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Tcnicas en Microbiologa

Microbiologa
Tema 2
Clasificacin e identificacin de
bacterias
Tcnicas en Microbiologa
Microbiologa
Clasificacin
o Ordenacin de los organismos en grupos taxonmicos basndose en
su similitud.
Nomenclatura
o Es la asignacin de nombres a los grupos taxonmicos. Sistema
binomial de Linneo.
Identificacin
o Procesos que determinarn si un organismo desconocido pertenece
a alguno de los grupos taxonmicos ya definidos.
Taxonoma
o La ciencia de la clasificacin, nomenclatura e identificacin.
Sistemtica
o Clasifica a las especies a partir de su historia evolutiva (filogenia).
o Estudio de la diversidad de organismos y sus relaciones.
o Relaciona la filogenia con la taxonoma.
o Incluye la informacin filogentica, taxonmica, ecolgica o
paleontolgica.
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El ltimo antepasado comn universal, conocido por sus siglas en ingls LUCA
(Last Universal Common Ancestor)
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En taxonoma microbiana los niveles o rangos utilizados son los siguientes:
DOMINIO
REINO
FILO o DIVISIN
CLASE
ORDEN
FAMILIA
GNERO
ESPECIE
Biologa
grupo taxonmico bsico la ESPECIE.
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La unidad es el CLON o CEPA, poblacin de clulas genticamente idnticas
derivadas de la divisin sucesiva de una sola clula, se obtiene por aislamiento y
cultivo puro.
ESPECIE: una coleccin de cepas que comparten numerosas propiedades estables y
que difieren de forma significativa de otros grupos de cepas.
Especie nueva cepa tipo coleccin de cultivos.
Taxonoma microbiana
Dominio: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Gnero: Escherichia
Especie: E. coli
Dominio: Eucarya
Reino: Plantae
Divisin: Chlorophyta
Clase: Trebouxiophyceae
Orden: Chlorellales
Familia: Chlorellaceae
Gnero: Chlorella
Especie: C. vulgaris
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Taxonoma microbiana
Tipificacin
discriminacin a nivel de cepa dentro de una misma especie.
Importancia desde un punto de vista epidemiolgico y en microbiologa
clnica ms que desde un punto de vista estrictamente taxonmico
(Serotipo, biotipo, ecotipo, morfotipo.).
Manual Bergey (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology).
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Taxonoma microbiana
Rango Nombre taxonmico
Dominio
Phylum o Reino
Clase
Orden
Familia
Gnero
Especie
Bacteria
Proteobacteria
-Proteobacteria
Enterobacteriales
Enterobacteriaceae
Shigella
S. dysenteriae Serotipos
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Identificacin bacteriana: Taxonoma
Gran cantidad de mtodos de identificacin bacteriana
que dan lugar a una Taxonoma polifsica :
Fenotpicos
Genotpicos
Filogenticos (mtodo taxonmico, pero no identificativo)
No clasificacin oficial de bacterias
Taxonoma dinmica
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Identificacin - Informacin taxonmica
Nivel 1 ADN, ARN
Nivel 2 Protenas
Nivel 3 Quimiotaxonoma
Nivel 4 Fenotipado
Secuenciacin, hibridacin, genotipado, % G-C..
Secuenciacin, SDS-PAGE, serologa, zimogramas.
FAME, composicin de la pared, quinonas.
Morfologa, galeras multipruebas, bioqumica.
F
I
A
B
I
L
I
D
A
D
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Anlisis fenotpico
Incluye los siguientes mtodos:
Mtodos fenotpicos clsicos y sistemas miniaturizados
Mtodos serolgicos
Mtodos quimiotaxonmicos
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Mtodos fenotpicos clsicos
Caracteresmorfolgicos
o Morfologa de la colonia, Gram, tamao y forma de la clula, distribucin de los
flagelos, presenciadeesporas, inclusionescelulares
Movilidad
o Mvil ono, tipodemovilidad
Metabolismo
o Mecanismodeconversindeenerga, utilizacindecompuestos decarbono, tipode
fermentaciones, presenciadedeterminadasenzimasorutas
Biotipos
Fisiologa
o Rangosdetemperatura, pH, respuestaal oxgeno, toleranciaosmtica
Antibiograma: antibiotipos
Fagotpica
Caractersticasecolgicas: ecotipos
Inconvenientes:
cultivo del microorganismo y tenerlo en forma de cultivo puro.
variacin en estas caractersticas en funcin de las condiciones de cultivo y edad.
necesaria una estandarizacin.
Actualmente en uso: su realizacin y coste los hacen ms asequibles.
Se basan en:
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Identificacin de una bacteria entrica
mediante tcnicas microbiolgicas clsicas
utilizando exclusivamente criterios fenotpicos.
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Sistemas miniaturizados
o
Galeras multipruebas
Mtodos rpidos que permiten la identificacin de microorganismos a
travs de la realizacin de diferentes pruebas bioqumicas.
Dispositivo de plstico con microtubos conteniendo diferentes medios de
cultivo deshidratados o diferentes sustratos de enzimas.
Lectura rpida de resultados a veces con un dato numrico.
Comparacin con bases de datos.
Ejemplos:
o BBL
o ENTEROTUBE II
o OXI/FERMTUBE II
o API
o Micro ID
o RapID systems
o Biochemical ID systems
o Sistemas biolog: se basan en la capacidad respiratoria a diferentes
fuentes de carbono (71 fuentes de carbono) y ensayos de
sensibilidad qumica (23).
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API
Enterotube
Sistema Biolog
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Sistemas miniaturizados
o
Galeras multipruebas
Ventajas:
o Proponen el mejor conjunto depruebas paralaidentificacin deun grupo
bacteriano.
o Simplificanlainterpretacindelosresultadosutilizandovaloresnumricos
o Tienenlosreactivoslistosparasuuso
o Algunassontotalmenteautomatizables
Desventajas:
o Altavariabilidadintraespecficaenlosmicroorganismos
o Especiesbacterianasmuysemejantes
o El resultadodealgunaspruebaspuedeser dudoso
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Mtodos serolgicos
Existen varias tcnicas:
Inmunofluorescencia
Aglutinacin en latex
Inmunoensayo enzimtico (ELISA)
Radioinmunoanlisis (RIA)
Uso de anticuerpos para la deteccin de antgenos especficos presentes en
el microorganismo o grupo bacteriano que queramos identificar o directamente contra
las toxinas. Diagnsticos rpidos. Antgenos ms usados:
AntgenosK (capsulares, termolbil)
Antgenos O (antgenos somticos quecorresponden al lipopolisacrido de la
pareddelosGram-, termorresistente)
AntgenosH(flagelares, termolbil)
Serotipos Serotipado
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Inmunofluorescencia
Directa
Indirecta
Quistes de Cryptosporidium
Legionella pneumophila en biopsia de pulmn
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Aglutinacin en ltex
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Inmunoensayo enzimtico
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Mtodos quimiotaxonmicos
Se basa en el estudio de la composicin qumica de los microorganismos.
Microorganismos emparentados contienen una composicin muy parecida y esta
composicin puedeservir como un patrn paraidentificarlos. Entrelos compuestos
msusadosconestefinestn:
Perfil decidosgrasos(FAME, FattyAcidMethyl Ester)
Perfil de cidos grasos unidos a fosfolpidos (PLFA)
Perfil deprotenas(protemica)
Composicindelaparedcelular
Quinonasisoprenoides
Anlisis fenotpico
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Perfil de cidos grasos
Tipos y las proporciones relativas de cidos grasos presentes en la membrana
citoplasmtica y los lpidos de la membrana externa.
Extraccin de los cidos grasos.
Formacin de steres metlicos.
Separacin por cromatografa de gases.
Requiere una gran estandarizacin.
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Mtodos quimiotaxonmicos
Perfil deprotenas
o Protenastotales
o Extraccin
o Anlisis:
ElectroforesisdesnaturalizanteconSDS
Espectrometrademasas(MALDI-TOF)
Composicindelaparedcelular
o TipodepeptidoglucanodelasG+
Quinonasisoprenoides:
o Membranas de muchos procariotas (transporte de electrones y
fosforilacinoxidativa.
o Diferenciasentamaoysaturacindelascadenaslaterales.
o Muchavariabilidad.
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Mtodos Genotpicos (moleculares)
Se basan en el anlisis de los cidos nucleicos extrados de los
microorganismos en forma directa o bien de una muestra conteniendo el
microorganismo en cuestin:
Ventajas
1. Especificidad
2. Sensibilidad
3. Rapidez
4. Puedenser automatizadas
5. Permiten identificar nuevos microorganismos
6. Permiten estudiar las poblaciones microbianas sin
hacer aislamientos
7. Permiten ladeteccindemicroorganismos altamente
patgenos (muertos)
8. Permitenel monitoreodel surgimientodemutaciones
enel genoma
Desventajas
1. Nodistinguen entreorganismos vivos ymuertos
2. Setienequecontar con conocimientos desecuencias
denucletidos especficas del microorganismo
3. Se requiere de personal altamente capacitado para el
desarrollo delaspruebas deidentificacin
4. Serequiereequipomasespecificoparael diagnostico,
locual elevalainversininicial
5. Se desarrollan procedimientos con mltiples etapas,
lo que incrementa la posibilidad de errores, adems
de la posibilidad de obtener falsos positivos y falsos
negativos.
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Mtodos moleculares
1. % de guanina y citosina
2. Basadas en Hibridacin
Utilizacin de sondas de ADN
a. Fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLPs)
b. FISH (Fluorescence In Situ Hybridation)
c. ARNr 16S (Ribotipado, filogenia)
d. Hibridacin ADN-ADN
3. Tcnicas basadas en amplificacin: PCR
Filogenia e identificacin
A. Anlisis de genes o regiones cortas especficas
a) Amplificacin de ARNr 16S
b) RT-PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa )
c) Primers generales (para hongos, para bacterias)
d) Primers especficos (nivel de especie)
B. Anlisis de todo el genoma o de varios fragmentos simultneamente fingerprinting (anlisis de
poblaciones)
a) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
i. se amplifica una regin del genoma con primers generales
ii. se digiere (corta) el producto amplificado con una enzima de restriccin (de cero a tres
cortes)
iii. el producto se corre en un gel
iv. se analiza el patrn de bandas resultante: nmero y tamao de las bandas
b) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms)
c) RAPD (RandomAmplified Polymorphic DNAs)
d) ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
C. Tipificacin multilocus de secuencias (Multilocus sequence typing, MLST): secuenciacin genes
mantenimiento
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% Guanina - Citosina
>% G-C ms termoestabilidad del ADN
o Absorbancia a 260 nmaumenta al separarse la doble hlice
Diferir ~5% - poco relacionadas
No identifica especies
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% Guanina - Citosina
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Hibridacin in situ directamente con colonias
Tipos de hibridacin:
Fase slida
o Tipo Southern
o Tipo sndwich
Fase lquida
In situ: FISH, CARD-FISH, colonias
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Fragmentos de restriccin de longitud polimrfica
(RFLP)
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FISH
Teidas con sondade
ARNr universal
Teidas con sonda
especficade ARNr
eucariota
Fotografa
contrastede fases
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CARD-FISH
Verde: Archaea
Azul: otros organismos coloreados con DAPI
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Hibridacin in situ directamente con colonias
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Ribotipado
Subunidad pequea del ARNr de tres microorganismos muy
diferentes
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Ribotipado
Ribotipado de cuatro bacterias lcticas
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Protocolo general de la PCR
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Anlisis RAPD
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Mtodos filogenticos
Varias tcnicas:
Las secuencias de genes del ARNr 16S
nueva especie - secuencias del ARNr 16S difieren >3% de una especie
conocida
nuevo gnero - si difieren >5%.
La carencia de divergencias en el ARNr 16S limita bastante su uso para
discriminar bacterias a nivel de especie.
Anlisis de secuencias multignicas: similar al MLST pero usando secuencias
completas y mtodos cladsticos.
Anlisis de secuencias de genomas completos.
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Identificacin
Nivel 1 ADN, ARN
Nivel 2 Protenas
Nivel 3 Quimiotaxonoma
Nivel 4 Fenotipado
Secuenciacin, hibridacin, genotipado, % G-C..
Secuenciacin, SDS-PAGE, serologa, zimogramas.
FAME, composicin de la pared, quinonas.
Morfologa, galeras multipruebas, bioqumica.
F
I
A
B
I
L
I
D
A
D