Identificacion Streptococos

EVALUACI N DE MEDI OS DE CULTI VO PARA EL
AI SLAMI ENTO DE Streptococcus pyogenes EN

PACI ENTES CON DI AGNOSTI CO CL NI CO DE
FARI NGOAMI GDALI TI S QUE ACUDEN AL
LABORATORI O DEL SELADI S DURANTE LOS MESES
DE JULI O A DI CI EMBRE DEL 2008.
ELABORADOPOR:
Lic.IvnKoskyValenciaCruz
(Tesis de grado presentada para optar al titulo de Especialista en Diagnstico de
Laboratorio en Salud, mencin Microbiologa)
LaPaz Bolivia
2009
EVALUACI N DE MEDI OS DE CULTI VO PARA EL
AI SLAMI ENTO DE Streptococcus pyogenes EN
PACI ENTES CON DI AGNOSTI CO CL NI CO DE
FARI NGOAMI GDALI TI S QUE ACUDEN AL
LABORATORI O DEL SELADI S DURANTE LOS MESES
DE JULI O A DI CI EMBRE DEL 2008.
ELABORADOPOR: Lic.IvnKoskyValenciaCruz
ASESORES: RaquelCaldernMoralesM.Sc.
J uanEdgarCallisayaH.M.Sc.
(Tesis de grado presentada para optar al titulo de Especialista en Diagnstico de
Laboratorio en Salud, mencin Microbiologa)
LaPaz Bolivia
2009
Dedicatoria:
A mi querido maestro que me enseo todo en la
vida y al que le debo mis logros y aunque se me
adelanto aun sigue guiando mis pasos desde el
cielo para mi papi Dmaso.
Agradecimientos
A Dios por darme la oportunidad de estar aqu con ustedes y me hizo un ganador
desde el principio.
A mi mamita, que con su aliento constante en las buenas y en las malas, me impulso a
seguir mi camino para ir alcanzando mis metas.
A mis hermanos, que me soportaron y me ayudaron a su manera.
A la Dra. Raquel Caldern y al Dr. Juan Callisaya, quienes iluminaron mis pasos
desde el inicio, compartiendo sus enseanzas y guindome acertadamente, y a los
cuales les debo mi fascinacin por la Bacteriologa.
Al personal del instituto SELADIS, a la directora, a los docentes y a los grandes
amigos que encontr y con los que compart momentos inolvidables.
Finalmente a todos los amigos que a su manera colaboraron en la realizacin del
presente trabajo.
TABLADECONTENIDO
Pgina
RESUMEN.................................................................................................................. 1
ABSTRACT................................................................................................................. 2
1. INTRODUCCIN............................................................................................... 3
1.1 ANTECEDENTES.................................................................................................5
1.2 PLANTEAMIENTODELPROBLEMA..............................................................7
1.3 J USTIFICACIN..................................................................................................9
1.4 MARCOTERICO ............................................................................................11
1.4.1 CONCEPTO................................................................................................................. 11
1.4.2 FARINGITISESTREPTOCOCICA............................................................................. 12
1.4.2.1 FACTORESDEVIRULENCIA ...................................................................................... 13
1.4.2.2 MANIFESTACIONESCLINICAS.................................................................................. 17
1.4.2.3 COMPLICACIONES ...................................................................................................... 18
1.4.2.4 DIAGNOSTICOBACTERIOLOGICO............................................................................ 21
1.4.2.5 TRATAMIENTO ............................................................................................................ 26
1.4.2.6 PORTACIN,FRACASODETRATAMIENTOYREINFECCIN............................... 28
2. OBJ ETIVOS...................................................................................................... 30
2.1 OBJ ETIVOPRINCIPAL....................................................................................30
2.2 OBJ ETIVOSESPECFICOS..............................................................................30
3. DISEOMETODOLGICO............................................................................ 31
3.1 DESCRIPCIN ...................................................................................................31
3.2 TAMAOMUESTRAL......................................................................................31
3.3 CRITERIOSDEINCLUSIN............................................................................31
3.4 CRITERIOSDEEXCLUSIN..........................................................................32
3.5 VARIABLESYSUMEDICIN.........................................................................32
3.5.1 VARIABLEDEPENDIENTE ...................................................................................... 33
3.5.2 VARIABLEINDEPENDIENTE .................................................................................. 33
3.5.3 OPERACIONALIZACINDEVARIABLES.............................................................. 33
3.6 MATERIALES,EQUIPOSYREACTIVOS...................................................... 34
3.7 TCNICASYPROCEDIMIENTOS.................................................................. 36
3.7.1 PREPARACIONDEMEDIOSDECULTIVO............................................................. 37
3.7.1.1 AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavados ....................................... 37
3.7.1.2 AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavadosmsazidasodica ............ 37
3.7.1.3 AgarSangreHumana(glbulosrojossinlavado) ....................................... 37
3.7.1.4 AgarSangredeCarnero ............................................................................. 37
3.7.2 TOMADEMUESTRA................................................................................................ 38
3.7.3 SIEMBRA.................................................................................................................... 38
3.7.4 IDENTIFICACINDELOSESTREPTOCOCOSAISLADOS................................... 39
3.7.4.1 HEMLISIS.................................................................................................................... 39
3.7.4.2 TINCINGRAM............................................................................................................ 40
3.7.4.3 PRUEBADELACATALASA........................................................................................ 40
3.7.4.4 BACITRACINAYTRIMETOPRIM/SULFAMETOXAZOL........................................... 41
3.7.4.5 PRUEBADEPYR(PIRROLIDONILARILAMIDASA) ................................................. 42
3.7.4.6 PRUEBAVOGUESPROSKAUER................................................................................. 43
3.8 INSTRUMENTOSYTECNICASDERECOLECCINDEDATOS.............. 44
3.9 PROCESAMIENTOYANLISISDELOSDATOS........................................ 44
4. RESULTADOS ..................................................................................................45
5. DISCUSIN ......................................................................................................54
6. CONCLUSIONES.............................................................................................57
7. RECOMENDACIONES ....................................................................................58
8. BIBLIOGRAFA...............................................................................................59
TABLADEFIGURAS
Pgina
Figura1.TincingramdeStreptococcuspyogenes...12
Figura2. Streptococcuspyogenes enagarsangredecarnero.13
Figura3.FactoresdevirulenciadeStreptococcuspyogenes.. 15
Figura4.SitiodeaccindeTMSybacitracina...24
Figura5.SitiodeaccindePenicilinasyMacrolidos... 27
Figura6.HemlisisdeStreptococcuspyogenesenagarsangre.39
Figura7.TincingramdecoloniabetahemolticadeStreptococcuspyogenes.40
Figura8.Pruebadelacatalasa... 41
Figura9.PruebadelaBacitracinayTrimetoprim/sulfametoxazol....42
Figura10.PruebadePYR(PirrolidonilArilamidasa).... 42
Figura11.PruebaVoguesProskauer(VP) 43
LISTADETABLASYGRAFICOS
Pgina
Tablaygrafico1.TasasdeevaluacindelASHconglbulosrojoslavados(24h).. 46
Tablaygrafico2.TasasdeevaluacindelASHconglbulosrojoslavados(48h).. 47
Tablaygrafico3. TasasdeevaluacindelASHconglbulosrojoslavadosmsazidasodica
(24h)...48
Tablaygrafico4. TasasdeevaluacindelASHconglbulosrojoslavadosmsazidasodica
(48h)...49
Tablaygrafico5.TasasdeevaluacindelASH(24h).. 50
Tablaygrafico6.TasasdeevaluacindelASH(48h).. 51
Tabla7.Distribucindepatgenosbacterianosaislados52
Grafico7.Distribucindepatgenosbacterianosaislados.53
TABLADEANEXOS
Pgina
Anexo1. PreparacindeASHconglbulosrojoslavados.... 63
Anexo2.Lavadodeglbulosrojos.... 64
Anexo3. PreparacindeASHconglbulosrojoslavadosmsazidasodica....65
Anexo4. PreparacindeASHconglbulosrojossinlavado.66
Anexo5. Preparacindeagarsangredecarnero....67
Anexo6.Tincingram... 68
Anexo7.Formularioderecoleccindedatos 69
Anexo8. Fotografas... 70
Fotografa1.Cultivodehisopadofaringeoconpresenciadefloranormal 70
Fotografa2.Cultivodehisopadofaringeoconpresenciadeflorapatgena............. 70
Resumen
El presente estudio evalu la eficacia de medios de cultivo alternativos:Agar Sangre
Humana con glbulos rojos lavados (ASHGL), Agar Sangre Humana con glbulos
rojos lavados ms azida sodica (ASHGLA) y Agar Sangre Humana con glbulos
rojossinlavado(ASH),paraelaislamientodeStreptococcuspyogenesbetahemoltico
en pacientes con diagnostico clnico de faringoamigdalitis, frente al agar sangre de
carnerocomopruebadereferenciaalas24y48horasdeincubacin.Debidoaquecon
frecuencia en los laboratorios de Bacteriologa Clnica, utilizan sangre humana como
alternativade la sangredecarnero,enlapreparacinde mediosde cultivo.Serealiz
un estudio con diseode testdiagnostico,longitudinal yprospectivo en 100 muestras
dehisopadofaringeodepacientesqueacudenallaboratoriodelSELADISdurantelos
meses de Julio a Diciembre del 2008. Los resultados revelaron que los tres medios
evaluadosalcanzaron100%deespecificidadyvalorpredictivopositivoalas24y48
horasde incubacin.Encuantoalasensibilidad y valorpredictivonegativo,elmedio
de cultivo ASHGL,present los valores ms altos alcanzando 100%de sensibilidad y
valor predictivo negativo a las 48 horas de incubacin. El ASH, le sigue con una
sensibilidad a las 48 horas de 86% y un valor predictivo negativo a las 48 horas de
98%. Por lo tanto, se concluye que la incubacin por 48 horas permite un mayor
nmero de aislamientos y que el medio de cultivo ms eficaz es el Agar Sangre
Humana conglbulosrojos lavados, por sus excelentes resultados, que lohacen tan
eficazcomoelAgarSangredeCarnero.
Palabr as clave: Faringoamigdalitis, azida sodica, beta hemoltico, valor predictivo
positivo,valorpredictivonegativo.
Abstr act
The present study evaluated the effectiveness of alternative culture mediums: Blood
Agar whit washedhuman red blood cells (ASHGL), Blood Agar with washed human
redbloodcellsmoresodiumazide(ASHGLA)andBloodAgarwithhumanredblood
cells without washing (ASH), for the isolation of beta hemolytic Streptococcus
pyogenesinpatientswithclinicaldiagnosisofpharyngitis,againstthesheepbloodagar
like reference test at 24 and 48 hours of incubation. Because frequently in clinical
bacteriologylaboratories,theyusehumanbloodlikealternativetothesheepblood,for
the preparation of culture medium. The study was realised with design of diagnostic
test, longitudinal and prospective in 100 samples of pharyngeal swabs from patients
attendingthelaboratorySELADISduringJulytoDecember2008.Theresultsrevealed
that the three evaluated mediums reached 100% of specificity and positivepredictive
valueat24and48 hoursofincubation. Intermsofsensitivity andnegativepredictive
value,theculturemediumASHGLpresentedthehighestvalueswith100%sensitivity
and negative predictive value at 48 hours of incubation. The ASH, follows with a
sensitivity of 86% at 48 hours and a negative predictive value of 98% at 48 hours.
Therefore, we conclude that the incubation for 48 hours allows a larger number of
isolatesand the mosteffective culture medium isBlood Agar whitwashedhumanred
bloodcells,fortheirexcellentresults,makingitaseffectiveassheepbloodagar.
Keywor ds: Pharyngitis, sodium azide, beta hemolytic, positive predictive value,
negativepredictivevalue.
1. INTRODUCCIN
Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) en la actualidad, uno de los mayores
problemasde SaludPblicaenelmundo,eslaelevadaprevalenciadebacteriascausantesde
enfermedades humanasyel crecientenumerodebacteriasresistentesa los antimicrobianos.
Las infecciones del tracto respiratorio son las ms frecuentes y se caracterizan por producir
unaelevada mortalidad al ser unpunto de encuentroentreel ser humano interno y el medio
exterior, lo que motivan numerosas consultas mdicas y ocasionan una gran parte de las
prescripcionesdeantimicrobianos.
La faringoamigdalitis es la que muestra mayor importancia, es frecuente en la poblacin
peditricacomotambinenadolescentesyadultosjvenes,esmsprevalenteenclimasfros
yenlosperiodosdeinviernoyprimaveraporloqueennuestraciudadestasituacinsehace
mspreocupante.
Mltiples agentes virales y bacterianos son capaces de producir faringoamigdalitis, la
infeccinsecaracterizaporsergeneralmenteunaenfermedadbenignaydecursoautolimitado
cuandoesdeetiologaviral,perocuandoesdeorigenbacterianoestesuelesermscomplejo.
Streptococcus pyogenes beta hemoltico del grupo A es el principal agente etiolgico de las
faringoamigdalitisbacterianas.Motivoporelcualesmuyimportanteundiagnosticoenforma
correcta y oportuna, para iniciar un tratamiento adecuado que resuelva el problema, pero
principalmente para prevenir las posteriores complicaciones de la infeccin como lo son las
complicacionessupuradasynosupuradas(fiebrereumtica,glomrulonefritis).
El cultivo de hisopado faringeo en agar sangre con 5 % sangre de carnero es el mtodo
estndar de referencia para el aislamiento de Streptococcus pyogenes por su elevada
sensibilidadyespecificidad,apesardeltiempoquedemandasurealizacinde48a72horas,
es recomendada endiferentesnormas y opinionesdeexpertos.Sin embargo debencumplirse
lascondicionesadecuadasparaelcultivoyaqueestassonbacteriasdedifcilaislamientoyse
deben tomar todas las precauciones para evitar reportar resultados errneos, principalmente
resultados falsos negativos, que confunden al medico tratante y pueden llevar a
complicacionesdelainfeccin,queenalgunoscasossonfatales.
Una falencia que se ha visto con frecuencia en los centros de salud de nuestra ciudad y del
pas, es que en los laboratorios de Bacteriologa Clnica se utiliza como alternativa de la
sangredecarnero,lasangrehumanaenlapreparacindelagarsangre.Lasangredecarneroes
recomendada por normas nacionales e internacionales, pero por su elevado costo y difcil
acceso sebuscounaalternativacomo lasangrehumanaquees msaccesible, peroelusode
sangrehumanapuedeafectarel resultadode lapruebaencierta magnitud, yaque tieneensu
composicin elementos que pueden interferir con el normal desarrollo de Streptococcus
pyogenes.
Por lo tanto, en este estudio con el objetivo de encontrar alternativas para el diagnostico de
Streptococcus pyogenes beta hemoltico, se evaluaron medios de cultivo utilizando sangre
humana, peroconalgunas modificacionesquepermiten aumentar sueficacia ydeestaforma
conocer elalcancedecadaunoencuantoasusensibilidad,especificidadyvalorespredictivos.
1.1 ANTECEDENTES
La faringoamigdalitis es una de las infecciones del tracto respiratorio ms frecuente, su
incidencia es mayor en sectores sociales ms desfavorecidos como respuesta a una dieta,
viviendaycondicionesgeneralesdepobreza, elinviernoyelcomienzodelaprimaverasonlas
pocas del ao ms propicias.
1
Un diagnostico preciso es de gran importancia cuando el
agente causal es Streptococcus pyogenes beta hemoltico, principalmente por las
complicacionesquesepuedenpresentar(complicacionessupuradasynosupuradas).
2
EnChileunestudiode Cofreycolaboradoresenel2005, indicaque lamayorade loscasos
de faringoamigdalitissondeetiologa viral y elrestoesdeetiologabacteriana, dentrodelas
causasbacterianas ms frecuentesStreptococcuspyogenes es laprincipal,siendo responsable
de15a30%delafaringoamigdalitisagudasenniosyde5a10%enadultos.
3
UnestudiorealizadoenelHospitaldelNiodeLaPazennuestropasen1998,muestraque
dentro de los agentes etiolgicosbacterianos queproducen faringoamigdalitis, Streptococcus
pyogeneseselagentemsfrecuenteconun56.6%.
2
Bisno y colaboradores indican que en ausencia de complicaciones, la faringoamigdalitis
estreptoccica se autolimita, sin embargo casi siempre reciben tratamiento antimicrobiano
luego de un cultivo positivo. Alrededor de 15 % de los individuos con faringoamigdalitis
estreptoccica puede convertirse en portadores asintomticos y ser susceptibles a
complicacionesestreptoccicas.
3
Fica en un estudio realizado en Chile el 2002, muestra que el diagnstico clnico de
faringoamigdalitispresentaunabajaespecificidad,debidoaquesoloel10a30%soncasos
de faringoamigdalitis estreptoccica, por lo que se debe realizar un prueba de diagnstico
microbiolgico el cual es el cultivo de hisopado faringeo en agar sangre de carnero, que
realizadoenformacorrectatieneunasensibilidadde90a95%yesconsideradocomopatrn
dereferenciadiagnstica.
5
Enel2006ChvezycolaboradoresenelPerrealizanunestudiodondeindicanqueelcultivo
dehisopadofaringeorealizadoenagarsangrehumanapermiteelaislamientodeStreptococcus
pyogenes al igual queel agar sangredecarnero, mostrando de este modo que el agar sangre
humanapuedeserusadocomounaalternativa.
4
Ennuestropasnosetienenestudiosrelacionadosconlaevaluacindemediosdecultivopara
el aislamiento de Streptococcus pyogenes, por lo que no se tienen antecedentes publicados,
siendoporlotantoestetrabajodelosprimerosqueserealizan.
1.2 PLANTEAMIENTODELPROBLEMA
La faringoamigdalitis representa para todos los pases un importante problema de salud que
motivan numerosas consultas mdicas y ocasionan una gran parte de las prescripciones de
antimicrobianos, es frecuente en la poblacin peditrica como tambin en adolescentes y
adultosjvenes,msprevalenteenclimasfrosyenlosperiodosdeinviernoyprimavera,por
loqueennuestraciudadestasituacinsehacemspreocupante.
La faringoamigdalitis es de etiologa viral y bacteriana, donde el principal agente causal
bacterianoesStreptococcuspyogenesbetahemolticodelgrupoA,responsabledel10a30%
deloscasosdefaringoamigdalitis.Motivoporelcualsedebe realizarundiagnosticopreciso
en forma correcta y oportuna, y as iniciar el tratamiento adecuado para aliviar los signos y
sntomas del paciente, para reducir la transmisin a los contactos ms cercanos, para
minimizar los efectos adversos de los antimicrobianos administrados y la posible resistencia
que esta puede generar ante un diagnostico errneo, pero principalmente para prevenir las
posteriores complicaciones de la infeccin como lo son las complicaciones supuradas y no
supuradas(fiebrereumtica,glomrulonefritis)quepresentanelevadastasasdemortalidad.
Elcultivoenagarcon5%desangredecarneroeselmtodoestndarparaelaislamientode
Streptococcus pyogenes en la faringe, pero cuando no secumplen lascondiciones adecuadas
en el cultivo se cometen errores al emitir resultados. Se pueden presentar resultados falsos
positivosyfalsosnegativosquesonfatalesparaelpaciente,cuandoexistencomplicacionesde
lainfeccin.
Los resultados falsos positivos pueden deberse a el aislamiento de Estreptococos beta
hemolticos de otros grupos, tambin al aislamiento de Arcanobacterium haemollyticum o
Haemophylus haemolyticus que presentan colonias parecidas a Streptococcus pyogenes beta
hemoltico en el cultivo, que se dan cuando no se aplican pruebas complementarias que
confirmenunaacertadaidentificacin.
Tambin se presentan resultados falsos negativos por las caractersticas de Streptococcus
pyogenes,queesunabacterianutricionalmenteexigenteydedifcilaislamiento,igualmentese
puededeberaunamalatomademuestra,unmalprocesamientodelamuestra,unaincubacin
breve (menos de48horas), presencia de cepas no hemolticasde Streptococcus pyogenes o
porelusodemediosdecultivoalternativos,comoelusodesangrehumanaenvezdesangre
decarnero.Esteltimoeseltemadondesecentraesteestudio.
La sangre de carnero es recomendada por normas nacionales e internacionales en la
preparacindelagarsangre,peroporsuelevadocostoydifcilaccesibilidad,sololaboratorios
dereferenciaeinvestigacinlautilizan,yaquecuentanconambientesptimosypresupuesto
necesario.Adems,confrecuenciaenloslaboratoriosdeBacteriologaClnica,sehavistoque
utilizansangrehumanacomoalternativaenlapreparacindelagarsangre.Sinembargoeluso
de la sangre humana puede afectar el resultado de la prueba en cierta magnitud, ya que la
sangre humana tiene en el plasma elementos (inmunoglobulinas, complemento, etc) que
pueden interferir con el normal crecimiento de Streptococcus pyogenes, del mismo modo el
anticoagulante con el cual fue obtenida la sangre humana puede interferir con la prueba.
Motivo por el cual este estudio evala medios de cultivo utilizando sangre humana, para el
aislamientodeStreptococcuspyogenes betahemoltico.
1.3 J USTIFICACIN
La mejor herramienta diagnstica de la faringoamigdalitis estreptoccica aun permanece en
debate,condiferentesopciones,debido a lamagnituddeesteproblemayalasimplicaciones
deeficaciaycosto.
Lasopcionesincluyeneldiagnsticoclnicosinestudiobacteriolgico,elcualtieneunabaja
especificidady secorreel riesgode un tratamientoantimicrobiano inadecuadooinnecesario.
La confirmacin bacteriolgica por el cultivo de hisopado farngeo a pesar del tiempo que
demanda su realizacin de 48 a 72 horas, es recomendada en diferentes normas y por
opinionesdeexpertos.Tambinseutilizanpruebasdiagnsticasrpidasperoestastienenuna
baja sensibilidad y un resultado negativo debe ser confirmado mediante cultivo, y adems
tienenunmayorcosto.
El cultivo de hisopado faringeo en agar sangre con 5 % sangre de carnero es el mtodo de
referenciaopatrndeoro (gold standard)para elaislamientode Streptococcus pyogenespor
su elevada sensibilidad y especificidad, sin embargo deben cumplirse las condiciones
adecuadas para el cultivo ya que estas son bacterias de difcil aislamiento y se deben tomar
todas las precauciones para evitar reportar resultados errneos, principalmente resultados
falsos negativos.
Con frecuencia en loscentros desalud denuestra ciudad y del pas se ha observado que los
laboratorios de Bacteriologa Clnica, utilizan como alternativa de la sangre de carnero, la
sangre humana en la preparacin del medio de cultivo agar sangre, debido a que la sangre
humanaesmsaccesibleynotienecosto.Porlotantoenestainvestigacinconelobjetivode
evaluar estas alternativas, para el diagnostico de Streptococcus pyogenes beta hemoltico se
evaluaronmediosdecultivoutilizandosangrehumana,peroconalgunasmodificacionescomo
el uso glbulos rojos lavados y otras modificaciones, con el fin de establecer las mejores
condicionesparaelaislamientodeStreptococcus pyogenes.
Los medios de cultivo evaluados son agar sangre humana con glbulos rojos lavados, agar
sangre humana con glbulos rojos lavados ms azida sodica y agar sangre humana con
glbulos rojos sin lavado, utilizando el agar sangre de carnero como prueba de referencia o
patrndeoro(goldstandard).
En este sentido la evaluacin de los medios de cultivo alternativos, permite determinar los
alcances de cada uno en cuanto a su sensibilidad, especificidad y valores predictivos.
Conociendolaeficaciadelosmediosdecultivo,sepretendedarunaalternativaconfiableque
permita introducir estos mtodos en el trabajo de rutina del laboratorio de Bacteriologa
Clnica, cuando no se tiene sangre de carnero y de esta manera evitar dar un diagnostico
errneo,principalmenteevitarreportarresultadosfalsosnegativos.
1.4 MARCOTERICO
1.4.1 CONCEPTO
Las infecciones del tracto respiratorio superior son las ms frecuentes y se caracterizan por
producirunaelevadamortalidadalserunpuntodeencuentroentreelserhumanointernoyel
medioexterior.
5
Las vas areas superiores estn constituidos por la nasofaringe y la orofaringe, que se
encuentran comunicadas con los senos paranasales y el odo medio y estn colonizados por
unaflorabacterianaconstituidapormsde200especiesqueproduceninfeccionesaesenivel,
lasmsfrecuentessonfaringitis,faringoamigdalitis,sinusitis,otitis,infeccionesdiftericas,tos
ferinayanginadeVincent.
6
La infeccin de la orofaringe o nasofaringe constituye una de las principales causas de
consulta mdica y uso de antibiticos en la atencin primaria. Mltiples agentes virales y
bacterianos son capaces de producir faringoamigdalitis, la infeccin se caracteriza por ser
generalmenteunaenfermedadbenignaydecursoautolimitado.
7
Lafaringitisamigdalitis,esunprocesoinflamatoriodifusodelosfolculoslinfoidesdela
faringe, con participacin de la mucosa y de las estructuras subyacentes.
5,6
Dada la
continuidadanatmicasuelenafectarsezonascontiguastalescomolasamgdalas(adenoiditis,
tonsilitisoamigdalitis),la mucosanasal (rinitis), lavulayelpaladarblando.Porefectos
prcticosdesignos, sntomasyetiologa, enlaprctica clnicaseengloba esteprocesocomo
faringoamigdalitis.
8
El 60 a 80 % de pacientes con faringoamigdalitis obedecen a una etiologa viral. Los virus
involucrados ms frecuentemente son Rhinovirus, Adenovirus, Parainfluenza, Virus
respiratorio sincitial, Virus herpes simple, el Virus EpsteinBarr es un agente frecuente de
faringitis y generalmente se manifiesta con las caractersticas clnicas de una mononucleosis
infecciosa. Enfermedades sistmicas como Citomegalovirus e Influenza entre otras, pueden
estar asociadas a faringitis aguda, como tambin la primoinfeccin del Virus de la
inmunodeficienciahumana(VIH).
5,9
El 20 a 40 % de las faringoamigdalitis son de origen bacteriano, la causa bacteriana ms
frecuente y susceptible de ser tratada con antimicrobianos, es Streptococcus pyogenes beta
hemoltico del grupo A de Lancefield, en nios alcanza una frecuencia de 15 a 30% y en
adultosde5a10%.
9
Otros microorganismos tambin puedenproducirun cuadro de faringoamigdalitisbacteriana,
pero se detectan con menos frecuencia, entre ellos se encuentran estreptococos beta
hemolticosdelgrupoCyG,Corynebacteriumdiphteriae,Neisseriagonorrhoeae,Chlamydia
pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,
Arcanobacteriumhaemolyticum(adolescentes)y Staphylococcusaureus.
9,10
Debido a la importancia para este estudio, desde un punto de vista clnico, diagnostico y
teraputiconosconcentraremosfundamentalmenteenlafaringoamigdalitisporStreptococcus
pyogenesbetahemolticodelgrupoA.
1.4.2 FARINGITISESTREPTOCOCICA
Streptococcus pyogenes beta hemoltico del grupo A se presenta microscpicamente como
clulas esfricas de 0.6 1.0 um de dimetro, se agrupan en forma de cocos en cadenas de
longitud variable en muestras clnicas o cuando crecen en medios lquidos enriquecidos.
Tienen una pared celular gram positiva, son inmviles, no formadores de esporas, catalasa
negativosy anaerobiosfacultativos.
11
Fig.1. TincingramdeStreptococcuspyogenesenmuestradehisopado faringeo.
Los estreptococospuedendiferenciarse de forma ms precisa en serogrupos en funcin a las
caractersticas antignicas de los hidratos de carbono de la pared celular, esta clasificacin
realizadapor Rebeca Lancefield permite distinguir 18 grupos de la A a H y K a T, los ms
importantes son los grupos A, B, C, D, F y G donde Streptococcus pyogenes pertenece al
grupoA.
12,13
Nutricionalmente son bacterias exigentes, requieren medios complejos enriquecidos con
sangre para su desarrollo ptimo. En agar sangre crecen formando colonias traslucidas o
transparentes de superficie lisa, de 0.3 a 0.5 mm de dimetro con un halo beta hemoltico
alrededor.
13
Fig.2.DesarrollodecoloniasbetahemolticasdeStreptococcuspyogenesenagarsangrede
carnero.
1.4.2.1 FACTORESDEVIRULENCIA
Se han identificado un gran numero de componentesestructurales yproductos extracelulares
enStreptococcuspyogenes.
Entreloscomponentesestructuralestenemos:
a) Capsula de cido hialuronico, es la capa ms superficial del microorganismo, es un
polmero lineal de alto peso molecular compuesto por unidades repetidas de disacridos.
Desde el punto de vista qumico es indistinguible del material fundamental del tejido
conectivoloqueexplicalafaltadeinmunogenicidaddelacapsula,dificultandosufagocitosis,
laproduccindecapsulaesmximadurantelafasedecrecimientologartmico.
14
b) La pared celular, esta formado por un peptidoglucano grueso junto con los cidos
lipoteicoicosintegrales.Recientesestudiosdemuestranqueloscidoslipoteicoicos integrales
desempeanunpapelimportanteenlaadherenciainicialalasclulasepitelialesfaringeas.
13,14
c)Elcarbohidratoespecificodegrupo(carbohidratoC),constituidopor undimeroderamnosa
yNacetilglucosamina.
14
d)LaprotenaMdelaparedcelular,constituyeelmayorfactordevirulencia.Esdeestructura
fibrilar, se encuentra como un dimero estable formando un complejo entre ellas, en
configuracin alfa hlice. Se encuentra anclada a la membrana celular y atraviesa la pared
celular.LascepasconabundanteprotenaMsemultiplicanrpidamenteyaquepuedeneludir
la fagocitosis interfiriendo en la opzonizacion a travs de la inhibicin de la activacin de la
va alterna de la cascada del complemento. La protena M tambin tiene la habilidad de
precipitar fibrinogeno directamente en la superficiebacteriana. Las cepasque no expresan la
protena M son avirulentas. El efecto antifagocitico es anulado en presencia de
concentracionesadecuadasdeanticuerpostipoespecficos.
13,15
e)Elfactordeopacificacindelsuero(FO),esotro antgenodelasuperficiecelularasociado
a la protena M. El FO es una alfalipoproteinasa capaz de opacificar el suero de mamfero.
PeronotodaslascepastipificablesporlaprotenaMposeenestefactor.ElFOesantignicoy
tipoespecifico,porquesuhabilidaddeopacificarelsueropuedeserinhibidaporanticuerpos
homlogos y no heterlogos de la protena M. Este factor es importante principalmente por
dosrazones:
Es un marcador epidemiolgico muy til que ayuda en la clasificacin de los
estreptococoscuandonoesdetectableporlaprotenaM.
LarespuestatipoespecificaynoespecificaalaprotenaMesgeneralmentemsdbil
despusdeunainfeccinfaringeaconFOpositivoqueconserotiposnegativos.
13,16
f) Las protenas T y R son otro complejo antignico que no interviene en la patogenicidad
bacteriana,perosontilesparacompletarlatipificacindeestreptococos,enespecialencepas
noidentificablesporlaprotenaM.
13
g)Laprotena Fnofibrilar,juegaunrolcrticoeneliniciodelacolonizacin,se adhiereala
fibronectina, que es una glucoproteina situada en la superficie de las clulas epiteliales
humanas.
h) Recientemente sehadescrito una peptidasa unida a la clula que cliva elcomponente C5
delcomplementoeinhibelaquimiotaxisdelosneutrofilosinvitroeinvivo.
10
Fig.3.FactoresdevirulenciadelaestructuradelaparedcelulardeStreptococcuspyogenesy
productosextracelulares.
Streptococcus pyogenes elabora numerosos productos extracelulares, de los cuales solo un
numerolimitadohansidobiencaracterizados.
a)Hemolisinas:Producendostiposdehemolisinas,laestreptolisinaOylaestreptolisinaS.
La estreptolisinaO,deriva sunombreporsu labilidad aloxigeno,es inhibida por eloxigeno
deformareversibleyporelcolesterolenformairreversibleademsdesuefecto ltico sobre
PRODUCTOS
EXTRACELULARES
Estreptolisinas
DNAasa
Hialuronidasa
Estreptoquinasas
Estreptodornasas
Exotoxina
pirogena
Proteina M
Capsula(acido hialuronico )
Acidos lipoteicoicos
Peptidoglicano
Carbohidrato antigenico degrupo
(substancia C)
Proteinas RyT
Membranacelular
loseritrocitosestoxicaparadistintostiposcelularescomoleucocitos,monocitosyclulasen
cultivo. Por su labilidad al oxigeno esta hemolisina es responsable de la beta hemlisis por
debajo de la colonia y en los sitios de picado en el agar sangre. La estreptolisina O es
producidaporcasitodaslascepasS.pyogenes(grupoA)ytambinporalgunosestreptococos
delosgruposCyG.Comorespuestadelsistemainmuneseproduceunanticuerpodespusde
una infeccin por cualquier estreptococo productor de estreptolisina O (ASTO), dicho
anticuerpo bloquea la hemlisis por estreptolisina O y este fenmeno proporciona las bases
para la determinacin del anticuerpo en el suero de los pacientes. Un ttulo de
antiestreptolisina O (ASTO), por arriba de 160 Ul/ml, se considera elevado y sugiere una
infeccinrecienteporS.pyogenes.Losanticuerpos(ASTO),sondetipoIgG.
13,15
La estreptolisina S, producida por estreptococos en presencia de suero o de otras sustancias
como albmina, alfalipoproteina, RNA. Es estable al oxigeno pero termolbil, no es
antignico y al igual que la estreptolisina O es toxica para distintos tipos celulares. Por sus
caractersticas es responsable de la hemlisis que se observa en las placas de agar sangre
alrededorypordebajodelacolonia.
13,17
b) La exotoxina pirgena estreptoccica (SPE), antes conocida como toxina eritrogenica, es
responsable de la erupcin de la escarlatina. Experimentalmente esta sustancia exhibe una
variedaddeotraspropiedadestoxicasincluyendopirogenicidadycitotoxicidad.Seconocen10
toxinas serologicamente diferentes (A J), cuyos efectos pueden ser neutralizados por
anticuerpos.
13
c) Muchos productos extracelulares, pueden favorecer la licuefaccin del pus y la
diseminacindeS.pyogenesatravsdelosdiferentesplanostitulares,estosincluyen:
EnzimasantigenicamentedistintasquedegradanalDNA:DNAsasA,B,CyD.
Hialuronidasa,quedegradaenzimaticamentealacidohialuronicodeltejidoconectivo.
Estreptoquinasa, que promueve la disolucin de cogulos al catalizar la conversin de
plasminogenoenplasmina.
Otrosproductosextracelularesson:NADasas,proteinasas,amilasayesterasa.
18
1.4.2.2 MANIFESTACIONESCLINICAS
La transmisin de la faringoamigdalitis estreptoccica se da por contacto estrecho persona
persona por va area, a travs de las secreciones, generndose brotes pequeos en grupos
cerradososemicerradosypuedealcanzarunafrecuenciadehastael 30%enlosmesesfros.
18
Las manifestaciones clnicas sepresentan luegodeun periodode incubacin inicialde 2 a 4
das, el inicio suele ser sbito con fiebre, odinofagia, cefalea, malestar general y dolor
abdominal.
13
En el examen fsico se puede encontrar congestin de la faringe y amgdalas con o sin
exudado blanco grisceo, los ganglios linfticos cervicales anteriores habitualmente son
dolorosas a la palpacin y estn tumefactos. La infeccin por cepas que elaboran las
exotoxinas pirgenas A, B o C pueden producir una erupcin escarlatiniforme en pacientes
que no poseen anticuerpos antitoxina, caractersticamente la erupcin aparece a las 24 a 48
horasdespusdeliniciodelossntomasyluegode3a4dascomienzaadesaparecerseguido
por descamacin de la piel. La presencia de rinorrea, disfona, tos o diarrea no son
manifestaciones producidas por Streptococcus pyogenes y sugieren una etiologa viral o por
micoplasmas.Noexistenelementosdelahistoriadelpacienteoexamenfsicocapacespors
solos de hacer el diagnstico seguro. En ausencia de complicaciones la faringitis
estreptoccica es autolimitada, pero casi siempre se realiza tratamiento antimicrobiano al
paciente. Sin embargo alrededor del 15% de los individuos con faringitis estreptoccica
puedenconvertirseenportadoresasintomticoluegodeltratamiento.
13,19
1.4.2.3 COMPLICACIONES
La faringitisestreptoccicapuede originarcomplicaciones,clsicamente sedescriben 2 tipos
decomplicaciones: supuradasynosupuradas.
1.4.2.3.1 COMPLICACIONESSUPURADAS
Las complicaciones supuradas son el resultado de la invasin del microorganismo a
estructuras adyacentes e incluye el absceso periamigdalino, absceso retrofarngeo, adenitis
cervicalsupurada,sinusitis,otitismedia,mastoiditisybacteriemia.
13
1.4.2.3.1.1 Infeccionescutneas
Impetigo. Ocurre en nios de 5 a 15 aos y se caracteriza por la aparicin de vesculas que
evolucionanapstulasqueseabrenenlos5a7dassiguientesparaformarcostrasgruesas,en
generalestaslesionessepresentansobrelosmiembrosinferioresytambinpuedeinvolucrarse
conStaphylococcusaureus.
19
Erisipela.Esunainfeccinasociadacontejidosblandosylinfticoscutneos,seproduceuna
inflamacinagudadelapiel.Puedeafectarcara,extremidadesotroncocursaconfiebrealta,
escalofrosysignosdetoxicidad.Lospacientessuelentenerfaringitisestreptoccicaasociada,
eltratamientoconpenicilinaescurativo.
18,19
Celulitis. Es una inflamacin aguda extendida de la piel y el tejido subcutneo, que puede
seguir aquemaduras,heridasoincisionesquirrgicas. Sediferenciadelaerisipelaporque la
lesinnoestadelimitadaynoexisteunademarcacinentrelaszonasafectadas.Seacompaa
de fiebre, escalofros, linfangitis y en ocasiones con bacteriemia. Suele observarse en los
consumidoresdedrogasintravenosas.
20
Fascitis necrotizante. Es una infeccin de las fascias y tejidos subcutneos profundos,
caracterizada por una necrosis rpida y extensa. Tpicamente se inicia con una lesin
traumtica,la inflamacin seextiende yse intensifica, lapiel seoscurecey se tornaprpura.
Seacompaafrecuentementedebacteriemia.Lastasasdemortalidadsonaltasinclusoconun
tratamientoadecuado.
20
Sepsis puerperal. Se presenta en mujeres luego del parto o un aborto, los microorganismos
invaden los genitales internos y causan endometritis, linfangitis, bacteriemia, fascitis
necrotizante y sndrome de shock toxico estreptoccico, tambin se observo la transmisin
intrapartoloqueconduceaunaenfermedadgraveyamenudomortalenelneonato.
21
1.4.2.3.2 COMPLICACIONESNOSUPURADAS
Lascomplicacionesnosupuradascorrespondenala fiebre reumticayglomerulonefritispost
estreptoccica.
1.4.2.3.2.1 Fiebrereumtica(FR)
Sepresenta 2 a5 semanasdespusdeunafaringitisestreptoccica y semanifiestacomouna
enfermedad febril aguda. La FR es una colagenopatia multisistemica tarda, clnicamente se
puede ver artritis migratoria de las grandes articulaciones, carditis y valvulitis, eritema
marginado, ndulos subcutneos y corea de Sydenham, los que se pueden presentar en
diferentes grados de intensidad y mltiples combinaciones. Las infecciones cutneas por
StreptococcuspyogenesdesencadenanFR.SeasociaconcepascondeterminadosserotiposM
llamadoscomnmente cepas reumatogenas,esta cepastienen lacaractersticadenoposeer
elfactordeopacidadydeposeerunagruesacapsula.
18,19
La patologacardiaca afecta el endocardio, miocardio, pericardio y ms a menudo la vlvula
mitral, que se manifiestan clnicamente como soplos cardiacos, cardiomegalia, insuficiencia
cardiacacongestiva,pocasvecesdepresentaparocardiacoymuerte.
En general la artritis es migratoria, afecta mltiples articulaciones, principalmente en codos,
rodillas,tobillosymuecas.
19
Las manifestaciones agudas de la FR duran de 3 a 6 meses, el diagnostico diferencial es
amplio, los hallazgos de laboratorio muestran una eritrosedimentacion elevada, protena C
reactiva elevada y la deteccin de una infeccin estreptoccica previa (S. pyogenes)
demostradaporcultivodehisopadofaringeoypor ttulos elevadosocrecientesdeanticuerpos
antiestreptococicos.
13
El tratamiento consiste en la administracin de penicilina G benzatinica cada 4 semanas, en
paciente alrgicos se utiliza eritromicina. La duracin del tratamiento esta en controversia,
algunosgruposopinanquenodebeserdescontinuadahastaqueelpacientecumpla20aosy
otrosquesemantengademaneraindefinida.
20
El tratamiento adecuado de la faringoamigdalitis estreptoccica hasta 9 das despus de
iniciadoslossntomasescapazdeprevenirestacomplicacinpostestreptococica.
13,21
1.4.2.3.2.2 Glomerulonefritispostestreptoccica
Sepresenta10dasdespusdeunafaringoamigdalitisestreptoccicay3a6semanasdespus
de una infeccin cutnea por cepas de S. pyogenes llamadas nefritogenas. Es una
enfermedadinflamatoriadelglomrulorenalqueseasociaconlesionesglomerularesdifusas,
hipertensin,hematuriayproteinuria.
19,20
Clnicamente la enfermedad se caracteriza por malestar general, anorexia, cefalea, edema y
congestincirculatoria.
En general se puede demostrar el antecedente de una infeccin por S. pyogenes por el
aislamientodeesteenuncultivodehisopadofaringeoolesionesdepieloporlaelevacinde
anticuerposantiestreptoccicos.
La han propuestos varias teoras para explicar el mecanismo por el cual se produce este
cuadro, la ms sostenible explica que los estreptococos inducen la formacin de anticuerpos
antiestreptoccicos contra los antgenos de la capsula, de la pared celular y la membrana
celular quedan reaccionescruzadas condistintasporciones antignicasen tejidocardiaco, el
sarcolema miocrdico, el msculo esqueltico, articulaciones y tejido renal (a nivel del
glomrulo)
13,22
Para el tratamiento el paciente debe recibir penicilina G benzatinica para erradicar las cepas
nefritogenas, el tratamiento antimicrobiano adecuado y oportuno no parece proteger
completamente de esta complicacin. A diferencia de la fiebre reumtica no se recomienda
unaprofilaxiscontinuayaquesonraroslosepisodiosdeglomerulonefritispostestreptoccica
recurrentes.
13,18
1.4.2.4 DIAGNOSTICOBACTERIOLOGICO
Frente a la sospecha clnica, debe realizarse la confirmacin etiolgica. Los objetivos de un
diagnsticorpidoyadecuadoson:
23,24
Prevenir las complicaciones supuradas y no supuradas con tratamiento antibitico
oportuno.
Mejorar lossignosysntomasclnicos delpaciente.
Reducir latransmisindelainfeccinalaspersonascercanas.
Minimizar los potenciales efectos adversos derivados del uso inadecuado de
antimicrobianos.
1.4.2.4.1 CULTIVOFARNGEO
Elhisopadofarngeocultivadoenagarsangredecarneroeshastahoyelmtododereferencia
(gold standard) parael diagnstico de faringoamigdalitis estreptoccica y realizado en forma
correcta,tieneunasensibilidadde90a95%.
7
1.4.2.4.1.1 Obtencindelamuestra
Se debe enfocar una luz brillante dentro de la cavidad bucal por encima del hombro de la
personaquetomalamuestra,luegoseutilizaunbajalenguasparadeprimirlalenguaconelfin
detenerunabuenavisualizacindelafaringey amgdalas.
Se pide al paciente que respire profundamente y con un hisopo se frota con firmeza ambas
amgdalas y la faringe posterior, tambin se debe tomar una muestra de todo el exudado
purulentosiexiste.
Al introducir y retirar el hisopo se debe tener cuidado de no tocar las paredes laterales de la
cavidad bucal o lengua para reducir al mnimo la contaminacin con bacterias de la flora
comensal.
Luego de la recoleccin de la muestra se introduce el hisopo enun tuboestril con solucin
fisiolgica u otro medio de transporte (conservar menos de 2 horas a temperatura
ambiente).
13,25
1.4.2.4.1.2 Siembra
Una vez tomada la muestra se siembra en 1/3 de una placa de agar sangre de carnero y se
agotaenlasuperficieconunasabacteriolgica,haciendocortesenprofundidaddetalmanera
queseexpreselahemolisinaOdeStreptococcuspyogenes.
El cultivoseincubade 35 a37 C yla primeralecturasehace a las18 a 24horas buscando
coloniasbeta hemolticas.Si no sehan desarrollado estascolonias, sevuelve aincubar hasta
las 48 horas. La incubacin anaerobia y el uso de medios selectivos pueden aumentar la
proporcin de cultivos positivos. La incubacin en CO
2
favorece el desarrollo de otros
patgenosfarngeoscomoArcanobacteriumhaemolyticum.
13,26
1.4.2.4.1.3 Interpretacindelcultivo
Losestreptococosenagarsangrepuedenproducirtrestiposdehemlisis:
Alfa hemlisis, es la lisis parcial de los eritrocitos que rodea a una colonia, producen un
cambiodecolorgrisverdosooparduzcoenelagarsangre.
Beta hemlisis, es la lisis completa de eritrocitos, que produce una eliminacin de la sangre
delmediodebajodelacoloniayasualrededor.
Gama hemlisis, son colonias que no muestran hemlisis, no producen cambio en el medio
debajodelascoloniasyasualrededor.
Las colonias de S. pyogenes son circulares, beta hemolticas, de borde entero, de dimetro
variable(0.3a0.5mm).Puedenpresentartresformas:mate,brillanteymucosa.Eltamaode
la zona de hemlisis es de dos a cuatro veces el dimetro de la colonia, en alguna cepas es
menormicroscpicamentesoncocosgram(+)encadena.
26
Para diferenciar S.pyogenesdeotros estreptococosbeta hemolticos sepuedenusardistintos
mtodos.
PruebadelaCatalasa:Lacatalasaesunaenzimaquedescomponeelperoxidodehidrgeno
(H
2
O
2
) en oxigeno y agua. Desde el punto de vista qumico es una hemoproteina similar en
estructuraalahemoglobina,exceptoenquelos4tomosdehierroenlamolculaestnenla
formaoxidadaenlugardereducida. Lacatalasaactasegnlasiguientereaccin.
2H
2
O
2
2H
2
O+O
2
(burbujasdeoxigeno)
Salvo los estreptococos, la mayor parte de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas
poseen actividad catalasa. En ste caso el resultado debe ser negativo, ya que sta prueba
permitediferenciaraS.pyogenesdeS.aureus(poseelaenzimacatalasa) principalmente.
13
Bacitracina: Esta prueba se basa en la susceptibilidad de S. pyogenes a la bacitracina, este
antimicrobiano se une al Bactoprenol, molcula lipdica de membrana que transporta las
subunidades de peptidoglicn hacia la cara externa de la membrana. La prueba se realiza
mediante la colocacin de un disco que contiene 0,04 U de bacitracina sobre la colonia
extendida.Aldasiguientesedeterminalasusceptibilidadaellamediantelamedicindelhalo
deinhibicindecrecimiento,cualquierzonadeinhibicinalrededordeldiscoseconsiderauna
pruebapositiva.Estatcnicatiene5%defalsosnegativosyentre10y20%defalsospositivos
yaquehayotrosestreptococos(gruposCyG),quetambinsonsusceptibles.
13,27
Trimetoprimsulfametoxazol: La prueba de sensibilidad a Trimetoprimsulfametoxazol
distinguelosestreptococosdel grupo A y Bdeotrosestreptococos betahemolticos. Cuando
seutilizajuntoalabacitracinaayudaadistinguirestreptococosdelgrupoAyB.LascepasA
y B son resistentes a Trimetoprimsulfametoxazol. Se utiliza un disco comercial (1,25 ug
Trimetoprim y 23,75 sulfametoxazol), cualquier zona de inhibicin indica sensibilidad a
Trimetoprimsulfametoxazol.
13
Este antimicrobianointerfiere conelmetabolismo del cido flico,queesunprecursor de la
sntesisdepurinas,pirimidinasyaminocidos,bloquealasntesisdecidosnucleicosypared
celular.
Fig. 4.SitiosdeaccindelosantimicrobianosTrimetoprimsulfametoxazolybacitracina.
THF:Tetrahidrofolato,DHF: Dihridrofolato
Prueba de PYR: Es otro mtodo muy utilizado y se basa en la actividad de la enzima
pirrolidonil arilamidasa, el sustrato para la prueba es la
L
pirrolidonilbetanaftilamida libre
queeshidrolizadoporunaaminopeptidasaespecificabacteriana,lahidrlisisdelsustratopor
esta enzima libera betanaftilamida libre que se detecta por el agregado N,N
dimetilaminocinnamaldehdo, luego este reactivo de deteccin se une a la naftilamida para
formarunabasedeSchiffdecolorrojo.Esunapruebapresuntivatantoparaestreptococosdel
grupo A (Streptococcus pyogenes) como del grupo D. Es producida nicamente por estos
estreptococos, salvo algunos otros raramente aislados en clnica como Aerococos,
Estafilococos, Arcanobacterium haemolyticum, por lo que es esencial comprobar que la
bacteria estudiada es un estreptococo. Una gran ventaja es su rapidez de ejecucin y
lectura.
13,27
Prueba VoguesProskauer: El acido pirvico es el principal compuesto formado durante la
degradacin fermentativa de la glucosa, ms tarde se metaboliza a travs de diferentes vas
metablicas.Unadeesasvaseslavadefermentacinbutanediol,quedacomoresultadola
produccin de acetoina (acetil metil carbinol), en presencia de oxigeno atmosfrico e
hidrxidodepotasio(KOH)al40%,laacetoinaseconvierteadiacetiloyelalfanaftolsirve
de catalizador para producir un complejo rojo que indica una pruebapositiva. Enel casode
Streptococcuspyogenes,elresultadoesnegativoparalaprueba,seutilizaantecasosdudosos
conotrosestreptococosbeta hemolticos.
13
AlfaDglucosa Acidopirvico Acetoina+CO
2 KOH
Diacetilo
Diacetilo + alfanaftol + grupoguanidino(arginina)
condensacion
Productorosaorojo
1.4.2.4.2 TECNICASDEDETECCINDIRECTADEANTGENOS
Unadesventajadelcultivoesquedemoraentre2a3dasenentregarresultadosyporesose
handesarrolladopruebasdedeteccinrpidadeantgenos.
La prueba de deteccin de antgenos permite detectar al carbohidrato de la pared celular
bacterianadirectamente,apartirdeunhisopadofarngeo,conlaventajadeobtenerresultados
inmediatos.
22
El ensayo inmunoenzimtico es una alternativa altamente especfica ya que
existennumerososkitscomercialesdisponibles,estaspruebasemplean tcnicasdeextraccin
del antigeno especfico de grupo mediante un paso de extraccin enzimtica seguido de la
deteccindelantigenoextrado.Lamayoradelaspruebasdisponiblestieneunaespecificidad
mayor o igual a 97% comparado con el cultivo y una sensibilidad del 62% al 96%.
13
La
ventaja comparativa es el resultado inmediato, pero se recomienda realizar un cultivo de
hisopado farngeo confirmatorio ante un resultado negativo de la prueba directa yuna fuerte
sospechaclnica.
7,25
Tambin se han utilizado tcnicas moleculares como la reaccin en cadena de la polimerasa
consondasysondasamplificadasdeDNA,paraladeteccindirectaenmuestrasdehisopado
faringeo, la evaluacin de este ensayo muestra una sensibilidad del 88,6% al 94,8% y
especificidaddel98%al99,7%
9
por loqueenalgunos laboratorioshansustituidoel cultivo
conestapruebaparalaconfirmacindelosresultadosnegativosdelantigenodirecto.
28
1.4.2.5 TRATAMIENTO
El curso clnico habitual de los pacientes con faringoamigadalitis estreptoccica no
complicada es la resolucin de la sintomatologa en tres o cuatro das. Los objetivos del
tratamiento antimicrobiano son aliviar los signos y sntomas, y evitar las complicaciones
supuradas y no supuradas. Sin embargo aun sin tratamiento los pacientes tendern a la
resolucin espontneade su enfermedad, pero un porcentajede los pacientescon eventosno
tratadosdesarrollaruncuadrodefiebrereumticauotrascomplicaciones.
29
Eltratamientoantimicrobianoestindicadoenpacientesconfaringoamigdalitisestreptoccica
confirmada por cultivo farngeo o una prueba rpida positivo. S. pyogenes no ha presentado
hastaahora cepas resistentesa laspenicilinasocefalosporinas,o haber mostradounaumento
enlaconcentracininhibitoriamnima(CIM)enlasltimasdcadas,porlotantoapesardesu
ampliousopor msde 50 aos el tratamiento deeleccin es lapenicilina. La eritromicina o
algunodelosnuevosmacrlidoseslaeleccindesegundalneaydepreferenciaenpacientes
con hipersensibilidad a la penicilina.
30
Sin embargo existe una tasa de resistencia a
macrlidosqueestaentre5y7%.
7
En 1974 se aislaron en Japn las primeras cepas resistentes a macrlidos y de ah han sido
descritas ampliamente en la literatura, en la mayora de las reas ha permanecido en baja
frecuencia de resistencia, pero en pases como Espaa y Finlandia ha alcanzado porcentajes
superiores a 30%, lo que en varios trabajos se ha correlacionado con un mayor uso de
macrlidos.EnJapnseredujoelporcentajederesistenciade22%en1981a1%en1990,lo
quehasidoatribuidoaunadisminucindelusodemacrlidosduranteesetiempo.
S. pyogenes describe dos mecanismos de resistencia a macrlidos: modificacin del sitio
blancoyeflujoactivo.
31,32
Modificacindel sitioblanco. Este mecanismose producepor laadquisicin deungen erm
(erythromycin ribosome methylase) que codifica una enzima que N6 dimetila un residuo
especficodeadeninaenel23SrARN,produciendouncambioconformacionalenelribosoma
que disminuye la afinidad a macrlidos, lincosamidas y estreptograminas B, frmacos
qumicamentedistintosperoconsimilarmecanismoysitiodeaccin.Estaresistenciacruzada
seconocecomoresistenciafenotpicaMLSByseexpresaenformaconstitutivaoinducible.
Eflujo activo. Este mecanismo se produce por la presencia deun gen mef (macrolideefflux)
que codifica la sntesis de una bomba que media el eflujo en forma activa dependiente de
energa, se activa un sistema de expulsin para que la clula elimine a los macrlidos y
exprese su resistencia. Esteeflujo activo slo confiere resistencia a macrlidospor loque se
conoce como resistencia fenotpica M. Es el mecanismo de resistencia ms frecuentemente
descritoenS.pyogenes.
Fig.5.SitiosdeaccindelasPenicilinasyMacrolidos.
El tratamiento antibitico en faringoamigdalitis estreptoccica por antimicrobiano, dosis y
duracineslasiguiente:
PorviaoralseadministrapenicilinaV:
Ennios:250mgcada812horaspor10das,
En adolescentes y adultos: 250 mg cada 68 horaspor 10das o 500 mg c/ 12 horas por 10
das.
PorvaIntramuscularseadministrapenicilinaBenzatina:
Penicilina Benzatina de 1.2 x10
6
U para pacientes conuna masa mayoro igual a 27 kg en 1
dosis.
PenicilinaBenzatinade6x105Uparapacientesconunamasamenora27kgen 1dosis.
Para pacientes con reacciones de hipersensibilidad a la penicilina se administra por va
oral:
Eritromicinaestolato2040mg/Kg/dacada612horaspor10das.
Eritromicinasuccinato40mg/kg/dacada 612horaspor 10das.
Azitromicina5 15mg/kg/dacada24horaspor 5das.
Claritromicina15mg/kg/dacada12horaspor 10das.
Cefadroxilo30mg/kg/dacada12horaspor10das.
Cefuroximoaxetil20 30mg/kg/dacada12horaspor 10das.
Cefaclor20 40mg/kg/dacada812horaspor 10das.
Cefprozil15 30mg/kg/dacada12horaspor10das.
Clindamicina1020mg/kg/dacada68horaspor10das.
Laamoxicilinapuedeserutilizadaenlugardelapenicilinaoralenniospequeosdebidoasu
mejortoleranciaynoporventajasmicrobiolgicas.
33
1.4.2.6 PORTACIN,FRACASODETRATAMIENTOYREINFECCIN
Se entiende por portador aquelpacienteque en forma persistente presenta S.pyogenes ensu
faringe pero que se encuentra asintomtico y sin respuesta inmune correspondiente, no se
realiza tratamiento antimicrobiano en general excepto en casos con antecedentes de fiebre
reumtica.
Seentiendeporfracasodeltratamientoalapersistenciaorecurrenciadelossntomasosignos
sugerentesde faringoamigdalitisestreptoccica.El fracasorealeslaincapacidadde erradicar
el S. pyogenes responsable del episodio agudo de faringoamigdalitis luegode un tratamiento
antibiticoadecuado.Lafallaeneltratamientoconpenicilinasepuede atribuiralapresencia
de otras bacterias productoras debeta lactamasas, un mal cumplimiento del tratamiento,una
reinfeccindesdeunafuentecercanaoporundiagnsticoerrneo asociado a laportacinde
S.pyogenes.
26
Los pacientes que presentan mltiples reinfecciones pueden ser portadores crnicos de S.
pyogenes y su cuadro clnico ser provocado por otra etiologa. La amigdalectoma debe ser
consideradaexcepcionalmenteysloenaquellospacientesquepresentanepisodiosfrecuentes
enlosquesehadescartadorazonablementeunaportacincrnicadeS.pyogenes.
34
2. OBJ ETIVOS
2.1 OBJ ETIVOPRINCIPAL
vEvaluar mediosde cultivo alternativos parael aislamiento de Streptococcus pyogenes beta
hemoltico en pacientes con diagnostico clnico de faringoamigdalitis, utilizando el agar
sangredecarnerocomopruebadereferenciaopatrndeoro(goldstandard),enmuestrasde
hisopado faringeo depacientes que acuden al laboratorio del SELADIS durante los meses
deJulioaDiciembredel2008.
2.2 OBJ ETIVOSESPECFICOS
v Determinarlasensibilidaddelosmediosdecultivoevaluadosalas24horasy48horasde
incubacin.
v Determinarla especificidadde los mediosdecultivoevaluados a las24horas y 48horas
deincubacin.
v Determinar los valores predictivos positivos y negativos de los medios de cultivo
evaluadosalas24horasy48horasdeincubacin.
v Determinarquemediosdecultivoevaluadossonlos masefectivosparael aislamiento de
Streptococcuspyogenes betahemolticoenpacientesconfaringoamigdalitis.
3. DISEOMETODOLGICO
3.1 DESCRIPCIN
El presente trabajo de investigacin tiene un diseo de test diagnstico de tipo longitudinal,
prospectivo y observacional, siendo el periodo de recoleccin de los datos el tiempo que se
demorenalcanzareltamaomuestral.Serealizunaevaluacindemediosdecultivoparael
aislamientodeStreptococcuspyogenesbetahemolticoenpacientescondiagnsticoclnicode
faringoamigdalitis, tomando en cuenta la sensibilidad, especificidad, valores predictivos
positivos y negativos de cada uno de los medios de cultivo. De esta manera se evalu la
eficacia decadauno, con la finalidad de que los resultados de la investigacin nos permitan
elegirelolosmediosdecultivomsadecuados.
La presente investigacinse realiz en el instituto de Servicios deLaboratorioDiagnsticoe
Investigacin en Salud (SELADIS) dependiente de la UMSA, en el rea de Bacteriologa
Clnica y Micologa, ubicado en la avenida Saavedra Nro. 2224, de la ciudad de La Paz,
Bolivia.
3.2 TAMAOMUESTRAL
Setomcomouniversoatodaslasmuestrasdehisopadosfaringeoscondiagnsticoclnicode
faringoamigdalitis que mensualmente se solicitan al laboratorio de Bacteriologa Clnica y
Micologa,quesegnlasestadsticasdel2007 sonunpromediode35pormes.Lasunidades
deobservacin fueron lasmuestrasdehisopadosfaringeosyeltamaomuestralcalculadoes
de100muestras, paraunnivel deconfianzadel95%yunerrorestndarnomayoral5%.
3.3 CRITERIOSDEINCLUSIN
Se incluyeron en el estudio muestras de hisopados faringeos de pacientes con diagnostico
clnicodefaringoamigdalitisqueacudieronallaboratoriodelSELADIS,sintomarencuenta
edadnisexo.
3.4 CRITERIOSDEEXCLUSIN
Se excluyeron de este estudio las muestras de pacientes que recibieron tratamiento
antimicrobianosenlosltimos2das,pacientesquenocumplanlosrequisitosparalatomade
muestra,comopacientesquenoseencontrabanen ayunaso se realizaronlimpiezade laboca
y dientes.
3.5 VARIABLESYSUMEDICIN
Seentiendeporsensibilidaddelapruebaalaproporcindemuestraspositivascorrectamente
identificadasporlapruebaempleada.
VerdaderosPositivos x100
VerdaderosPositivos+FalsosNegativos
La especificidad es la proporcin de muestras negativas correctamente identificadas por la
pruebaempleada.
VerdaderosNegativos x100
VerdaderosNegativos+FalsosPositivos
El valor predictivo positivo (VPP) es la probabilidad que tiene el paciente de tener
faringoamigdalitis por S. pyogenes, cuando el resultado de la prueba evaluada ha resultado
positivo.
VerdaderosPositivos x100
VerdaderosPositivos+FalsosPositivos
El valor predictivo negativo (VPN) es la probabilidad que tiene el paciente de no tener
faringoamigdalitis por S.pyogenes,cuandoelresultadodelapruebaevaluadaesnegativo.
VerdaderosNegativos x100
VerdaderosNegativos+FalsosNegativos
Especificidad=
Sensibilidad=
VPP=
VPN=
3.5.1 VARIABLEDEPENDIENTE
Setienecomovariabledependiente,laevaluacindelosmediosdecultivoparaelaislamiento
deStreptococcuspyogenes.
3.5.2 VARIABLEINDEPENDIENTE
Como variables independientes se tienen a las tasas de sensibilidad, especificidad y valores
predictivospositivosynegativosdelosmediosdecultivoevaluados.
3.5.3 OPERACIONALIZACINDEVARIABLES
TMS:Trimetoprim/sulfametoxazol
PYR:pirrolidonilarilamidasa
VP:VoguesProskauer
OPERACIONALIZACION
VARIABLE TIPO
ESCALA DESCRIPCION
INDICADOR
Cultivoen agar
sangrehumanacon
glbulosrojoslavados
Cualitativa
nominal
dicotomica
Positivo
Negativo
Presenciadecoloniasde
Streptococcus pyogenes,
confirmadopor tincin
gram,catalasa,
bacitracina,TMS,PYRy
VP.
Porcentajede
sensibilidad,
especificidadyvalores
predictivospositivosy
negativos
Cultivoen agar
sangrehumanacon
glbulosrojoslavados
msazidasodica
Cualitativa
nominal
dicotomica
Positivo
Negativo
gram,catalasa,
VP.
Porcentajede
sensibilidad,
negativos
Cultivoen agar
sangrehumanacon
glbulosrojossin
lavado
Cualitativa
nominal
dicotomica
Positivo
Negativo
gram,catalasa,
VP.
Porcentajede
sensibilidad,
negativos
Cultivoenagar
sangredecarnero
Cualitativa
nominal
dicotomica
Positivo
Negativo
gram,catalasa,
VP.
Porcentajede
positividad
3.6 MATERIALES,EQUIPOSYREACTIVOS
MATERIALES:
Hisoposestriles.
Cajaspetride10y20mL.
Tubosdeensayocontaparoscaestriles.
Portaobjetos.
Asabacteriolgica.
Agujabacteriolgica.
Mecherobunsen.
Matrazerlenmeyerde200y500mL.
EQUIPOS:
Autoclavedevapor.
Incubadorade35a37C.
Microscopioptico.
Refrigerador4C.
REACTIVOS:
MediodecultivoslidoAgarSoyaTripticasa(BDDifco&BBL).
MediodecultivoslidoAgarazidasodica(BIOBRASS.A.,Brasil).
Discosprueba PirrolidonilArilamidasaPYR(Lab.W.BrizuelaSA,Argentina).
PruebadeVoguesProskauer.
Sangrehumanaobtenidaconcitratodesodio.
Sangrehumana,conglbulosrojoslavadosconsolucinfisiolgica.
Sangredecarnero(Androgen, Bolivia).
Solucinfisiolgicaestril.
Peroxidodehidrogenoal3%.
Sensidiscosdebacitracina 0.04U(BBL) y trimetoprim/sulfametoxazol 1.25
ug/23.75ug(Lab. Britania,Argentina).
Bateradetincingram.
Aceitedeinmersin.
CepaStreptococcuspyogenesATCC19615.
3.7 TCNICASYPROCEDIMIENTOS
Antes de iniciar la evaluacin de los medios de cultivo seutiliz una cepa de Streptococcus
pyogenesATCC19615betahemoltico,comocontrolpositivo enlosmediosdecultivoylas
pruebasdeidentificacincomplementarias.
3.7.1 PREPARACIONDEMEDIOSDECULTIVO
3.7.1.1 Agar Sangr eHumanaconglbulosr ojoslavados
Sepreparelmediodecultivoutilizando5%desangrehumanaconglbulosrojoslavadosy
mediodecultivosolidAgarSoyaTripticasa(BDDifco&BBL). (anexo1)
Lasangrehumanafueobtenidaentuboscolectorassiguiendolosprotocolosdeextraccinde
bancosde sangre,utilizandocomoanticoagulantecitratode sodioen unaproporcin 1/5,5 (1
ml citrato de sodio (3,2%) + 4.5 mL sangre fresca donante), la sangre humana utilizada
pertenece a una persona clnicamente sana y que no presento antecedentes de enfermedades
infecciosasde gravedad.Estasangrefuelavada5veces con solucin fisiolgica estril antes
desuuso,paraeliminarinterferentesdelplasma. (anexo2)
3.7.1.2 Agar Sangr eHumanaconglbulosr ojoslavadosmsazidasodica
Sepreparelmediodecultivoutilizando5%desangrehumana con glbulos rojoslavados
y mediodecultivosolidAgarAzidaSodica(BIOBRASS.A.,Brasil).(anexo3)
3.7.1.3 Agar Sangr eHumana(glbulosr ojossinlavado)
Sepreparelmediodecultivoutilizando5%desangrehumanaconglbulosrojossinlavado
y mediodecultivosolidAgarSoyaTripticasa(BDDifco&BBL). (anexo4)
3.7.1.4 Agar Sangr edeCar nero
Se prepar el medio de cultivo utilizando 5 % de Sangre de carnero (Androgen Bolivia) y
mediodecultivosolidAgarSoyaTripticasa(BDDifco&BBL).(anexo5)
3.7.2 TOMADEMUESTRA
Se solicit al paciente que coloque la cabeza en hiperextension y se ilumin la faringe, se
enfoc unaluzbrillantedentrode lacavidad bucal porencimadelhombrode lapersonaque
tomlamuestra,luegoconunbajalenguasestrilsedeprimilalenguaconelfindeteneruna
buenavisualizacindelafaringey amgdalas.
Se pidi al pacienteque respire profundamente y con un hisopo se frot con firmeza ambas
amgdalas y la faringe posterior, tambin se tom una muestra de todoel exudado purulento
cuandohubo,serealizestaoperacin2veces.
Alintroduciryretirarelhisoposetuvocuidadodenotocarlasparedeslateralesdelacavidad
bucalolenguaparareduciralmnimolacontaminacinconbacteriasdelafloracomensal.
Luego de la recoleccin, para transportar la muestra se introdujeron los hisopos en un tubo
estril con medio de transporte lquido, las muestras se conservaron menos de 2 horas a
temperaturaambienteantesdelasiembra.
Alasmuestrasobtenidasselesrealizlossiguientesprocedimientos:
3.7.3 SIEMBRA
Unaveztomadalamuestrasesembrenlosmediosaevaluar:
Agarsangrehumanaconglbulosrojoslavados.
Agarsangrehumanaconglbulosrojoslavadosmsazidasodica.
Agarsangrehumana(glbulosrojossinlavado).
Finalmentesesembrenagarsangredecarnero,quefueutilizadocomopruebadereferencia
opatrndeoro(goldstandard).
Se sembr en 1/3 de una placa de agar sangre con el hisopo y se agot la muestra en la
superficie con un asa bacteriolgica, se utilizo la tcnica de agotamiento en pentgono,
haciendo cortes en profundidad de tal manera que se expresen las hemolisinas de
Streptococcuspyogenes.
Loscultivosse incubarona una temperatura de 35a 37 C enatmsfera aerobia por 24 a 48
horas, la primera lectura se realiz a las 24 horas buscando colonias beta hemolticas. Si no
hubodesarrollodeestascolonias,sevolviaincubarhastalas48horas.
3.7.4 IDENTIFICACINDELOSESTREPTOCOCOSAISLADOS
Lascoloniasbetahemolticasfueronidentificadassegnmtodosestndaresnormadosconlos
queellaboratoriocuenta:
v TincinGram
v Pruebadelacatalasa
v SusceptibilidadaBacitracina0.04UyTrimetoprim/sulfametoxazol1.25ug/23.75ug
v PruebaPYR(PirrolidonilArilamidasa)
v AntecasosdudosossecompletconlapruebaVoguesProskauer
3.7.4.1 HEMLISIS
Streptococcus pyogenes en agar sangre present colonias beta hemolticas circulares,
translucidas o transparentes y que tienen una superficie lisa o mate, de borde entero con un
dimetrovariablede0.3 a0.5mm.Eltamaodelazonadehemlisisfuededosatresveces
eldimetrodelacolonia,enalgunacepasfuedemenortamao.
Fig.6.ColoniasdeStreptococcuspyogenesbetahemolticoenagarsangredecarnero.
Para diferenciar Streptococcuspyogenesdeotrosestreptococosbetahemolticos se utilizaron
distintosmtodosquemencionamosacontinuacin.
3.7.4.2 TINCINGRAM
Se hizo un frotis delgado de la colonia en solucin fisiolgica estril, se dej secar, se fij
pasndoloatravsdelallamadeunmecherobunsenyseutilizlabateraparatincingram.
(anexo6)
Seexamin elfrotisteidocon aceitede inmersinconelobjetivode100Xdelmicroscopio
ptico.MicroscpicamentelascoloniasdeStreptococcuspyogenesseobservaroncomococos
gram (+) de 0.6 a 1.0 um de dimetro, que se agrupan en forma de cocos en cadenas de
longitudvariable.
Fig.7.TincingramdecoloniabetahemolticadeStreptococcuspyogenesenagarsangre.
3.7.4.3 PRUEBADELACATALASA
Con una aguja de inoculacin se transfiri una porcin del centro de una colonia a la
superficie de un portaobjetos de vidrio, luego se coloc una gota de H
2
O
2
al 3% sobre el
portaobjetos.Eldesprendimientodeburbujas seconsider unapruebapositiva.Laformacin
de unas pocas burbujas luego de 20 a 30 segundos no se consider un resultado positivo,
ademsloseritrocitostienencatalasapor locualsetuvocuidadodenoarrastrarlos juntocon
lacoloniaestudiada.
Fig.8. Pruebadelacatalasa.()PruebanegativaparacoloniasdeStreptococcuspyogenes.(+)
PruebapositivaparacoloniasdeStaphylococcusaureus.
3.7.4.4 BACITRACINAYTRIMETOPRIM/SULFAMETOXAZOL
Bacitracina (A):Esta pruebasebasaenlasusceptibilidadde S.pyogenes ala bacitracina.Se
realizmediantelacolocacindeundiscoquecontiene0,04Udebacitracinasobreunaodos
colonias extendidas en agar sangre y se incub por 24 horas a 35 37 C. Se determin la
susceptibilidad a la bacitracina mediante la medicin del halo de inhibicin de crecimiento,
cualquierzonadeinhibicinalrededordeldiscoseconsiderunapruebapositiva.
Trimetoprimsulfametoxazol (TMS): La pruebadesensibilidadaTrimetoprimsulfametoxazol
diferenci los estreptococos del grupo A (Streptococcus pyogenes) y del grupo B
(Streptococcus agalactiae) de otros estreptococos beta hemolticos. Se utiliz un disco
comercial (1,25 ug trimetoprim y 23,75 sulfametoxazol), mediante lacolocacindeun disco
sobre una o dos colonias extendidas en agar sangre y se incub por 24 horas a 35 37 C.
Cualquier zonadeinhibicinindicsensibilidadatrimetoprimsulfametoxazol.
Cuando se utiliz junto a la bacitracina, permiti diferenciar los estreptococos segn la
sensibilidad(S) oresistencia(R)quepresentaron,delasiguienteforma:
Bacitracina(S)yTMS(R):Streptococcuspyogenes delgrupoA.
Bacitracina(R)yTMS(R):StreptococcusagalactiaedelgrupoB.
Bacitracina(R)o(S)y TMS(R):Estreptococosbetahemolticosdeotrosgrupos
(gruposC,FoG).
Fig.9. Prueba de la Bacitracina y Trimetoprim/sulfametoxazol para Streptococcus pyogenes
betahemolitico.Bacitracina(A)sensible, Trimetoprim/sulfametoxazol(TMS)resistente.
3.7.4.5 PRUEBADEPYR(PIRROLIDONILARILAMIDASA)
Enuntubodeensayosecolocaron50uLdeaguadestiladaestrilyserealizunasuspensin
densadelabacteriaenestudio(2a4escalaMcFarland),secolocundiscoPYRyseagitel
tubo hasta que el disco qued sumergido en la suspensin. Luego se incub de 35 a 37 C
durante 30 minutos, posteriormente se agreg al tubo una gota de la solucin reveladora
(Pirrolidonilbetanaftilamina)y seobservelcambiodecolor deldiscodurante5minutos.
Un color rojo rosado del disco indic unaprueba positiva, si eldisconocambio decolor se
considerunapruebanegativa.
(a) (b)
Fig.10.PruebadePYR(PirrolidonilArilamidasa).(a)PYRpositivodecepadeStreptococcus
pyogenes.(b)PYRnegativodecepadeStaphylococcusaureus.
3.7.4.6 PRUEBAVOGUESPROSKAUER
Streptococcus pyogenes, es negativo para la prueba, se utiliz ante casos dudosos con otros
estreptococosbetahemolticos.
Con un asabacteriolgica se sembr enun tubodecaldo Rojode MetiloVogues Proskauer,
un cultivo puro del microorganismo a estudiar, se incub 24 horas a 3537 C. Luego de la
incubacinsetransfiri 1mLdelcaldoauntubodeensayoestril,seagreg0.6mLdealfa
naftolal5%y0.2mL deKOHal40%eneseordenaltubo.Seagitsuavementeeltubopara
exponerelmedioaloxigenoatmosfricoy sedejeltuboenreposodurante10a15minutos.
Eldesarrollodeuncolorrojodespusdelos15minutosconstituyunapruebapositiva,siel
medionocambidecolorseconsiderunapruebanegativa.
Fig.11.PruebaVoguesProskauer(VP). Izquierda,VP negativode coloniasde Streptococcus
pyogenes. Derecha, VP positivo de colonias de estreptococos beta hemolticos del grupo
milleri.
3.8 INSTRUMENTOSYTECNICASDERECOLECCINDEDATOS
Paralarecoleccindedatosseutilizunformularioderegistroelcualfuellenadoenundiario
cientficohastaalcanzareltamaomuestralrequerido. (anexo7)
3.9 PROCESAMIENTOYANLISISDELOSDATOS
Con los datos obtenidos realizando las pruebas mencionadas en los medios de cultivo
evaluados, se cre una base de datos con el programa estadstico EPIDAT 3.0 y se
determinaron las tasas de sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y
negativosapartirdetablas2X2.
4. RESULTADOS
Despus de alcanzar el tamao muestral deseado de 100 muestras de hisopados faringeos
analizados,seobtuvieron14cultivospositivos y 86cultivosnegativosparael aislamientode
Streptococcuspyogenes betahemolticodelgrupoA.
Para obtener las tasas de sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor
predictivo negativo (VPN) de los medios de cultivo evaluados, se utiliz el cultivo en agar
sangredecarnerocomopruebadereferenciaopatrndeoro(goldstandard)alas24horasy
48horasdeincubacin.
El estudio de la evaluacin del medio de cultivo Agar Sangre Humana con glbulos rojos
lavados (ASHGL) a las 24 horas de incubacin, present una sensibilidad del 86 % y una
especificidad del 100 %, con un valor predictivo positivo del 100 % y valor predictivo
negativodel98%.
TABLA 1:Tasasdeevaluacindel ASHGL alas24horasdeincubacin parael aislamiento
deStreptococcuspyogenes,obtenidosenelSELADISdurantelosmesesdeJulioaDiciembre
del2008.
VerdaderoDiagnstico
ASCARNERO
TASAS ASHGL
I ntervalode
confianza
95%
cultivo(+) Cultivo() Total
SENSI BILI DAD
86% (60100%)
PRUEBA
ASHGL
C(+) 12 0 12 ESPECIFICI DAD 100% (100100%)
C() 2 86 88 VPP 100% (100100%)
Total 14 86 100 VPN 98% (93100%)
ASHGL: AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavados
VPP: Valorpredictivopositivo
VPN:Valorpredictivonegativo
GRAFICO1: TasasdeevaluacindelASHGLalas24horasdeincubacinparaelaislamiento
del2008.
86
100 100
98
75
80
85
90
95
100
%
Sensibil i dad Especi fici dad VPP VPN
Agarsangrehumanacongl bul osroj oslavados24horas
Fuente:Tabla1
lavados (ASHGL) a las 48 horas de incubacin, present una sensibilidad del 86 % y una
especificidad del 100 %, con un valor predictivo positivo del 100 % y valor predictivo
negativodel98%,
TABLA 2:Tasasdeevaluacindel ASHGL alas48 horasdeincubacinparael aislamiento
del2008.
VerdaderoDiagnstico
ASCARNERO
TASAS ASHGL
I ntervalode
confianza
95%
SENSI BI LI DAD
100% (100100%)
C(+) 14 0 14 ESPECI FI CI DAD 100% (100100%)
PRUEBA
ASHGL
C() 0 86 86 VPP 100% (100100%)
Total 14 86 100 VPN 100% (100100%)
ASHGL: AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavados
GRAFICO2: TasasdeevaluacindelASHGLalas48horasdeincubacinparaelaislamiento
del2008.
100 100 100 100
0
20
40
60
80
100
%
Agarsangrehumanacongl bul osroj oslavados48horas
Fuente:Tabla2
lavadosms azidasodica (ASHGLA) a las24 horasdeincubacin,presentunasensibilidad
del 43 % y una especificidad del 100 %, con un valor predictivo positivo del 100 % y
negativodel91%,
TABLA3:TasasdeevaluacindelASHGLAalas24horasdeincubacinparaelaislamiento
del2008.
VerdaderoDiagnstico
ASCARNERO
TASAS
ASH
GLA
I ntervalode
confianza
95%
SENSI BI LI DAD
43% (1769%)
C(+) 6 0 6 ESPECI FICI DAD 100% (100100%)
PRUEBA
ASHGLA
C() 8 86 94 VPP 100% (100100%)
Total 14 86 100 VPN 91% (8697%)
ASHGLA: AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavadosmsazidasodica
GRAFICO 3: Tasas de evaluacin del ASHGLA a las 24 horas de incubacin para el
aislamientodeStreptococcuspyogenes, obtenidosenelSELADISdurantelosmesesdeJulioa
Diciembredel2008.
43
100 100
91
0
20
40
60
80
100
%
Agarsangrehumanacongl bul osroj osl avadosmsazidasodi caal as24horas
Fuente:Tabla3
lavadosms azidasodica(ASHGLA) a las48horasdeincubacin,presentunasensibilidad
del 71 % y una especificidad del 100 %, con un valor predictivo positivo del 100 % y
negativodel96%,
TABLA4:TasasdeevaluacindelASHGLAalas48horasdeincubacinparaelaislamiento
del2008.
VerdaderoDiagnstico
ASCARNERO
TASAS
ASH
GLA
I ntervalode
confianza
95%
SENSI BI LI DAD
71% (40100%)
C(+) 10 0 10 ESPECI FI CI DAD 100% (100100%)
PRUEBA
ASHGLA
C() 4 86 90 VPP 100% (100100%)
Total 14 86 100 VPN 96% (90100%)
ASHGLA: AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavadosmsazidasodica
GRAFICO 4: Tasas de evaluacin del ASHGLA a las 48 horas de incubacin para el
aislamientodeStreptococcuspyogenes, obtenidosenelSELADISdurantelosmesesdeJulioa
Diciembredel2008.
71
100 100
96
0
20
40
60
80
100
%
Agarsangrehumanacongl bul osroj osl avadosmsazidasodi caal as48horas
Fuente:Tabla4
El estudio de la evaluacin del medio de cultivo Agar Sangre Humana (glbulos rojos sin
lavado) (ASH) a las 24 horas de incubacin, present una sensibilidad del 57 % y una
especificidaddel100%conunvalorpredictivopositivodel100%ynegativodel93%,
TABLA5:Tasas deevaluacindel ASH a las 24horas deincubacinparael aislamientode
Streptococcuspyogenes,obtenidosenelSELADISdurantelosmesesdeJulioaDiciembredel
2008.
VerdaderoDiagnstico
ASCARNERO
TASAS ASH
I ntervalode
confianza
95%
SENSI BILI DAD
57% (2094%)
C(+) 8 0 8 ESPECIFICI DAD 100% (100100%)
PRUEBA
ASH
C() 6 86 92 VPP 100% (100100%)
Total 14 86 100 VPN 93% (86100%)
ASH: AgarSangreHumana(glbulosrojossinlavado)
GRAFICO5:TasasdeevaluacindelASHalas24horasdeincubacinparaelaislamientode
2008.
43
100 100
91
0
20
40
60
80
100
%
Agarsangrehumana(gl bul osroj ossi nlavado)al as24horas
Fuente:Tabla5
El estudio de la evaluacin del medio de cultivo Agar Sangre Humana (glbulos rojos sin
lavado) (ASH) a las 48 horas de incubacin, present una sensibilidad del 86 % y una
especificidaddel100%conunvalorpredictivopositivodel100%ynegativodel98%,
TABLA6:Tasas deevaluacindel ASH a las 48 horas deincubacinparael aislamientode
2008.
VerdaderoDiagnstico
ASCARNERO
TASAS ASH
I ntervalode
confianza
95%
SENSI BI LI DAD
86% (60100%)
C(+) 12 0 12 ESPECI FICI DAD 100% (100100%)
PRUEBA
ASH
C() 2 86 88 VPP 100% (100100%)
Total 14 86 100 VPN 98% (93100%)
ASH: AgarSangreHumana(glbulosrojossinlavado)
GRAFICO6:TasasdeevaluacindelASHalas48horasdeincubacinparaelaislamientode
2008.
86
100 100
98
75
80
85
90
95
100
%
Agarsangrehumana(gl bulosroj ossinl avar)al as48horas
Fuente:Tabla6
En nuestra poblacin en estudio, la identificacin mediante el cultivo de hisopado faringeo
revel14aislamientos deStreptococcuspyogenesbetahemoltico(14%).
Tabla7: Distribucinde bacterias aisladasen elcultivodehisopado faringeo,obtenido enel
SELADISdurantelosmesesdeJulioaDiciembredel2008.
n: nmerodeaislamientos
IDENTIFICACIN
BACTERIANA
n PORCENTAJE
Streptococcuspyogenes 14 14%
Moraxellacatarrhalis 28 28%
Staphylococcusaureus 18 18%
Proteusmirabilis 2 2%
Klebsiellapneumoniae 2 2%
Floranormaldefaringe 36 36%
TOTAL 100 100
Grafico7:Distribucindebacteriasaisladasenelcultivodehisopadofaringeo,obtenidoenel
SELADISdurantelosmesesdeJulioaDiciembredel2008.
14
28
18
2 2
36
0
5
10
15
20
25
30
35
40
%
S
.
p
y
o
g
e
n
e
s
M
.
c
a
t
a
r
r
h
a
l
i
s
S
.
a
u
r
e
u
s
P
.
m
i
r
a
b
i
l
i
s
K
.
p
n
e
u
m
o
n
i
a
e
F
l
o
r
a
n
o
r
m
a
l
%BACTERIASAISLADAS
Fuente:Tabla7
5. DISCUSIN
Elpresenteestudiodescribeeldiagnosticobacteriolgicodeunadelasinfeccionesdelasvas
respiratoriasaltas,querepresentanparatodoslospasesunimportanteproblemadesalud.La
faringoamigdalitis, es frecuente en la poblacin peditrica como tambin se presenta en
adolescentesyadultosjvenes,esmsprevalenteenclimasfrosyenlosperiodosdeinvierno
yprimavera,porloqueennuestraciudadestasituacinsehacemspreocupanteporlasbajas
temperaturasy loscambios bruscosdetemperatura.
1
El cultivo de hisopado faringeo en agar sangre con 5 % sangre de carnero es el mtodo
estndar de referencia para el aislamiento de Streptococcus pyogenes por su elevada
sensibilidadyespecificidad,apesardeltiempoquedemandasurealizacinde48a72horas,
esrecomendadaendiferentesnormasyopinionesdeexpertos.
9
Sinembargodebencumplirse
lascondiciones adecuadasparaelcultivo,yaqueStreptococcuspyogenesesunabacteriasde
difcil aislamiento y se deben tomar todas las precauciones para evitar reportar resultados
errneos, en el estudio no se present ningn resultado falso positivo por la elevada
especificidadquetienelaprueba,perosiseencontraronresultadosfalsosnegativos.
La evaluacin de los medios de cultivo Agar Sangre Humana con glbulos rojos lavados,
Agar Sangre Humana con glbulos rojos lavados ms azida sodica y Agar Sangre Humana
con glbulos rojos sin lavado, utilizando el agar sangre de carnero como patrn de oro,
mostraron una mejor eficacia a las 48 horas de incubacin, porque se observ un mayor
numero de aislamientos de Streptococcus pyogenes beta hemoltico, lo que coincide con
estudiosdeChvezycolaboradores
4
,ademslaincubacinalas48horasrevelunaumento
de la sensibilidad y valor predictivo negativo de los medios evaluados, que se debe a que
existen cepas que a las 24 horas de incubacin no muestran una beta hemlisis perceptible,
peroalas48horaslahemlisisyaesevidenteypermiteunacorrectaidentificacin,porloque
no es recomendable dar resultados a las 24 horas de incubacin, para evitar reportar falsos
negativos.
Lostresmediosevaluadosmostraronunaexcelenteespecificidadyvalorpredictivopositivoa
las 24 y 48 horas de incubacin. El 100 % de especificidad alcanzado, nos indica que no se
encontraronresultadosfalsospositivos,que losmediosnodetectaronStreptococcuspyogenes
beta hemoltico donde el medio de referencia tampoco lo detecto y esto gracias a que se
utilizan pruebas complementarias que apoyan al cultivo (tincin gram, catalasa, bacitracina,
TMS, PYR y VP) que son fundamentales para la identificacin de Streptococcus pyogenes.
Los medios tambin presentaron un valor predictivo positivo del 100% que muestra que la
probabilidad de los pacientes de tener una faringoamigdalitis estreptoccica es del 100%
cuando el resultado de una de las pruebas es positivo, salvo el caso de paciente portador
asintomticodeStreptococcuspyogenes.
El mediodecultivo AgarSangre Humanaconglbulos rojos lavadospresent los msaltos
valores de sensibilidad y valor predictivo negativo de 86% y 98% a las 24 horas
respectivamente,peroalas48horasestosvaloresaumentaronasu valor mximo del100%,
lo que nos indica que este medio de cultivo no reporto resultados falsos negativos y aisl
Streptococcus pyogenes beta hemoltico en todas las muestras donde el medio de referencia
tambin lo aisl, que es muy importante para el paciente ya que un tratamiento oportuno
resuelvelafaringoamigdalitisyevitalasposteriorescomplicaciones postestreptoccicas.
Por los resultados presentados de sensibilidad, especificidad y valores predictivos a las 48
horasdeincubacin,quealcanzanel100%,elpresenteestudiorevelqueelmediodecultivo
AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavadosestaneficazcomoelagarsangredecarnero
para el aislamiento de Streptococcus pyogenes beta hemoltico (tabla 1 y 2). Estudios
anteriores apoyan nuestros resultados, con la diferencia que los cultivos fueron incubadosen
presenciade5%deCO
2
ylasangrehumananoutilizglbulosrojoslavados.
4
Encambioen
nuestroestudioseutiliz sangrehumanaconglbulosrojoslavadosqueevitalainterferencia
de elementos del plasma humano (anticuerpos, complemento, anticoagulante) y se incub en
condicionesaerobias,quetambinpermiteaislarotrospatgenosaerobiosestrictos,ademsde
Streptococcus pyogenes. Lo que demuestra que el Agar Sangre Humana con glbulos rojos
lavados puedeserusadocomounaalternativaconfiable.
ElAgarSangreHumanaconglbulosrojossinlavado,eselmedioquelesigueeneficaciaal
AgarSangreHumanaconglbulosrojoslavados,yaquemuestraunasensibilidad alas24y
48horasde57%y86%respectivamenteyunvalorpredictivonegativoalas24y48horasde
93% y 98% respectivamente (tablas 3 y 4). Lo que demuestra que el uso de glbulos rojos
lavadosaumentalaeficaciadelmediodecultivoyqueloselementosdelplasma(anticuerpos,
complemento, anticoagulante) interfieren con el crecimiento de algunas cepas de
Streptococcuspyogenes,porloqueestemedioreportresultadosfalsosnegativos,aunqueno
son excesivos y la faringoamigdalitis puede autolimitarse, el problema se presenta cuando
existeunacomplicacindelainfeccinlacualgeneralmenteesfatal,ysutratamientoesmuy
costosoy portiemposmuyprolongados.
13,18,19
ElmediodecultivoAgarSangreHumanaconglbulosrojoslavadosmsazidasodica,esel
mediomenoseficazdelostresevaluados,yaquealcanzunasensibilidadalas24y48horas
de 43% y71% respectivamente y unvalor predictivonegativo a las24y48horasde 91% y
96% respectivamente (tablas 5 y6). Aunqueelmedio contiene azida sodica elcual inhibeel
crecimiento de bacterias gram negativas, favorece el desarrollo de estreptococos y contiene
glbulosrojoslavados,nofueunmedioeficazcomoseesperaba.Estosepodradeberaquea
las 24 horas incubacin en la mayora de los cultivos se presentaban demasiados resultados
falsosnegativos ya las48horas en algunoscasoslahemlisisse extendaportodoelmedio
decultivohaciendomsdifcilymorosoidentificarcorrectamenteStreptococcuspyogenes,ya
que algunosestreptococosalfa hemolticos semostrabancomobetahemolticos.Tambin se
pudo observar que en este medio de cultivo, los glbulos rojos envejecan ms rpidamente
que en los otros medios evaluados, al tercer da de preparado el medio de cultivo ya
presentabauncolormarrn,probablementedebidoaquelosglbulosrojossufrenalgndao
porelazidasodica.
Delos100cultivosdehisopadofaringeoprocesadosenlapoblacinestudiada,Streptococcus
pyogenes beta hemoltico fue aislado en un 14 % (tabla 7), lo que coincide con otras
investigaciones.
1,2,7,9
6. CONCLUSIONES
Por losresultadosobtenidosenelpresenteestudioseconcluyeque:
v Los tres mediosde cultivo evaluados muestran una mejor eficacia a las 48 horas de
incubacin, porque se vio un aumento significativo de la sensibilidad y valor
predictivonegativo.
v Al evaluar la Sensibilidad de los medios de cultivo alternativos, el que alcanz la
mayor eficacia a las 48 horas de incubacin es el medio Agar Sangre Humana con
glbulosrojoslavados,seguidoporelmedioAgarSangreHumanaconglbulosrojos
sin lavado y el menos eficaz es el medio Agar Sangre Humana con glbulos rojos
lavadosmsazidasodica.
v LaevaluacindelaEspecificidadyValorPredictivoPositivodelosmediosdecultivo
sealan que los tres medios mostraron excelentes resultados a las 24 y 48 horas de
incubacin,alcanzadolosvaloresmsaltos enamboscasos.
v En cuanto al Valor Predictivo Negativo el ms eficaz a las 48 horas de incubacin,
pertenece al medio AgarSangre Humana conglbulosrojos lavados,seguidopor el
medio Agar Sangre Humana con glbulos rojos sin lavado y el menos eficaz es el
medioAgarSangreHumanaconglbulosrojoslavadosms azidasodica.
v Porlo tanto,luegodeanalizar los resultadosobtenidos,el mediodecultivo demayor
eficaciaparaelaislamientodeStreptococcuspyogenesbetahemolticodelgrupoAen
pacientes con diagnostico de faringoamigdalitis, es el Agar Sangre Humana con
glbulos rojos lavados, por sus excelentes valores de sensibilidad, especificidad y
valorespredictivos.
7. RECOMENDACIONES
Que el personal mdico desalud solicite la realizacindelcultivo de hisopado faringeo ante
un diagnstico clnico de faringoamigdalitis, para no iniciar un tratamiento antimicrobiano
inadecuado o innecesario y de esta forma minimizar los efectos adversos de los
antimicrobianos administrados y la posible resistencia queesta puede generar. Tambin para
reducir la transmisin de la infeccin y fundamentalmente para prevenir las posteriores
complicacionesdelainfeccinporStreptococcuspyogenes.
Incluirenlarutinadetrabajodeloslaboratoriosquenoutilizanagarsangredecarnero,eluso
del Agar Sangre Humana con glbulos rojos lavados, ya que este medio es de fcil
preparacinylosresultadosdelestudionosmuestranqueestaneficazcomoelagarsangrede
carneroparaelaislamientodeStreptococcuspyogenesbetahemolticoydeestamaneraevitar
reportarresultadosfalsosnegativosprincipalmente.
RealizarunestudioderesistenciabacterianadeStreptococcuspyogenesalasPenicilinas,que
segn investigaciones anteriores no presentan resistencia hasta nuestros das y del mismo
modorealizar un estudio de resistencia a losMacrolidosquehan mostradoun aumentode la
resistenciaenlosltimosaos.
Realizarunestudioqueevaluyvalidelaeficaciadelmediodecultivo AgarSangreHumana
con glbulos rojos lavados, para el aislamiento de otras bacterias patgenas humanas,
nutricionalmente exigentes, que requieran sangre en la preparacin de sus medios de
aislamiento.
ANEXOS
ANEXO1
PREPARACINDEAGARSANGREHUMANACONGLOBULOSROJOSLAVADOS
Es un medio de aislamiento especialmente diseado para facilitar el crecimiento de
microorganismos exigentes, bacterias gram positivas y todas las especies encontradas en
muestrasdeorigenclnico.
Mediosyr eactivos:
MediodecultivosolidAgarsoyatripticasa(BDDifco&BBL)
Sangrehumanaconglbulosrojoslavados
Pr epar acin:
En un matraz erlenmeyer disolver una proporcin de 40 gramos/litro de medio de
cultivo solid Agar soya tripticasa con agua destilada o desionizada y disolver
completamentecalentandoenhornilla.
El mediodecultivo ya disuelto se esteriliza en autoclave 15 minutos a121 C y una
presinde1Kg/cm
2
.
Unavezautoclavadoselmediosetrasladaaunazonaestril,paraenfriarlolentamente
aunatemperaturaqueoscilaentrelos45C+/2C.
Incorporar 5 % de Sangre humana con glbulos rojos lavados, homogenizar
completamentey dispensar unvolumende10mLdemedioporcajapetriestril.
Guardarlosmediosenrefrigeracina4C.Elmediodecultivopreparadoantesdela
adicindesangreesclaroyamarilloparduzco,posteriormentealaadicindesangre,
esdelcolordelamisma.
Finalmenteseincubade35a37Cpor24horasunacajapetridemediodecultivodel
lotepreparado,comocontroldeesterilidad.
ANEXO2
LAVADODEGLOBULOSROJOSHUMANOS
El objetivo del lavado de los glbulos rojos es eliminar los componentes del plasma como
elementosdelsistemainmuneyelanticoagulanteutilizadoquepuedenafectareldesarrollode
microorganismosenelagarsangre.
Pr ocedimiento:
Para evitarla contaminacinde lasangre,todos lospasosdelprocedimientosehacen
bajolaproteccindeunmecherobunsenyconmaterialestril.
En un tubo estril con cierre hermtico se alcuota la cantidad necesaria de sangre
humana para la preparacin del medio. Los glbulos rojos son lavados con solucin
fisiolgicaestril(0.85%NaCl).
Altuboseleaadeunvolumenigualdesolucinfisiolgica,secierrahermticamente
ysemezclanporinversin5veces.
Luegosecentrifugaa1500rpmpor5minutos.
Se elimina el sobrenadante con una micropipeta estril y se le aade nuevamente un
volumenigualdesolucinfisiolgica,semezclaporinversinysecentrifuga.
Se repiten los ltimos dos paso 5 veces, para que la sangre tenga por lo menos 5
lavados.
Finalmenteseaadealmediodecultivoestrilatemperado.
ANEXO3
PREPARACION DE AGARSANGRE HUMANA CON GLOBULOR ROJOS LAVADOS MAS
AZIDASODICA
microorganismosexigentesytodaslasespeciesencontradasenmuestrasdeorigenclnico.El
medio contiene azida sodica el cual inhibe el crecimiento de bacterias gram negativas y
favorece el crecimiento de estreptococos, el azida selecciona microorganismos en cuyos
procesosrespiratoriosestnimplicadosloscitocromos,debidoqueactacomouninhibidorde
lacadenarespiratoriayademselmediodecultivocontieneglbulosrojoslavados.
Mediosyr eactivos:
MediodecultivosolidAgarazidasodica(BIOBRASS.A.,Brasil)
Sangrehumanaconglbulosrojoslavados
Pr epar acin:
cultivo solid Agar soya tripticasa con agua destilada o desionizada y disolver
presinde1Kg/cm
2
.
Incorporar 5 % de Sangre humana con glbulos rojos lavados, homogenizar
ANEXO4
PREPARACIONDEAGARSANGREHUMANA:
muestrasdeorigenclnico.
Mediosyr eactivos:
Sangrehumana(conglbulosrojossinlavado)
Pr epar acin:
cultivosolidAgarsoyatripticasa(marca)conaguadestiladaodesionizadaydisolver
presinde1Kg/cm
2
.
Incorporar 5 % de Sangre humana con glbulos rojos sin lavado, homogenizar
Guardarlosmediosenrefrigeracina4C.Elmediodecultivopreparadoantesde la
ANEXO5
PREPARACIONDEAGARSANGREDECARNERO:
muestrasdeorigenclnico.Eselmtododereferenciaopatrndeoro(goldstandard)parael
aislamientodeStreptococcuspyogenes.
Mediosyr eactivos:
Sangredecarnerodesfibrinada(AndrogenBolivia)
Pr epar acin:
cultivosolidAgarsoyatripticasa(marca)conaguadestiladaodesionizadaydisolver
presinde1Kg/cm
2
.
Incorporar 5 % de Sangre de carnero desfibrinada, homogenizar completamente y
dispensar unvolumende10mLdemedioporcajapetriestril.
ANEXO6
TINCIONDEGRAM:
Es una tincin diferencial usada para demostrar las propiedades tintoriales de bacterias de
todos los tipos segn la pared celular que estas presenten. Las bacterias gram positivas
retienenlavioletadegencianadespusdeladecoloracin,lasbacteriasgramnegativasnoson
capacesderetenerestecolorante.
Bater aparatincingr am:
VIOLETADEGENCIANA
85% violetadegenciana
55% alcohol
H
2
O
d
csp.90mL
4.5g oxalatodeamonio
LUGOL
1g yodo
2g yodurodepotasio
100mLH
2
O
d
ALCOHOLACETONA
50mLacetona
50mLetanol(95%)
FUCSINABASICA
3g fucsinabasica
100mLetanol(95%)
H
2
O
d
csp. 1000 mL
Pr ocedimiento:
Secoloca el frotissobreunsoporteparatensiny secubre lasuperficieconsolucin
devioletadegenciana,sedeja1minutoyselavaconagua.
Secubreelfrotisconsolucindeyododurante1minutoy selavaconagua.
Se cubre el frotis con solucin decolorante alcoholacetona, dejndolo 1 minuto y se
lavaconagua.
Secubreelfrotisconfucsinabsicaysedejaactuarpor1minuto.
Se examina el frotis teido con aceite de inmersin con el objetivo de 1000X del
microscopio.
A
N
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o
ANEXO8
Fotografa 1: Cultivo de hisopado faringeo conpresencia de flora normal, estreptococos alfa
hemolticosymoraxelas.
Fotografa 2: Cultivo de hisopado faringeo conpresencia de flora normal, estreptococos alfa
hemolticosyflorapatgena,Streptococcuspyogenesbetahemoltico.
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