PREPARACION DE MEDIOS NUTRITIVOS DE CULTIVO PDA I. INTRODUCCION Los medios de cultivo son soluciones que contienen una consistencia y propiedades para permitir el desarrollo favorable de microorganismos, clulas y tejidos. Estas sustancias son utilizadas en el campo de la biotecnologa, biologa y en nuestro caso la fitopatologa para proveer a nuestros organismos un ambiente ptimo para desarrollarse y ser estudiados, evaluados, comparados, etc Los microorganismos son los seres ms abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensin de oxgeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecolgicos. Entre los requerimientos ms importantes para su desarrollo estn el carbono, el oxgeno, nitrgeno, dixido de carbono e hidrgeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento especficos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. II. OBJETIVOS
a. Preparar un litro de medio de cultivo PDA (papa dextrosa agar). b. Utilizar el medio PDA para la siembra de microorganismos del suelo.
III. REVISION BIBLIOGRAFICA
MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es un sustrato o una solucin de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
Segn su origen: o Naturales o Sintticos o Semi-sintticos Segn su consistencia: o Lquidos o Solidos o Semislidos Segn su composicin: o Comunes o universales o Enriquecidos FACULTAD DE AGRONOMIA - UNSA PRACTICA: Preparacin de medio de cultivo PDA 2
o Selectivos o Diferenciales o De enriquecimiento Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos: Cambio de pH: por ejemplo agregando cido actico para favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil para la mayora de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6. Cambio de temperatura: la mayora de las bacterias crece ptimamente entre 20 C y 40 C. Los cultivos tpicos de S. Faecalis requieren 60 C de temperatura y los de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4 C. Alteraciones osmticas: se acrecientan las propiedades osmticas un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la seleccin de bacterias halfilas como Staphylococcus spp. (7,5%). Ajuste en la tensin de oxgeno: es importante en la seleccin de aerobios y anaerobios. Ajuste en la tensin de anhdrido carbnico: muchos patgenos importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensin ms all de la atmosfrica. Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias indeseables tenemos: Antispticos: sustancias antibacterianas inespecficas que pueden actuar como inhibidores. Por ejemplo: el medio de cultivo comercial S - S (Salmonella - Shigella) que contiene verde brillante (inhibe las bacterias gram positivas) y sales biliares (que inhiben un gran nmero de gram negativas menos enterobacterias). Otro ejemplo es el medio de Mc Conkey que contiene cristal violeta (inhibe las gram positivas pero no las enterobacterias) Antibiticos: sustancias antibacterianas especficas que impiden el crecimiento de aquellos microorganismos que no nos interesa que crezcan en ese medio. Un ejemplo es el medio de Thayer - Martin con VCN (vancomicina, colistina y nistatina) que se utiliza para el aislamiento de gonococos. La penicilina en una concentracin de 5,50 unidades/ ml inhibe la mayora de las gram positivas. Otro ejemplo es el medio de Sabourand - cloranfenicol para el aislamiento de Cndida albicans.
Papa Dextrosa Agar (PDA) Es un medio muy usado que sirve para aislar todo tipo de hongos. Beauveria, Paecilomyces, Lecanicillium (Verticillium) y Metarhizium, los ms importantes hongos parsitos de insectos, al igual que los parsitos de plantas y los hongos saprofitos crecen muy bien y esporulan en este medio. Cuando se aslan hongos a partir de insectos colectados del suelo, es recomendable acidificar el medio con cido lctico al 25%. Se agregan 3 4 gotas sobre el agar solidificado de la placa con el objeto de evitar el desarrollo de bacterias. FACULTAD DE AGRONOMIA - UNSA PRACTICA: Preparacin de medio de cultivo PDA 3
El Papa Dextrosa Agar puede ser suplementado con antibiticos o cidos para inhibir el crecimiento bacteriano. Este medio es recomendado para realizar el recuento colonial. Tambin puede ser utilizado para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clnica. La infusin de papa promueve un crecimiento abundante de los hongos y levaduras y el agar es adicionado como agente solidificante. Los medios de cultivo por ser los ms comunes en el aislamiento de hongos se clasifican de diversa forma, as tenemos de acuerdo a su origen, que puede ser natural, sinttico y semi sinttico Decimos que es un medio natural cuando son preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como extractos de tejidos e infusiones y aquel medios sinttico es aquel que contiene una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente y aquel cultivo semi sinttico son aquellos sintticos a los que se le aade factores de crecimiento. Tenemos otro tipo de clasificacin que puede ser importante en la utilizacin de este medio en el curso, esta clasificacin es aquella que se caracteriza por ser solida semislida y liquida.
IV. MATERIALES Y METODOS
MATERIALES
Para preparar 1 un litro de PDA 250 gr de papa. 25 gr de azcar. 25 gr de agar. 2 litros de agua destilada. Un litro de alcohol. Un paquete de algodn. Un cojn de leja clorox. Cinco botellas de vidrio que soporten esterilizacin con capacidad de 246 mL cada una. Para diversas actividades en la preparacin Baguetas Beaker Cocina elctrica Ollas FACULTAD DE AGRONOMIA - UNSA PRACTICA: Preparacin de medio de cultivo PDA 4
Olla a presin Bolsas de polipropileno Colador Balanza METODO 1. Se colocaron a hervir las papas cortadas en pedazos con cascara (lavadas con agua destilada) ms un litro de agua destilada por aproximadamente 30 min hasta conseguir que la papa este cocida. 2. El lquido se decanta hacia un recipiente, del recipiente se hace colar hacia un beaker de un litro. 3. Se agrega el azcar y el agar en el extracto an caliente para disolverlos finalmente se agrega agua destilada hasta llegar a un litro del preparado. 4. Luego de que la mezcla est homognea se vierte en las cinco botellas para ser cubiertas por algodn y hojas bond para lograr un sello. 5. Se colocan las botellas en bolsas de polipropileno para pasar a autoclave en la olla a presin. 6. El autoclave o esterilizacin se hace a 121 C a una presin de 15 PSI durante 30 min para evitar la activacin de endosporas que son resistentes al calor. 7. Se deja enfriar dentro de la olla para regular las presiones con el exterior y se retiran para su conservacin.
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
RESULTADOS
La solucin preparada servir como medio de cultivo para hongos Fitopatgenos en la misma practica de microorganismos del suelo. La solucin de PDA preparada ser colocada sobre las placas Petri para la posterior instalacin de los cultivos.
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Las cantidades a preparar deben ser razonables y segn bibliografa.
La utilizacin del equipo adecuado garantiza un buen resultado en este caso una olla a presin ptima para el autoclave del PDA
DISCUCIONES El autoclave se realiza a tal temperatura y a tal presin como una forma de esterilizacin y evitar la posterior aparicin de microorganismos no deseados, asegurando un medio libre de patgenos ajenos al que se desea cultivar. FACULTAD DE AGRONOMIA - UNSA PRACTICA: Preparacin de medio de cultivo PDA 6
El autoclave se realiza en una olla a presin especial capaz de soportar tal presin y temperatura a la cual es sometida en esta actividad. El uso de las cantidades adecuadas y el orden de stas garantiza el xito en la preparacin del medio de cultivo en este caso PDA.
VI. CONCLUSIONES
a) Tales cantidades son recomendadas para la preparacin de un litro de solucin PDA. b) La preparacin de la solucin PDA lograda servir como medio de cultivo de organismos del suelo a estudiar.
VII. RECOMENDACIONES Toda la preparacin debe hacerse en laboratorio con las condiciones necesarias para mantener un ambiente asptico, desinfectando todo y usando material limpio. La consistencia que debe lograrse debe ser espesa y una coloracin clara para la correcta observacin.
VIII. BIBLIOGRAFA
Facultad de agroindustrias, UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE, consultado el 24 de septiembre del 2014, disponible en: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf
Producción en Laboratorio de Microorganismos Efectivos de Montaña (MM), para Su Uso en La Degradación Acelerada de Residuos Orgánicos de Cosecha en Finca