caso
de haber utilizado el colorante de azul de metilo, violeta de genciana o azul toloudina;
aparecern de color rojo si fue fucsina diluida.

Tincin negativa:
Objetivo:
Determinacin morfolgica rpida (la preparacin no requiere fijacin previa).
Evidenciar la presencia de cpsulas.

Fundamento: se aplica un colorante cido, por ello los microorganismos que tambin
estn cargados negativamente no van a captar el colorante, quedando claros y brillantes
sobre un fondo teido oscuro. Este mtodo proporciona una visin muy exacta de las
clulas bacterianas y se consigue una imagen ms real de su forma y tamao, adems de
permitirnos observar si presenta o no cpsulas.

Tinciones estructurales: estas tinciones sirven para poner de manifiesto la presencia de
distintas estructuras propias de muchas bacterias, como es el caso de esporas, flagelos,
vacuolas, cilios, corpsculos metacromticos entre otros.

Tinciones diferenciales: dentro de las tinciones diferenciales tenemos: Tincin de Gram,
tincin de Zhiel- Neelsen, tincin de espiroquetas y tienen como caractersticas:

Se necesita fijacin previa generalmente por calor.
Se utilizarn dos colorantes, siendo el ltimo el colorante de contraste.
Nos permite visualizar su morfologa, la composicin de la pared bacteriana su resistencia
a la decoloracin cida.
Tincin Gram:
Objetivo:
Visualizar diferentes tipos bacterianos (Gram+, Gram-) en funcin de la distinta composicin
de su pared bacteriana.
Visualizar su morfologa y disposicin.
Es el mtodo ms empleado en bacteriologa gracias al cual las bacterias se pueden clasificar en dos
grandes grupos (Gram+, Gram-). Este distinto comportamiento en la tincin de Gram es debido a la
distinta composicin de la pared de las clulas bacterianas.
De acuerdo con esto, la tincin Gram se va a basar en el empleo de un primer colorante bsico,
generalmente cristal violeta, que teir de color azul todas las bacterias. Posteriormente, un
mordiente, lugol, que aumentar la afinidad del primer colorante a las clulas, luego un agente
decolorante, decolorar solamente un tipo de bacteria que sern teidas con el colorante de
contraste o segundo colorante.
Este distinto comportamiento frente a la decoloracin es dependiente de la composicin de la
pared bacteriana, hecho que servir para clasificarlas como Gram + (aquellas que no han sido
decoloradas y que por lo tanto quedan teidas con el cristal violeta, adoptando un color azul
violceo) o como Gram (aquellas que han sido decoloradas y son teidas con el colorante de
contraste, la safarina; por lo tanto su color es rosa-rojo).
Bacteria Gram positivas: Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de
cidos teicoicos. cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado en la capa de
peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de la Pared que est en la
superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido Teicoico es el responsable del
determinante antignico del organismo.













Bacterias Gram negativas: Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una
membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena,
fosfolpido y lipopolisacrido. En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est embebida en el
fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se llama Lpido A y es
txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La pared de la clula tiene poros
llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana
citoplsmica y la pared celular hay un espacio periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas
inactivadoras de antibiticos y protenas de transporte.








Especialmente la
coloracin Gram aporta dos
ideas bsicas para la
deficinin "taxonmica" de
las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan las clulas bacterianas.
La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos
morfolgicos, lo que se conoce como pleomorfismo.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana:
Coco (del griego kkkos, grano): de forma esfrica, tienen 1m de dimetro aproximadamente.
Diplococo: cocos en grupos de dos.
Tetracoco: cocos en grupos de cuatro.
Estreptococo: cocos en cadenas.
Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo.
Bacilo (del latn baculus, varilla): en forma de bastoncillo, su tamao est comprendido entre
0.3-1.5 m por 1-10 m (seccin transversal por largo).
Formas helicoidales:
Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma, juda o cacahuete; tienen 0.8 x 5 m de
largo.
Espirilo: en forma helicoidal rgida o en forma de tirabuzn.
Espiroqueta: en forma de tirabuzn (helicoidal flexible), tiene hasta 50 m de largo.
Algunas especies presentan incluso formas tetradricas o cbicas. Esta amplia variedad de formas
es determinada en ltima instancia por la composicin de la pared celular y el citoesqueleto, siendo
de vital importancia, ya que puede influir en la capacidad de la bacteria para adquirir nutrientes,
unirse a superficies o moverse en presencia de estmulos.
3. Procedimiento:
El mtodo de tincin utilizado fue la
tincin de Gram
Se realiz la preparacin del
frotis:
Pasar el portaobjetos
por la llama del
mechero, con el objetivo
de esterilizarla, adems
el portaobjetos debe
estar perfectamente
limpio y desengrasado.
Esterilizar el inoculado
flameando en la llama del mechero, esperar que se enfre y sacar una gota suero y
posteriormente se le aade una pequea cantidad de cultivo que se extender de forma que
quede fina y homognea. Dejar que la muestra seque a temperatura ambiental.


















Cuando la muestra estuvo seca, se procedi a fijarla mediante el flameado (se pas la
muestra tres veces por la llama del mechero, sin que la muestre est en contacto directo
con la llama).







Se aplic sobre el portaobjetos el primer colorante que correspondi a cristal violeta por 1
minuto.





Lavar durante dos segundos con agua destilada
para eliminar el exceso de colorante.









Aadimos el mordiente lugol, que actu fijando el colorante anterior a las bacterias,
aplicndose durante 1 minuto.









Se volvi a eliminar el exceso mediante el lavado con agua destilada durante dos segundos.
Decoloramos con alcohol acetona unos 20 segundos.









Se lav nuevamente con agua destilada durante 2 segundos.
Se cubri la muestra con el segundo colorante, safranina (colorante de contraste) durante un
minuto.









Se lav con agua destilada durante 2 segundos y se dej secar a temperatura ambiente.
Se observo la muestra en el microscopio con el objetivo de inmersin, usando aceite de cedro.

4. Resultados:
coloracin.
Datos obtenidos el da Jueves 10 de abril de 2014.
GRUPO AMBIENTE CARCTERES DE LAS COLONIAS FORMA AGRUPACION GRAM






N 1
Biblioteca









Cabello

Borde: Liso
Elevacin: Plana
Carcter ptico: Translcido
Pigmentacin: Crema

Borde: LIso
Elevacin: Convexa
Carcter ptico: Opaco
Pigmentacin: Blanca



Bacilos





Cocos


Diplobacilos





Estafilococos


Positivo





Positivo

GRUPO AMBIENTE
CARACTERISTICAS
DE LA COLONIA
FORMA AGRUPACION
GRAM
N2
BAO FIA
PLACA 6
(GRUPO N3)
Pigmentacin:
crema.
Tamao: 1mm.
Borde: liso.
Elevacin: plana.
Carcter ptico:
opaco.
Cocos Estreptococos
Negativo
(debe ser
positivo)
Cantidad de Bacilo Diplobacilos Positivo
TUBO N 3 crecimiento:
abundante
Distribucin de
crecimiento:
distante
Olor: ptrido

En el tubo N3 no me acuerdo que ambiente es?
En el bao fia: los cocos del tipo estreptococos, solo existen en gram positivos, yo en el microscopio
vi color rosado, eso quiere decir que me sali gram negativo, pero el profe me dijo para justificar
esto, no veo otra que cambiarlo a positivo nada ms, no veo otra explicacin, VI MAL, jejejejee.


GRUPO AMBIENTE CARACTERES DE CULTIVO AGRUPACION GRAM
N3


Estafilococo
GRAM +
AZUL Negativo

TAMAO: 1,5mm
BORDE: liso
ELEVACIN: plana
CARACTERES PTICOS: opaco
PIGMENTACIN: Crema



TAMAO: 1,5mm
BORDE: liso


ELEVACIN: plana

CARACTERES PTICOS: opaco

PIGMENTACIN: amarillo

Diplococos
GRAM-
ROJO Negativo














GRUPO AMBIENTE
CARACTERISTICAS
DE LA COLONIA
FORMA AGRUPACION
GRAM
N4

TUBO N 2
(GRUPO 4)
Cantidad de
crecimiento:
abundante
Distribucin de
crecimiento:
Turbio
Olor: Ptrido
Fuerte
Bacilos Diplobacilo
Gram
negativo
INOCULADOR
NO ESTERIL-
sector D
(GRUPO N3)
Cantidad: 1
Tamao: 1 mm
Margen: entero
Elevacin: plana
Cromogenesis:
crema
Carcter ptico:
opaco
cocos Estafilococos
Gram
negativo
(debi
salir
positivo)
U_U

Datos obtenidos el da jueves 11 de septiembre del 2014.


GRUPO AMBIENTE
CARACTERISTICAS DE LA
COLONIA
FORMA AGRUPACION GRAM
N5
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
Pigmentacin: crema. Cocos Estafilococos Negativo
Tamao:
Borde: liso.
Elevacin: plana.
Carcter ptico:
Translucido
HUELLA DIGITAL
Pigmentacin: crema.
Cocos Estafilococos Negativo
Tamao:
Borde:
Elevacin: convexa.
Carcter ptico: opaco

5. Conclusiones:
El mtodo Gram para coloracin de bacterias es muy til y permite identificar las
caractersticas de las bacterias con la utilizacin del microscopio

Se logr identificar la forma, agrupacin y tipo de gram al que pertenece cada muestra,
utilizando el microscopio y la coloracin de bacterias; pues las bacterias gram positivas se
tien de color azul oscuro o violeta mientras que las gram negativas se tien de un color
rosado tenue, esto debido a la diferencia en su pared celular.

Se reconoci adecuadamente las partes del microscopio y pudo utilizarse para la
observacin y reconocimiento de las bacterias en cada muestra analizada.
6. Recomendaciones:

Seguir paso a paso la tcnica de coloracin a emplear.

Tener presente los factores que influyen en las tcnicas de tincin para realizar la coloracin
efectivamente.

Fijar correctamente el microorganismo para evitar que los colorantes y decolorantes utilizados
en la tincin arrastren los microorganismos.

En la fijacin, no exponer directamente la muestra a la llama, el calor excesivo puede cambiar la
morfologa celular de las bacterias a observar.

Al lavar con agua la mezcla que se est colorando, el agua no debe caer directamente a la
muestra.
7. Bibliografa:
www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
http://bc.inter.edu/facultad/amlugo/biol2013/tincion%20bacte.htm
http://www.elergonomista.com/microbiologia/11s01.htm


CUESTIONARIO:
1.Definir: Poder de resolucin, abertura numrica.
PODER DE RESOLUCIN
El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio de percibir por separado dos puntos
pequeos, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la capacidad para percibir detalles. El poder resolutivo
aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm
uno del otro y yo los veo como un solo punto borroso (aparte de necesitar urgente un oculista) tendr
menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos
que distan de 0,5cm entre si.
ABERTURA NUMRICA
La apertura numrica de un sistema ptico es un nmero adimensional que caracteriza el rango de ngulos
para los cuales el sistema acepta luz. La apertura numrica brinda una indicacin de la capacidad de
coleccin de luz y poder de resolucin a una distancia fija de un objetivo .La apertura numrica es
importante porque indica el poder de resolucin de una lente. Una lente con una apertura numrica
grande ser capaz de visualizar ms detalles que una lente con una apertura numrica ms baja no podr.
Adems, las lentes con aperturas numricas grandes aceptan ms luz y dan una imagen ms brillante.
La diferencia es que el poder de resolucin la capacidad de percibir por separados 2 puntos pequeos muy
prximos mientras que la apertura numrica es un nmero que indica la cantidad de luz y la resolucin a
una distancia fija de un objeto.



2. Hacer una relacin de enfermedades microbianas que son transmitidas por el aire, agua, suelo.
ENFERMEDAD TRANSMITIDA POR EL AIRE.
ENFERMEDAD AGENTE
CAUSANTE
GENERO-ESPECIE
INFORMACION DE LA ENFERMEDAD
tuberculosis pulmonar Bacilo de Koch
bacteria
Se trata de una enfermedad de localizacin
preferentemente pulmonar, pero que no solo
afecta al pulmn propiamente dicho sino que
afecta tambin a los ganglios hiliares vecinos, a
los bronquios y a la pleura. Adems de ello,
tambin existen formas de tuberculosis que
afectan a otros rganos, como cerebro y
meninges, hueso, hgado, rin, piel, etc
LEGIANELOSIS Legionella
pneumophila
Bacteria Gram
negativa
La Legionella o Legionela, es una bacteria Gram
negativa con forma de bacilo. Viven en aguas
estancadas con un amplio rango de
temperatura.
POLIOMIELITIS Virus poliovirus La poliomielitis es una enfermedad contagiosa,
tambin llamada parlisis infantil, afecta
principalmente al sistema nervioso. La
enfermedad la produce el virus poliovirus. Se
dispersa de persona a persona a travs de
secreciones respiratorias o por la ruta fecal oral

ENFERMEDAD TRANSMITIDA POR EL AGUA.
ENFERMEDAD AGENTE
CAUSANTE
GENERO-ESPECIE
INFORMACION DE LA ENFERMEDAD
Disentera amebiana Entamoeba
histolytica-
protozoo
rizpodo
Es una enfermedad parasitaria intestinal de
tipo alimenticia producida por la infeccin por
la ameba Entamoeba histolytica, muy
extendido en climas clidos y tropicales. El
parasito se adquiere por lo general en su
forma qustica a travs de la ingestin oral de
alimentos o lquidos contaminados.cuando
invade al intestino, puede producir disentera,
aunque tambin pueda extenderse a otros
rganos.
Disenteria bacilar.
(shigelosis)
Shigella
Bacterias Gram
negativas
Es una infeccin bacteriana aguda que
afecta al intestino grueso y la porcin distal
del intestino delgado causada por un grupo de
bacterias Gram negativas llamadas Shigella.

Clera. Vibrio cholerae
bacteria
El clera es una enfermedad aguda, diarreica,
provocada por una infeccin
intestinal por la bacteria Vibrio cholerae
Hepatitis A. Virus de la
hepatitis A.
La hepatitis A es una enfermedad infecciosa
producida por el virus de la
hepatitis A (VHA) que provoca una inflamacin
aguda del hgado en la mayora de los
casos.

ENFERMEDAD TRANSMITIDA POR EL SUELO.
ENFERMEDAD AGENTE INFORMACION DE LA ENFERMEDAD
CAUSANTE
GENERO-ESPECIE



3.
a)Diferencie entre las paredes celulares de las bacterias gram positiva, y las bacterias gram negativas.
Las bacterias Gram positivas son aquellas que se tien de azul oscuro o violeta, esta caracterstica est
ntimamente ligada a la estructura de la pared celular. La pared celular compuesta por una gruesa capa
de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica
mediante molculas de cido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a
estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin de Gram. A diferencia de las
Gram-negativas, las Gram-positivas no presentan una segunda membrana lipdica externa a la pared
celular y esta pared es mucho ms gruesa.
Las bacterias Gram negativas son aquellas bacterias que no se tien de azul oscuro o violeta por la
tincin de Gram, y lo hacen de un color rosado tenue. Esta caracterstica est ntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular. Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipdicas
entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-
positivas presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptiglicano es mucho ms gruesa. Al ser
la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de Gram.

b) Afecta la edad del cultivo a la reaccin de tincin del gram?
Definitivamente la edad del cultivo afecta, pues mientras ms tiempo tenga el cultivo tanto mayor ser
el numero de colonias y el tamao de de estas. Adems al tenr el cultivo mas tiempo, la permeabilidad
de la pared celular incrementa; por ejemplo, para cultivos gram positivos que sean viejos, que esten
muertos o tengan problemas en la pared celular, al realizar la reaccin Gram se obtiene un falso Gram
negativo, pues por el problema de la pared celular reacciona como Gram negativo.
Las clulas envejecidas, o crecidas en condiciones que impiden la sntesis de mucopptido pueden
verse de color rojo. La intensidad de la decoloracin con alcohol suele ser el problema ms comn en la
reaccin Gram.

4. Hacer una lista de cinco (05) bacterias gram positiva y gram negativa con las enfermedades que
propician.
GRAM POSITIVO
Enfermedad Bacteria
Dermatitis gangrenosa Staphylococus spp. Es un habitante normal del tracto intestinal y de
la piel, pero ocasionalmente formas virulentas pueden producir
enfermedad en aves susceptibles.
Pueden ocasionar problemas vasculares, necrosis de dedos,
dermatitis gangrenosa y pododermatitis. Otras veces dan lugar a
mortalidad embrionaria, septicemia, artritis, etc.
Amigdalitis Streptococcus pyogenes. Origina sntomas respiratorios: dificultad al
respirar, cambios en el canto, etc. El cuadro clnico que aparece es
similar al producido por el acaro de los sacos areos.
Tetanos Clostridium tetani: Es de forma bacilar, una bacteria anaerbica que
se tie Gram positivo en cultivos frescos, pero en cultivos
establecidos, se tie Gram negativo.
Posee un flagelo y desarrolla endospora terminal.
Sensible al oxigeno pero resistente al calor.
Es el causante principal de la enfermedad del ttanos.
Neumonia Streptococcus pneumoniae es la principal causa de neumona
adquirida en la comunidad
Gonorrea
Neisseria gonorrhoeae es el causal de una de las ETS (Enfermedades
de Transmisin Sexual) ms difundidas: la gonorrea.

GRAM NEGATIVO
Enfermedad Bacteria
Peste bubnica Yersinia: este gnero comprende tres especies, Yersinia pestis,
agente causal de la antigua y temida enfermedad, la peste bubnica;
Yersinia pseudotuberculosis, agente causal de una enfermedad
parecida a la tuberculosis que afecta los ndulos linfticos de
animales y muy raramente en los humanos; Yersinia enterocolitica,
agente causal de una infeccin intestinal y ocasionalmente tambin
de infecciones sistmicas en los humanos y otros animales.
Disentera Bacilar Shigella dysenteriae es normalmente patgena para los humanos y
causa una gastroenteritis bastante grave que suele denominarse
disentera bacilar. Se transmite por los alimentos y por el agua y
puede invadir las clulas del epitelio intestinal. Cuando se ha
establecido produce una endotoxina y una neurotoxina que causan
efectos enterotxicos.
Tifus Epidemico Rickettsias: son clulas cocoides o bacilares, son parsitos
intracelulares estrictos. Son los agentes etiolgicos de enfermedades
como el tifus epidmico, por ejemplo Rickettsia prowazekii y
Ricketssia typhi. Otras son causantes de las fiebres de las Montaas
Rocosas y las fiebres Q. Dentro de este gnero se encuentra la
especie Coxiella burnetii que es el agente etiolgico de la fiebre Q.
DIARREAS
EPIDEMICAS
Escherichia coli: son habitantes universales del tracto intestinal de
los humanos y de los animales homeotermos, puede desempear
una funcin nutricional en el tracto intestinal mediante la sntesis de
vitaminas, especialmente de vitamina K. Las cepas silvestres de E.
coli casi nunca muestran requerimientos de ningn factor nutritivo y
pueden crecer a partir de una gran variedad de fuentes de carbono y
energa, como azcares, aminocidos, cidos orgnicos, etc. Existen
cepas patgenas, algunas pueden causar diarreas infantiles, que
alcanzan proporciones epidmicas en guarderas o en
departamentos de obstetricia.
COLERA Vibrio cholerae es una bacteria Gram negativa con forma de bastn
(un bacilo) curvo que provoca el clera en humanos.
LEGIANELOSIS La Legionella o Legionela, es una bacteria Gram negativa con forma
de bacilo. Viven en aguas estancadas con un amplio rango de
temperatura. Su crecimiento se ve favorecido por la presencia de
materia orgnica. La especie Legionella pneumophila produce la
enfermedad del legionario o Legionelosis. La infeccin por Legionella
puede presentarse como neumona tpica o como una enfermedad
febril sin focalizacin pulmonar denominada Fiebre de Pontiac.