DETERMINACION DE LOS COEFICIENTES DE RENDIMIENTO DE PRODUCTOS Y

REACTIVOS EN UNCULTIVO BATCH DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

1
SILVIA ALVAREZ
2
LIZETH KATHERINE ARIAS
3
DIANA MARCELA SAAVEDRA
FUNDACIN UNIVERSIDAD AMRICA, AV. CIRCUNVALAR NO. 20-53
Septiembre 9 de 2014
202-3

Tradicionalmente se ha utilizado la palabra fermentacin en microbiologa industrial para describir los
procesos de cultivo de microorganismos con propsitos industriales.

I. MARCO TEORICO
El microorganismo: Saccharomyces
cerevisiae.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo
ascomiceto unicelular. Los hongos son
organismos eucariticos (sus clulas tienen una
organizacin interna en orgnulos
membranosos) quimiohetertrofos, es decir
aquel individuo que tiene como fuente de
energa las reacciones y, como fuente de
carbono, la materia orgnica.
Los organismos necesitan carbono y energa
para poder crecer. En la naturaleza las fuentes
de energa pueden ser qumicas (energa
presente en los enlaces de compuestos
qumicos) o lumnica (energa de la luz que se
transforma en energa qumica). Por otra parte,
las reacciones de xido-reduccin que tienen
lugar en los seres vivos requieren donadores de
electrones que pueden ser orgnicos o
inorgnicos. Por ltimo, el carbono puede
encontrarse de dos formas, como carbono
orgnico y como carbono inorgnico (CO2).
El microorganismo responsable de la
fermentacin alcohlica es la levadura S.
cerevisiae. Las levaduras son hongos
unicelulares, a diferencia de otro tipo de
hongos a los que se le conocen como
filamentosos. Sin embargo, biolgicamente,
ambos tipos de hongos (unicelulares o
filamentosos) son similares. Las levaduras se
multiplican en los medios de cultivo como
clulas aisladas individuales que se dividen y, de
esta forma, aumentan su nmero.







El crecimiento de un hongo como levadura o
como hongo filamentoso est, en algunas
ocasiones, regulado por condiciones
ambientales, de forma que un mismo hongo
puede crecer en ciertas situaciones como
levadura y en otras como hongo filamentoso
(por ejemplo, los hongos patgenos ustilago
maydis y Candida albicans).
Fermentacin.

La fermentacin alcohlica es un proceso
anaerobio en el que las levaduras y algunas
bacterias, descarboxilan el piruvato obtenido de
la ruta Embden-Meyerhof-Parnas (glicolisis)
dando acetaldehdo, y ste se reduce a etanol
por la accin del NADH2 [1 2]. Siendo la
reaccin global (1), conocida como la ecuacin
de Gay-Lussac [3]:
Figura 1. Saccharomyces cerevisiae. Tomado de
http://www.allposters.com/-sp/Baker-s-or-
Brewer-s-Yeast-Saccharomyces-Cerevisiae-with-
Some-Budding-SEM-Posters_i9014836_.htm
C6H12O6 -> 2 CH3CH2OH + 2 CO2
(1)
Glucosa > 2 Etanol + 2 Dixido de
carbono (2)
El balance energtico de la fermentacin puede
expresarse de la siguiente forma [3]:
C6H12O6 + 2 ADP + 2 H3PO4 > 2
CH3CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O
(3)


Hoy en da la industria licorera y alimenticia
utiliza varios tipos de mtodos analticos para la
determinacin azcar y alcohol en los licores
y/o bebidas a utilizar como medio de venta.
Uno de los mtodos ms acordes y con mejor
resultados en la determinacin de los azucares
con carcter reductor, es el mtodo (DNS),
mtodo que ha sufrido varias modificaciones a
travs de los aos para adecuarse al anlisis de
diferentes materiales y su principal
ventaja radica en su alta sensibilidad y
productividad debido a que es un mtodo
espectrofotomtrico; el procedimiento se basa
en una reaccin redox que ocurre entre el DNS
y los azcares reductores presentes en la
muestra, sin embargo a nivel industrial no es
recomendable utilizarlo cuando dicha trata
sustancias tales como mieles y caldos de
fermentacin que lo contengan, esto debido a
segn estudios realizados en la materia, a los
altos niveles de dispersin. El presente informe
desarrollara el procedimiento respectivo para la
determinacin de azucares reductores a partir
de una solucin patrn de glucosa de
concentracin 1gL que permitir realizar y
ajustar una curva de calibracin, y una solucin
desconocida por el mtodo del cido 3,5
dinitro saliclico (DNS).
Cultivo discontinuo
En el caso de tratarse de cultivos batch, los
nutrientes crticos se aaden en baja cantidad al
principio, pero continan aadindose en dosis
pequeas a lo largo de todo el crecimiento, de
manera escalonada. Este sistema se usa a
menudo para la sntesis de metabolitos
secundarios, la sntesis de los cuales est
sometida a represin por el catabolito, o bien
cuando el inculo es problemtico.
Sin embargo los cultivos discontinuos o
batch son los ms habituales. En el inicio del
cultivo, el medio estril se inocula con un
volumen adecuado de microorganismos y se
permite que se lleve a cabo la fermentacin en
condiciones ptimas. A lo largo del proceso no
se aade ningn nutriente, salvo el oxgeno.
Llega un momento, por lo tanto, en que los
nutrientes son limitantes para el crecimiento,
por lo que se dan las fases tpicas de un cultivo
bacteriano.
Crecimiento celular
Es importante conocer la cintica de
crecimiento de los cultivos microbianos porque
es necesario poder predecir cmo va a
evolucionar un cultivo, cmo va a ir
consumindose el substrato y cmo se va a ir
acumulando el producto de una fermentacin.
Figura 2.. Tomado de
Las clulas aisladas cultivadas en un volumen
finito de medio de cultivo apropiado van
utilizando los nutrientes que tienen disponibles
con la mayor eficiencia y rapidez que pueden,
sintetizando sus propios componentes celulares
y dividindose en cuanto han podido duplicar
su masa y su material gentico. El tiempo que
tarda una clula en hacer todo lo anterior es lo
que conocemos como tiempo de generacin y
puede variar desde unos 20 minutos en
condiciones ptimas hasta varios meses en
condiciones del suelo. Cada vez que transcurre
un tiempo de generacin, el nmero de clulas
se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento
exponencial.
Fases del crecimiento de un cultivo




Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo:
(1) la fase lag en la que el microorganismo se
adapta a las nuevas condiciones y pone en
marcha su maquinaria metablica para poder
crecer activamente. La duracin de esta fase es
variable y en general es mayor cuanto ms
grande sea el cambio en las condiciones en las
que se encuentra el microorganismo. (2) La fase
exponencial cuya cintica explicamos en la
pgina anterior. (3) La fase estacionaria en la
que no hay aumento neto de microorganismos,
lo que no significa que no se dividan algunos,
sino que la aparicin de nuevos individuos se
compensa por la muerte de otros. (4) La fase de
muerte en la que el nmero de
microorganismos vivos disminuye de forma
exponencial con una constante k que depende
de diferentes circunstancias.
En la fase de muerte se dice que el nmero de
microorganismos vivos disminuye
exponencialmente. Considerando vivo al
microorganismo que puede multiplicarse
(dividirse), y muerto al que ha perdido
irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es
importante entender este concepto porque los
microorganismos microbiolgicamente
muertos no tienen por qu estar
metablicamente inactivos.
La velocidad de crecimiento de las levaduras
depende directamente de la concentracin del
sustrato. Este comportamiento se describe
generalmente mediante la ecuacin de Monod.
Este modelo sugiere que el desarrollo de las
levaduras depende de una mxima velocidad de
crecimiento y una concentracin de saturacin,
el cual es vlido para un amplio rango de
organismos y nutrientes, donde todos cuentan
con un lmite superior de concentracin sobre
el cual se genera una disminucin de la
velocidad de crecimiento, lo que se conoce
como inhibicin (Boulton 1996).
El modelo de Monod describe una curva de
crecimiento, en la cual se presenta una primera
etapa de adaptacin al medio, fase lag, que
depende tanto del nmero de clulas, como del
sistema metablico. Cuando esta fase se
prolonga la presencia de txicos o una pobre o
inadecuada inoculacin puede ser la razn.
Luego se presenta un crecimiento exponencial
que ocurre a una mxima velocidad, la duracin
de esta fase depende de la concentracin inicial
del sustrato limitante; as como de la habilidad
del microorganismo para adaptarse a la
disminucin de la concentracin de sustrato
(Ribreau 2006). En el punto, en el que se
presenta limitacin de sustrato, la velocidad
especifica de crecimiento se comporta en
Figura 3. Fases de crecimiento de un cultivo.
Tomado de http://www.unavarra.es/genmic
/micind-2-3.htm
(Ecuacin 1)
(Ecuacin 2)
(Ecuacin 3)
(Ecuacin 4)
funcin de la siguiente expresin, cintica de
monod.

res
Luego de la fase exponencial, donde se tiene el
mximo valor de biomasa, se da una fase
estacionaria durante la cual algunas clulas se
dividen mientras otras mueren, para finalmente
llegar a la fase de muerte. En general todo el
comportamiento podr definirse en funcin de
la velocidad especfica de crecimiento y la
velocidad de lisis o metabolismo endgeno
(Nielsen 2003; Ribreau 2006). Cinetica de
crecimiento de la levadura.









II. RESULTADOS

Se prepar el medio de cultivo, para ello se
elaboraron 2 soluciones que contenan NH3,
MgSO4*7H2O, CaCl2*2H2O, K2HPO4 y
glucosa con una concentracin de 15 gL
-1
, una
vez obtenida las soluciones (medio de cultivo)
se esterilizaron sometindolos a una
temperatura de 121C y 15 psia de presin por
15 minutos, esto para destruir o remover
cualquier microorganismo, este procedimiento
se basa en el tiempo de penetracin y el de la
muerte trmica para un determinado
microrganismo
[1]
.

La inoculacin se llev a cabo agregando
un microorganismo (levadura) a las
muestras, activando en bao de maria 38C
por 20 minutos, este medio de cultivo se
dej en fermentacin por 3 das
aproximadamente 79,45 hor

III. RESULTADOS


Se prepar el medio de cultivo, para ello se elaboraron 2 soluciones que contenan NH3,
MgSO4*7H2O, CaCl2*2H2O, K2HPO4 y glucosa con una concentracin de 15 gL
-1
, una vez obtenida
las soluciones (medio de cultivo) se esterilizaron sometindolos a una temperatura de 121C y 15 psia
de presin por 15 minutos, esto para destruir o remover cualquier microorganismo, este
procedimiento se basa en el tiempo de penetracin y el de la muerte trmica para un determinado
microrganismo
[1]
.

La inoculacin se llev a cabo agregando un microorganismo (levadura) a las muestras, activando en
bao de maria 38C por 20 minutos, este medio de cultivo se dej en fermentacin por 3 das
aproximadamente 79,45 horas.

Los productos principales de la fermentacin son el alcohol etlico y el anhdrido carbnico y se
originan de la fermentacin alcohlica.

C6H12O6 + LEVADURA 2 CO2 + 2 C2H6O

A continuacin se muestran las cantidades iniciales y finales del cultivo, para poder realizar el balance
de materia.


Muestra Masa
C6H12O6 (g)
Masa
levadura (g)
Masa
CO2 (g)
Masa
C2H6O (g)
A 0,075 0,25
B 0,075 0,26

Para determinar la masa inicial de la glucosa
Partiendo del mecanismo de reaccin para la produccin de etanol, el rendimiento terico se defini
segn la Ecuacin.

Tabla 1. Datos iniciales y finales para balance de materia
En la tabla 2 se muestran las cantidades en volumen de glucosa, agua, tartrato mixto de sodio y potasio
y DNS necesarias para la elaboracin de las soluciones de trabajo y el blanco



Solucin
(gL
-1
)
Volumen
C6H12O6 (mL)
Volumen H2O
(mL)
Volumen
DNS (mL)
V.sal de
Rochelle (mL)
0 0 3 3 1
5 1 2 3 1
10 2 1 3 1
12 2,4 0,6 3 1
15 3 0 3 1

Cada grupo realizo una solucin de las anteriormente descritas en la tabla 2 con triplicado, para la
construccin de la curva de calibracin, para la cual se necesita conocer las concentraciones de glucosa
despus de haber hecho la disolucin con agua destilada, ya que se tom 1 mL de la solucin en este
caso la de concentracin 10 gL
-1
y se diluyo en 10 mL de H2O, dicha concentracin se puede hallar con
la ecuacin que rige las disoluciones:

De esta ecuacin se despeja C2 que es la concentracin de glucosa despus de la disolucin, y se
determinan las concentraciones de las 4 soluciones y el blanco, se midi la absorbancia de cada solucin
con un espectrofotmetro a 575 nm, por triplicado para luego sacar un promedio, los datos obtenidos
fueron registrados en la tabla 3.



Concentracin
(gmL
-1
)
Concentracin
final (gmL
-1
)
Absorbancia
0 0 0,000
5 0,45454545 0,301
10 0,90909091 0,598
12 1,09090909 0,667
15 1,36363636 0,765

Partiendo de estos datos se construy la curva de calibracin




y = 0.5752x + 0.0269
R = 0.9859
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 0.5 1 1.5
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Concentracion
Tabla 2. Datos preparacin de soluciones de trabajo
(Ecuacin 5)
Tabla 3. Resultados de absorbancia estndares de trabajo
Figura 1. Curva de calibracin.

Para el caso de las muestras se llev a cabo el mismo procedimiento de determinacin de glucosa
mediante DNS, tomando una alcuota de cada muestra, se realiz por duplicado, utilizando el mismo
blanco, se midi la absorbancia de cada muestra, los datos estn consignados en la tabla 4.



Muestra Absorbancia
A1 0,015
A2 0,026
B1 0,020
B2 0,007

Para calcular la concentracin de glucosa presente en la muestra, se interpolo en la ecuacin de la recta
(Figura 1), y se obtiene el valor de la concentracin:




Despejando x (concentracin de glucosa) de la Ecuacin 6,

Donde y es la absorbancia de la muestra problema, se reemplaza y se obtiene la concentracin de
glucosa presente es las muestras, los resultados obtenidos estn consignados en la tabla 5.



Muestra Concentracin
A1 -0,0206
A2 -0,00156
B1 -0,01199
B2 -0,03459

Como anteriormente se mencion el medio de cultivo se dej en fermentacin por 79,45 horas, pasado
dicho tiempo se pes el medio de cultivo, para poder calcular la produccin de CO2, mediante la
prdida de peso, pues el dixido de carbono sale en forma de gas, la diferencia entre el peso inicial y
final indica la cantidad de CO2 desprendido por la levadura.



Muestra Peso inicial (g) Peso final (g) CO2 (g)
A 180,22 179,97 0,25
B 180,07 179,81 0,26



Para la determinacin de la biomasa se tomaron 10 mL de las muestras, se
colocaron en un tubo falcn (figura 2) que se pes previamente y
posteriormente se pas a centrifugar a 600 rpm por 8 minutos, se descart el
sobrenadante y se volvi a pesar el tubo, con esta informacin se obtiene el
Tabla 4. Resultados de absorbancia muestras
(Ecuacin 6)
Tabla 5. Resultados concentracin
Tabla 6. Determinacin CO2
peso de la biomasa en base hmeda, la informacin descrita se encuentra en la tabla 6.







Muestra P. inicial
(g)
P. final
(g)
Biomasa
(g)
A 7,1715 7,2765 0,105
B 7,3809 7,4657 0,0848



La biomasa obtenida en peso hmedo, se pasa a peso seco:

(

)
Dnde:

Huh %: humedad en tantos por ciento sobre base hmeda
Ph : peso de la muestra hmeda
Ps : peso de la muestra seca

Despejando Ps de la ecuacin 3:

(

)
Para A:

(

)
Para B:

(

)


El estudio cintico de la prctica, incluye un sistema de mecanismos, que deben evaluarse desde el
sistema metablico de las levaduras. Para ello se siguen modelos cinticos que evalen el crecimiento de
microorganismos, para lo cual se busca relacinar entre la variacin en el concentracin de sustrato, y
su tasa de consumo, asumiendo que a una mayor tasa de consumo inicial de sustrato, el sistema
desarrollara una mejor velocidad de reaccin, que repercutira en tiempo ms cortos del proceso
general, siguiendo la reaccin de la fermentacin alcohlica, el mecanismo de la velocidad de consumo
de sustrato lo define como la relacin entre la variacin de la concentracin del sustrato en el tiempo, lo
que a su vez se puede expresar a travs de una constante de velocidad y la concentracin de sustrato,

Tabla 6. Determinacin biomasa.
(Ecuacin 3)

IV. ANALISIS DE RESULTADOS

http://esalvucci.wordpress.com/crecimiento-microbiano/

V. CONCLUSIONES





VI. BIBLIOGRAFIA


[1] http://www.ms.gba.gov.ar/sitios/laboratorio/files/2012/08/ESTERILIZACI%C3%93N-DE-MEDIOS-DE-
CULTIVO.pdf

Base
http://www.academia.edu/4403544/DETERMINACION_DE_AZUCARES_REDUCTORES_ME
TODO_DNS

http://www.elnuevodia.com.co/nuevodia/sociales/la-columna-del-
chef/166937-fermentacion#sthash.Ta4jBXFK.dpuf


http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-4.htm
http://web.udl.es/usuaris/r5213847/Cin%C3%A9tica.pdf